universidade federal do rio grande do norte ......confiança e amor nos une até hoje. te amo muito!...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
FABIANA MARIA COIMBRA DE CARVALHO
ESTUDO DO EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DE SEMENTES DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) EM ALTERAÇÕES METABÓLICAS E MOLECULARES INDUZIDA POR DIETA EM RATOS WISTAR.
NATAL 2019
FABIANA MARIA COIMBRA DE CARVALHO
ESTUDO DO EFEITO DO INIBIDOR DE TRIPSINA PURIFICADO DE SEMENTES DE TAMARINDO (Tamarindus indica L.) EM ALTERAÇÕES METABÓLICAS E MOLECULARES INDUZIDA POR DIETA EM RATOS WISTAR.
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Orientadora: Prof. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais Co-orientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos
NATAL
2019
3
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson – Centro de Biociências - CB
Carvalho, Fabiana Maria Coimbra de. Estudo do efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo (Tamarindus indica L.) em alterações metabólicas e moleculares induzida por dieta em ratos Wistar / Fabiana Maria Coimbra de Carvalho. - Natal, 2020. 90 f.: il. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Orientadora: Profa. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais. Coorientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos. 1. Tamarindus indica L. - Tese. 2. Perfil lipídico - Tese. 3. Glicemia - Tese. 4. PPAR-gama - Tese. 5. TNF-alfa - Tese. I. Morais, Ana Heloneida de Araújo. II. Santos, Elizeu Antunes dos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 634.46
Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351
4
5
Dedico esta obra
À Deus, aos meus pais Fred e Sandra, ao meu esposo Daniel, pelo apoio incondicional e
constante incentivo e a minha orientadora, Professora Drª. Ana Heloneida, pela confiança,
incentivo, pois sem a senhora a realização desse trabalho não seria possível.
6
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus pela sabedoria e discernimento que Ele me concedeu ao longo do curso de Nutrição para que eu fizesse a escolha certa por ter optado pela área da pesquisa para atuar, a qual eu me identifiquei muito, me dando força para que eu pudesse
continuar trilhando e lutando cada vez mais ao longo dessa jornada. Posso afirmar que Ele foi, é, e sempre será o meu refúgio e fortaleza, socorro presente nas minhas angústias, se não fosse a Sua mão e o Seu poder seobre a minha vida, eu não teria conseguido chegar até aqui. Hoje
com o título de mestre em Nutrição, já exercendo a docência e agora preparada para receber o título de doutora em Bioquímica.
Agradeço também aos meus pais, Sandra e Fred, por estarem sempre ao meu lado, me apoiando, me incentivando pra que eu sempre lutasse pelos meus sonhos e objetivos. Obrigada por serem exemplos em minha vida, exemplos de superação, honestidade,
determinação, perseverança, responsabilidade, dedicação, coragem e fé. Obrigada por todo amor e carinho. Podem ter certeza que tudo isso foi fundamental para que eu chegasse até
aqui. Muito obrigada por todo investimento, por tudo o que vocês fizeram buscando sempre o melhor para mim. Sou eternamente grata a vocês! Amo muito vocês!
Agradeço ao meu esposo, Daniel, que sempre esteve ao meu lado, me apoiando e
incentivando para seguir o caminho que eu sonho. Muito obrigada, meu amor, por toda paciência, compreensão, amor, carinho, lealdade, cuidado que tiveste comigo até hoje, sempre
compreendendo as minhas renúncias e apoiando para que o objetivo principal fosse alcançado. Obrigada também pelo apoio nos experimentos, na tabulação de dados, não só na pesquisa, mas na docência também, em todas as áreas da minha vida sei que sempre tive e
sempre terei seu apoio. Juntos somos mais fortes e a nossa cumplicidade, amizade, respeito, confiança e amor nos une até hoje. Te amo muito!
Também gostaria de agradecer o amor e carinho da minha irmã Flávia e meu cunhado
Gustavo que sempre compreenderam essa minha jornada e sempre me deram força, torcendo por mim e pelo meu sucesso. Também agradeço por ter me dado a honra de ser tia e
“paparicar” bem muito minha sobrinha, pode ter certeza, que Fernanda foi meu refúgio no momento de muito “estresse”, titia ama muito essa pequena. Saibam que vocês são especiais,
amo vocês! Agradeço também ao meu cunhado, Raphael Serquiz, por todo apoio, auxílio, disponibilidade em me ajudar e por todo carinho que sempre teve comigo. Pode ter certeza que é recíproco,
você é muito especial e sou grata por tudo que fizeste por mim! Amo você, Raphinha!
Também agrdeço a madrinha do meu esposo, Rosângela, que considero como minha madrinha, a nossa “Dinda”, e a minha sogra Rejane, por toda torcida, por todo apoio e
carinho, mesmo que distante, mas sempre curtindo cada degrau conquistado. Obrigada por tudo sempre! Amo vocês!
Agradeço aos meus amigos Karlinha, Vanessinha, Rayonara, Elayne, Rafael Cardoso,
Gustavo Martins, Thiago (“China”), em especial Amandinha e Ágnes por sempre estarem ao meu lado, me apoiando, incentivando, acreditando e torcendo por mim. Saibam que os nossos
encontros foram fundamentais para aliviar os “estresses” dessa longa jornada. Vocês são especiais, amo vocês!
7
Também agradeço a toda minha equipe de rabalho da Universidade Potiguar (UnP) por todo apoio nessa longa jornada, por todas as conversas e “desabafos” quando necessário, em
especial a minha gestora e amiga professora Msc. Lidiane Fernandes por toda compreensão, todo apoio e todo incentivo, por entender o momento da reta final e me ajudar a conciliar a
docência e o doutorado de uma forma mais leve. Também agradeço em especial as amigas e parceiras de trabalho professora Drª Larissa Praça e professora Msc. Mabelle Lima por todo
apoio, todo “fardo” dividido, toda parceria para que tudo se tornasse mais leve. Muito obrigada a todos vocês!
Além disso, quero agradecer especialmente a umas das responsáveis por hoje eu estar aqui
realizando esse sonho, que é a minha orientadora professora Drª Ana Heloneida, pois já estamos juntas há um tempo e pode ter certeza que todo seu incentivo e orientação foram
fundamentais para que eu desse continuidade no caminho da pesquisa. Muito obrigada, por ter acreditado em mim, por ser minha orientadora desde a iniciação científica, a senhora é um exemplo de mestre para mim, com a senhora aprendi como se faz ciência. Obrigada por me ajudar a concretizar o sonho de ser mestre, de ser pesquisadora, por todo carinho, apoio e
amizade que sempre tive da senhora. Obrigada por tudo!
Agradeço também, ao meu co-orientador, professor Drº Eliseu Santos, pela colaboração e acolhida no laboratório (LQFPB). Sempre preocupado em saber como estavam os
experimentos e sempre que possível me auxiliando. Obrigada por todos os ensinamentos e apoio, pode ter certeza que tudo isso foi fundamental para a realização desse trabalho. Muito
obrigada!
Agradeço a todo grupo de pesquisa da nutrição, NutriSBioativoS, por ter feito parte desse projeto, contribuindo de alguma forma para a realização do mesmo. Quero agradecer em
especial, a Amanda e Izael, que juntos iniciamos essa jornada, desde a iniciação científica até o doutorado e sempre estivemos ao lado um do outro, sempre nos apoiando e incentivando
para que seguíssemos em frente, muito obrigada por todo apoio, carinho, amizade e companheirismo, estaremos sempre juntos. Agradeço também em especial a Bia, por toda
parceria, todos os “desabafos”, todo carinho e amizade, estaremos sempre juntas. Agradeço ao professor e amigo Alexandre Serquiz, por toda disponibilidade para a realização
desse trabalho. Muito obrigada, por todo apoio, paciência e compreensão ao longo dessa jornada, principalmente para a realização dos experimentos. Pode ter certeza que sua
participação foi fundamental para que tudo pudesse acontecer da melhor forma possível. Aproveito e agradeço também a toda equipe do biotério da UNP, em especial seu Manoel e
Tarcísio para a realização dos experimentos. Obrigada pela ajuda! Agradeço também a professora e amiga Drª Maíra Lima pela colaboração e contribuição para a realização desse trabalho, muito obrigada por todo auxílio e disponibilidade para que todos os experimentos ocorressem da melhor forma possível. Aproveito e já agradeço por toda a
contribuição realizada na minha banca de qualificação e por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, pelo cuidado com que analisou meu trabalho e pela grandiosa contribuição
que fez. Muito obrigada por todo apoio sempre.
Agradeço a professora Drª Adriana Rezende por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, é uma honra tê-la na minha banca. Quando fui decidir os nomes para compor a
mesma, elenquei logo o nome da senhora, já que tenho uma admiração pelo seu trabalho e já tive o prazer de tê-la na minha banca de defesa do mestrado e pude ver o compromisso e
8
seriedade das suas argumentações, muito obrigada pelo cuidado com que olhaste meu trabalho e pela valiosa contribuição que fizeste. Muito obrigada por tudo!
Agradeço a professora Drª Lucia de Fatima Campos Pedroza por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, é uma honra tê-la na minha banca. Tenho uma admiração pelo seu trabalho e por toda sua carreira na Nutrição. És um exemplo de mestre e profissional para
mim. Tenho orgulho de ser egressa da primeira turma do programa pós-graduação em nutrição, por saber o quanto que a senhora lutou para que esse projeto fosse concretizado, e, assim, concretizar o sonho de muitas pessoas, como, por exemplo, o meu, de ter o título de
mestre em Nutrição. Muito obrigada pelo cuidado com que olhaste meu trabalho e pela valiosa contribuição que fizeste. Muito obrigada por tudo!
Também agradeço a professora e amiga Drª Paula Ivani por ter aceitado fazer parte da minha banca de defesa, é uma honra tê-la na minha banca. Sou grata por ter aceitado meu convite, pois me acompanhaste desde a iniciação científica até aqui, obrigada pelo cuidado com que
avaliaste meu trabalho e pela grandiosa contribuição que fizeste. Muito obrigada por tudo, por todas as conversas e por todo carinho de sempre!
Agradeço ao pessoal do LQFPB, por nos acolher no laboratório e sempre estarem disponíveis
para nos ajudar. Muito obrigada. Não poderia deixar de agradecer a minha turma de doutorado, que sempre estava junta, unida, torcendo uns pelos outros, nos apoiando para que todos pudessem chegar ao objetivo comum: a defesa do doutrado. Obrigada a todos pelos momentos de angústias compartilhados a cada disciplina que se passava, bem como os momentos de descontração, alegria, risadas e acima
de tudo pelo apoio.
Também agradeço a todos os professores do PPGBIOQ. Pode ter certeza que todos vocês contribuíram para o aprimoramento e aperfeiçoamento dos meus conhecimentos para que eu pudesse trilhar esse longo caminho. Vocês são essenciais para a concretização do meu sonho.
Agradeço também a Samara, secretária do PPGBIOQ, por toda disponibilidade que sempre
teve em me ajudar nas burocracias exigidas pelo programa. Muito obrigada por tudo!
A todos os funcionários e professores do departamento de Bioquímica e Nutrição da UFRN. Ao programa de Pós-Graduação em Bioquímica. A PPG Capes pelo financiamento – código
001, em um período desse doutorado.
Às pessoas que direta ou indiretamente auxiliaram o desenvolvimento e conclusão desse trabalho.
9
“...Às vezes a felicidade demora a chegar Aí é que a gente não pode deixar de sonhar
Guerreiro não foge da luta e não pode correr Ninguém vai poder atrasar quem nasceu pra vencer...”
Alexandre Assis / Carlos Rodrigues / Gilson Bernini
10
Estudo do efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo (tamarindus indica l.) em alterações metabólicas e moleculares induzida por dieta em ratos Wistar.
RESUMO
A crescente prevalência da obesidade e de todas as morbidades associadas tem aumentado a busca por novos métodos de tratamento. Torna-se essencial investigar o efeito das vias de atuação das dietas desequilibradas, nutricionalmente, sobre marcadores e/ou parâmetros metabólicos/bioquímicos, inflamatórios e moleculares, e identificar moléculas que possam atuar prevenindo esse quadro. Neste estudo, foi avaliada uma dieta experimental rica em alimentos ultraprocessados e, posteriormente, o efeito do inibidor de tripsina purificado de sementes de tamarindo em modelo experimental sobre parâmetros bioquímicos e moleculares. Foi produzida uma dieta experimental e analisada a sua composição centesimal, índice glicêmico e carga glicêmica. Para essas duas últimas análises, foram utilizados dois grupos de ratos Wistar (n=5). Ainda foi avaliado o efeito dessa dieta e do inibidor de tripsina de sementes de tamarindo purificado (ITTp) em alterações metabólicas, induzidas pela dieta experimental em ratos Wistar. Os experimentos foram conduzidos em duas fases: 1) 17 semanas, nesse foram utilizados dois grupos de ratos Wistar (n=5), um dos grupos de animais foram alimentados com a dieta experimental, enquanto o outro grupo com a dieta padrão (Labina®). Ao final dessa fase, os animais tiveram analisados: o estado nutricional, marcadores e parâmetros bioquímicos, inflamatórios, hormonais e moleculares; 2) Neste, foram utilizados quatro grupos de ratos Wistar (n=5); desses, três grupos de animais foram, inicialmente, alimentados por 17 semanas com dieta experimental e se apresentaram com obesidade e então dois desses grupos foram tratados por 10 dias, da seguinte forma: a) dieta padrão b) ITTp (730 µg/kg). O terceiro grupo de ratos Wistar com obesidade não recebeu tratamento (controle negativo) e mais um grupo de ratos Wistar, eutróficos alimentados com dieta padrão foi adicionado ao experimento como controle positivo. No 11º dia de experimento foram avaliados: medidas zoométricas; consumo e ganho de peso; marcadores e parâmetros bioquímicos e moleculares. A dieta experimental apresentou alto índice glicêmico (77,6) e alta carga glicêmica (38,8). Houve diferença significativa (p < 0,0001) na diferença cumulativa semanal dos valores do Índice de Lee, evidenciando um aumento, nas 17 semanas de estudo, no grupo que recebeu a dieta experimental. Os animais que receberam a dieta experimental apresentaram glicemia de jejum aumentada (p=0,008) comparado aos animais que receberam a dieta padrão. Também houve diferença estatística significativa em relação ao VLDL-c (p=0,016) e TG (p=0,016), sendo maior no grupo de animais que recebeu a dieta experimental. Foi visto que os ratos do grupo da dieta experimental apresentaram expressão relativa de mRNA de PPARy significativamente maior nos tecidos gonadal e retroperitoneal (p=0,0121 e p=0,0024, respectivamente). O grupo tratado com ITTp apresentou as medianas significativamente mais baixas, do que as do grupo da dieta da experimental (p=0,0065). O grupo de ratos Wistar com obesidade tratados com ITTp apresentou as concentrações de TG e VLDL-c mais baixas (p=0,0108) comparada aos demais grupos. Ainda assim, o grupo de animais tratados com ITTp apresentou a expressão relativa de mRNA de TNF-α significativamente (p=0,025) menor comparadas aos outros grupos, independente da expressão de mRNA de PPAR- γ. O presente estudo apresenta o ITTp, como uma molécula bioativa que atua na modulação das alterações metabólicas e moleculares, provocadas por uma dieta experimental de alto indice glicêmico. Portanto, é de grande interesse biotecnológico, principalmente para o desenvolvimento de biofármacos com potencial de aplicação com função anti-TNF-α.
Palavras-chave: Tamarindus indica L.. Perfil lipídico. Glicemia. PPAR- γ. TNF-α.
11
Evaluation of the effect of purified tamarind seed trypsin inhibitor on metabolic changes induced by experimental diet in a wistar rat model.
ABSTRACT
The increasing prevalence of obesity and all associated noncommunicable chronic diseases (NCDs) has increased the search for new methods to combat them. To investigate the effect of the nutritional pathways of nutritionally unbalanced diets on markers and/or parameters metabolic/biochemical, inflammatory and molecular, and look for molecules that can act by reverse this situation is essential. In this study, an experimental diet rich in ultra-processed foods was evaluated and, subsequently, the effect of purified tamarind seed trypsin inhibitor in an experimental model on biochemical and molecular parameters. An experimental diet was produced and its centesimal composition, glycemic index and glycemic load were analyzed. For glycemic index and glycemic load analyzes two groups of Wistar rats were used. It was also evaluated the metabolic changes induced by either this experimental diet and the tamarind seed purified trypsin inhibitor (ITTp). The experiments were conducted in two phases: 1) 17 weeks, in which two groups of Wistar rats (n = 5) were used, one group of animals were fed with the experimental diet, while the other group with the standard diet (Labina®). At the end of this phase, were analyzed: nutritional status, and biochemical, inflammatory, hormonal and molecular parameters and markers. 2) four groups of Wistar rats (n = 5) were used. Of these, three groups of animals were initially fed for 17 weeks with an experimental diet and presented obesity and then two of these groups were treated for 10 days with a) standard diet or b) ITTp (730 µg / kg). The third group of obese Wistar rats received no treatment (negative control) and one more group of eutrophic Wistar rats were added to the experiment as a positive control. On the 11th day of the experiment were evaluated: zoomometric measurements; consumption and weight gain; and biochemical and molecular parameters and markers. The experimental diet showed high glycemic index (77.6) and high glycemic load (38.8). There was a statistically significant difference (p <0.0001) in the cumulative weekly difference in Lee Index values, evidencing an increase in the 17 weeks of study in the group that received the experimental diet. The animals that received the experimental diet presented significantly increased fasting glucose (p = 0.008) when compared to the animals fed by standard diet. There were also statistically significant difference in relation to VLDL-c (p = 0.016) and TG (p = 0.016), being higher in the group of animals that received the experimental diet. Rats from the experimental diet group had significantly higher PPARγ mRNA relative expression in the gonadal and retroperitoneal tissues (p = 0.0121 and p = 0.0024, respectively). The pTTI-treated group showed significantly lower medians than the experimental diet group (p = 0.0065).The group of obese Wistar rats treated with ITTp had the lowest TG and VLDL-c concentrations (p = 0.0108) compared to the other groups. In addition, the group of animals treated with ITTp had significantly lower TNF-α mRNA relative expression (p = 0.025) compared to the other groups, regardless of PPAR-γ mRNA relative expression. This present study presents the ITTp as a bioactive molecule that acts on the modulation of metabolic changes caused by a high glycemic index experimental diet. Therefore, ITTp is a molecule with great biotechnological potential, especially for the development of biopharmaceuticals with anti-TNF-α function.
Keywords: Tamarindus indica L .. Lipid profile. Blood glucose. PPAR- γ. TNF-α.
12
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Curva glicêmica da dieta experimental e glicose .................................................30 FIGURA 2 Índice de Lee em ratos Wistar recebendo (A) dieta padrão (B) dieta experimental. (C) Diferenças cumulativas no índice de Lee e (D) Perímetros da Cintura (PC) de animais recebendo dieta padrão e dieta experimental durante o experimento...............................................................................................................................31 FIGURA 3 Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo em ratos Wistar recebendo dieta padrão ou experimental em (A) tecido adiposo retroperitoneal e (B) tecido adiposo gonadal.........................................................................................................................33 FIGURA 4 Eletroforese (SDS-PAGE) das proteínas de sementes de tamarindo..................................................................................................................................48 FIGURA 5 Consumo alimentar e ganho de peso em ratos Wistar após 10 dias de tratamento..................................................................................................................................49 FIGURA 6 Glicemia de jejum em ratos Wistar após 10 dias de tratamento..................................................................................................................................50 FIGURA 7 Perfil lipídico de ratos Wistar após 10 dias de tratamento..................................................................................................................................51 FIGURA 8 Expressão relativa do mRNA de TNF-α no tecido adiposo perirrenal em ratos Wistar após 10 dias de tratamento..................................................................................................................................52 FIGURA 9 Imunocoloração de TNF-α no tecido adiposo de ratos Wistar após 10 dias de tratamento..................................................................................................................................53 FIGURA 10 Expressão relativa do mRNA do PPAR-γ no tecido adiposo perirrenal em ratos Wistar após 10 dias de tratamento..................................................................................................................................54
13
LISTA DE TABELAS TABELA 1 Rótulo nutricional (g / Kg) da dieta Labina®....................................................24 TABELA 2 Composição centesimal (g/100 g) das dietas experimental e padrão........................................................................................................................................29 TABELA 3 Média dos incrementos sob a curva glicêmica obtidos dos animais do grupo da dieta experimental e do grupo que recebeu a glicose.......................................................................................................................................30 TABELA 4 Parâmetros bioquímicos dos animais da dieta experimental e padrão durante as 17 semanas................................................................................................................................32 TABELA 5 Composição centesimal (g/100 g) das dietas experimental e padrão. ...................................................................................................................................................44 TABELA 6 Efeito do ITTp no TNF-α plasmático em ratos Wistar submetidos a diferentes tratamentos por 10 dias. ...................................................................................................................................................51 TABELA 7 Escore da imuno-histoquímica de TNF-α em tecido adipose de ratos wistar submetidos a difefentes tratamentos durante 17 semanas.....................................................................................................................................54 TABELA 8 Resultado da busca de estudos sobre inibidores enzimáticos (inibidores de tripsina, elastase e Inibidor de quimiotripsina) de Tamarindus indica L. e sua aplicação na saúde de modo direto e indireto......................................................................................................................................71
14
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BApNA N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida
CCK Colecistocinina
CG Carga glicêmica
CHO Carboidrato
ChREBP Proteína de ligação ativada como elemento responsivo a carboidratos
DAB Diaminobenzidina
DCNT Doenças Crônicas Não Transmissíveis
DIO Diet-induced obesity
DMARDs Drogas modificadoras da doença
DM 2 Diabetes mellitus tipo 2
dNTPs Desoxirribonucleotídeos Fosfatados
dUTP 2'-desoxiuridina 5'-trifosfato
EB Extrato Bruto
ENH Elastase de Neutrófilo Humano
ESI-MS Espectrometria de massa com fonte de ionização eletrospray
EVTI Inibidor de Tripsina de Sementes de Erythrina veluntina
fMLP N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
GAPDH Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato
GGT Gama Glutamil Transpeptidase
GLUT4 Transportadores de Glicose 4
HDL-C Lipoproteínas de Alta Densidade
HGLI Dieta de alto índice glicêmico e de alta carga glicêmica
HMG-CoA 3- hidróxi-3-metil-glutaril-coenzima A
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência
IG Índice Glicêmico
IL-1β Interleucina-1 beta
IL-6 Interleucina-6
IL-13 Interleucina-13
IMC Índice de Massa Corpórea
IRS-1 Substrato-1 do Receptor de Insulina
ITT Inibidor de Tripsina de Semente de Tamarindo
15
LDL-C Lipoproteínas de Baixa Densidade
LPL Lipoproteína Lipase
MALDI-TOF-MS spectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por
matriz
MCP-1 Proteína quimioatraente 1 de macrófagos
NF-Κb Fator Nuclear kappa B
NutriSBioativoS Nutrição e substâncias bioativas para saúde
OMS Organização Mundial de Saúde
PAF Fator de agregação plaquetária
PAI-1 Inibidor do Ativador de Plasminogênio-1
PC Perímetro da cintura
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PPARγ Receptores ativados por proliferador de peroxissoma gama
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Gel de Poliacrilamida Descontínuo e Desnaturante
SM Síndrome Metabólica
SREBP Proteínas de ligação reguladora de esteróis
TG Triglicerídeos
TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética
TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica
TLR-4 Receptor do Tipo Toll
TNF-α Fator de Necrose Tumoral-alfa
TZDs Tiazolidinedionas
UI Unidade de Inibição
VLDL-c lipoproteínas de muito baixa densidade
16
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................................19
2. CAPÍTULOS ...................................................................................................................20
2.1 CAPÍTULO 1 .................................................................................................................20
2.1.1. Introdução .................................................................................................................21
2.2.2 Material e métodos .....................................................................................................23
2.2.2.1 Tipo de estudo e material biológico ...........................................................................23
2.2.2.2 Produção e análise da composição centesimal da Dieta Experimental ........................24
2.2.2.3 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental .............................................................................................................................................25
2.2.2.4 Determinação do efeito da dieta experimental sobre parâmetros antropométricos, bioquímicos e moleculares. ...................................................................................................26
2.2.2.5 A avaliação zoométrica e diagnóstico do estado nutricional de obesidade ..................27
2.2.2.6 Parâmetros Bioquímicos ............................................................................................27
2.2.2.7 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ em tecido adiposo .....................................28
2.2.2.8 Análise Estatística .....................................................................................................28
2.2.3 Resultados ..................................................................................................................29
2.2.3.1 Composição Centesimal da Dieta Experimental.........................................................29
2.2.3.2 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental com pellets ...........................................................................................................................30
2.2.3.3 Avaliação do estado nutricional .................................................................................30
2.2.3.4 Avaliação bioquímica ................................................................................................31
2.2.2.5 Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo ........................................32
2.2.4 Discussão ....................................................................................................................33
2.2.5 Conclusão ...................................................................................................................38
2.2 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................38
2.2.1. Introdução .................................................................................................................39
17
2.2.2 Materiais e métodos ...................................................................................................42
2.2.2.1 Tipo de Estudo e Material Biológico .........................................................................42
2.2.2.2 Experimento In Vitro ................................................................................................42
2.2.2.3 Experimento In Vivo .................................................................................................43
2.2.2.4 Animais.....................................................................................................................44
2.2.2.5 Dietas ........................................................................................................................44
2.2.2.6 Evolução da ingestão de alimentos e ganho de peso...................................................45
2.2.2.7 Parâmetros bioquímicos ............................................................................................45
2.2.2.8 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ e TNF-α no tecido adiposo ........................45
2.2.2.9 Imuno-histoquímica do TNF-α ..................................................................................46
2.2.2.10 Análise Estatística ...................................................................................................47
2.2.3. Resultados..................................................................................................................47
2.2.3.1 ITTp ..........................................................................................................................47
2.2.3.2 Consumo alimentar e ganho de peso ..........................................................................48
2.2.3.3 Glicose ......................................................................................................................49
2.2.3.4 Perfil lipídico ............................................................................................................50
2.2.3.5 TNF-α .......................................................................................................................51
2.2.3.6 Imuno-histoquímica deTNF-α ...................................................................................53
2.2.3.7 PPAR-γ .....................................................................................................................54
2.2.4. Discussão ...................................................................................................................55
2.2.5. Conclusões .................................................................................................................61
2.3 CAPÍTULO 3 .................................................................................................................61
2.3.1 Introdução ..................................................................................................................62
2.3.2 Metodologia ................................................................................................................63
2.3.3 Tamarindo (Tamarindus indica L. ) uma fruta tropical ...........................................64
2.3.4 Inibidores enzimáticos ...............................................................................................66
2.3.5 Inibidores enzimáticos em tamarindo e suas atividades heterólogas .......................67
18
2.3.6 Perspectivas de aplicação para saúde dos Inibidores enzimáticos de tamarindo ....76
2.3.7 Conclusões ..................................................................................................................78
3. CONCLUSÃO .................................................................................................................78
4. TRAJETÓRIA ACADÊMICA .......................................................................................79
REFERÊNCIAS..................................................................................................................81
19
1. INTRODUÇÃO
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a obesidade é definida como um
acúmulo anormal ou excessivo de gordura, decorrente do desequilíbrio energético, drogas,
predisposição genética ou mesmo fatores ambientais. Essa epidemia poderá favorecer o
surgimento e desenvolvimento de doenças crônicas não-transmissíveis (DCNTs), contribuindo
para o aumento de risco de desenvolvimento das doenças cardiovasculares, aumento do risco
de diabetes mellitus tipo 2 (DM 2), dislipidemia, aterosclerose, além de ser causa incidente da
síndrome metabólica (SM) (CAVALCANTI et al., 2009; GUIMARÃES et al., 2016;
AGUILERA et al., 2019; JAACKS et al., 2019).
Nos dias atuais, junto à globalização, vem sendo modificado o estilo de vida dos
indivíduos, conhecido como estilo de vida ocidental e com isso, está ocorrendo uma mudança
no padrão alimentar. Essa alteração está resultando no aumento da alimentação consumida fora
de casa, em estabelecimentos onde o preparo e o consumo são rápidos e os alimentos possuem
alta palatabilidade. Esse padrão alimentar é composto por alimentos industrializados com alto
valor calórico, apresentando um elevado teor de carboidratos, principalmente, carboidratos
simples, provenientes do uso de cereais refinados; além de grandes quantidades de gordura,
principalmente gorduras saturadas ou trans e baixo teor de proteínas, fibras alimentares e
micronutrientes, também reconhecidos como alimentos ultraprocessados (CASTRO et al.,
2015; SAKURAI et al., 2016; GIBNEY et al., 2018)
Para Sartorelli e Cardoso (2006) a dieta hiperglicídica está combinada com fatores de
risco para a dislipidemia, assim como ocorre em dietas ricas em lipídeos. Possivelmente, essa
relação é atribuída ao estímulo mais elevado à lipogênese hepática, especialmente na síntese de
triglicerídeos e consequentemente as lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL-c), por
meio de uma maior oferta de glicose plasmática. As dietas desequilibradas nutricionalmente,
comumente provocam aumento do tecido adiposo, condicionado pelo aumento da expressão do
receptor proliferador de peroxissoma gama (PPARγ), mais especificamente o PPARγ2 que é
mais expresso no tecido adiposo. Ainda, dentre os mecanismos moleculares associados no
desenvolvimento da resposta inflamatória induzida pelo tecido adiposo, destaca-se, a via de
sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB), o qual aumenta a expressão de vários genes que
codificam para proteínas relacionadas a resposta inflamatória e, consequentemente, está ligado
à patogênese de diferentes DCNTs (OUCHI et al., 2011; KRINNINGER et al., 2011;
KANNEGANTI; DIXIT, 2012; WEISBERG et al., 2013).
20
Para o tratamento das DCNTs envolvendo o processo inflamatório, existem vários
medicamentos que são utilizados, como os fibratos e tiazolidinedionas (TZDs) que agem
ativando os receptores nucleares, tais como os PPARγ. As TZDs aumentam a expressão dos
transportadores de glicose no músculo e no tecido adiposo (GLUT4), da Lipase lipoprotéica
(LPL) e reduzem a expressão da leptina e do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) (BROWN;
PLUTZKY 2007; SHAH; MEHTA; REILLY, 2008). No entanto, as ações maléficas e os
efeitos indesejáveis (hepatotoxicidade) provocados pelos fibratos e TZDs têm fortalecido e
contribuído para o aumento em pesquisas com foco em substâncias com propriedades mais
seletivas e menos tóxicas (BROWN; PLUTZKY 2007; SHAH; MEHTA; REILLY, 2008).
Dessa forma, a busca por moléculas bioativas, com base em plantas tem sido bastante
intensificada, visando à formulação de novos biofármacos.
As bioatividades de inibidores de tripsina em sementes, entre elas as de tamarindo, têm
sido demonstrados em alguns estudos. Em estudos recentes, realizados pelo grupo de pesquisa
NutriSBioativoS (Nutrição e substâncias bioativas para saúde), um inibidor de tripsina de
semente de tamarindo (ITT) foi purificado e caracterizado (MEDEIROS et al., 2018) e tem
apresentado diversas propriedades bioativas (MEDEIROS et al., 2018; CARVALHO et al.,
2019). Ribeiro et al. (2015) mostraram que o ITT isolado apresenta, um efeito sacietogênico,
reduzindo, em ratos eutróficos, o ganho de peso associado ao aumento plasmático
de colecistoquinina (CCK). Carvalho et al. (2016) mostraram que o ITT apresenta, além da
redução do consumo alimentar em animais com obesidade e SM, a redução de TNF-
α plasmático e da média da glicemia de jejum, entretanto sem diferença estatística entre os
grupos estudados. Ressalta-se que o ITT não apresentou hepatotoxicidade nos dois
últimos estudos citados acima (RIBEIRO et al., 2015; CARVALHO et al., 2016).
Em face da propriedade sacietogênica e anti-inflamatória do ITT e a relação entre
dietas nutricionalmente inadequadas e alteração metabólicas, torna-se relevante investigar o seu
potencial efeito na redução dos parâmetros bioquímicos e moleculares, alterados por dietas
desequilibradas. Desse modo, neste estudo, foi avaliada uma dieta experimental rica em
alimentos ultraprocessados e, posteriormente, o efeito do inibidor de tripsina purificado de
sementes de tamarindo em modelo experimental sobre parâmetros bioquímicos e moleculares.
2. CAPÍTULOS
2.1 CAPÍTULO 1
Os resultados estão sob revisão no periódico International Food Research Journal. Carvalho, F.M.C.; Costa, I.S.; Santos, J.P.S.O.; Oliveira, G.S.; Santos, J.; Silva, F.K.B.; Bortolin, R.H.; Silbiger,
21
V.N.; Neves, R.A.M.; Maciel, B.L.L.; Santos, E.A.; Morais, A.H.A. Directly measured and calculated glycemic index and glycemic load in an experimental pellet-diet for obesity induction and its metabolic effects in Wistar rats.
Cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica em uma dieta experimental e seus efeitos na obesidade e nas alterações metabólicas em ratos Wistar.
RESUMO
As doenças relacionadas à obesidade no mundo aumentaram como resultado de distúrbios metabólicos induzidos por dietas de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica. Foi avaliada a composição centesimal, medido e calculado diretamente o índice glicêmico e os valores da carga glicêmica de uma dieta utilizada para induzir obesidade e alterações metabólicas. Dois grupos de ratos Wistar machos adultos (n = 5) foram alimentados com dieta padrão e experimental por 17 semanas. A dieta experimental, composta majoriatiriamente por carboidratos, com índice glicêmico de 77,6 e carga glicêmica de 38,8. Essa dieta aumentou os níveis de glicemia de jejum, triglicerídeos, VLDL-C e de mRNA de PPARγ no tecido adiposo. O índice glicêmico e a carga glicêmica foram diretamente medidos e calculados destacando informações essenciais para a caracterização da dieta. Além disso, a dieta induziu a obesidade e seus distúrbios. Sugere-se que essa metodologia possa ser utilizada em outros estudos com o objetivo de avaliar o efeito metabólico de dietas ricas em carboidratos. Palavras-chave: Dieta experimental; Glicemia de jejum; Triglicerídeos; VLDL-C; PPARγ. ABSTRACT Worldwide, the obesity-related diseases have increased as a result of metabolic disorders induced by diets with high glycemic index and glycemic loads. We evaluated the centesimal composition and directly measured and calculated glycemic index and glycemic load values of a pellet-diet used to induce obesity and metabolic alterations. Two groups of adult male Wistar rats (n = 5) were fed with a standard or experimental diet for 17 weeks. The experimental diet was rich in carbohydrates and the glycemic index was of 77.6 and the glycemic load was of 38.8. This pellet-diet increased fasting glycemia, triglycerides, VLDL-C and PPARγ mRNA expression in adipose tissue. Directly measured and calculated values of glycemic index and glycemic load highlighted essential information for the characterization of our diet. Moreover, the diet induced obesity and its disorders. We suggest this direct methodology could be used in other studies aiming to evaluate the metabolic effect of high carbohydrate diets. Keywords: Experimental diet; Fasting blood glucose; Triglycerides; VLDL-C; PPARγ.
2.1.1. Introdução
Os hábitos alimentares da sociedade moderna têm impactado no aumento da incidência
das doenças crônicas não transmissíveis (DCNTs) (WHO, 2016). Contudo, mesmo com a
diversidade nutricional apresentada nesses hábitos, quando se relacionam os padrões de
consumo alimentar com os distúrbios metabólicos, a sua maioria é considerada obesogênica
(ROSSINI; SILVA; MORAES, 2012; NAKANISHI; SERIKAWA; KURAMOTO, 2015;
22
MYRTILLE; HEUVEL; FLEUR, 2016). Desse modo, as DCNTs têm sido estudadas,
preferencialmente, induzidas por dietas que refletem essa variedade de alimentos altamente
energéticos e palatáveis (geralmente produtos industrializados e ultraprocessados)
(BUETTNER; SCHÖLMERICH; BOLLHEIMER, 2007). Essas dietas apresentam altos
índices (IG) e/ou cargas glicêmicas (CG), por se assemelharem ao padrão alimentar atual, as
que melhor refletem as causas dietéticas para essas desordens metabólicas (WHO, 2016;
BORTOLIN et al., 2018).
Tais dietas inadequadas, sejam desequilibradas qualitativa ou quatitativamente, na sua
maioria, provocam aumento do tecido adiposo, sendo esse efeito demonstrado nos estudos,
frequentemente, condicionado pelo aumento da expressão do proliferador de peroxissoma gama
(PPARγ), mais especificamente o PPARγ2 (TONTONOZ; HU; SPIEGELMAN, 1994;
SCHOONJANS; STAELS; AUWERX, 1996; REN et al., 2002; LIOU et al., 2011; LIANG et
al., 2016; CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017). Nos adipócitos, o PPARγ2
regula a expressão de numerosos genes, envolvidos no metabolismo de glicídios e lipídeos,
incluindo Adipocyte protein 2 (LIANG et al., 2016), acil-CoA sintetase (TONTONOZ; HU;
SPIEGELMAN, 1994) e lipoproteína lipase (SCHOONJANS; STAELS; AUWERX, 1996).
Controla a expressão da proteína transportadora de ácidos graxos 1 e cluster of differentiation
36, ambos envolvidos na captação de lipídeos pelos adipócitos (REN et al., 2002; LIOU et al.,
2011; CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017).
Os distúrbios hormonais provocados por dietas obesogênicas têm sido também uma
alternativa na busca por explicações pelo aumento da ingestão alimentar (hiperfagia) e da
eficiência energética que acabam por influenciar no aumento das DCNTs (LI et al., 2008;
DEKKER et al., 2010). Ainda, evidências de pesquisas experimentais mostram que esse
aumento no consumo alimentar, frequentemente, está atrelado aos distúrbios no metabolismo
hormonal e na resposta desses ao consumo oral e à presença dos nutrientes no sistema digestivo
(INSTITUTO ADOLFO LUTZ , 1985; NADERALI et al., 2001; BRASIL, 2005; LI et al.,
2008; DEKKER et al., 2010).
Adicionalmente, fatores como a composição da dieta, a duração do tratamento dietético
e alguns nutrientes isolados, têm demonstrado ser importantes no desenvolvimento de
distúrbios metabólicos (INSTITUTO ADOLFO LUTZ , 1985; NADERALI et al., 2001;
FOSTER-POWELL; HOLT; BRAND-MILLER, 2002; BRASIL, 2005; MONRO; SHAW,
2008; GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS, 2011; THE
UNIVERSITY OF SYDNEY, 2015). Sendo assim é de grande importância o estudo da
composição centesimal dessas dietas que induzem obesidade (DIO - Diet-induced obesity) e
23
consequentemente sua informação nutricional. Dentre os nutrientes em estudos que analisam
consequências metabólicas e bioquímicas das dietas, o alto teor de frutose tem sido apontado
(NOVELLI et al., 2007; AUGUSTIN et al., 2015) em detrimento da presença de gordura na
dieta (REEVES, 1997; BLEICHER et al., 2001).
Dessa maneira, a busca por explicações relacionadas aos efeitos de certos nutrientes
presentes nessas dietas ou mesmo das suas inadequações quantitativas sobre a hiperfagia e,
consequentemente, a obesidade e as suas consequências, ainda são insuficientes. Além disso,
existem as limitações éticas e impedimentos legais que revestem esses estudos com DIO e seus
efeitos deletérios no organismo em seres humanos (ORDÓÑEZ, 2005; SHUKLA et al., 2015).
Assim, são comuns estudos experimentais, sendo recomendadas as pesquisas com
animais, especialmente ratos, dada a similaridade existente entre o seu genoma com o dos
humanos (PINTO JÚNIOR; SERAPHIM, 2012), mas que possuam modificações específicas,
susceptibilidade genéticas ou apresentando doenças induzidas por vias que não são as mesmas
que acometem os humanos (ISKEN et al., 2009). Estudos que avaliem dietas que representem
o padrão alimentar da atualidade, que sejam realizados em linhagens de animais que
representem a diversidade daquela população e que promovam impactos significativos no
metabolismo, nos mais diversos níveis, são menos comuns.
Adicionalmente, a busca por informações sobre os mecanismos envolvidos nessa
relação de causa efeito, entre dieta e doença, vem sendo exaustivamente pesquisada. Para isso,
alguns modelos têm sido apresentados na literatura, visando fornecer meios para se avaliar e
responder as mais diversas perguntas acerca dessa relação.
O presente estudo traz a perspectiva de um modelo de indução de distúrbios
metabólicos avaliados em diversos níveis, sejam antropométricos, plasmáticos e molecular, por
meio da utilização de uma nova dieta experimental, também analisada quanto à sua composição
centesimal, índice e carga glicêmica.
2.2.2 Material e métodos
2.2.2.1 Tipo de estudo e material biológico
Esse é um estudo experimental composto por dois experimentos in vivo diferentes
realizados no Biotério da Universidade Potiguar - UnP. O primeiro experimento analisou o
índice glicêmico e a carga glicêmica da dieta experimental durante quatro semanas. O segundo
experimento investigou o efeito da mesma dieta experimental nos parâmetros antropométricos,
24
bioquímicos e moleculares por dezessete semanas. Os experimentos ocorreram com dois grupos
de animais, de acordo com a metodologia descrita abaixo.
A dieta Labina® (Paulínia, SP, Brasil) e os alimentos industrializados,
ultraprocessados, utilizados na dieta experimental foram obtidos, comercialmente, na cidade de
Natal, RN. Para a análise da composição centesimal, todos os reagentes utilizados foram de
grau analítico e obtidos da Sigma (St. Louis, EUA), VETEC Química Fina Ltda (Rio de Janeiro,
Brasil) e Merck (Rio de Janeiro, Brasil). Tabela 1. Rótulo nutricional (g / kg) da dieta Labina®.
Dieta Labina® Umidade (g/Kg) 130,00 Cinzas (g/Kg) 100,00 Proteína (g/Kg) 230,00 Lipídios (g/Kg) 40,00 Fibra Bruta (g/Kg) 50,00
2.2.2.2 Produção e análise da composição centesimal da Dieta Experimental A dieta experimental foi produzida, utilizando, em sua composição, água, ração
Labina®, sendo acrescentados alimentos fontes de carboidratos simples, ultraprocessado, ricos
em sacarose, em proporções recomendadas por Naderali et al. (2001). Assim, para a produção
da dieta experimental foram utilizados: 100 g de ração, 100 mL de leite condensado e 21,2 g de
açúcar refinado.
Assim, a ração Labina® sólida, em forma de cilindros, foi triturada com auxílio de
moinho e/ou cutler. Posteriormente, os ingredientes foram adicionados e misturados,
manualmente; em seguida, foram modelados em forma de cilindros e assados em forno pré-
aquecido a 180 ºC, por, aproximadamente, 40 minutos, até se apresentarem secos e dourados.
A dieta experimental foi avaliada quanto à sua composição centesimal e para isso,
inicialmente, triturada e analisada quanto ao teor de umidade, por meio de secagem em estufa
a 105 °C até massa constante. Após esse procedimento foi seca para que as demais análises
fossem realizadas em base seca e em triplicata. A análise de lipídeos foi realizada pelo método
de Soxhlet, que consiste em um processo de extração contínuo, onde se utilizou hexano como
solvente. Os teores de cinzas foram determinados por incineração em mufla, a 550 °C, até
obtenção de massa constante e o conteúdo de proteínas foi efetuado pelo método de Kjeldahl.
Todas as análises foram realizadas usando os métodos padronizados pelo Instituto Adolfo Lutz
25
(BRASIL, 2005). A análise de fibra bruta foi feita segundo o método Ba 6ª-05 da Associação
de comunidades analíticas (INSTITUTO ADOLFO LUTZ, 1985).
Após as análises todos os resultados foram convertidos para base úmida. Os
carboidratos foram determinados por diferença (100 g do alimento - soma total dos valores
encontrados para umidade, lipídeos, cinzas, proteínas e fibras).
2.2.2.3 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental
Esse primeiro experimento in vivo foi realizado com dois grupos de animais por 4
semanas para avaliar o índice glicêmico e a carga glicêmica da dieta experimental. Os animais
foram avaliados semanalmente e calculados os valores médios de glicemia (MONRO; SHAW,
2008). Ratos Wistar adultos (16 semanas), machos, foram distribuídos individualmente em
gaiolas de polipropileno, formando 2 grupos de 5 animais. Os animais foram mantidos em
condições de luz padrão (12/12 h claro / escuro) e temperatura (23-25 ° C), sendo água e
alimento ad libitum. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Guia para o
Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (20). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Uso de Animais (CEUA-UnP) sob protocolo nº 012/2015.
Para a avaliação do índice glicêmico e carga glicêmica, a glicose foi dada a um grupo
de animais (n = 5) como padrão e a dieta experimental para o outro grupo de animais (n = 5).
Foram administrados por gavagem aos animais em jejum 5 mL da dieta experimental contendo
0,1 g / mL de carboidratos ou solução padrão de glicose (0,1 g / mL) (MONRO; SHAW, 2008).
A glicemia foi medida aos 0, 5, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a gavagem e a curva glicêmica
foi construída. Alíquotas de sangue foram obtidas da veia caudal dos ratos e colocadas em fita
glicêmica e analisadas em medidor de glicose (ADVANTAGE®, Boehringer Mannheim,
EUA).
Para determinação teórica do IG, seguiu-se o protocolo proposto pela Food and
Agriculture Organization/World Health Organization (FAO, 1998), levando a efeito as
seguintes etapas:
a) identificação do total de carboidrato glicêmico (em gramas) de cada alimento da refeição;
b) determinação da proporção de carboidrato glicêmico de cada alimento em relação ao total de
carboidrato glicêmico de cada refeição;
c) localização do IG de cada alimento (utilizando-se a glicose como referência) em tabela
específica (FOSTER-POWELL; HOLT; BRAND-MILLER, 2002);
26
d) determinação da contribuição de cada alimento ao IG da refeição (IG do alimento pela
proporção de seu carboidrato glicêmico, em relação ao carboidrato glicêmico da refeição);
e) determinação do IG de cada refeição, pela soma dos valores obtidos no item anterior.
Para o cálculo do IG, foi realizado, obedecendo à seguinte equação: IG = área sob a
curva glicêmica do alimento teste dividida pela área sob a curva glicêmica da glicose X 100.
Para o cálculo da área da curva glicêmica, foi utilizada a soma dos incrementos da curva, como
segue: Área= (A + B + C + D) t + (D + E) T + E²T 2 2 2 (E+F) Quando: A, B, C, D, E e F
representam os incrementos sobre a curva glicêmica e T e t representam o tempo depois da
administração das dietas (WOLEVER et al., 1991).
Determinado o IG, foi caracterizada como baixo, médio ou alto (≤55; 56 a 69 e ≥70,
respectivamente), considerando IG moderado e alto como inadequado e baixo como adequado,
conforme proposto na literatura (AUGUSTIN et al., 2015).
A CG da refeição foi determinada por meio da multiplicação do carboidrato do
alimento, em gramas, pelo seu IG, dividido por 100 (Equação: CG = IG x teor CHO disponível
na porção). A classificação pode ser baixa, média ou alta (≤10; 11 a 19 e ≥20, respectivamente),
considerando CG moderada e alta como inadequada e baixa como adequada (AUGUSTIN et
al., 2015).
2.2.2.4 Determinação do efeito da dieta experimental sobre parâmetros antropométricos, bioquímicos e moleculares.
Para a determinação do efeito da dieta experimental nos parâmetros antropométricos,
bioquímicos e moleculares foram avaliados dois grupos de ratos Wistar machos (com 6
semanas):
Grupo dieta experimental (n = 5): os animais receberam a dieta experimental, caracterizada
acima, como grupo teste.
Grupo dieta padrão (n = 5): os animais receberam a dieta Labina®, como grupo controle.
O segundo experimento foi realizado por 17 semanas, que foi o tempo necessário para
induzir a obesidade em todos os animais tratados com a dieta experimental. No último dia do
experimento, os animais ficaram em jejum por 8 horas e o sangue foi coletado para a análise
dos parâmetros bioquímicos.
Os ratos foram anestesiados com xilazina a 2% e cetamina a 5% e as amostras de
sangue foram coletadas pela veia porta. Em seguida os animais foram sacrificados em uma
câmara de CO2. As gorduras dos tecidos gonadal e retroperitoneal foram isoladas e utilizadas
27
para a avaliação da expressão de mRNA de PPARγ. Os animais foram mantidos em condições
de padrão de luz (12/12 h claro / escuro) e temperatura (23 – 25 ° C), água e comida ad libitum.
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA-UnP)
sob nº 012/2015.
2.2.2.5 A avaliação zoométrica e diagnóstico do estado nutricional de obesidade
Os animais foram tratados com as dietas descritas acima, oferecidas durante 17 semanas
e semanalmente foi realizada a avaliação zoométrica. Sendo assim, foi possível calcular o
Índice de Lee (raiz cúbica do peso corporal(g)/Comprimento naso-anal x 1000). O diagnóstico
de obesidade baseado no Índice de Lee (semelhante ao Índice de Massa Corpórea – IMC -
utilizado para seres humanos), se apresenta quando, a partir dos cálculos, se obtêm valores
acima de 0.300, pois valores inferiores a esse, indicam eutrofia (NOVELLI et al., 2007), ou
seja, estado nutricional de normalidade.
Os animais também tiveram os seus Perímetros da Cintura (PC) aferidos no final do
experimento. Para mensurar o PC, foi realizada a pega do animal com luva e pano com objetivo
de contenção, de acordo com as recomendações (GUIDE FOR THE CARE AND USE OF
LABORATORY ANIMALS, 2011), de forma que os mesmos ficaram posicionados
verticalmente, sendo assim possível a determinação do PC, localizado imediatamente anterior
a pata traseira do animal, com auxílio de fita antropométrica (Vanosan®).
Todas as medidas foram conduzidas por pessoas treinadas, visando a atender aos
critérios de autenticidade científica, em conformidade com Novelli et al. (2007).
2.2.2.6 Parâmetros Bioquímicos
Ao final do segundo experimento, no último dia das 17 semanas, os animais foram
submetidos por 8 h – 12 h em jejum. Assim, o sangue foi coletado pela veia porta e o soro
utilizado para a determinação da glicemia de jejum, triglicerídeo (TG), Lipoproteínas de Alta
Densidade (HDL-c), Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL-c), colesterol total, Transaminase
Glutâmica Oxalacética (TGO), Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP) e Gama Glutamil
Transpeptidase (GGT), após a sua realização, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2.
O método empregado para as dosagens dos parâmetros bioquímicos foi o enzimático-
colorimétrico (Kit CELM®, São Paulo, Brasil).
28
2.2.2.7 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ em tecido adiposo
Após a coleta de sangue para dosagem dos parâmetros bioquímicos, no segundo
experimento in vivo, as gorduras da região retroperitoneal e gonadal foram retiradas por meio
de um corte longitudinal (com auxílio de tesoura, da base do abdômen até todo o segmento do
externo, mostrando toda a cavidade abdominal e torácica), para a análise da expressão relativa
de mRNA de PPAR-γ, sendo realizada conforme descrito a seguir.
Desse modo, o RNAm das gorduras foi extraído com o uso do reagente TRIzol®
(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), sendo utilizados 100 mg de tecido fresco
macerado em cadinhos com nitrogênio líquido. A quantificação dos RNAm foi realizada
utilizando o kit de ensaio de RNA (Invitrogen Life Technologies). Para avaliar a expressão de
RNAm de PPAR-γ no tecido adiposo, o cDNA foi preparado por transcrição reversa do RNA
total. O cDNA foi utilizado para a reação em cadeia da polimerase (PCR) contendo TaqMan
Universal PCR Master Mix para Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma
(PPAR-γ, Rn0044094), da Thermo Fisher Scientific (Wilmington, DE, USA). A expressão
relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCT, e os resultados são apresentados como
mudanças em comparação com os valores médios do grupo controle (grupo eutrófico),
normalizados para GAPDH, de acordo com Livak e Schmittgen (2001).
2.2.2.8 Análise Estatística
O tamanho da amostra foi calculado de acordo com o coeficiente de variação e a
diferença entre os tratamentos considerados significativos. Presumiu-se que existisse uma
diferença de resposta fisiologicamente significativa dos parâmetros avaliados quando o
tratamento (dieta experimental) exerceu efeito de 25% ou mais em relação ao grupo que não
recebeu a dieta. Assim, adotou-se o coeficiente de variação antecipado de 10%, com
probabilidade de erro inferior a 5% e potência de 90%.
Todos os dados foram testados quanto à normalidade usando o teste Shapiro-Wilk e
são apresentados como média (desvios padrão). Os ganhos acumulados no Índice de Lee foram
calculados, considerando as diferenças do Índice de Lee no final de cada semana até o dia 1 do
experimento. O teste two-way ANOVA foi usado para avaliar as diferenças acumuladas no
Índice de Lee e na evolução da circunferência abdominal entre os grupos de estudo durante as
17 semanas de experimento, uma vez que essas variáveis apresentaram distribuição normal
(teste de Shapiro-Wilk, p> 0,05). O teste de Mann-Whitney foi utilizado para comparar
29
parâmetros bioquímicos entre os grupos de estudo, uma vez que essas variáveis não
apresentaram distribuição normal (teste de Shapiro-Wilk, p <0,05). O teste T de Student foi
usado para comparar aumentos de vezes na expressão do mRNA de PPARγ, uma vez que o
teste de Shapiro-Wilk mostrou que os dados tinham distribuição normal (p> 0,05). Diferenças
significativas foram aceitas quando o valor de p foi menor que 0,05. Os dados foram analisados
utilizando o Graph Pad Prism, versão 5.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA).
2.2.3 Resultados
2.2.3.1 Composição Centesimal da Dieta Experimental
A Tabela 2 apresenta a composição centesimal da dieta experimental. Demostrando
que para a dieta experimental o componente majoritário foi o carboidrato (48%).
Tabela 2. Composição centesimal (g/100 g) da dieta experimental.
Dieta experimental média (sd) (%) Energia (Kcal) 315,26 (19,27) 100 Umidade (g/100 g) 4,54 (0,04) 5 Cinza (g/100 g) 9,22 (0,09) 9 Proteína (g/100 g) 20,72 (1,08) 21 Lipídio (g/100 g) 4,34 (0,17) 4 Carboidratos* (g/100 g) 48,33 (5,38) 48 Fibra Bruta (g/100 g) 12,85 (4,68) 13
Dieta Experimental: Mistura composta de ração Labina®, leite condensado e açúcar (1:1:0.21).* Calculado pela diferença (100 g da dieta - Soma total dos valores encontrados para umidade, lipídios, cinzas, proteínas e fibras).
30
2.2.3.2 Medição direta e cálculo do índice glicêmico e da carga glicêmica na dieta experimental com pellets
A Figura 1 mostra a curva glicêmica da dieta experimental, comparada com a curva
padrão de glicose. A dieta experimental possui alto índice glicêmico (77,6) e alta carga
glicêmica (38,8). (Tabela 3).
Figura 1. Curva glicêmica da dieta experimental e glicose. Dieta experimental: os animais receberam 5 mL de dieta experimental (0,1 g / mL de carboidratos), composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). Glicose: os animais receberam 5 mL de glicose (0,1 g / mL) como padrão. p = 0,4931, anova bidirecional.
Tabela 3. Média dos incrementos sob a curva glicêmica obtidos dos animais do grupo da dieta experimental e do grupo que recebeu a glicose.
Tempo (min) Dieta Experimental Glicose
0 – 30 21,15* 39,70*
30 – 60 41,85* 63,00*
60 – 90 36,45 34,50
90 – 120 23,40 21,15 Soma das áreas do gráfico (AUC) 122,85* 158,35*
Dieta experimental: os animais receberam 5 mL de dieta experimental (0,1 g / mL de carboidratos), composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). Glicose: os animais receberam 5 mL de glicose (0,1 g / mL) como padrão. A área sob a curva do gráfico, correspondente a cada período de medição de glicose no sangue, 0-30 min, 30-60 min, 60-90 min, 90-120 min, respectivamente. AUC = soma de todas as áreas do gráfico que corresponde ao valor do índice glicêmico. Two-way ANOVA, p <0,0001.
2.2.3.3 Avaliação do estado nutricional
A avaliação do estado nutricional foi realizada usando o índice de Lee nas 17 semanas
de experimento. As figuras 2A e 2B mostram a evolução do índice de Lee para animais no
Tempo (minutos)
31
grupo de dieta padrão e experimental. O índice de Lee começou a aumentar (> 0,300) em
animais que receberam a dieta experimental a partir da 6ª semana do experimento. A partir
dessa semana, o número de animais com obesidade aumentou até 100% apresentarem obesidade
na última semana de experimento. Por outro lado, os animais que receberam a dieta padrão
mantiveram o Índice de Lee abaixo de 0,300 durante as 17 semanas. Além disso, baseado nos
cálculos das diferenças cumulativas nos ganhos do índice de Lee a cada semana do
experimento, observou-se um ganho significativo nos animais alimentados com a dieta
experimental quando comparados aos que receberam a dieta padrão, indicando um aumento
crescente no grupo que recebeu a dieta experimental (Figura 2C).
O PC foi constante em ratos que receberam dieta padrão. Isso não foi observado no
grupo da dieta experimental, que mostrou um aumento no PC durante o experimento, de 15,4
cm para 17 cm na última semana (Figura 2D).
Figura 2. Índice de Lee em ratos Wistar recebendo (A) dieta padrão (B) dieta experimental. (C) Diferenças cumulativas no índice de Lee e (D) Perímetros da Cintura (PC) de animais recebendo dieta padrão e dieta experimental durante o experimento. Índice de Lee = raiz cúbica do peso corporal (g) / comprimento naso-anal x 1000. As diferenças cumulativas consideram os valores do dia 1 do experimento e os valores no final de cada semana. Valores do índice Lee acima de 0,300 indicam obesidade. Dieta padrão: Labina®. *Two-way ANOVA P <0,0001 (A, B e C), P <0,001 (D). Dieta padrão: Labina®. Dieta experimental: Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21).
2.2.3.4 Avaliação bioquímica
32
A tabela 4 mostra os parâmetros bioquímicos dos animais nos grupos estudados. Os
animais do grupo da dieta experimental apresentaram valores maiores de glicemia de jejum,
VLDL-c e TG quando comparados aos que receberam a dieta padrão.
Tabela 4. Parâmetros bioquímicos dos animais da dieta experimental e padrão após as 17 semanas.
Parâmetros Dieta experimental média (sd)
Dieta padrão média (sd)
Teste Mann-Whitney, p
valor
Glicose em jejum (mg/dL) 185,80 (112,58) 88,40 (17,19) 0,020
Colesterol total (mg/dL) 104,40 (30,94) 112,40 (53,95) 0,168
HDL-C (mg/dL) 24,60 (4,87) 25,20 (6,26) 0,186
LDL-C (mg/dL) 52,96 (30,33) 75,08 (52,48) 0,827
VLDL-C (mg/dL) 31,80 (3,76) 12,12 (2,46) 0,011
TG (mg/dL) 159,00 (18,78) 60,60 (12,28) 0,011
TGO (mg/dL) 19,20 (5,31) 17,00 (8,68) 0,321
TGP (mg/dL) 40,80 (21,28) 27,60 (16,23) 0,430
GGT (mg/dL) 18,40 (4,88) 18,80 (5,45) 0,586
Grupos estudados com n = 5 ratos. HDL-C: lipoproteína de alta densidade. LDL-C: lipoproteína de baixa densidade. VLDL-C: lipoproteína de densidade muito baixa. TG: triglicerídeos. TGO: transaminase oxaloacética. TGP: transaminase glutâmica pirúvica. GGT: gama-glutamil transpeptidase. Dieta padrão: Labina®. Dieta experimental: Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21).
2.2.2.5 Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo
A expressão relativa de mRNA de PPARγ, em tecido adiposo foi avaliada em tecido
gonadal e retroperitoneal, representando tecidos adiposos viscerais e subcutâneos,
respectivamente (Figura 3A e B). Os ratos do grupo da dieta experimental apresentaram maior
expressão relativa de mRNA do PPARγ em ambos nos tecidos quando comparados aos animais
do grupo da dieta padrão.
33
Figura 3. Expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo em ratos Wistar recebendo dieta padrão ou experimental em (A) tecido adiposo retroperitoneal e (B) tecido adiposo gonadal. Teste T, p <0,05. Todos os grupos representam experimentos com n = 05 animais. Dieta padrão: Labina®. Dieta experimental: Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). GAPDH: Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato.
2.2.4 Discussão
A maioria das dietas criadas para induzir a obesidade em modelos animais é rica em
alimentos palatáveis comuns às dietas humanas e está associada à indução persistente de
hiperfagia e consequente consumo excessivo de energia. Portanto, essas dietas têm sido,
preferencialmente, utilizadas em pesquisas relacionadas à obesidade e aos distúrbios
metabólicos (ROSSINI; SILVA; MORAES, 2012). Para isso, ratos Wistar têm sido utilizados
para induzir desequilíbrios fisiológicos e metabólicos pela dieta e são considerados eficazes no
estudo da obesidade e distúrbios relacionados à obesidade, mas apresentam variações
individuais e diferentes respostas às dietas (CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON,
2017).
Assim, o estudo da composição centesimal dessas dietas é relevante para permitir
comparações entre seus efeitos e diferentes constituintes. Neste estudo, foram produzidos e
analisados a composição centesimal, o índice glicêmico e a carga glicêmica de uma dieta
experimental, testando seu efeito na obesidade e nos distúrbios metabólicos relacionados à
obesidade.
A dieta experimental apresentou alto teor de carboidratos (62%) quando comparada à
dieta padrão, nutricionalmente equilibrada que obedeceu às recomendações da AINN-93G, com
50% de carboidratos (REEVES, 1997). Um grande conteúdo dos carboidratos da dieta
experimental era simples (49%) e apenas 13% eram complexos (fibra), refletindo os produtos
utilizados para a sua formulação. É importante ressaltar que poucos estudos com análise de
fibras em dietas para induzir a obesidade foram realizados, embora esse seja um nutriente
Teste T, p <0,05. Teste T, p <0,05.
34
importante para determinar a resposta glicêmica (SHUKLA et al., 2015).
Além da ração comercial, o açúcar e leite condensado, ambos ricos em sacarose, foram
utilizados como ingredientes na dieta experimental. Para a preparação de leite condensado, um
alimento ultra-processado, no Brasil, 40% ou mais de açúcar são adicionados ao leite,
dependendo da quantidade de extrato de leite seco utilizado (ORDÓÑEZ et al., 2005). Isso
indica alto teor de carboidratos simples na dieta experimental, na qual carboidratos complexos
vieram apenas da dieta comercial padrão.
Esta composição é consistente com a observação de um alto índice glicêmico e uma
alta carga glicêmica na dieta experimental. Sendo assim, neste estudo foi oferecida uma dieta
de alto índice glicêmico e de alta carga glicêmica (HGLI) por 17 semanas a ratos Wistar. Ao
final do experimento, todos os animais que receberam essa dieta HGLI apresentaram obesidade
e um aumento significativo no PC, quando comparados aos animais do grupo da dieta padrão.
Esse efeito é possível devido ao alto consumo de energia, justamente relacionado ao excesso
de sacarose na dieta HGLI, o qual está diretamente associado ao ganho de peso e aumento no
PC (CAMPBELL; SENIOR; BELL-ANDERSON, 2017).
No estudo de Pinto Junior e Seraphim (2012), em seus estudos, descobriram que a
administração de uma dieta de cafeteria por um período de 14 semanas alterou o índice de Lee
a partir da segunda semana de tratamento. Resultados semelhantes também foram observados
nos estudos de Novelli et al. (2007), nos quais o PC foi significativamente maior em animais
que receberam dietas de cafeteria, reconhecidas como dietas nutricionalmente inadequadas,
como a HGLI produzida e analisada neste estudo.
Entretanto, em nenhum desses estudos, o índice glicêmico, a carga glicêmica ou
mesmo a composição centesimal foram avaliados. Isso não permitiu a identificação clara de
quais nutrientes ou características das dietas experimentais utilizadas estavam influenciando
principalmente as alterações encontradas. Quando traduzido para a prática clínica, esse
conhecimento seria importante, uma vez que orientações e estratégias nutricionais nos
tratamentos da obesidade precisam se concentrar nos componentes da dieta, o que pode
impactar na qualidade da dieta e no sucesso do tratamento (WHO, 2016).
Considerando que na avaliação do estado nutricional e dos distúrbios metabólicos, as
alterações bioquímicas, condicionadas a hábitos de vida pouco saudáveis, podem preceder
modificações antropométricas; neste estudo, foi avaliado também, o efeito da dieta
experimental em marcadores plasmáticos e moleculares relacionados à obesidade.
Sabe-se que o principal determinante da glicose pós-prandial é a quantidade total de
carboidratos ingerida, embora a qualidade dos carboidratos também influencie a glicemia
35
(SHUKLA et al., 2015). Devido ao fato de o corpo não digerir e absorver todos os carboidratos
na mesma velocidade, o IG foi desenvolvido para avaliar o efeito dos carboidratos na glicemia.
Assim, o IG é um indicador qualitativo da capacidade de um carboidrato ingerido para aumentar
os níveis de glicose no sangue. Esse método é usado para classificar os diferentes tipos de
carboidratos da dieta por sua capacidade de aumentar a glicose no sangue quando comparado a
um alimento de referência (MONRO; SHAW, 2008; AUGUSTIN et al., 2015).
Entretanto, na maioria dos estudos com dietas experimentais, o IG de diferentes
alimentos é determinado levando-se em consideração, apenas, o tipo de amido, ou seja, a
quantidade de amilose e amilopectina que constitui o amido de um determinado alimento
(ISKEN et al., 2009; KLECKNER; WONG; CORKEY, 2015). Por outro lado, sabe-se que não
apenas o tipo de amido, mas também vários fatores podem afetar o IG, incluindo viscosidade
da fibra, matriz alimentar, cozimento, processamento e composição dos macronutrientes
(SHUKLA et al., 2015).
Já a carga glicêmica, de acordo com Augustin et al. (2015), é definida como resultado
do IG e a quantidade de carboidrato presente na porção de alimento consumida, em comparação
com o alimento padrão. Portanto, o objetivo da carga glicêmica é avaliar a quantidade e a
qualidade dos carboidratos, considerando o efeito do consumo de uma porção usual de um
alimento na glicemia.
A quantidade e a qualidade dos carboidratos são consideradas importantes há muitos
anos no contexto da obesidade. Estudos epidemiológicos recentes sugerem que, tanto a
quantidade quanto a qualidade dos carboidratos, possuem um papel preponderante como
preditores de saúde e doença, associados, principalmente, à dislipidemia, doenças
cardiovasculares e diabetes (ALESSA et al., 2015).
A maioria dos estudos com as chamadas dietas de alto índice glicêmico, em modelos
animais, não analisa ou apresenta o índice glicêmico e a carga glicêmica de suas dietas. Esses
efeitos são comumente avaliados apenas considerando a contribuição quantitativa dos
diferentes carboidratos nas dietas, ou considerando o aumento da glicemia em estudos in vivo
sem considerar a quantidade ingerida de carboidratos (CAMPBELL; SENIOR; BELL-
ANDERSON, 2017). Isso ainda é comum, embora a importância dessas informações seja
consolidada e consensual no que se refere ao consumo de carboidratos na dieta (AUGUSTIN
et al., 2015). Neste estudo, a dieta HGLI foi analisada quanto ao seu índice glicêmico e carga
glicêmica, utilizando metodologias estabelecidas para a avaliação de dietas humanas. Para
nosso conhecimento, esse foi o primeiro modelo experimental de DIO que realizou a medida
direta da carga glicêmica da dieta utilizada.
36
O índice glicêmico de uma dieta é estimado usando os valores individuais dos
alimentos que a compõem por meio de fórmulas. No entanto, o uso de valores alimentares de
índice glicêmico para estimar o valor de uma refeição ou dieta pode ser inadequado, uma vez
que fatores como variedade de alimentos, maturação, processamento e cozimento são
conhecidos por modificar os valores de IG. No estudo de Dodd et al. (2011), a estimativa do
índice glicêmico da refeição usando valores alimentares individuais foi superestimada em 22 a
50% em comparação à medida direta da refeição.
Embora a relação entre dietas com alto índice glicêmico e obesidade e suas
complicações associadas sejam evidentes em vários estudos com seres humanos (WOLEVER
et al., 1991; MANN et al., 2007; CRINO et al., 2015), a necessidade de modelos experimentais
de DIO não se esgota. Assim, este estudo se destaca por determinar o índice glicêmico, além
de dados inéditos de carga glicêmica em dietas experimentais e é apresentado como uma
importante contribuição para estudos em modelos animais.
Há uma necessidade constante de estudos de DIO mais completos e complexos,
envolvendo descobertas, do nível clínico ao molecular, na tentativa de esclarecer e fornecer
subsídios que expliquem o efeito causa dos hábitos alimentares. Nesse sentido, é importante
estudar e compreender diferentes dietas e seus efeitos sobre a obesidade e suas complicações,
dada a crescente prevalência da obesidade em todo o mundo e o papel determinante das dietas
(GBD, 2017).
As limitações éticas da indução da obesidade em humanos devem ser adotadas e,
portanto, quanto mais robusto e completo o modelo, especialmente as informações sobre dieta,
melhor será estabelecer correlações e relações com a obesidade. Com base em estudos que
avaliam os efeitos da variação do conteúdo de carboidratos das dietas no perfil glicêmico, é
possível afirmar que o aumento da ingestão de carboidratos aumenta a variabilidade glicêmica
e, consequentemente, as complicações macro e microvasculares observadas em doenças
crônicas como o diabetes. Essas complicações incluem retinopatia, neuropatia, nefropatia,
doenças cardiovasculares, aumento do estresse oxidativo, disfunção endotelial e produção de
radicais livres (TAY; THOMPSON; BRINKWORTH, 2015).
No presente estudo, foi verificado que a dieta experimental HGLI não influenciou o
colesterol total, HDL-c, LDL-c, TGO, TGP ou GGT. No entanto, glicemia de jejum, TG e
VLDL-c aumentaram significativamente. Esse efeito está de acordo com a composição
centesimal da dieta experimental HGLI, que era, predominantemente, composta por
carboidratos simples, principalmente sacarose. Sabe-se que a hiperinsulinemia, resposta
comum à ingestão de uma dieta simples e rica em carboidratos, pode favorecer a deposição
37
lipídica nos tecidos (GRANNER; PILKIS, 1990), justificando as altas concentrações de TG,
apresentados pelos animais submetidos à dieta experimental HGLI. Além disso, segundo
Paschos e Paletas (2009), com o aumento do TG, a sensibilidade à insulina é reduzida,
resultando na redução da absorção de glicose pelos tecidos sensíveis à insulina.
Consequentemente, ocorre o processo de lipólise, gerando a formação de ácidos graxos livres
e glicerol, que entram no fígado e tecido adiposo para formar mais TG, levando ao aumento do
VLDL-c; isso justifica nossos dados para o aumento do VLDL-c.
Bocarsly et al. (2010), em seu estudo com xarope de milho rico em frutose, utilizado
em ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas, observaram que ocorreu o aumento do peso
corporal e dos TG. Aeberli et al. (2013), em estudo com humanos, avaliaram o efeito de
quantidades moderadas de frutose e sacarose e concluíram que ambos, quando comparados à
glicose, comprometiam a sensibilidade à insulina hepática e influenciavam o perfil lipídico.
Esses achados corroboram os resultados deste estudo. Foi constatado o aumento da expressão
relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo gonadal e retroperitoneal de ratos Wistar
alimentados com a dieta experimental HGLI. Esse foi um achado interessante, uma vez que
essas localidades refletem tecido adiposo subcutâneo e visceral, respectivamente, indicando
uma indução consistente de desordem metabólica.
Sabe-se que o PPARγ regula a expressão de genes relacionados ao metabolismo de
carboidratos e lipídios, também responsáveis pela captação de glicose mediada por insulina nos
tecidos periféricos e pela diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos (TONTONOZ; HU;
SPIEGELMAN, 1994; SCHOONJANS; STAELS; AUWERX, 1996; REN et al., 2002). Dietas
hiperglicêmicas, como a dieta experimental usada neste ensaio, geralmente causam um aumento
no tecido adiposo condicionado por um aumento na expressão do mRNA de PPARγ, mais
especificamente PPARγ2, o que foi observado no presente estudo.
Assim, a família PPAR tem sido estudada como alvos terapêuticos em distúrbios
lipídicos e de carboidratos, uma vez que esses genes estão implicados em distúrbios metabólicos
observados em diabetes, dislipidemia, aterosclerose, obesidade, síndrome metabólica e doenças
cardiovasculares. Os PPARs desempenham, também, um papel importante na sensibilização
periférica à insulina, reduzindo a expressão de resistina e TNF-α e aumentando a expressão de
atividade da adiponectina e lipoproteína lipase (LPL) (TONTONOZ; HU; SPIEGELMAN,
1994; SCHOONJANS; STAELS; AUWERX, 1996).
Vários estudos foram realizados para entender os mecanismos associados à DIO
(DEKKER et al., 2010; ROSSINI; SILVA; MORAES, 2012), isso se justifica pelo número
crescente de obesidade mundial. Neste estudo, o conhecimento da carga glicêmica medida
38
diretamente em um modelo experimental de DIO, como é feito em dietas humanas, é uma
informação nova e pode enriquecer as discussões sobre dietas e suas implicações clínicas.
Outros estudos em animais poderiam medir diretamente o índice glicêmico e a carga glicêmica
conforme apresentado neste estudo, considerando que esses são parâmetros importantes para a
avaliação da dieta. Quando a DIO é o principal resultado avaliado nos estudos, uma melhor
caracterização das dietas utilizadas pode ajudar a esclarecer as relações de causa e efeito nos
modelos.
2.2.5 Conclusão
O índice glicêmico medido e calculado diretamente e a carga glicêmica destacaram
informações essenciais para a caracterização da dieta experimental estudada. Os dados
demonstraram que a dieta experimental induziu alto índice glicêmico e alta carga glicêmica.
Sugere-se que essa metodologia direta possa ser utilizada em outros estudos com o objetivo de
avaliar o efeito metabólico de dietas ricas em carboidratos. Ainda, a dieta induz a obesidade,
em ratos Wistar, distúrbios metabólicos (hiperglicemia e dislipidemia) e o aumento da
expressão relativa de mRNA de PPARγ no tecido adiposo. O conhecimento do índice e da carga
glicêmica proporcionou uma melhor compreensão das relações de causa-efeito no modelo.
2.2 CAPÍTULO 2
Os resultados foram publicados no periódico Nutrients, conforme segue a referência: Carvalho, F.M.C.; Lima, V.C.O.; Costa, I.S.; Luz, A.B.S.; Ladd, F.V.L.; Serquiz, A.C.; Bortolin, R.H.; Silbiger, V.N.; Maciel, B.L.L.; Santos, E.A.; Morais, A.H.A. Anti-TNF-α Agent Tamarind Kunitz Trypsin Inhibitor Improves Lipid Profile of Wistar Rats Presenting Dyslipidemia and Diet-induced Obesity Regardless of PPAR-γ Induction. Nutrients. 2019 Feb 27;11(3).
Inibidor de tripsina do tipo Kunitz purificado de Tamarindo atua como agente anti-TNF-α, melhora o perfil lipídico de ratos Wistar com dislipidemia e obesidade induzida por dieta de alto índice glicêmico, independentemente de PPAR-γ
RESUMO
A crescente prevalência de obesidade e, consequentemente, inflamação crônica e suas complicações têm aumentado a busca por novos métodos de tratamento. Foi avaliado o efeito do inibidor da tripsina purificado de semenetes tamarindo (ITTp) nas alterações metabólicas em ratos Wistar com obesidade e dislipidemia. Três grupos de animais com obesidade e dislipidemia foram formados, consumindo dieta com alto índice glicêmico e alta carga glicêmica (HGLI), por 10 dias: Obeso / dieta HGLI; Obeso / dieta padrão; Obeso / dieta HGLI + TTIp (730 µg / kg); e um grupo eutrófico de animais foi alimentado com dieta padrão. Os ratos Wistar foram avaliados, diariamente, quanto à ingestão de alimentos e ganho de peso. No
39
11º dia, os animais foram anestesiados e sacrificados para coleta de sangue e tecido adiposo visceral. Os animais tratados com ITTp apresentaram ingestão alimentar, TG (76,20 ± 18,73 mg / dL) e VLDL-c (15,24 ± 3,75 mg / dL) significativamente menor do que o grupo não tratado (p = 0,0065). As concentrações plasmáticas e a expressão relativa de mRNA de TNF-α no tecido adiposo visceral também diminuíram em animais com obesidade e dislipidemia tratados com ITTp (p <0,05 e p = 0,025, respectivamente) com imunocoloração negativa. O ITTp apresentou atividade anti-TNF-α, independentemente de PPAR-γ e os ratos Wistar com obesidade e dislipidemia apresentaram perfil lipídico melhorado.
Palavras-chave: inflamação; Tamarindus indica L; triglicerídeos; VLDL.
ABSTRACT
The increasing prevalence of obesity and, consequently, chronic inflammation and its complications has increased the search for new treatment methods. The effect of the purified tamarind seed trypsin inhibitor (TTIp) on metabolic alterations in Wistar rats with obesity and dyslipidemia was evaluated. Three groups of animals with obesity and dyslipidemia were formed, consuming a high glycemic index and glycemic load (HGLI) diet, for 10 days: Obese/HGLI diet; Obese/standard diet; Obese/HGLI diet + TTIp (730 µg/kg); and one eutrophic group of animals was fed a standard diet. Rats were evaluated daily for food intake and weight gain. On the 11th day, animals were anesthetized and sacrificed for blood and visceral adipose tissue collection. TTIp treated animals presented significantly lower food intake than the untreated group (p = 0.0065), TG (76.20 ± 18.73 mg/dL) and VLDL-C (15.24 ± 3.75 mg/dL). Plasma concentrations and TNF-α mRNA expression in visceral adipose tissue also decreased in obese animals treated with TTIp (p < 0.05 and p = 0.025, respectively) with a negative immunostaining. We conclude that TTIp presented anti-TNF-α activity and an improved lipid profile of Wistar rats with dyslipidemia and obesity induced by a high glycemic index and load diet regardless of PPAR-γ induction.
Keywords: inflammation; Tamarindus indica L.; triglycerides; VLDL.
2.2.1. Introdução
Há indicações de que dietas hipolipídicas e hiperglicêmicas estimulam,
consideravelmente, a lipogênese (UYEDA; YAMASHITA; KAWAGUCHI, 2002),
aumentando a expressão de enzimas lipogênicas (DELZENNE et al., 2001) por meio de fatores
de transcrição, como proteínas de ligação reguladora de esteróis (SREBP) (STOECKMAN;
TOWLE, 2002) e proteína de ligação ativada como elemento responsivo a carboidratos
(ChREBP), que é ativado em resposta à alta glicemia bem como a estimulação do receptor
ativado por proliferador de peroxissoma gama (PPAR-γ) (KERSTEN, 2001).
De acordo com Virdis et al. (2018), a dieta hiperglicêmica está relacionada aos fatores
de risco para dislipidemia e obesidade, da mesma forma que as dietas ricas em lipídios.
Possivelmente, essa relação é atribuída ao maior estímulo à lipogênese hepática, principalmente
na síntese de triglicerídeos e, consequentemente, às lipoproteínas de muito baixa densidade
(VLDL-c), por meio de um maior suprimento de glicose no plasma.
40
A obesidade é definida como deposição concentrada ou generalizada de ácidos graxos,
derivada de desequilíbrio nutricional associado ou não a distúrbios metabólicos genéticos ou
endócrinos (WHO, 2016). Ela é um risco importante para diabetes mellitus tipo 2, hipertensão
arterial, doença arterial coronariana, dislipidemias e certos tipos de câncer e distúrbios
circulatórios (GUIMARÃES et al., 2016; GBD, 2017). A obesidade é uma doença crônica
complexa na qual o tecido adiposo é infiltrado por macrófagos ativados que libera quantidades
excessivas de citocinas inflamatórias, como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), inibidor do
ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), interleucina-6 (IL-6), proteína 4 de ligação ao retinol,
proteína quimioatraente 1 de macrófagos (MCP-1) e proteínas de fase aguda (TILG;
MOSCHEN, 2006). Esses fatores exercem ações parácrinas, que perpetuam a inflamação local
no tecido adiposo, e endócrinas, que induz resistência à insulina e disfunções vasculares e
cardíacas (PERMANA et al., 2009).
Entre os fatores inflamatórios, o TNF-α é produzido, não apenas pelas células do
sistema imunológico, mas também pelas células do tecido adiposo e possivelmente por outros
tecidos diferenciados (DE SOUZA et al., 2005). Nas últimas décadas, um maior interesse no
TNF-α foi estabelecido devido à sua implicação no desenvolvimento da resistência à insulina,
seu papel potencial como regulador da massa do tecido adiposo e seu aumento nas
concentrações no hipotálamo de animais submetidos às dietas hiperlipidêmicas e
hiperglicêmicas (SETHI; HOTAMISLIGIL, 1990; LYON; LAW; HSUEH, 2003; HARWOOD
JR, 2012).
Ainda assim, para o tratamento da obesidade, sendo esse um processo inflamatório,
existem vários medicamentos que são utilizados, dentre eles tem-se os fibratos e
tiazolidinedionas (TZDs) que agem ativando os receptores nucleares, tais como o PPARγ. As
TZDs reduzem a expressão da leptina e do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) (BROWN;
PLUTZKY, 2007; SHAH; MEHTA; REILLY, 2008), diminuindo assim, o processo
inflamatório ocasionado pela patologia. Porém, os fibratos e TZDs ocasionam alguns efeitos
adversos e indesejáveis (hepatotoxicidade) (BROWN; PLUTZKY, 2007; SHAH; MEHTA;
REILLY, 2008).
Além disso, existem medicamentos usados para a redução de doenças inflamatórias,
como artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase e espondilite anquilosante. Entre os agentes
biológicos aprovados para o tratamento estão aqueles que atuam como antagonistas do TNF-α,
chamados anti-TNF-α (MELO; MAGINA, 2018; LIM et al., 2018). Atualmente, estão
disponíveis cinco agentes que bloqueiam a ação do TNF-α e são aprovados pelo FDA:
etanercept (Enbrel®, (Pfizer Ireland Pharmaceuticals, Dublin, Irlanda)), infliximab
41
(Remicade®, (Cilag AG., Schaffhausen, Suíça)), adalimumabe (Humira®, (AbbVie
Farmacêutica LTDA, Santo Amaro, São Paulo)), certolizumabe-pegol (Cimzia®, (Vetter
Pharma-Fertigung GmbH & Co. KG, Langenargen, Alemanha)) e golimumabe (Simponi®,
(Baxter Pharmaceutical Solutions LLC, Indiana, Estados Unidos)) (MITOMA et al., 2018).
No entanto, todos esses medicamentos causam alterações no perfil lipídico, como
aumento de triglicerídeos, bem como o aparecimento de diabetes tipo 2 e aumento do risco de
aterosclerose (CACCIAPAGLIA et al., 2011). Dessa forma, a busca por substâncias bioativas
de plantas tem sido intensificada, a fim de formular novos biofarmacêuticos.
Além disso, moléculas puras com ações inibitórias foram sintetizadas e utilizadas em
vários tratamentos (LI et al., 2005; YANOVSKI; YANOVSKI, 2002). Como exemplo, o
orlistat reduz a digestão e / ou absorção de nutrientes (SHAH; MEHTA; REILLY, 2008).
Inibidores específicos da recaptação de serotonina (fluoxetina), bem como a sibutramina, têm
sido utilizados no tratamento da obesidade (YANOVSKI; YANOVSKI, 2002). Medicamentos
à base de plantas, como o Potein® (Dermo manipulações, São José dos Pinhais, Paraná),
composto por inibidor isolado de tripsina, têm sido utilizados para fins de perda de peso (CHEN
et al., 2012).
Nesse contexto, o isolamento, purificação, caracterização e biodisponibilidade de
inibidores de tripsina em sementes, entre eles de tamarindo, foram demonstrados em alguns
estudos (ARAÚJO et al., 2005; FOOK et al., 2005; LIMA et al., 2019). Em um estudo do grupo
NutriSBioativoS, um inibidor de tripsina parcialmente purificado a partir de sementes de
tamarindo (ITT) (RIBEIRO et al., 2015) apresentou um efeito sacietogênico, reduzindo o ganho
de peso em ratos eutróficos associado ao aumento plasmático de colecistoquinina (CCK). No
estudo de Carvalho et al. (2016), além da redução do consumo de alimentos em animais com
obesidade e SM, foi observado o efeito na redução do TNF-α e no perfil lipídico com o uso de
ITT. Além disso, o ITT não apresentou hepatotoxicidade nos dois últimos estudos citados acima
(RIBEIRO et al., 2015; CARVALHO et al., 2016).
O ITT purificado (ITTp) apresentou uma massa aproximada de 18 kDa, reduzindo a
leptina em ratos Wistar com obesidade (MEDEIROS et al., 2018). É relevante investigar a ação
sobre os parâmetros de saciedade e bioquímicos, bem como o efeito nos marcadores
moleculares alterados por dietas hiperglicêmicas desequilibradas. Isso permitirá a compreensão
de seus mecanismos de ação, estimulando estudos de novos fármacos potenciais que possam
ser efetivos na prevenção e / ou controle de doenças que envolvem alterações metabólicas.
42
2.2.2 Materiais e métodos
2.2.2.1 Tipo de Estudo e Material Biológico
Este é um estudo experimental para investigar o efeito do tratamento com ITTp nos
parâmetros bioquímicos e moleculares. O experimento ocorreu com quatro grupos de animais,
de acordo com a metodologia descrita abaixo.
2.2.2.2 Experimento In Vitro
A metodologia utilizada para obter o ITT puro (ITTp) com atividade anti-tríptica foi
previamente estabelecida e adaptada por Medeiros et al. (2018). Para obter a farinha e o extrato
de proteína bruta, as sementes de tamarindo foram moídas em farinha com granulação fina
(malha 40). A extração foi então realizada adicionando tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 à
farinha de tamarindo. Essa solução foi mantida sob agitação constante à temperatura ambiente
e, em seguida, o material foi centrifugado e filtrado para obter o extrato bruto (EB).
Posteriormente, foi realizado um fracionamento de proteínas com sulfato de amônio em três
faixas de saturação.
A fração proteica que exibiu a maior atividade antitripsina foi submetida a uma
cromatografia de afinidade com tripsina-Sepharose (10 cm x 1,5 cm) em tampão Tris-HCl 50
mM, pH 7,5 para isolamento do ITT. Em seguida, o material adsorvido em coluna foi eluído
com HCl 5 mM e coletado em alíquotas de 3 mL a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min.
As proteínas adsorvidas na coluna de afinidade foram dialisadas contra tampão Tris-
HCl 50 mM, pH 7,5, liofilizadas e denominadas ITT. O ITT foi analisado e purificado por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa (Hilicon AB, Umea, Suécia),
em cromatógrafo líquido LC-10A da Shimadzu constituído por um sistema binário de
bombeamento de solvente (LC-10ADvp) (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão), detector
espectrofotométrico UV-Vis (SPD- 10A VP) (Mettler-Toledo Ind. E Com. Ltda., Barueri, São
Paulo), injetor Rheodyne e estação de trabalho com aplicativo de controle do sistema (SCL–
10Avp system controller). A coluna utilizada foi a coluna analítica Vydac C18 218TP54
(Hichrom, Berkshire, Inglaterra), 5µm, 4,6 × 250mm, 300Å; o solvente A era água de qualidade
analítica + 0,1% de TFA e o solvente B era ACN / TFA a 0,1%, com o gradiente ideal para a
eluição da proteína de interesse. A eluição do conteúdo de proteína foi monitorada por detecção
UV nos comprimentos de onda 216 nm e 280 nm. As coletas foram realizadas manualmente e
o pico protéico de interesse, denominado ITTp.
43
O inibidor de tripsina purificado a partir de sementes de tamarindo foi denominado
ITTp. Todas as etapas de purificação foram monitoradas por um ensaio de inibição de tripsina
usando 1,25 mM de BApNA (N-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida) como substrato de acordo
com (KAKADE; SIMONS; LIENER., 1969) Para a quantificação de proteína, o método de
Bradford (1976) foi utilizado.
O material foi congelado e armazenado a -20 ° C. A purificação e a estimativa do peso
molecular das várias etapas de purificação foram avaliadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida desnaturante e descontínua (SDS-PAGE) 12,5% (LAEMMLI, 1970). Após
eletroforese, as proteínas foram coradas com prata (OAKLEY; KIRSCH; MORRIS, 1980).
2.2.2.3 Experimento In Vivo
Para avaliar o efeito dos tratamentos (ITTp e dieta padrão), os experimentos foram
realizados com quatro grupos de animais (ratos Wistar, n = 5, macho, adulto, com 6 semanas).
Esses grupos foram formados por animais alimentados com dieta HGLI (LUZ et al., 2018) e
com diagnóstico nutricional de obesidade pelo Índice Lee ≥300 (BERNARDIS; PATTERSON,
1968).
Inicialmente, todos os quinze animais foram submetidos a cinco dias de adaptação para
estabelecer as condições do experimento e o padrão do consumo diário de alimentos. Durante
o período de adaptação, todos os animais receberam água por gavagem e todos os
procedimentos que ocorreram durante os dez dias de experimentos foram efetivados e repetidos
diariamente.
O ITTp foi administrado na concentração de 730 µg / kg por gavagem / dia. Essa
concentração foi definida como resultado do IC50 do ITTp (MEDEIROS et al., 2018) seguindo
as recomendações de Carvalho et al. (2016).
Todos os animais, com diagnóstico de obesidade e outro grupo eutrófico alimentado
com dieta padrão, foram tratados por dez dias, conforme descrito abaixo:
Eutrófico / Dieta padrão (n = 5): recebeu a dieta Labina® (Presence, Paulínia, São Paulo) + 1
mL de água por gavagem. Esse foi o grupo controle eutrófico, que não recebeu nenhum
tratamento;
Obeso / Dieta HGLI (n = 5): recebeu a dieta experimental HGLI + 1 mL de água por gavagem.
Esse foi considerado o grupo obeso controle que não recebeu tratamento;
Obeso / Dieta padrão (n = 5): recebeu a dieta Labina® + 1 mL de água por gavagem. Esse foi
considerado o grupo obeso que recebeu tratamento convencional;
44
Obeso / Dieta HGLI + ITTp (n = 5): recebeu a dieta experimental HGLI + 1 mL de ITTp (730
µg / kg) por gavagem, considerado o grupo no tratamento teste.
Os animais foram avaliados, diariamente, quanto ao consumo diário de alimentos e
suas medidas zoomométricas (peso, comprimento da cauda, comprimento naso-anal e índice de
Lee). No 11º dia do experimento, os ratos foram anestesiados e sacrificados para coleta de
sangue e gordura visceral e análise dos parâmetros bioquímicos e moleculares.
2.2.2.4 Animais
Ratos Wistar machos adultos foram obtidos no laboratório da Universidade Potiguar
(UnP) e distribuídos aleatoriamente e individualmente em gaiolas de polipropileno. Quatro
grupos de cinco animais foram formados. Os animais foram mantidos em condições de padrão
de luz (12/12 h claro / escuro) e temperatura (23–25 ° C), água e comida ad libitum. Todos os
experimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de
Laboratório (GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY ANIMALS, 2011) e o
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA-UnP) sob protocolo de
aprovação nº 012/2015.
2.2.2.5 Dietas
As dietas experimentais oferecidas aos ratos durante o experimento in vivo foram a
Labina®, uma dieta padrão e comercialmente disponível, e a dieta HGLI. A dieta HGLI contém
48% de carboidratos e um índice glicêmico de 77,6 e uma carga glicêmica de 38,8
(CARVALHO et al., 2019; LUZ et al., 2018) (Tabela 5).
Tabela 5. Composição centesimal (g/100 g) das dietas experimental e padrão. Dietas Experimental Padrão Labina’s® Label
Kcal (Calorias) 315,26 ± 19,27 (100%) 265,45 ± 7,99 (100%) - Umidade 4,54 ± 0,03 (5%) 7,47 ± 0,30 (7%) Maximum: 13,0%
Cinza 9,22 ± 0,09 (9%) 9,84 ± 0,04 (10%) - Proteina 20,72 ± 1,08 (21%) 28,59 ± 0,25 (29%) Minimum: 23,0% Lipideo 4,34 ± 0,17 (4%) 3,74 ± 0,06 (4%) Minimum: 2,5%
Carboidratos* 48,33 ± 5,38 (48%) 29,35 ± 2,08 (29%) - Fibra Bruta 12,85 ± 4,68 (13%) 21,00 ± 1,68 (21%) Maximum: 9,0%
Dieta experimental: Mistura de Labina®, Leite condensado e açúcar (1:1:0.21); Dieta Padrão: Labina®. * Calculado pela diferença (100 g de alimento - soma total dos valores encontrados para umidade, lipídios, cinzas, proteínas e fibras).
45
2.2.2.6 Evolução da ingestão de alimentos e ganho de peso
Após o estabelecimento do padrão de consumo, esses animais foram tratados com as
dietas descritas acima e avaliados quanto a alterações no peso e no consumo alimentar; 1 h após
a administração oral das diferentes dietas. Antes da administração oral das dietas, os animais
foram submetidos a jejum por um período de 6 h.
Os resultados do consumo alimentar (g) e do peso (g) foram expressos utilizando as
diferenças das médias diárias durante os tratamentos e demonstrados em porcentagem (%) de
acordo com a diferença entre a média do valor inicial e final do consumo e peso ganho, tanto
no período de adaptação quanto no final do experimento.
2.2.2.7 Parâmetros bioquímicos
No último dia do experimento, os animais foram submetidos a jejum de 8 a 12 horas.
O sangue foi então coletado pela veia porta e o soro utilizado para a determinação da glicemia
de jejum, triglicerídeos (TG), lipoproteínas de alta densidade (HDL-C), lipoproteínas de baixa
densidade (LDL-C), colesterol total e TNF-α. Os animais foram então sacrificados em uma
câmara de CO2.
O método utilizado para os parâmetros bioquímicos foi o enzimático-colorimétrico
(Labtest®, Minas Gerais, Brasil). Foi utilizado o kit de imunoensaio quantitativo TNF-α (R &
DSystems # RTA00, Minneapolis, Canadá). Segundo o fabricante, a sensibilidade do kit foi
<15 pg / mL.
2.2.2.8 Expressão relativa de mRNA de PPAR-γ e TNF-α no tecido adiposo
Após a coleta de sangue para dosagem dos parâmetros bioquímicos, as gorduras da
região perirrenal (visceral) foram retiradas, por meio de um corte longitudinal (com auxílio de
tesoura cirúrgica, da base do abdômen até todo o segmento do externo, mostrando toda a
cavidade abdominal e torácica), para a análise da expressão de PPAR-γ e TNF-α, sendo
realizada conforme descrito a seguir.
Desse modo, o RNAm das gorduras foi extraído com o uso do reagente TRIzol®
(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA), sendo utilizados 100 mg de tecido fresco
macerado em cadinhos com nitrogênio líquido. A quantificação dos RNAm foi realizada
utilizando o kit de ensaio de RNA (Invitrogen Life Technologies). Para avaliar a expressão de
RNAm de PPAR-γ e TNF-α no tecido adiposo, o cDNA de cada um foi preparado por
46
transcrição reversa do RNA total. cDNA foi utilizado para a reação em cadeia da polimerase
(PCR) contendo TaqMan Universal PCR Master Mix para: Receptores ativados por
proliferadores de peroxissoma (PPAR-γ, Rn0044094) e Fator de Necrose Tumoral Alfa (TNF-
α, Rn01525859), todos da Thermo Fisher Scientific (Wilmington, DE, USA). A expressão
relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCT, e os resultados são apresentados como
mudanças em comparação com os valores médios do grupo controle (grupo eutrófico),
normalizados para GAPDH, de acordo com Livak e Schmittgen (2001).
2.2.2.9 Imuno-histoquímica do TNF-α
Para a imuno-histoquímica, os procedimentos foram realizados de acordo com
Khan et al. (2016), com algumas modificações. O material foi desidratado e emblocado em
parafina, com execução de cortes de 3 µm de espessura em micrótomo rotativo de parafina e
posterior montagem em lâminas gelatinizadas. Em seguida, estas foram desparafinizadas e
hidratadas. A recuperação antigênica foi realizada utilizando uma placa aquecedora durante 20
minutos até atingir 80 ºC. Entre cada passo, utilizou-se cinco ciclos de cinco minutos para
lavagem em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,4.
Para a detecção de TNF-α no tecido adiposo, utilizou-se o kit Rabbit Specific
HRP/DAB (ABC) (Abcam, Cambridge, Reino Unido), de acordo com as instruções do
fabricante, e o anticorpo primário policlonal de coelho: anti-TNF-α (diluição 1:100) (Abcam,
Cambridge, Reino Unido) foi incubado overnight. Para a análise, imagens do tecido adiposo
após a imunohistoquímica foram capturadas utilizando uma câmera digital DS-Ri1 (Nikon,
Edgewood, Nova York, EUA) acoplada a um microscópio Eclipse Ni (Nikon, Edgewood, Nova
York, EUA) com objetiva de 10x.
A intensidade de TNF-α foi medida de forma semi-quantitativa e automática por
meio da determinação da densidade óptica em imagens de coloração diaminobenzidina (DAB),
uma vez que a densidade óptica é proporcional à concentração da coloração. A avaliação foi
baseada no software Image J (versão 1.51), utilizando um plugin conhecido como IHC profiler
(KHAN et al., 2016). As imagens de coloração DAB foram analisadas pixel por pixel e a essas
foi atribuída pontuação de acordo com uma nota, em que consistia na seguinte variação:
negativa (0), fracamente positiva (+1), positiva (+2) e altamente positiva (+3). Salienta-se que
o método em questão é validado, sendo considerado melhor e mais confiável quando comparado
47
ao método qualitativo, em que há somente análise visual (VARGHESE; BUKHARI;
MALHOTRA, 2014).
2.2.2.10 Análise Estatística
O tamanho da amostra foi calculado de acordo com o princípio 3Rs (substituição,
redução e refinamento), considerando uma amostragem simples e aleatória (modelo Cochran.)
Além disso, de acordo com o coeficiente de variação, a diferença entre os tratamentos foi
considerada significativa. Assim, assumiu-se uma diferença fisiologicamente significativa dos
parâmetros avaliados quando o tratamento (ITTp) exerceu efeito biológico de 25% ou mais em
relação ao grupo que não recebeu a dieta. Além disso, foi adotado o coeficiente de variação
prevista de 10%, com probabilidade de erro inferior a 5% e potência de 90%. O resultado foi
um "n" de 4,36 animais, cujo arredondamento, para o próximo número inteiro, foi de cinco
animais por grupo.
Os dados foram analisados quanto à normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov.
Todas as variáveis foram consideradas não paramétricas, e o teste de Kruskal-Wallis foi
utilizado para verificar se o ganho de peso, as diferenças de consumo diário e os dados
bioquímicos diferiam entre os grupos estudados. Quando diferenças significativas foram
detectadas, o teste post-hoc de Dunn foi usado. Os dados foram analisados no Graph Pad Prism,
versão 5.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA, EUA).
2.2.3. Resultados
2.2.3.1 ITTp
A purificação de ITTp foi confirmada por SDS-PAGE a 12,5% (Figura 4), com uma
banda proteica de, aproximadamente, 18 kDa, 40100,31 UI / mg de proteína e 100% de inibição
para tripsina.
48
Figura 4. Eletroforese (SDS-PAGE) das proteínas de sementes de tamarindo. M: Marcador (São Paulo, Brasil) (Rainbow ™); EB: Extrato bruto (15 µg); F1: fração 0% a 30% de sulfato de amônio (15 µg); F2: fração F2 saturada com 30% a 60% de sulfato de amônio (15 µg); ITTp: Inibidor de ripsina de Tamarindo purificado (17 µg).
2.2.3.2 Consumo alimentar e ganho de peso
A Figura 5 mostra os resultados da ingestão de alimentos e ganho de peso de animais
com obesidade tratados com ITTp durante os dez dias. O grupo tratado com ITTp apresentou
as menores medianas de consumo alimentar (Figura 5A), quando comparado aos animais não
tratados (Kruskal-Wallis, p = 0,0065). A Figura 5B mostrou a diferença na ingestão alimentar,
considerando os valores médios final e inicial em porcentagem (%), demonstrando que o grupo
de ratos Wistar que recebeu, apenas, a dieta HGLI apresentou maior consumo alimentar,
seguido pelo grupo tratado com ITTp e o grupo da dieta padrão (tratamento convencional).
Não houve diferença estatística no ganho de peso (g) nos grupos estudados durante os
10 dias do experimento (Figura 5C). No entanto, o ganho de peso total, considerando os valores
médios final e inicial, em porcentagem (%), foi ligeiramente maior no grupo de animais sem
tratamento, embora não seja estatisticamente diferente entre os grupos (Figura 5D).
49
Figura 5. Consumo alimentar e ganho de peso em ratos Wistar após 10 dias de tratamento. (A) Ingestão diária de alimentos (g). (B) Percentual de ingestão de alimentos (%). (C) ganho de peso diário (g). (D) Percentual de ganho de peso (%). Todos os tratamentos foram realizados por 10 dias: eutrófico / dieta padrão (animais eutróficos recebendo dieta Labina® + água por gavagem), obeso / dieta HGLI (animais obesos recebendo dieta HGLI + 1 mL de água por gavagem), obeso / deita padrão (animais obesos recebendo dieta Labina® + água por gavagem) e obeso / dieta HGLI + ITTp (animais obesos recebendo dieta HGLI + 1 mL de ITTp por gavagem a 730 µg / kg). Todos os grupos representam experimentos com cinco animais. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21); Dieta padrão: ração Labina®. HGLI: Alto índice glicêmico e carga.* Diferença estatística entre os grupos com o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post-hoc de Dunn, com p <0,05. ** Diferença estatística entre os grupos eutrófico / dieta padrão e obeso / dieta HGLI com o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post-hoc de Dunn, com p <0,05 ITTp: inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.).
2.2.3.3 Glicose
De acordo com a Figura 6, os animais tratados com ITTp e a dieta padrão
reduziram a glicemia de jejum quando comparados ao grupo de ratos com obesidade não
tratados, que continuaram consumindo a dieta HGLI. Além disso, essa figura também
mostra a dispersão / homogeneidade dos dados, demonstrando que o grupo tratado com
ITTp apresentou resultados menos dispersos e mais homogêneos.
50
Figura 6. Glicemia de jejum em ratos Wistar após 10 dias de tratamento. Eutrófico / dieta padrão (animais eutróficos recebendo dieta Labina® + água por gavagem). Obeso / dieta HGLI (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de água por gavagem), obeso / dieta padrão (animais obesos que recebem dieta Labina® + água por gavagem) e dieta obesa / HGLI + TTIp (animais obesos que recebem dieta HGLI + 1 mL de ITTp por gavagem a 730 µg / kg). Todos os grupos representam experimentos com cinco animais. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21); Dieta padrão: ração Labina®. HGLI: Dieta de alto índice e carga glicêmica. ITTp: Inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.).
2.2.3.4 Perfil lipídico
Os grupos com obesidade tratados com ITTp e dieta padrão apresentaram as menores
concentrações de TG (76,20 ± 18,73 e 62,2 ± 18,0 mg / dL) e VLDL-c (15,24 ± 3,75 e 12,4 ±
3,6 mg / dL), respectivamente (Figuras 7A, B), quando comparado ao grupo com obesidade
sem tratamento (Kruskal-Wallis p = 0,0108). Em relação às concentrações de TG, o grupo
tratado com ITTp apresentou resultados menos dispersos e mais homogêneos.
51
Figura 7. Perfil lipídico de ratos Wistar após 10 dias de tratamento. (A) TG: triglicerídeos. (B) VLDL-C: lipoproteína de muito baixa densidade. (C) LDL-C: lipoproteína de baixa densidade. (D) colesterol total. (E) HDL-C: lipoproteína de alta densidade. Eutrófico / dieta padrão (animais eutróficos recebendo dieta Labina® + água por gavagem). Obeso / dieta HGLI (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de água por gavagem), obeso / dieta padrão (animais obesos que recebetam dieta Labina® + água por gavagem) e obeso / dieta HGLI + ITTp (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de ITTp por gavagem a 730 µg / kg). Todos os grupos representam experimentos com cinco animais. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21); Dieta padrão: comida Labina®. HGLI: Dieta de alto índice e carga glicêmica. ITTp: Inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.). * Diferença estatística entre os grupos com o teste de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste post-hoc de Dunn, com p <0,05.
2.2.3.5 TNF-α
Todos os animais com obesidade tratados com TTIp apresentaram concentrações
indetectáveis de TNF-α plasmático (Tabela 6), semelhante ao grupo eutrófico que recebeu
a dieta padrão (grupo saudável). Isso não foi observado nos outros grupos com obesidade
estudados.
Tabela 6. TNF-α plasmático em ratos Wistar submetidos a diferentes tratamentos por 10 dias.
Parâmetro Eutrófico/ Dieta padrão
Obeso/ Dieta HGLI
Obeso/ Dieta padrão
Obeso/ Dieta HGLI + ITTp
TNF-alfa Indetecável 5.86 ± 0.43 6.53 ± 0.96 Indetecável Eutrófico / Dieta padrão (animais eutróficos recebendo dieta Labina® + água por gavagem). Obeso / dieta HGLI (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de água por gavagem), obeso / Ddieta padrão (animais obesos que receberam dieta Labina® + água por gavagem) e obeso / Dieta HGLI + ITTp (animais obesos que receberam
4C
4A
52
dieta HGLI + 1 mL de ITTp por gavagem a 730 µg / kg). Todos os grupos representam experimentos com cinco animais. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21); Dieta padrão: comida Labina®. HGLI: Dieta de alto índice e carga glicêmica. ITTp: Inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.).
A expressão relativa de mRNA de TNF-α no tecido adiposo perirrenal foi menor nos
animais com obesidade tratados com a dieta padrão (p = 0,014) e ITTp (p = 0,025) quando
comparados ao grupo com obesidade não tratado (Figura 8).
Figura 8. Expressão relativa do mRNA de TNF-α no tecido adiposo perirrenal em ratos Wistar após 10 dias de tratamento. Eutrófico / dieta padrão (animais eutróficos recebendo dieta Labina® + água por gavagem). Obeso / dieta HGLI (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de água por gavagem), obeso / dieta padrão (animais obesos que receberam dieta Labina® + água por gavagem) e obeso / dieta HGLI + ITTp (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de TTIp por gavagem a 730 µg / kg). Todos os grupos representam experimentos com cinco animais. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21); Dieta padrão: comida Labina®. HGLI: dieta de alto índice e carga glicêmica. ITTp: Inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.). GAPDH: Desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (Rn01775763_g1). TNF-α: fator de necrose tumoral alfa (LOC103694, Rn01525859_g1). Diferença estatística entre os grupos, com o teste de Mann-Whitney e p <0,05.
53
2.2.3.6 Imuno-histoquímica de TNF-α
A imuno-histoquímica mostrou uma discreta imunocoloração de TNF-α no tecido
adiposo de animais com obesidade tratados com ITTp e dieta padrão, com imunocoloração
negativa (0) por densidade óptica (Tabela 7). Ao contrário do grupo não tratado, que apresentou
intensa coloração dessa citocina nos compartimentos de tecido perirrenal avaliados (Figura 9)
Figura 9. Imunocoloração de TNF-α no tecido adiposo de ratos Wistar após 10 dias de tratamento. Todos os grupos representam experimentos com n = 5 animais. a) Adipócitos perirrenais no grupo eutrófico / dieta padrão; (b) adipócitos perirrenais na grupo obeso / dieta HGLI; (c) adipócitos perirrenais no grupo obeso / dieta padrão; (d) Adipócitos perirrenais no grupo obeso / dieta HGLI + ITTp. As barras indicam 1000 µm. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,2); ITTp: Inibidor de tripsina purificado de sementes de Tamarindus indica L..
54
Tabela 7. Escore da imuno-histoquímica de TNF-α em tecido adiposo de ratos wistar submetidos a difefentes tratamentos durante 17 semanas.
Todos os grupos representaraem os experimentos com n= 5 animais. TNF-α: fator de necrose tumoral alfa. aDieta padrão: comida Labina®. bDieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21). ITTp: Inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.)
2.2.3.7 PPAR-γ
Não houve diferença entre os grupos estudados para a expressão relativa de mRNA de
PPAR-γ nos tecidos adiposos perirrenais (Figura 10).
Figura 10. Expressão relativa do mRNA do PPAR-γ no tecido adiposo perirrenal em ratos Wistar após 10 dias de tratamento. Eutrófico / dieta padrão (animais eutróficos recebendo dieta Labina® + água por gavagem). Obeso / dieta HGLI (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de água por gavagem), obeso / dieta padrão (animais obesos que receberam dieta Labina® + água por gavagem) e obeso / dieta HGLI + ITTp (animais obesos que receberam dieta HGLI + 1 mL de TTIp por gavagem a 730 µg / kg). Todos os grupos representam experimentos com cinco animais. Dieta HGLI: Mistura composta por Labina®, leite condensado e açúcar (1: 1: 0,21); Dieta padrão: ração Labina®. HGLI: dieta de alto índice e carga glicêmica. ITTp: Inibidor de tripsina purificado de tamarindo (Tamarindus indica L.). GAPDH: Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Rn01775763_g1). PPAR-γ: Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma.
Eutrófico/ Dieta padrãoa
Obeso/ Dieta HGLI b
Obeso/ Dieta padrão
Obeso/ Dieta HGLI + ITTpc
Negativo (0) 4 - - 5 Menos positive (+1) 1 1 3 - Positivo (+2) - 4 1 - Muito positive (+3) - - 1 -
3C
55
2.2.4. Discussão
Em estudos anteriores, Medeiros et al. (2018) purificaram o ITTp (inibidor da tripsina
do tipo Kunitz de tamarindo). Neste estudo, o ITTp foi novamente obtido, conforme visualizado
pelo SDS-PAGE. Foi avaliado seu efeito sacietogênico, parâmetros bioquímicos e moleculares
em ratos Wistar com obesidade e dislipidemia.
No presente estudo, em animais com obesidade, o ITTp exerceu seu efeito
sacietogênico de maneira semelhante a quando foi parcialmente purificado (CARVALHO et
al., 2016). O processo de purificação de uma proteína pode influenciar diretamente na sua
bioatividade. Assim, o isolado proteico, parcialmente purificado (ITT), quando totalmente
purificado (ITTp), poderia ter perdido as bioatividades anteriormente apresentadas
(CARVALHO et al., 2016; MEDEIROS et al., 2018; COSTA et al., 2018), uma vez que essas
atividades nas proteínas estão diretamente relacionadas às suas estruturas e conformações
(COX; NELSON, 2008).
No estudo de Lima et al. (2016), o isolado proteico de sementes de Erythrina velutina
apresentou alta atividade para elastase neutrofílica humana (ENH), uma característica que não
foi observada por Machado et al. (2013), ao purificar o isolado proteico de Erythrina velutina
(EVTI) usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) após a coluna de afinidade
Trypsin-Sepharose CNBr 4B. No estudo, o EVTI mostrou alta eficiência inibitória na tripsina
e não inibiu a HNE.
No presente estudo, os ratos Wistar com obesidade apresentaram menor consumo
alimentar quando tratados com ITTp, em comparação aos demais grupos avaliados. Vale
ressaltar que, dos quatro grupos, dois continuaram consumindo, durante os dez dias de
experimento, a mesma dieta capaz de induzir a obesidade e, apenas, um grupo passou a
consumir a dieta padrão (nutricionalmente adequada). Assim, nesse caso, por aderirem a uma
dieta nutricionalmente adequada, os animais com obesidade diminuíram seu consumo,
semelhante ao efeito causado pelo uso do ITTp.
Em relação ao ganho de peso, foi observado uma consistência entre os resultados
obtidos com o consumo alimentar, mas não houve diferença estatística significativa entre os
grupos. No entanto, houve um aumento no ganho de peso no grupo que consumiu a dieta HGLI
sem tratamento. Além disso, foi observada uma redução do ganho de peso nos grupos de
animais tratados com ITTp e dieta padrão, mas não significativa.
A redução na ingestão alimentar e a consequente perda de peso observada em estudos
com inibidores de tripsina são mais comuns em animais eutróficos, embora tenham sido
56
administradas em um curto período e esses efeitos sejam atribuídos principalmente ao efeito
secretagogo e consequente aumento plasmático de CCK (KOMARNYTSKY; COOK;
RASKIN, 2011; NAKAJIMA et al., 2011; CHEN et al., 2012; SERQUIZ et al., 2016).
No entanto, observa-se que em roedores com obesidade, o efeito sobre a saciedade em
comparação com animais eutróficos ocorre independentemente da concentração plasmática de
CCK quando estimulado por diferentes secretagogos desse hormônio (STOECKEL et al., 2008;
DUCA; ZHONG; COVASA, 2013; COSTA et al., 2018).
No estudo de Costa et al. (2018), em ratos Wistar, a redução na ingestão alimentar por
ITT (25 mg / kg) administrada por 10 dias foi independente do aumento plasmático de CCK.
Essa redução pode ter sido causada por uma diminuição significativa na concentração
plasmática de leptina nesses animais, um efeito também atribuído ao ITT (COSTA et al., 2018),
uma vez que a leptina influencia diretamente o efeito sacietogênico de CCK (BARRACHINA
et al., 1997; MATSON et al., 2000; GOMEZ; ENGLANDER; GREELEY, 2004).
Medeiros et al. (2018) em um estudo com ITTp (730 µg / kg) constataram o mesmo
efeito de redução da leptina plasmática em ratos, sem ação na CCK, também descrita por Costa
et al. (2018) usando a mesma molécula, ainda parcialmente purificada. Portanto, o efeito
satietogênico apresentado pelo ITTp neste estudo também pode ser justificado pela melhora da
sensibilidade à CCK, independentemente de seu aumento plasmático, que é condicionado pela
redução da leptina, que geralmente é alta na obesidade. No entanto, a leptina plasmática foi
reduzida em animais tratados com ITTp (MEDEIROS et al., 2018).
Além disso, os inibidores enzimáticos atuam regulando não apenas os hormônios, mas
também vários parâmetros bioquímicos. Serquiz et al. (2016), em seu estudo sobre o efeito do
inibidor isolado de amendoim (AHTI) em animais eutróficos, revelou sua ação na redução da
glicemia de jejum. Analisando os efeitos do ITTp se obsevou uma diferença significativa entre
os grupos estudados em relação à diminuição das concentrações plasmáticas de VLDL-c e TG,
nos quais o grupo tratado com ITTp e a dieta padrão apresentaram concentrações mais baixas
do que os grupos não tratados.
No grupo de animais em que a dieta padrão foi administrada, a redução nos parâmetros
lipídicos (VLDL-c e TG) deve-se provavelmente ao fato de a dieta apresentar características
normoglicêmicas e normolipídicas, diferente da dieta HGLI com alta carga glicêmica e altas
concentrações de açúcar. No estudo de Pawlak et al. (2001), ratos Wistar submetidos a dietas
com alto índice glicêmico (45% do valor energético total da dieta derivada de carboidratos,
20% de proteínas e 35% de lipídios) apresentaram trigliceridemia basal significativamente
aumentada quando comparados aos ratos alimentados com a dieta contendo a mesma
57
porcentagem de composição de macronutrientes, mas com carboidratos de baixo índice
glicêmico (PAWLAK et al., 2001).
A ingestão aguda de carboidratos promove sua própria oxidação, reduzindo a oxidação
de gordura, que é depositada, aumentando a adiposidade corporal (GRAHAM; ADAMO,1999;
BRAND-MILLER et al., 2002) Esse efeito é maior quando os carboidratos têm um alto índice
glicêmico. Por exemplo, em um estudo de 32 semanas, os animais submetidos a dietas baseadas
em carboidratos de alto índice glicêmico apresentaram maior ganho de peso, maior aumento na
adiposidade visceral e maiores concentrações de enzimas lipogênicas, do que animais
submetidos a dietas com o mesmo conteúdo de energia, mas com um índice glicêmico mais
baixo (PAWLAK; DENYER; BRAND-MILLER, 2000).
Além disso, essa característica da dieta HGLI pode justificar, por exemplo, os valores
absolutos médios de glicemia, VLDL-c e TG em animais que foram mantidos na dieta HGLI
sem tratamento durante o experimento; bem como o estado inflamatório encontrado, com altas
concentrações de TNF-α plasmático, além da própria obesidade.
Existem inúmeros estudos sugerindo que dietas hiperglicêmicas podem aumentar a
trigliceridemia, favorecer a formação de partículas pequenas e densas de LDL-c e reduzir as
concentrações plasmáticas de HDL-c (KATAN, 1998; KRAUSS et al., 2000; PARKS, 2001).
Dois mecanismos possíveis foram identificados como responsáveis pelo aumento da
trigliceridemia induzida pelos carboidratos: (1) aumento da síntese de triglicerídeos e
consequente aumento da produção e liberação de VLDL-c pelo fígado e (2) diminuição da
depuração de partículas ricas em TG plasmáticas (PARKS et al., 1999).
Dietas hiperlipídicas e hiperglicêmicas estimulam, consideravelmente, a lipogênese
(UYEDA; YAMASHITA; KAWAGUCHI, 2002), aumentando a expressão de enzimas
lipogênicas (DELZENNE et al., 2001). A estimulação de enzimas lipogênicas pode ocorrer por
fatores de transcrição, como SREBP3 e ChREBP, que são ativados em resposta à alta glicemia
(UYEDA; YAMASHITA; KAWAGUCHI, 2002) e à estimulação do receptor nuclear PPAR-γ
(KERSTEN, 2001). A glicose em si, devido à conversão em acetil-CoA na via glicolítica,
estimula a lipogênese, que é um substrato para esse processo. Além disso, a glicose plasmática
estimula a lipogênese, atuando no processo de liberação de insulina. A insulina é provavelmente
o fator hormonal mais importante que afeta a lipogênese, estimulando-a de maneira muito
potente, aumentando a captação de glicose pelas células adiposas, recrutando transportadores
de glicose para a membrana plasmática e ativando enzimas glicolíticas e lipogênicas
(KERSTEN, 2001).
58
Mittendorfer e Sidossis (2001) submeteram indivíduos saudáveis a uma dieta
hiperglicêmica (75% de energia na forma de carboidratos e 10% na forma de gorduras) e a uma
dieta hiperlipídica (30% de carboidratos e 55% de gordura) e analisaram o metabolismo de
VLDL-c a partir de partículas de VLDL-c marcadas isotopicamente. Concluiu-se que a maior
concentração de VLDL-c ocorreu após a ingestão da dieta hiperglicêmica. A provável
explicação para a maior secreção de VLDL foi a de que seria resultado da menor oxidação de
ácidos graxos derivados do plasma, observada no estudo, após o consumo da dieta
hiperglicídica, o que causou aumento da disponibilidade de ácidos graxos para a síntese
hepática de triglicérides.
Curiosamente, o ITTp também causou a redução das concentrações de VLDL-c e TG
em animais com obesidade que permaneceram na dieta HGLI. Também, se observou que os
valores de glicemia de jejum dos animais com obesidade que receberam a dieta HGLI foram
semelhantes aos dos animais eutróficos e aos dos ratos Wistar com obesidade tratados com a
dieta nutricionalmente adequada. O ITTp pode estar atuando em algumas dessas vias, reduzindo
a expressão de enzimas lipogênicas ou mesmo reduzindo a expressão de fatores de transcrição,
como SREBP e ChREBP. Já que não influenciou na expressão do gene PPAR-γ e esse também
se apresenta como candidato na indução da lipogênese condicionada por dietas de alto índice
glicêmico (CARVALHO et al., 2016; LIU; WILLETT, 2017; SAMPAIO et al., 2007).
O PPARγ regula a expressão de vários genes envolvidos no metabolismo lipídico,
incluindo a proteína adipocitária 2 (TONTONOZ; HU; SPIEGELMAN, 1994), ACIL-CoA
sintetase (SCHOONJANS; WATANABE; SUZUKI, 1995) e LPL (SCHOONJANS; STAELS;
AUWERX, 1996). Também controla a expressão da proteína transportadora de ácidos graxos
1 e do agrupamento de diferenciação 36, ambos envolvidos na captação lipídica pelos
adipócitos (SCHOONJANS; WATANABE; SUZUKI, 1995). O PPARγ tem um papel
regulador na adipogênese (BARROSO et al., 1999; REN et al., 2002). Um estudo recente
sugeriu que a ativação do PPARγ pode diminuir a progressão da aterosclerose e aumentar a
sensibilidade à insulina e pode ser um alvo terapêutico potencial para o tratamento de várias
doenças, incluindo diabetes mellitus tipo 2 e dislipidemia (TAVARES; HIRATA; HIRATA,
2007).
Na literatura tem-se, também, o exemplo clássico, das estatinas, que são fármacos que
atuam reduzindo as dislipidemias e possuem uma cinética competitiva, competindo de forma
reversível com 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A (HMG-CoA) para o sítio ativo da enzima
HMG-CoA redutase, inibindo a síntese do colesterol (FONSECA, 2005). Em face desse fato,
já é de conhecimento, de acordo com Medeiros et al. (2018), que o ITTp é um inibidor do tipo
59
competitivo para tripsina. Assim, é possível ter sua atuação de forma semelhante às estatinas,
atuando, não, apenas, sobre a expressão de genes envolvidos nessa reversão, mas também agir
competindo de forma reversível ou irreversível com as enzimas lipogênicas. Isso pode ser de
grande relevância para a indústria farmacêutica, já que inibidores com essa característica são,
em sua maioria, não competitivos (LI et al., 2004).
Neste estudo, quando o TNF-α foi analisado como marcador de inflamação, ele foi
reduzido a concentrações indetectáveis em todos os animais tratados com TTIp. Esse é um
resultado interessante, uma vez que o TNF-α desempenha um papel central na inflamação
crônica (OUCHI et al., 2011; KANNEGANTI; DIXIT, 2012; WEISBERG et al., 2013). Além
disso, considerando que as concentrações de TNF-α são indetectáveis em humanos e animais
saudáveis (PETROS; PETERS, 1996; DURUM; MUEGGE, 1996), pode-se afirmar que o ITTp
teve um efeito significativo na redução da inflamação em animais com obesidade, reduzindo
essa inflamação a concentrações iguais às de animais saudáveis, independentemente da perda
de peso. Vale ressaltar que, neste estudo, animais eutróficos, também, apresentaram
concentrações indetectáveis de TNF-α.
Corroborando o que foi mencionado anteriormente, em animais com obesidade,
tratados com ITTp, foi observada uma diminuição significativa na expressão relativa do tecido
de mRNA de TNF-α com imunocoloração negativa no adiposo visceral. Estudos mostram que
o TNF-α é uma citocina que atua diretamente no adipócito, promovendo a indução de apoptose,
inibição da lipogênese e inibição da expressão de LPL de GLUT-4 e acil-CoA sintetase,
cumprindo, assim, um importante papel regulador na acumulação de gordura no tecido adiposo
(ARNER, 1995; PETROS; PETERS, 1996; KANNEGANTI; DIXIT, 2012; WEISBERG et al.,
2013). Assim, era esperado que todos os animais com obesidade mostrassem altas
concentrações plasmática de TNF-α, expressão do gene TNF-α e imunocoloração positiva para
TNF-α no tecido adiposo analisado.
Sua expressão aumentada parece estar relacionada à redução da expressão de
substrato-1 do receptor de insulina (IRS-1), GLUT-4 e adiponectina no tecido adiposo e
estimulação da produção de PCR e IL-6. Vale salientar que, na fase aguda da inflamação, o
aumento na produção de TNF-α e interleucinas como a IL-6 e IL-1β é característico. O TNF-α,
a IL-6 e a IL-1β são secretadas por macrófagos e apresentam efeitos sistêmicos e locais. O TNF
é responsável pela ativação de células endoteliais, estimulando a exposição de integrinas e
selectinas que participam no processo de rolamento leucocitário (CARTER, 2005;
KANNEGANTI; DIXIT, 2012).
60
O TNF-α está no topo da cascata inflamatória e é responsável pela ativação dos
linfócitos, estimulação da liberação de enzimas proteolíticas pelos macrófagos e produção de
outras citocinas inflamatórias como a IL-13. Assim, as citocinas desempenham um papel
fundamental na perpetuação da inflamação, por meio de feedbacks que controlam a atividade
imunológica, presentes em algumas doenças, como na artrite reumatoide, espondilite
anquilosante, obesidade, aterosclerose, doenças inflamatórias intestinais, síndrome metabólica
e diabetes melitus tipo 2 (TAY; THOMPSON; BRINKWORTH, 2015; LOZANO et al., 2016;
MELO; MAGINA, 2018; MITOMA et al., 2018).
Assim, para tratamento de algumas patologias, como a artrite reumatoide, é comum a
utilização alguns tipos de drogas como as drogas modificadoras da doença (DMARDs) (SILVA
et al., 2003; UEHBE; PIMENTA; GIORGI, 2006; MONTEIRO; ZANINI, 2008). Esse grupo
de medicamentos apresenta uma série de drogas quimicamente não relacionadas entre si,
podemos citar os antimaláricos, o metotrexato, a leflunomida, antagonistas dos receptores de
IL-1, agentes citotóxicos, e agentes biológicos bloqueadores de TNF-α (CICONELLI, 2005;
UEHBE; PIMENTA; GIORGI, 2006; BERTOLO, 2008).
Entre os agentes biológicos aprovados para o tratamento da artrite reumatóide estão
aqueles que atuam como antagonistas do TNF-α, chamados anti-TNF-α (LIM et al., 2018;
MELO; MAGINA, 2018). Atualmente, três agentes que bloqueiam a ação do TNF-α estão
disponíveis no Brasil: etanercept, infliximabe e adalimumabe (CACCIAPAGLIA et al., 2011;
MITOMA et al., 2018). No entanto, todos esses medicamentos têm como efeito adverso,
aumento de triglicerídeos, bem como o aparecimento de diabetes melittus tipo 2, além do risco
de aterosclerose (CACCIAPAGLIA et al., 2011).
Vale ressaltar que, neste estudo, o ITTp atuou de forma a reduzir o TNF-α plasmático
a concentrações indetectáveis e a expressão relativa de seu gene com imunocoloração negativa
no tecido adiposo visceral. Esses achados demonstram que ele pode atuar como um potente
anti-TNF-α, bloqueando ou mesmo como antagonista do TNF-α. Além disso, o ITTp não
apenas reduziu a inflamação, mas também reduziu as concentrações plasmáticas de VLDL-c e
o TG. Assim, o ITTp apresenta-se como um importante candidato a ser utilizado para diminuir
o risco cardiovascular, bem como o processo lipogênico da obesidade. Isso é de grande
relevância para a indústria farmacêutica; uma vez que até o momento, não existem produtos
farmacêuticos anti-TNF-α conhecidos que não alterem o perfil lipídico.
61
2.2.5. Conclusões
Os resultados permitem concluir que animais com obesidade e dislipidêmicos, quando
tratados com ITTp, reduziram a ingestão de alimentos e a inflamação crônica, reduzindo as
concentrações plasmáticas de TNF-α e a expressão relativa de seu gene no tecido adiposo
visceral. Além disso, o ITTp também atuou, reduzindo a dislipidemia apresentada pelos animais
com obesidade induzida por uma dieta de alto índice glicêmico e alta carga glicêmica,
independentemente de PPAR-γ.
2.3 CAPÍTULO 3 O artigo produto da revisão da literatura está sob revisão Food Reviews International Carvalho, F.M.C.; Maciel, B.L.L.; Morais, A.H.A. Tamarind enzymatic inhibitors: heterologous activities and health application perspectives.
INIBIDORES ENZIMÁTICOS DE TAMARINDO, SUAS ATIVIDADES HETERÓLOGAS E PERSPECTIVAS DE APLICAÇÃO PARA SAÚDE: UMA REVISÃO DE LITERATURA
RESUMO
O tamarindo (Tamarindus indica L.) é uma fruta versátil com uma grande variedade de usos. Vale salientar que suas sementes, principalmente devido à presença dos inibidores enzimáticos, possuem atividade anti-inflamatória; sacietogênica, apresentando potencial para o tratamento ou prevenção de obesidade e outras doenças. Nesse contexto, o isolamento, a purificação, a caracterização e as bioatividades de inibidores de proteases em sementes, têm sido demonstrados como aspirantes na biopropecção de inibidores enzimáticos com potencial para saúde. O presente artigo propõe abordar por meio de uma revisão da literatura, sistematicamente organizada e integrativa, as atividades heterólogas e perspectivas de aplicação para saúde dos inibidores enzimáticos de tamarindo.
Palavras-chave: Tamarindus indica L., inibidor de tripsina, protease inhibitors, revisão da literatura.
ABSTRACT
Tamarindus indica L. is a versatile fruit with a wide variety of uses. It is noteworthy that its seeds, mainly due to the presence of enzymatic inhibitors, have anti-inflammatory activity; sacietogenic, presenting potential for the treatment or prevention of obesity and other diseases. In this context, the isolation, purification, characterization and bioactivities of protease inhibitors in seeds have been shown to be aspirants in the bioprecision of enzymes with potential for health. This paper proposes to address, through a systematic and integrative
62
literature review, the heterologous activities and health application perspectives of tamarind enzyme inhibitors.
Keywords: Tamarindus indica L., trypsin inhibitor, protease inhibitors, literature review.
2.3.1 Introdução
O tamarindo (Tamarindus indica L.) é uma fruta versátil e nutritiva com uma grande
variedade de usos. Além da fruta, outras partes da sua planta, como raízes, sementes, casca e
folhas, possuem nutrientes e propriedades farmacêuticas. A polpa é relativamente pobre em
proteína e óleo, embora rica em vários aminoácidos. É uma boa fonte de cálcio, fósforo, cobre,
manganês e zinco, pobre em ferro e com elevado teor de vitamina B. As sementes e os grãos
são ricos em proteínas, ganhando assim importância como fonte alternativa, enquanto o
revestimento das sementes é rico em fibras e taninos. As sementes são uma boa fonte de ácidos
graxos e ricas em alguns minerais essenciais, como cálcio, fósforo, magnésio e potássio. As
folhas de tamarindo são uma fonte de vitamina C e ß-caroteno; com conteúdo mineral alto,
particularmente fósforo, potássio, cálcio e magnésio (KURU, 2014; MEHER; DASH; ROY,
2014; MENEZES et al., 2016; MUZAFFAR; KUMAR, 2017).
É válido ressaltar que praticamente todas as partes da planta do tamarindeiro têm
utilidade na medicina popular, e proporcionam diversas aplicações terapêuticas em humanos,
destacando-se a utilização como digestivo, calmante, laxante e expectorante (MENEZES et al.,
2016). O tamarindo também é utilizado como um potente antioxidante, devido à quantidade de
compostos fenólicos que possui em suas sementes, atuando como hipolipidêmico,
antiaterosclerótico, anti-inflamatório e com efeitos imunomodulatórios (MENEZES et al.,
2016).
Vale salientar que as sementes de tamarindo, devido à presença de inibidores
enzimáticos na sua composição, também possuem ação anti-inflamatória e atuam no controle
da saciedade, pelo que são potencialmente úteis no tratamento ou prevenção da obesidade.
(FOOK et al., 2005; RIBEIRO et al., 2015; CARVALHO et al., 2016; COSTA et al., 2018;
MEDEIROS et al., 2018; CARVALHO et al., 2019). Deste modo, os inibidores de proteases,
especialmente os da enzima tripsina têm se apresentado como aspirante à tecnologia de
biofármacos (LIMA et al., 2019).
Sendo assim, considerando a importância de discutir o uso de inibidores enzimáticos no
tratamento complementar das mais diversas doenças, o presente artigo abordará essa temática
por meio de uma revisão sistematicamente organizada e integrativa.
63
2.3.2 Metodologia
As revisões do tipo integrativa se compõem em seis etapas e nessas etapas,
primeiramente, se decide a hipótese ou a pergunta do estudo. Posteriormente, deve-se selecionar
os artigos científicos a serem revisados, seguindo a categorização e avaliação desses estudos.
Assim, a interpretação dos resultados e apresentação da revisão ou da síntese do conhecimento
são as últimas etapas desse processo (KNAF, 2005).
Desse modo, para orientar este estudo, elaborou-se a seguinte questão “Os inibidores
enzimáticos de tamarindo atuam de forma heteróloga e com perspectivas de aplicação para a
saúde?” Assim, obedecendo aos seguintes critérios de inclusão, os artigos foram selecionados
considerando os que mencionassem inibidores enzimáticos de tamarindo, apresentando
bioatividades, que estivessem indexados nas bases de dados pré-selecionadas, que fossem
publicados em inglês entre 2014 e 2019 e estivessem disponíveis na íntegra. Em contrapartida,
foram excluídos todos os artigos de acesso restrito ou que não atendessem aos critérios de
inclusão de modo cumulativo.
Acrescenta-se que os artigos foram identificados utilizando as bases de dados Pubmed,
Scielo e Medline, por meio de busca baseadas em palavras-chave indexadas no Medical Subject
Headings (MeSH): Tamarindus, Tamarindus indica, trypsin inhibitors, protease inhibitors.
Equações foram utilizadas com combinações de descritores relacionados à Tamarindus ou
Tamarindus indica utilizando trypsin inhibitors ou protease inhibitors, acompanhados pelo
operador booleano AND. Para essa seleção procedeu-se à leitura dos títulos e dos respectivos
resumos, com a finalidade de verificar a apropriação do estudo com a questão norteadora
levantada para investigação. Ao final da pesquisa, foram encontrados onze estudos, contudo
foram excluídos dois desses estudos em que continham apenas a caracterização dos inibidores
enzimáticos, mas que não apresentaram nenhum resultado sobre sua aplicação heteróloga com
vista à bioatividade. Dessa forma, somente nove se enquadravam nos critérios de inclusão
declarados.
Para a extração de dados dos artigos incluídos, foi investigada a sua identificação,
características do método abordado nos estudos, avaliação do rigor metodológico, intervenções
estudadas e resultados encontrados. A apresentação dos dados e a discussão foram feitas de
forma descritiva, possibilitando a aplicabilidade dessa revisão na abordagem do uso de
inibidores enzimáticos, provindos de tamarindo visando à aplicação para saúde.
64
2.3.3 Tamarindo (Tamarindus indica L. ) uma fruta tropical
O tamarindeiro ou tamarineiro, pertence à classe Dicotyledoneae, família
Leguminosae, com nome científico Tamarindus indica L. Sua Origem é proveniente da Savana
da África, porém se disseminou por todas as regiões tropicais, sendo cultivado, explorado e
exportado especialmente pela Índia e particularmente abundante nos estados de Madhya
Pradesh, Bihar, Andhra Pradesh, Chhattisgarh, Karnataka, Tamilnadu e Bengala Ocidental
(KURU, 2014; MEHER; DASH; ROY, 2014; MENEZES et al., 2016; MUZAFFAR; KUMAR,
2017). A Índia é o maior produtor mundial e inclui a sexta posição em termos de receita de
exportação de tamarindo, tendo apresentado uma produção média de cerca de 191.750 toneladas
no período de 2015-2016 (MUZAFFAR; KUMAR, 2017).
O amadurecimento dos frutos do tamarindeiro ocorre durante os meses de fevereiro a
março. As vagens são deixadas para amadurecer na árvore até que a casca exterior esteja seca
e possa ser facilmente separada da polpa sem aderência (MEHER; DASH; ROY, 2014). As
sementes são muito duras, brilhantes, avermelhadas ou arroxeadas, envoltas por uma dura
membrana coriácea, o chamado endocarpo. Uma fruta típica contém cerca de 55% de polpa,
34% de sementes e 11% de casca e fibra. Existem duas variedades de tamarindo encontradas
na Índia: a vermelha e a marrom, sendo esta última de sabor mais ácido ou azedo (MUZAFFAR;
KUMAR, 2017).
A polpa de tamarindo contém ácido tartárico, açúcares redutores, pectina, proteínas,
fibras e materiais celulósicos. Além de ser uma rica fonte de açúcar, a polpa é uma excelente
fonte de vitaminas do complexo B e exibe alta capacidade antioxidante que parece estar
associada a um alto conteúdo fenólico. A polpa da fruta é uma boa fonte de minerais, no entanto,
a composição aproximada depende da localidade. Os principais constituintes voláteis da polpa
de tamarindo incluem derivados de furano (44,4%) e ácidos carboxílicos (38,2%), além dos
componentes furfural (8%), ácido palmítico (7%), ácido oleico (1,4%) e fenil acetaldeído
(1,0%). O constituinte volátil mais abundante de tamarindo é o 2-acetil-furano, associado a
vestígios de furfural e 5-metilfurfural, que formam o aroma total da polpa de tamarindo. O sabor
ácido da polpa é dado, principalmente, pelo ácido tartárico (mais abundante), mas também são
encontrados os ácidos málico, succínico, cítrico e quínico (MUZAFFAR; KUMAR, 2017).
Já a semente de tamarindo é uma riquíssima fonte de proteínas, sendo formada por
aminoácidos sulfurados, e parte por inibidores de proteases. Além disso, Menezes et al. (2016)
mostraram que em 100 g de matéria seca da semente do tamarindo possui: 24,28 g de proteína;
7,20 g de lipídeos; 38,27 g de carboidratos; 18,00 g de fibras; 1308,00 mg de potássio; 36,60
65
mg de cálcio; 104,00 mg de magnésio; 8,90 mg de sódio; 7,00 mg de zinco; 2,10 mg de cobre;
12,10 mg de manganês e 45,50 mg de ferro.
Em face de tantas propriedades nutricionais, a planta tamarindo se destaca podendo
ser utilizada e consumida de diversas maneiras. Entre elas, devido ao seu sabor ácido e aroma
agradável, a polpa é amplamente utilizada para fins domésticos e industriais (ZOHRAMEENA
et al., 2017). A polpa de tamarindo, por ser pegajosa e comestível é um ingrediente comum em
preparações culinárias, como caril, chutneys, molhos e sorvete (MUZAFFAR; KUMAR, 2017).
Assim, comumente é consumida fresca e, muitas vezes, transformada em suco, infusão ou
salmoura e pode ser processada em geleia e doces. No entanto, também pode ser usada como
um substituto para acidulantes químicos na preparação de certos alimentos e bebidas. Em alguns
países africanos, o suco obtido da polpa da fruta é misturado com cinza de madeira para
neutralizar o gosto azedo do ácido tartárico. Em Gana, a polpa é misturada com açúcar e mel
para fazer uma bebida doce. A maioria dos países produtores fabrica bebidas comercialmente
(ZOHRAMEENA et al., 2017).
Essa fruta também reivindica alguns usos medicinais e é considerada um tônico
digestivo, carminativo, laxante, expectorante e tônico sanguíneo. O tamarindo é usado como
um alimento funcional. A polpa de tamarindo tem sido usada em medicamentos tradicionais
para tratar doenças e sintomas (MUZAFFAR; KUMAR, 2017).
Em relação à semente de tamarindo, é utlizada como um subproduto da indústria de
celulose. Em 1942, dois cientistas indianos anunciaram que os grãos decorticados continham
46-48% de uma substância formadora de gel (pectina). Esse polissacarídeo com caráter de
carboidrato e propriedades de formação de gel, chamado 'jellose' (KURU, 2014), tem sido
recomendado para uso como estabilizante em sorvetes, maioneses e queijo, e como ingrediente
ou agente em vários produtos farmacêuticos (KURU, 2014). Farinha da semente pode ser feita
em bolo e pão. As sementes torradas são consideradas superiores aos amendoins no sabor
(KURU, 2014).
Devido à composição nutricional e química geral, as sementes de tamarindo podem
ser adotadas como uma fonte alternativa de proteína barata para minimizar a desnutrição
proteica entre pessoas tradicionais que vivem em países em desenvolvimento (KURU, 2014;
MEHER; DASH; ROY, 2014; MENEZES et al., 2016; MUZAFFAR; KUMAR, 2017;
ZOHRAMEENA et al., 2017).
O tamarindo possui uma variedade de compostos e moléculas bioativas nas folhas,
sementes, casca, polpa e flores com efeitos benéficos para a saúde humana e possibilidade de
aplicação na indústria farmacêutica. As atividades: antioxidante, anti-inflamatória,
66
antimicrobiana e antifúngica tem sido documentadas como algumas dessas possíveis aplicações
(MUZAFFAR; KUMAR, 2017; CARVALHO et al., 2019).
Dessa forma, a prospecção de novas moléculas se mostra como uma alternativa
interessante e uma forma de explorar a variabilidade biológica de espécies ainda pouco
estudadas, tal como, Tamarindus indica L. Nesse campo, os inibidores enzimáticos, moléculas
de ampla aplicação biotecnológica, têm se destacado. Para o tamarindo há uma vasta literatura
sobre as atividades biológicas dessas moléculas e os métodos de isolamento, purificação e
análises sobre a segurança e sua utilização, já são bem estabelecidos (ARAÚJO et al., 2005;
FOOK et al., 2005; RAO; GOWDA, 2008; PANDEY; JAMAL, 2014; RIBEIRO et al., 2015;
CARVALHO et al., 2016; COSTA et al., 2018; MEDEIROS et al., 2018; CARVALHO et al.,
2019).
2.3.4 Inibidores enzimáticos
Os inibidores de proteases são substâncias pépticas (alfa-globulinas) que se
complexam com proteases ou enzimas proteolíticas, formando compostos de difícil
dissociação, inibindo a atividade delas, sendo denominadas inibidores de proteases. Esses são
vastamente distribuídos entre plantas, animais e microrganismos, e apresentam massas
moleculares entre 10 e 90 kDa (NEURATH, 1990).
Esses inibidores são classificados de acordo com as quatro classes mecanicistas
específicas das enzimas proteolíticas que inibem, sendo as duas mais importantes: inibidores
de serino proteases e inibidores de cisteína proteases (SANTOS et al., 2012). Em plantas, esses
inibidores são encontrados em maior quantidade dependendo da fase de maturação, localização
do tecido, tempo de colheita e de armazenamento, como também da variedade da planta,
podendo ainda assim, existir diferentes classes de inibidores, bem como uma variedade de
isoformas num único tecido ou órgão. Além disso, a expressão dos inibidores irá variar
conforme o estado fisiológico do organismo (SANTOS et al., 2012).
As várias classes de inibidores foram subdivididas em diversas famílias tomando como
base características, relacionadas a homologia entre os membros, relações topológicas entre
pontes dissulfeto e localização do sítio ativo. As serinoproteases são a classe de inibidores mais
bem caracterizada e vastamente distribuída no reino vegetal, principalmente em plantas das
famílias brassicaceae, curcubitaceae, salicicaceae, glycinaceae, solanaceae, fabaceae. Esses
inibidores foram agrupados em oito subfamílias: Bowman–Birk, Kunitz, Batata I, Batata II,
67
Abóbora, Cereal, Taumatina e RagiA1 (HABIB; FAZILI, 2007). As mais bem caracterizadas
famílias de inibidores de serinoproteases são os inibidores do tipo Kunitz e Bowman-Birk.
Os inibidores de proteases serínicas do tipo Kunitz têm pesos moleculares na faixa de
18–22 kDa, com uma estrutura primária composta por uma alça de ligação que se liga à tripsina,
um ou duas cadeias polipeptídicas e um baixo teor de cisteína. As pontes dissulfureto são
estabilizadas por quatro resíduos de cisteína. Uma vez que essas pontes dissulfeto são rompidas,
perda de atividade inibitória é observada (NEURATH, 1990). Inibidores do tipo Bowman-Birk
de dicotiledôneas têm baixo peso molecular, variando de 8 a 10 kDa, um alto conteúdo de
cisteína, possuindo afinidade por um gama de serina-proteases, como tripsina, quimotripsina e
elastase. Já inibidores do tipo Bowman-Birk de monocotiledôneas são divididas em duas
subclasses com diferentes pesos: ~ 8 kDa e ~ 16 kDa (SCARAFONI et al., 2008).
Entre os mais conhecidos inibidores enzimáticos, estão os inibidores de enzimas
proteolíticas (tripsina, quimotripsina) e amilolíticas (alfa-amilase) produzidas pelo pâncreas.
São os inibidores de enzimas proteolíticas de ocorrências muito generalizadas em tecidos
animais e vegetais. Embora a função biológica desses inibidores não seja totalmente conhecida,
acredita-se que eles tenham função na regulação da proteólise, e são essenciais para proteger
fluídos ou tecidos de degradação por atividades proteolíticas indesejadas (HABIB; FAZILI,
2007).
Por conseguinte, na literatura, além da sua função natural, já estão bem documentadas,
diversas ações heterólogas, destacando-se os estudos realizados com os inibidores de proteases,
presentes na semente de tamarindo, como apresentados neste estudo.
2.3.5 Inibidores enzimáticos em tamarindo e suas atividades heterólogas
Decorrente das mais diversas propriedades heterólogas que os inibidores enzimáticos
de tamarindo apresentam, há evidências de importantes papéis na cura ou prevenção de diversas
doenças. Muitos trabalhos têm demonstrado várias aplicações terapêuticas desses inibidores.
Desse modo, como resultado da busca utilizando os MeSH: Tamarindus, Tamarindus indica,
trypsin inhibitors, protease inhibitors nas bases de dados Pubmed, Lilacs e Scielo, foi possível
agrupar nove estudos que relatassem essas diversas aplicações (Tabela 8).
A homeostase celular requer um equilíbrio entre proteases e seus inibidores
endógenos. Quando esse equilíbrio é perdido em favor das proteases, são desencadeados
inúmeros processos biológicos, como, por exemplo, processamento e turnover de proteínas
endógenas, digestão de proteínas alimentares, regulação da formação e lise dos coágulos,
68
ativação de vias de apoptose, germinação das plantas, esporulação, ativação hormonal,
translocação através das membranas, fertilização, controle de resposta imune, diferenciação
celular e crescimento (SANTOS et al., 2012).
Em tamarindo e especialmente em suas sementes alguns inibidores enzimáticos têm
sido estudados com foco em suas propriedades naturais, mas, também heterólogas. Araújo et
al. (2005) purificou um inibidor do tipo Kunitz e caracterizou um inibidor de tripsina presente
na semente do tamarindo, o qual apresentou massa molecular estimada por eletroforese em gel
de poliacrilamida com dodecil sulfato (SDS-PAGE) de aproximadamente 20 kDa, inibição do
tipo não competitiva e rendimento de 2,2% com atividade inibitória específica para tripsina de
19600 UI/mg proteína. Nesse estudo, foi testada a atividade bioinseticida in vitro em relação a
pragas de insetos de diferentes ordens e in vivo durante o desenvolvimento larval de Ceratitis
capitata (mosca da fruta) e Callosobruchus maculatus (gorgulho de caupi) com um modelo de
bioensaio.
No estudo de Rao e Gowda (2008) um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus
indica L. foi purificado, apresentando massa molecular estimada por eletroforese em gel de
poliacrilamida com dodecil sulfato (SDS-PAGE) de aproximadamente 21 kDa. Atividade
específica de 3000 UI/mg e rendimento de 2,54%. Nesse estudo, adicionalmente foram
realizdas as análises de: Espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por
matriz (MALDI-TOF-MS); composição e sequência de aminoácidos; alinhamento sequencial
múltiplo; determinação de pI; e, testes de estabilidade em diferentes pHs e temperaturas.
Propondo que ele atua na proteção do embrião e da planta jovem e, além disso, funciona como
proteína de armazenamento.
Pandey; Jamal (2014), purificaram um inibidor de tripsina da semente de
Tamarindus indica L. identificado também como do tipo Kunitz apresentando uma massa
molecular estimada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato (SDS-PAGE)
de aproximadamente 21 kDa e atividade inibitória aproximada de 84%, com a IC50 de 1.68
µg/ml. Nesse estudo, foram utilizadas larvas da espécie Helicoverpa armigera para os testes de
atividades de fertilidade; fecundidade; determinação do índice de crescimento, atividades
larvicidas, pupicidas e duração do desenvolvimento. A proteína, retardou o crescimento e o
desenvolvimento, prolongou a duração do desenvolvimento larval-pupário e afetou
adversamente a fertilidade e a fecundidade de H. armigera. Sugerindo assim, que o inibidor de
tripsina de tamarindo tem efeito no controle da praga H. armigera. Diante dos estudos
discutidos pode-se perceber que esses três estudos acima apresentam sua relevância e atividades
heterólogas do inibidor de tripsina de tamarindo, porém sem aplicação para saúde humana.
69
No estudo de Fook et al. (2005), um outro inibidor de serino protease com 14,4 kDa,
denominado PG50, também foi purificado de sementes de tamarindo, com uma atividade
inibitória específica de 434.00 UI/mg em 77% de inibição para tripsina e IC50 de 55,96 µg/mL.
No entanto, o PG50 apresentou atividade seletiva contra tripsina bovina mas, também inibiu
elastase neutrofílica humana. O PG50 não mostrou atividade citotóxica, tampouco hemolítica
para células sanguíneas humanas, exibindo inibição diferente na liberação de elastase pelo fator
de agregação plaquetária (PAF), em 44,6% e na liberação por n-formil-metionil-leucil-
fenilalanina (fMLP), em 28,4%. Isso mostra que o PG50 afetou, preferencialmente, a liberação
de elastase pelos estímulos de PAF; isso pode indicar inibição seletiva nos receptores de PAF,
apresentando, então, atividade anti-inflamatória.
Ribeiro et al. (2015) isolaram (purificação parcialmente) um inibidor de tripsina da
semente de tamarindo (ITT); apresentando um peso molecular estimado por eletroforese em gel
de poliacrilamida com dodecil sulfato (SDS-PAGE) de, aproximadamente, 21 kDa, com uma
atividade específica de 102,950 UI/mg e rendimento de 2,2%. Esse inibidor, administrado em
modelo in vivo de ratos Wistar eutróficos, apresentou efeito sacietogênico, reduzindo o
consumo alimentar e o ganho de peso associado ao aumento sérico de colecistoquinina (CCK).
Carvalho et al. (2016) utilizaram o mesmo inibidor de tripsina de tamarindo
parcialmente purificado (ITT) em modelo in vivo, sendo constatado, além da redução do
consumo alimentar em ratos Wistar com obesidade e síndrome metabólica, o efeito na redução
de TNF-α e uma redução na média da glicemia, embora não significativa. Ressalta-se que o ITT
não apresentou hepatotoxidade nos dois últimos estudos citados acima.
Costa et al. (2018), utilizando o ITT, ainda parcialmente purificada, em modelo in
vivo, com ratos Wistar com obesidade, verificaram a redução da ingestão dietética,
independentemente do aumento de CCK sérico. Essa redução pode ter sido causada por uma
diminuição significativa na concentração plasmática de leptina nesses animais, que, geralmente,
é alta na obesidade, um efeito também atribuído ao ITT, uma vez que a leptina influencia,
diretamente, no efeito sacietogênico do CCK.
Medeiros et al. (2018) purificaram um inibidor de protease da semente de tamarindo
(ITTp); com peso molecular estimado por espectrometria de massa com fonte de ionização
eletrospray (ESI-MS) de aproximadamente 19 kDa; com uma atividade específica de 2196
UI/mg e com rendimento de 2,4%. Foram realizados também testes in vivo com ratos Wistar
com obesidade, constatando um efeito de redução de leptina, sem ação sobre CCK, assim como
já havia sido constatado com o inibidor parcialmente purificado.
Carvalho et al. (2019) utilizaram o ITTp em modelo in vivo, também em ratos
70
Wistar com obesidade. Todos os animais, com diagnóstico de obesidade tratados com o ITTp,
apresentaram redução plasmática e na expressão relativa de mRNA de TNF-α em tecido
adiposo, bem como imuno-histoquimica que mostrou imuno coloração negativa (0) para TNF-
α no tecido adiposo de animais com obesidade tratados com ITTp, diferentemente do grupo não
tratado que apresentou coloração intensa nos compartimentos de tecido perirrenal com
imunocoloração positiva (+3), por densidade óptica, sendo reconhecido com um agente anti-
TNF-α.
71
Tabela 8. Resultado da busca em estudos sobre inibidores enzimáticos (Inibidores de tripsina, elastase e quimiotripsina), Tamarindus indica L. e
aplicação na saúde de modo direto e indireto. Estudo Tipo de
inibidor enzimático
Fonte do inibidor
Características do inibidor
Desenho metodológico Efeito Bioativo
Mecanismo de ação sugerido Perspectiva de uso para
saúde Araújo
et al. (2005)
Kunitz Semente de
tamarindo
Massa molecular de aproximadamente 20 kDa, com atividade específica de 19.600 UI/mg de proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi purificado por meio de uma coluna de HPLC de fase reversa (Vydac C-18 TP 1022). Sendo realizado em seguida testes para atividade inibitória nos extratos do intestino de Plodia interpuncptella Alabama argilácea, Spodoptera frugiperda. Posteriormente foram testadas as atividades para avaliação do desenvolvimento desses insetos.
Atividade bioinseticida in vitro contra enzimas digestivas de insetos de diferentes ordens incluindo: Plodia interpuncptella (26.7%), Alabama argilácea (53.8%) e Spodoptera frugiperda (75.5).
O efeito do inibidor de tripsina sobre a mortalidade de larvas foi provavelmente devido ao fato de o sistema digestivo dessas larvas ser baseado tanto em serino proteases do tipo quimotripsina e tripsina. Esse inibidor é específico para enzimas semelhantes à tripsina, o que dificulta a disponibilidade de aminoácidos para o crescimento do inseto, levando a diminuição do desenvolvimento e à alta mortalidade.
-
Rao; Gowda (2008)
Kunitz Semente de
tamarindo
Massa molecular de aproximadamente 21 kDa, com atividade específica de 3000 UI/mg de proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi purificado por meio de uma coluna com afinidade para quitina (9 × 2,5 cm) previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,0, contendo NaCl 0,5 M. O inibidor de tripsina foi recuperado como a proteína não ligada. As frações que mostraram inibição contra tripsina foi dialisada contra o mesmo tampão, sem o NaCl. Em seguida foi realizado os testes de: Ionização por dissorção a laser assistida por matriz-tempo de espectroscopia de massa (MALDI-TOF-MS); composição de aminoácidos e análise de seqüências de aminoácidos; alinhamento Sequencial Múltiplo; determinação de pI; estabilidade em pH e temperatura.
Proteção do embrião e da planta jovem, além disso, funciona como proteína de armazenamento.
A abundância de inibidor de tripsina na semente de tamarindo, bem como a sua composição de aminoácidos, a degradação preferencial durante a germinação e a ausência de um papel catalítico na defesa das plantas demonstram claramente que se trata de uma “Proteína de armazenamento”. A baixa atividade catalítica do inibidor de tripsina pode ter um papel na proteção do embrião e da planta jovem.
-
72
Pandey; Jamal. (2014)
Kunitz Semente de
tamarindo
Massa molecular de aproximadamente 21 kDa com uma atividade específica de 1041,47 UI/mg proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi purificado por meio do uso das colunas Sephadex G-75, DEAE-Sepharose e Trypsin-Sepharose CL-4B. Foram utilizadas larvas da espécie H. armigera, sendo realizado testes para atividade inibitória nos extratos de seus intestinos. Em seguida foram testadas as atividades de fertilidade e fecundidade e a determinação do índice de crescimento, atividades larvicidas, pupicidas e duração do desenvolvimento.
Retardou o crescimento e o desenvolvimento, prolongou a duração do desenvolvimento larval-pupário e afetou adversamente a fertilidade e a fecundidade de H. armigera.
A associação possível desse inibidor de tripsina com H. armigera está relacionado com o fato do intestino médio dificultar o transporte de enzimas e seus produtos de hidrólise, o que, em combinação com a proteólise reduzida, é um fator limitante na disponibilidade de aminoácidos para o crescimento, levando a diminuição do desenvolvimento e à alta mortalidade.
-
Fook et al.
(2005)
Bowman-Birk
Semente de
tamarindo
Massa molecular de 14,4 kDa, com uma atividade específica de 434.00 UI/mg proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi purificado por meio de uma coluna - Sephadex G-50. Foi realizado o ensaio inibitório de elastase de neutrófilos humanos. Determinação do valor de IC50 para elastase de neutrófilos humanos. Ensaio da atividade inibidora contra proteases serina e cisteína. Citotoxicidade e ensaio hemolítico. Efeito na liberação de elastase neutrofílica humana estimulada por PAF e fMLP.
Afetou preferencialmente a liberação de elastase pelos estímulos de PAF e isso pode indicar inibição seletiva nos receptores de PAF.
A inibição da liberação de elastase é indicativa de um candidato a um produto anti-inflamatório. Esse inibidor de elastase de neutrófilos humano inibiu a formação de pNA (p-nitroanilida)em 44,6% para indução de PAF e 28,4% para indução de fMLP. Estimulação com PAF resulta em utilização da via de liberação intracelular p38 MAPK (p38 proteína quinase ativada), ao invés de via p42 / 44 como é utilizado pelo indutor fMLP. Esses resultados mostraram que o inibidor o afetou preferencialmente a liberação de elastase pelos estímulos do PAF e isso pode indicar inibição seletiva pelos seus receptores.
Anti-
inflamatório.
Ribeiro et al.. (2015)
- Semente de
tamarindo
Massa molecular majoritária de aproximadamente 21 kDa, com atividade específica de 102.950 UI/mg de proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi isolado por meio do uso da coluna Tripsina-Sepharose (CNBr-activated sepharoseTM 4B, GE healthcare). Esse inibidor foi utilizado em dois experimentos, no primeiro experimento
Reduziu o consumo alimentar, diminuindo o ganho de peso e elevou a concentração de CCK. Não houve hepatotoxicidade.
O efeito sacietogênico ocorreu, provavelmente devido ao aumento plasmático de CCK.
Secretagogo de CCK e efeito sacietogênico
73
para avaliar o seu efeito no consumo alimentar, ganho de peso e digestibilidade in vivo em ratos Wistar eutróficos. Foram realizadas dosagens de glicose, triglicerídeo (TG), colesterol total, lipoproteína de alta densidade (HDL), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). Órgãos foram avaliados para análise das alterações histopatológicas. O segundo experimento foi realizado para avaliar o seu efeito na saciedade a curto prazo. Foram avaliados ainda: GGT, proteína total, albumina, globulina, proteína C-reativa. E a avaliação do consumo alimentar e evolução do peso corporal. Além da concentração plasmática de CCK.
Carvalho et al. (2016)
- Semente de
tamarindo
Massa molecular majoritária de aproximadamente 21 kDa, com uma atividade específica de 83.970,58 UI / mg de proteína.
Um inibidor de tripsina de sementes de Tamarindus indica L. foi isolado por meio do uso da coluna Tripsina-Sepharose (CNBr-activated sepharoseTM 4B, GE healthcare), em seguida foram realizados testes in vivo com ratos Wistar com síndrome metabólica. Foram analisados: Consumo alimentar, ganho de peso, parâmetros bioquímicos (glicose, TG, HDL-C, LDL-C, colesterol total, TGO, TGP, GGT) e inflamatórios (TNF-α e IL-6).
Redução do consumo alimentar e concentração plasmática de TNF-α.
Redução do consumo alimentar e redução da concentração plasmática de TNF-α não foi explicada. Entretanto, ocorreram independente da perda do ganho de peso.
Sacietogênico e anti-inflamatório.
74
Costa et al.
(2018)
- Semente de
tamarindo
Massa molecular majoritária de aproximadamente 21 kDa, com uma atividade específica de 39.700,58 UI / mg de proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi isolado por meio do uso da coluna Tripsina-Sepharose (CNBr-activated sepharoseTM 4B, GE healthcare) e realizados testes in vivo com ratos Wistar com obesidade e analisados os seguintes parâmetros: consumo alimentar, medições zoométricas, CCK plasmática, leptina plasmática, expressão relativa de mRNA dos genes relacionados com CCK e a expressão do gene ob no tecido adiposo subcutâneo.
Redução da ingestão dietética e concentração de letina plasmática independentemente do aumento de CCK plasmático.
A redução da ingestão dietética pode ter sido causada por uma diminuição significativa na concentração plasmática de leptina nesses animais, que geralmente é alta na obesidade, uma vez que a leptina influencia diretamente o efeito sacietogênico do CCK. A redução na concentração plasmática de leptina não foi explicada.
Efeito sacietogênico e anti-lepdinêmico
Medeiros et al. (2018)
Kunitz Semente de
tamarindo
Massa molecular de aproximadamente 19 kDa, com uma atividade específica de 2196 UI/mg de proteína.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi purificado por meio das colunas Tripsina-Sepharose (CNBr-activated sepharoseTM 4B, GE healthcare) e HPLC C18 – Vydac. Em seguida foi realizado os testes de: redução e alquilação; sequenciamento parcial; alinhamento múltiplo; estabilidade a agentes desnaturantes; Ki e IC50 contra tripsina e ponto de PI. Foram realizados testes in vivo com ratos Wistar com obesidade e avaliadas as concentrações de CCK e leptina.
Redução na concentração plasmática de leptina, sem ação sobre CCK.
A redução na concentração plasmática de leptina não foi explicada, mas apresentou o mesmo efeito já visto para esse inibidor parcialmente purificado.
Efeito anti-
lepdinêmico
Carvalho et al. (2019)
- Semente de
tamarindo
Massa molecular de aproximadamente 19 kDa, com uma atividade específica de 40.100,31 UI / mg de proteína UI/mg.
Um inibidor de tripsina de semente de Tamarindus indica L. foi purificado por meio das colunas Tripsina-Sepharose (CNBr-activated sepharoseTM 4B, GE healthcare) e HPLC C18 – Vydac, em seguida foram realizados testes in vivo com ratos Wistar com obesidade. Foram analisados: Consumo alimentar, ganho de peso, parâmetros bioquímicos (glicose, TG, VLDL-c, HDL-C, LDL-C, colesterol total, TGO, TGP, GGT) e
Redução do consumo alimentar e do perfil lipídico (TG e VLDL-c – lipoproteína de muita baixa densidade). Redução da concentração plasmática, expressão relativa de mRNA e imunohistoquímica para TNF-α
Redução do consumo alimentar e do perfil lipídico (TG e VLDL-c) não foi explicada. A redução da concentração plasmática, expressão relativa de mRNA e imunohistoquímica para TNF-α ocorreram independente da expressão relativa de mRNA de PPAR-γ.
Sacietogênico antilipidêmico e anti-TNF-α.
75
inflamatório (TNF-α). Bem como a expressão relativa de mRNA e iminuhistoquímica de TNF-α no tecido adiposo. Analisou-se a expressão relativa de mRNA de PPAR-γ também em tecido adiposo.
2.3.6 Perspectivas de aplicação para saúde dos Inibidores enzimáticos de tamarindo
No mercado já existe um fitoterápico comercializado, composto por inibidores de
tripsina isolados: Potein® (CHEN et al., 2012) sendo utilizado com a finalidade de
emagrecimento. Adicionalmente, sabe-se que moléculas puras com ações inibitórias têm sido
sintetizadas e utilizadas como medicamentos em diversos tratamentos (YANOVSKI;
YANOVSKI, 2002; LI et al., 2005). Como exemplo, o orlistat que reduz a digestão ou absorção
de nutrientes (YANOVSKI; YANOVSKI, 2002). E também, os inibidores específicos da
recaptação de serotonina (fluoxetina), bem como a sibutramina que têm sido utilizada no
tratamento da obesidade (YANOVSKI; YANOVSKI, 2002).
Nesse contexto, o isolamento, a purificação, a caracterização e as bioatividades de
inibidores de tripsina em sementes, dentre elas as de tamarindo, têm sido relatado em alguns
estudos, e desse modo apresentam os inibidores enzimáticos como pretendentes na
biopropecção de biomoléculas com potencial para saúde.
Dentre as atividades heterólogas, descritas na literatura para os inibidores enzimáticos
de tamarindo, tem-se a atividade bioinseticida demostrada nos estudos de Araújo et al. (2005)
e Pandey; Jamal (2014). No entanto, com perspectiva de uso para saúde humana, o estudo de
Fook et al. (2005). apresentou um inibidor de tripsina com ação inibitória para elastase de
neutrófilo humano (atuação anti-inflamatória) e os estudos desenvolvidos pelo grupo Brasileiro
de pesquisa Nutrição e substâncias bioativas para saúde (NutriSBioativoS), apresentaram um
inibidor de tripsina com atividades: sacietogênica, hipoglicêmica, hipolipemiante, anti-
inflamatória, anti-TNF- α entre outras (RIBEIRO et al., 2015; CARVALHO et al., 2016;
COSTA et al., 2018; MEDEIROS et al., 2018; CARVALHO et al., 2019).
Em face de todas essas atividades citadas, sabe-se que ainda não há explicações para
a maioria dos efeitos dos inibidores de tripsina para saúde, grande parte dos mecanismos de
ação precisam ser esclarecidos. Tal fato pode ser exemplificado pelos estudos de Ribeiro et al.
(2015) e Costa et al. (2018), já que, no primeiro estudo, há uma suposição de que o efeito
sacietogênico do inibidor de tripsina em ratos Wistar eutróficos ocorre pelo aumento da
concentração plasmática de CCK. Já no segundo estudo, com ratos Wistar com obesidade, não
há uma correlação direta, mostrando que, quando se trata de secretagogos de CCK, várias vias
podem estar envolvidas e na obesidade outros fatores como a hiperleptinemia pode influenciar
diretamente na ação de CCK (BARRACHINA et al., 1997; MATSON et al., 2000).
Assim, são necessários mais estudos para que determinadas vias possam ser estudadas
77
e assim se descubra a(s) via(s) de atuação desses inibidores. Como por exemplo, avaliar a
composição corporal e o efeito desses inibidores sobre o tecido adiposo, considerando que no
estudo de Carvalho et al. (2016) com ratos Wistar com obesidade e síndrome metabólica
tratados com ITT, houve redução da ingestão alimentar e concentração plasmática de TNF - α
independente da perda de peso.
Sabe-se que dietas hiperlipídicas e hiperglicêmicas estimulam, consideravelmente, a
lipogênese (UYEDA; YAMASHITA; KAWAGUCHI, 2002), aumentando a expressão de
enzimas lipogênicas (DELZENNE et al., 2001). A síntese de enzimas lipogênicas pode ocorrer
estimuladas por fatores de transcrição, como SREBP3; ChREBP, ativado em resposta à
glicemia alta (UYEDA; YAMASHITA; KAWAGUCHI, 2002) e à estimulação do receptor
nuclear PPAR-γ (UYEDA; YAMASHITA; KAWAGUCHI, 2002). Já foi sugerido que o TTIp
pode estar atuando em algumas dessas vias, reduzindo a expressão de enzimas lipogênicas ou
até reduzindo a expressão de fatores de transcrição, como SREBP e ChREBP, visto que não
influenciou a expressão do gene PPAR-γ, candidato à indução de lipogênese condicionada por
dietas com alto índice glicêmico (SAMPAIO et al., 2007; CARVALHO et al., 2016).
Além disso, deve-se considerar que a atividade antitripsina do ITT parecer ser um fator
condicionante para o aumento de CCK plasmática. Dessa forma, agentes encapsulantes que
promovam a estabilidade do ITT podem ter relevância clínica. Em um estudo anterior com ratos
Wistar com obesidade (CARVALHO et al., 2016), CCK plasmático não aumentou em resposta
ao ITT, mas foi observada uma discreta redução no consumo alimentar. Pode-se sugerir que
esses efeitos poderiam ser diferentes se o ITT fosse oferecido encapsulado. Queiroz et al.
(2018), nanoencapsulou o ITT, potencializando sua atividade antitripsina. Sendo assim, testar
essa nova partícula em modelo experimental pode ser uma boa estratégia na tentativa de
potencializar os efeitos sacietogênicos na obesidade.
Em recente revisão da literatura, Lima et al. (2019), destacam que estudos envolvendo
inibidores de tripsina e alterações metabólicas, como obesidade, diabetes, síndrome metabólica,
hiperlipidemias, têm utilizado a gavagem como meio de administração dos inibidores, ou seja,
diretamente no trato gastrointestinal. No entanto, ressalta-se que a submissão dessas moléculas
ao processo digestivo pode gerar transformações em suas estruturas sendo difícil prever em
modelos in vivo mas, possíveis em modelos in vitro ou in silico, mesmo que não de modo
definitivo.
Diante dessas limitações, com o avanço das novas tecnologias, tem-se mais uma vez
o encapsulamento dessas moléculas, em matrizes que garantam a entrega do composto sem
modificações, uma nova forma de utilização (LI et al., 2014; QUEIROZ et al., 2018). O
78
encapsulamento promove não apenas a viabilidade, mas, principalmente protege a
funcionalidade e pode facilitar liberação do composto em partes específicas do organismo.
2.3.7 Conclusões
Apesar dos desafios na prospecção de novas moléculas para o tratamento das diversas
alterações metabólicas, os resultados com inibidores de tripsina das sementes de tamarindo são
promissores. Os diferentes efeitos fisiológicos dessas moléculas e a segurança já atestado na
literatura científica, torna os inibidores de tripsina potentes candidatos à ação em algumas
doenças crônicas. São necessários mais estudos que possam cada vez mais aprofundar o
conhecimento na área, para elucidar todas as propriedades dos inibidores enzimáticos de
tamarindo, a fim de obter informações suficientes validando seu uso na indústria farmacêutica.
3. CONCLUSÃO
Os resultados permitem concluir que uma dieta de alto índice glicêmico e alta carga
glicêmica induziu a obesidade em ratos Wistar, com alteração em VLDL-c e TG, além de
aumentar a expressão relativa de mRNA de PPAR-γ em tecido adiposo viseral e subcutâneo.
No entanto, quando esses animais com obesidade e dislipidêmicos foram tratados com ITTp
por 10 dias, foi constatada a redução da ingestão de alimentos e da inflamação crônica,
reduzindo as concentrações plasmáticas de TNF-α e a expressão relativa de seu gene no tecido
adiposo visceral. Além disso, o ITTp também atuou, reduzindo a dislipidemia apresentada pelos
mesmos, independentemente de PPAR-γ. Desse modo, apesar dos desafios na prospecção de
novas moléculas para o tratamento das diversas alterações metabólicas, provocadas pela
obesidade, os resultados com inibidores de tripsina das sementes de tamarindo são promissores.
São necessários mais estudos que possam elucidar os mecanismos de ação relacionados a todas
as propriedades bioativas, atribuídas ao ITT, a fim de obter informações suficientes, validando
seu uso na indústria farmacêutica.
79
4. TRAJETÓRIA ACADÊMICA
Este estudo é resultado de um grande projeto do grupo NutriSBioativoS, coordenado
pela prof. Dra. Ana Heloneida de Araújo Morais, envolvendo, hoje, quatorze alunos de pós-
graduação de dois programas (nutrição e bioquímica), sendo seis de mestrado e oito de
doutorado. Faço parte do grupo desde a graduação, quando fiz minha iniciação científica; há
nove anos venho estudando a atuação dos inibidores de tripsina e suas atividades heterólogas.
Mais especificamente, este trabalho foi uma continuação do meu mestrado, quando tive a
oportunidade, nesses três anos de doutorado, de me aprofundar na temática da obesidade e
desordens metabólicas avaliando a atuação do inibidor de tripsina de semente de tamarindo,
neste estudo purificado, nessas comorbidades.
É pertinente dizer que, nesses anos de doutorado, além da produção dos três artigos de
minha autoria conforme já apresentados nesta tese, pude colaborar com alguns outros artigos
que já estão publicados bem como trabalhos apresentados em congressos internacionais e
resumo expandido:
-“Characterization of novel tryspin inhibitor in raw and toasted peanuts using a simple
improved isolation”. Acta Chromatographica, 2017;
-“Biochemical characterisation of a Kunitz-type inhibitor from Tamarindus indica L. seeds and
its efficacy in reducing plasma leptin in an experimental model of obesity”. Journal of Enzyme
Inhibition and Medicinal Chemistry, 2018;
-“A CCK secretagogue protein from tamarindo seeds decreases leptin plasma concentrations in
obese Wistar rats”. Obesity, 2018.
-“Proteínas bioativas das sementes de tamarindo reduzem leptina plasmática independente da
perda de peso em ratos com obesidade”, Revista Saúde, 2018.
-“Proteínas bioativas das sementes de tamarindo reduzem leptina plasmática independente da
perda de peso em ratos com obesidade”, apresentado no XIII Congresso Internacional de
Nutrição Funcional, 2017. Aprovado para elaboração de resumo expandido.
-“Anti-TNF-α reduz triglicerídeos e VLDL-c em modelo experimental de obesidade”,
apresentado no XIV Congresso Internacional de Nutrição Funcional, 2018. Aprovado para
elaboração de resumo expandido.
- “A anti-obesity and anti-inflammatory trypsin inhibitor from tamarind reduces food Intake
and improves inflammatory status in rats with metabolic syndrome”, apresentado no IUNS
21st ICN (International Congress of Nutrition), 2017.
-“Dieta experimental induz síndrome metabólica em modelo animal”, apresentado no XIII
80
Congresso Internacional de Nutrição Funcional, 2017.
- “Encapsulação de extrato rico em carotenoides de melão Cantaloupe (Cucumis melo L.
cantaloupensis) em proteína do soro do leite concentrada”, apresentado no XIV Congresso
Internacional de Nutrição Funcional, 2018.
- “Caracterização físico-química de inibidor de tripsina isolado de sementes de tamarindo
(tamarindus indica l.) Nanoencapsulado em proteína do leite isolada”, apresentado no XIV
Congresso Internacional de Nutrição Funcional, 2018.
Além dos artigos, também co-orientei alguns trabalhos de conclusão de curso:
- “Efeito de um modelo de dieta de cafeteria no estado nutricional em ratos wistar” - Gerciane
Silva de Oliveira;
- “Dieta de cafeteria: produção, composição nutricional e influência na glicemia de jejum em
modelo animal” - Jéssika Priscilla Sales de Oliveira Santos.
81
REFERÊNCIAS AEBERLI, I. et al. Moderate Amounts of Fructose Consumption Impair Insulin Sensitivity in Healthy Young Men A randomized controlled trial. Diabetes Care., v.36, p.150-156, 2013. AGUILERA, C. et al. Obesity: Factor de riesgo o enfermedad? Revista Médica de Chile, v.147, p. 470-474, 2019. ALESSA, H. B. et al. Carbohydrate quality and quantity and risk of type 2 diabetes in US women. The American Journal of Clinical Nutrition, v.102, n.6, p.1543-1553, 2015. ARAÚJO, C.L. et al. In vivo bioinsecticidal activity toward Ceratitis Capitata (fruit fly) and Callosobruchus Maculatus (cowpea weevil) and in vitro bioinsecticidal activity toward different orders of insect pests of a trypsin inhibitor purified from tamarind tree (Tamarindus Indica) seeds. Agricultural Food Chemistry, v.53, p.4381–4387, 2005. ARNER, P. Differences in lipolysis between human subcutaneous and omental adipose tissues. Annals of Medicine, v.27, p.435–438, 1995. AUGUSTIN, L.S.A. et al. Glycemic index, glycemic load and glycemic response: An International Scientific Consensus Summit from the International Carbohydrate Quality Consortium (ICQC). Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, v.25, p.795-810, 2015. BARRACHINA, M.D. et al. Synergistic interaction between leptin and cholecystokinin to reduce short-term food intake in lean mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.94, n.19, p. 10455–60, 1997. BARROSO, I. et al. Dominant negative mutations in human PPARg associated with severe insulin resistance, diabetes mellitus and hypertension. Nature, v.402, p.880–883, 1999. BERNARDIS, L.L.; PATTERSON, B.D. Correlation between Lee index and carcass fat content in weanling and adult female rats with hypothalamic lesions. Journal of Endocrinology, v.40, p.527–528, 1968. BERTOLO, M.B. Como diagnosticar e tratar artrite reumatóide. Revista Brasileira de Medicina, v.65, p.64–72, 2008. BLEICHER, K.B. et al. Use of real-time gene-specific polymerase chain reaction to measure RNA expression of three family members of rat cytochrome P450. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, v.15, p.133-142, 2001. BOCARSLY, M.E. et al. High-fructose corn syrup causes characteristics of obesity in rats: increased body weight, body fat and triglyceride levels. Pharmacology Biochemistry Behavior, v.97, p.101-106, 2010. BORTOLIN, R.C. et al. A new animal diet based on human Western diet is a robust diet-induced obesity model: comparison to high-fat and cafeteria diets in term of metabolic and gut microbiota disruption. International Journal of Obesity, v.42, p.525-534, 2018.
82
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v.72, p.248–254, 1976. BRAND-MILLER, J.C. et al. Glycemic index and obesity. The American Journal of Clinical Nutrition, 76, 281S–285S, 2002. BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos, 4 rd ed. Instituto Adolfo Lutz, Ministério da Saúde, Brasília; 2005. p. 98-99. BROWN, J.F.; PLUTZKY, J. Peroxisome proliferator-activated receptors as transcriptional nodal points and therapeutic targets. Circulation, v.115, p.518–533, 2007. BUETTNER, R.; SCHÖLMERICH, J.; BOLLHEIMER, L.C. High-fat diets: Modeling the metabolic disorders of human obesity in rodents. Obesity, v.15, p.798-808, 2007. CACCIAPAGLIA, F. et al. Cardiovascular safety of anti-TNF-alpha therapies: Facts and unsettled issues. Autoimmunity Reviews, v.10, p.631–635, 2011. CAMPBELL, G.J.; SENIOR, A.M.; BELL-ANDERSON, K.S. Metabolic Effects of High Glycaemic Index Diets: A Systematic Review and Meta-Analysis of Feeding Studies in Mice and Rats. Nutrients, v.9, p.646, 2017. CARTER, A.M. Inflammation, thrombosis and acute coronary syndromes. Diabetes Vascular Disease Research, v.2, p.113–121, 2005. CARVALHO, F.M.C. et al. A trypsin inhibitor from tamarind reduces food intake and improves inflammatory status in rats with metabolic syndrome regardless of weight loss. Nutrients, v. 8, p.1–14, 2016. CARVALHO, F.M.C. et al. Anti-TNF-α Agent Tamarind Kunitz Trypsin Inhibitor Improves Lipid Profile of Wistar Rats Presenting Dyslipidemia and Diet-induced Obesity Regardless of PPAR-γ Induction. Nutrients, v.11, n.3, 2019. CARVALHO, F.M.C. et al. Directly measurement and calculation of the glycemic index and glycemic load in an experimental pellet-diet for obesity induction and its metabolic effects in Wistar rats. International Food Research Journal, Unpublished work, 2019. CASTRO, T. G.; NOVAES, J. F.; SILVA, M. R.; COSTA, M. B.; FRANCESCHINI, S. C. C.; TINÔCO, A. L. A.; LEAL, P. F. G. Caracterização do consumo alimentar, ambiente socioeconômico e estado nutricional de pré-escolares de creches municipais. Revista de Nutrição, v. 18, n. 3, 2005. CAVALCANTI, C. B. S.; CARVALHO, S. C. B. E.; BARROS, M. V. G. Indicadores antropométricos de obesidade abdominal: revisão dos artigos indexados na biblioteca SciELO. Revista Brasileira de Cineantropometria de Desempenho Humano, v. 11, n. 2, p. 217-225, 2009.
83
CHEN, W. et al. Suppressive effect on food intake of a potato extract (Potein®) involving cholecystokinin release in rats. Bioscience Biotechinology Biochemistry, v.76, p.1104–1109, 2012. CICONELLI, R.M. Artrite reumatóide—tratamento. Revista Sinopse, v.3, p.1–17, 2005. COSTA, S.I. et al. Satietogenic protein from tamarind seeds decreases food intake, leptin plasma and CCK-1R gene expression in obese Wistar rats. Obesity Facts, v.11, p.440-453, 2018. COX, M.M.; NELSON, D.L. Genes and Chromosomes. In: NELSON, D.L; LEHNINGER, A.L.; COX, M.M. Lehninger Principles of Biochemistry; 4th ed., WH Freeman & Co.: New York, NY, USA, 2008, cap. 24. CRINO, M. et al. The Influence of Population Weight Gain and Obesity of the Macronutrient Composition and energy Density of the Food Supply. Current Obesity Reports, v.4, p.1-10, 2015. DE SOUZA, C.T. et al. Consumption of a fat-rich diet activates a proinflammatory response and induces insulin resistance in the hypothalamus. Endocrinology, v.146, p.4192–4199, 2005. DEKKER, M.J. et al. Fructose: a highly lipogenic nutrient implicated in insulin resistance, hepatic steatosis, and the metabolic syndrome. Amerivan journal of physiology, endocrinology and metabolism, v.299, p.685-94, 2010. DELZENNE, N. et al. Study of the regulation by nutrients of the expression of genes involved in lipogenesis and obesity in humans and animals. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease, v.11, p.118-21, 2001. DODD H. et al. Calculating meal glycemic index by using measured and published food values compared with directly measured meal glycemic index. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 94, p.992-996, 2011. DUCA, F.A.; ZHONG, L.; COVASA, M. Reduced CCK signaling in obese-prone rats fed a high fat diet. Hormones Behavior, v.64, p.812–817, 2013. DURUM, S.K.; MUEGGE, K. Cytokines linking the immune and inflammatory systems. In: RICH, R. Clinical Immunology, 1st ed., Mosby-Year book: Maryland Heights, MO, USA, 1996; p. 350–362. FAO. Carbohydrates in human nutrition, a Joint FAO/WHO Report. FAO Food and Nutrition. Paper 66, Rome, 1998. FONSECA, F.A.H. Farmacocin etica das estatinas. Arquivo Brasileiro de Cardiologia, v.85, p.9–14, 2005. FOOK, J.M. et al. A serine proteinase inhibitor isolated from Tamarindus indica seeds and its effects on the release of human neutrophil elastase. Life Sciences Journal, v.76, p.2881–2891, 2005.
84
FOSTER-POWELL K, HOLT HAS, BRAND-MILLER CJ. International table of glycemic index and glycemic load values: 2002. The American Journal of Clinical Nutrition, v.76, p.5–56, 2002. GBD. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. The New England Journal of Medicine, v.377, p.13–27, 2017. GIBNEY, M.J.; FORDE, C.G.; MULLALLY, D.; GIBNEY, E.R. Ultra-processed foods in human health: a critical appraisal. The American Journal of Clinical Nutrition, 2017. GOMEZ, G.; ENGLANDER, E.W.; GREELEY Jr, G.H. Nutrient inhibition of ghrelin secretion in the fasted rat. Regulatory Peptides, v.117, p.33–36, 2004. GRAHAM, T.E.; ADAMO, K.B. Dietary carbohydrate and its effects on metabolism and substrate stores in sedentary and active individuals. Canadian Journal of Applied Physiology, v.24, p.393–415, 1999.
GRANNER, D.; PILKIS, S. The genes of hepatic glucose metabolism. The Journal of Biological Chemistry, v.265, p.10173-10176, 1990. GUIDE FOR THE CARE AND USE OF LABORATORY. Commttiee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research; Division on Earth and Life Studies; Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed.; The National Academies Press: Washington, DC, USA, p. 246, 2011. GUIMARÃES, M.F. et al. Which is the best cutoff of body mass index to identify obesity in female patients with rheumatoid arthritis? A study using dual energy X-ray absorptiometry body composition. Revista Brasileira de Reumatologia, v.57, p.279–285, 2016. HABIB, H.; FAZILI, K.M. Plant protease inhibitors: a defence strategy in plants. Biotechnology and Molecular Biology Reviews, v.2, p.68–85, 2007. HARWOOD Jr, H.J. The adipocyte as an endocrine organ in the regulation of metabolic homeostasis. Neuropharmacology, v.63, p.57–75, 2012. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3 rd ed. IMESP, São Paulo; 1985. p. 27-28. ISKEN, F. et al. Metabolic effects of diets differing in glycaemic index depend on age and endogenous glucose-dependent insulinotrophic polypeptide in mice. Diabetologia., v.52, p.2159–2168, 2009. KAKADE, M.; SIMONS, N.; LIENER, I. An evaluation of natural vs. synthetic substrates for measuring the antitryptic activity of soybean samples. Cereal Chemistry, v.46, p.518–526, 1969. KANNEGANTI, T.D.; DIXIT, V.D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology, v.13, n.8, p.707–12, 2012
85
KATAN, M.B. Effect of low-fat diets on plasma high-density lipoprotein concentrations. The American Journal of Clinical Nutrition, v.67, p.573–576, 1998. KERSTEN, S. Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis. EMBO Reports, v.21, p.282–286, 2001. KHAN, H.A. et al. Comparative evaluation of immunohistochemistry and real-time PCR for measuring proinflammatory cytokines gene expression in livers of rats treated with gold nanoparticles. Experimental and Toxicologic Pathology, v.68, p.381–390, 2016. KLECKNER, A.S.; WONG, S.; CORKEY, B.E. The intra- or extracellular redox state was not affected by a high vs. Low glycemic response diet in mice. PLoS ONE., v. 10, 2015. KNAF, K. The integrative review: updated methodology. Journal of Advanced Nursing, v.52, n.5, p. 546–553, 2005. KOMARNYTSKY, S.; COOK, A.; RASKIN, I. Potato protease inhibitors inhibit food intake and increase circulating cholecystokinin levels by a trypsindependent mechanism. International Journal of Obesity, v.35, p.236–243, 2011. KRAUSS, R.M. et al. AHA dietary guidelines: Revision 2000: A statement for healthcare professionals from the nutrition committee of the American heart association. Circulation, v.102, p.2284–2299, 2000. KRINNINGER, P.; BRUNNER, C.; RUIZ, P.A.; et al. Role of the adipocyte-specific NF-ĸB activity in the regulation of IP-10 and T cell migration. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism, v.300, 2011. KURU, P. Tamarindus indica and its health related effects. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, v.4, n.9, p.676-681, 2014. LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v.227, p.680–685, 1970. LI, S. et al. Assessment of Diet-induced Obese Rats as an Obesity Model by Comparative Functional Genomics. Obesity (Silver Spring), v.16, p.811–8, 2008. LI, X. et al. Soybean whey protein/ chitosan complex behavior and selective recovery of kunitz trypsin inhibitor. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.62, p.7279–7286, 2014. LI, X.-Q. et al. Comparison of inhibitory effects of the proton pump-inhibiting drugs omeprazole, esomeprazole, lansoprazole, pantoprazole and rabeprazole on human cytochrome P450 activities. Drug Metabolism & Disposition, v.32, p.821–827, 2004. LI, Z. et al. Meta-analysis: Pharmacologic treatment of obesity. Annals of nternal Medicine, v.142, p.532, 2005. LIANG, J. et al. Genetic predisposition to obesity is associated with insulin secretion in Chinese adults: The Cardiometabolic Risk in Chinese (CRC) study. Journal of Diabetes and its Complications, v.30, p.1229-33, 2016.
86
LIM, H. et al. Structural biology of the TNFα antagonists used in the treatment of rheumatoid arthritis. International Journal of Molecular Sciences, v.19, p.768, 2018. LIMA, V.C.O. et al. Gastroprotective and antielastase effect of protein inhibitors from Erythrina velutina seeds in na experimental ulcer model. Biochemistry and Cell Biology, v.95, p.243–250, 2016. LIMA, V.C.O. et al. Trypsin inhibitors: Promising candidate satietogenic proteins as complementary treatment for obesity and metabolic disorders? Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, v.34, p.405–419, 2019. LIOU, A.P. et al. Protein hydrolysate-induced cholecystokinin secretion from enteroendocrine cells is indirectly mediated by the intestinal oligopeptide transporter PepT1. American Journal of Physiology-Gastrointestinal Liver Physiology, v.300, p.895-902, 2011.
LIU, S.; WILLETT, W.C. Dietary Carbohydrates. 2017. Disponível em: <https://www.uptodate.com/contents/dietary-carbohydrates> Accesso em 01 dez 2018. LIVAK, K.J.; SCHMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods, v.25, p.402–408, 2001. LOZANO, L. et al. High-fructose and high-fat diet-induced disorders in rats: Impact on diabetes risk, hepatic and vascular complications. Nutrition & Metabolism, v.13, p.1, 2016. LUZ, A.B.S. et al. Adipocytes and intestinal epithelium dysfunctions linking obesity to inflammation induced by high glycemic index pellet-diet in Wistar rats. Bioscience Reports, v.38, p.1–15, 2018. LYON, C.J.; LAW, R.E.; HSUEH, W.A. Minireview: Adiposity, inflammation, and atherogenesis. Endocrinology, v.144, p.2195–2200, 2003. MACHADO, R.J.A. et al. Characterization and pharmacological properties of a novel multifunctional kunitz inhibitor from Erythrina velutina seeds. PLoS ONE, v.8, p.1–14, 2013. MANN, J. et al. FAO/WHO scientific update on carbohydrates in human nutrition: Conclusions. European Journal of Clinical Nutrition, v.61, Suppl 1: S132-7, 2007. MATSON, C.A. et al. Cholecystokinin and leptin act synergistically to reduce body weight. American Journal Physiology, Regulatory, Integrative and Comparative Physiology, v.278, n.4, p.882–90, 2000. MEDEIROS, A.F. et al. Biochemical characterisation of a Kunitz-type inhibitor from Tamarindus indica L. seeds and its efficacy in reducing plasma leptin in an experimental model of obesity. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, v.33, p.334–348, 2018 MEHER, B.; DASH, D.K.; ROY, A. A review on: phytochemistry, pharmacology and traditional uses of tamarindus indica L. World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences., v.3, p.229-240, 2014.
87
MELO, F.J.; MAGINA, S. Clinical management of Anti-TNF-alpha-induced psoriasis or psoriasiform lesions in inflammatory bowel disease patients: A systematic review. Internaional Journal of Dermatology, v.57, p.1521–1532, 2018. MENEZES, A.P.P. et al. Tamarindus indica L. A plant with multiple medicinal Purposes. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, v.5, n.3, p.50-54, 2016. MITOMA, H. et al. Molecular mechanisms of action of anti-TNF-α agents—Comparison among therapeutic TNF-α antagonists. Cytokine, v.101, p.56–63, 2018. MITTENDORFER, B.; SIDOSSIS, L.S. Mechanism for the increase in plasma triacylglycerol concentrations after consumption ofshort-term, high carbohydrate diets. The American Journal of Clinical Nutrition, v.73, p.892–899, 2001. MONRO, J.A.; SHAW, M. Glycemic impact, glycemic glucose equivalents, glycemic index, and glycemic load: definitions, distinctions, and implications. The American Journal of Clinical Nutrition, v.87, p.237S-243S, 2008. MONTEIRO, R.D.C.; ZANINI, A.C. Análise de custo do tratamento medicamentoso da artrite reumatóide. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v.44, p.25–33, 2008. MUZAFFAR, K.; KUMAR, P. Tamarind-a mini review. MOJ Food Process Technology, v.5, n.3, 296‒297, 2017
MYRTILLE, C.R.G.; HEUVEL, J.K.V.; FLEUR, S. The effect of obesogenic diets on brain neuropeptide Y. Physiology Behavior, v.27, p.161-73, 2016. NADERALI, E.K. et al. Diet-induced endothelial dysfunction in the rat is independent of the degree of increase in total body weight. Clinical Science, v.100, p. 635–41, 2001. NAKAJIMA, S. et al. Potato extract (Potein) suppresses food intake in rats through inhibition of luminal trypsin activity and direct stimulation of cholecystokinin secretion from enteroendocrine cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.59, p.9491–9496, 2011. NAKANISHI, S.; SERIKAWA, T.; KURAMOTO, T. Slc: Wistar outbred rats show close genetic similarity with F344 inbred rats. Experimental Animals, v.1, p.25-29, 2015. NEURATH, H. The diversity of proteolytic enzymes. In: BEYNON, R. J.; BOND, J. S. (Eds.). Proteolytic enzymes - a practical approach. Oxford: JRL Press, p.259, 1990. NOVELLI, E.L.B. et al. Anthropometrical parameters and markers of obesity in rats. Laboratory Animals, v.41, p.111-9, 2007. OAKLEY, B.R.; KIRSCH, D.R.; MORRIS, N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, v.105, p.361–363, 1980. ORDÓÑEZ, J.A. & Cols. Tecnologia de Alimentos. 2 rd ed. Artemed, Porto Alegre; 2005.
88
OUCHI, N.; PARKER, J.L.; LUGUS, J.J.; WALSH, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology, v.11, p. 85-97, 2011. PANDEY, P. K.; JAMAL, F. Bio-potency of a 21 kDa Kunitz-type trypsin inhibitor from Tamarindus indica seeds on the developmental physiology of H. armigera. Pesticide Biochemistry and Physiology, v.116, p.94–102, 2014. PARKS, E.J. Effect of dietary carbohydrate on triglyceride metabolism in humans. Journal of Nutrition, v.131, p.2772S–2774S, 2001. PARKS, E.J. et al. Effects of a low-fat, high-carbohydrate diet on VLDL, triglyceride assembly, production and clearance. Journal of Clinical Investigation, v.104, p.1087–1096, 1999. PASCHOS, P.; PALETAS, K. Non alcoholic fatty liver disease and metabolic syndrome. Hippokratia, v.13, p.9-19, 2009. PAWLAK, D.; DENYER, G.S.; BRAND-MILLEr, J.C. Long-term feeding with high glycemic index starch leads to obesity in maturerats. Proceedings of the Nutrition Society of Australia, v.24, p.215, 2000. PAWLAK, D.B. et al. High glycemic index starch promotes hypersercretion of insulinand higher body fat in rats without affecting insulin sensitivity. Journal of Nutrition, v.131, p.99–104, 2001. PERMANA, P.A. et al. Pioglitazone reduces inflammatory responses of human adipocytes to factors secreted by monocytes/macrophages. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism, v.296, E1076–E1084, 2009. PETROS, W.P.; PETERS, W.P. Cytokines. In: AUSTEN, K.F. et al. Therapeutic Immunology, 1st ed.; Blackwell Science, Inc.: Malden, MA, USA, 1996; p. 229–279. PINTO JÚNIOR, D.A.C.; SERAPHIM, P.M. Cafeteria diet intake for fourteen weeks can cause obesity and insulin resistance in Wistar rats. Revista de Nutrição, v.25, p.313-319, 2012. QUEIROZ, J.L.C. et al. Chitosan-whey protein nanoparticles improve encapsulation efficiency and stability of a trypsin inhibitor isolated from Tamarindus indica L. Food Hydrocolloids, p.247–256, 2018. RAO, H.D.; GOWDA, L.R. Abundant Class III Acidic Chitinase Homologue in Tamarind (Tamarindus indica) Seed Serves as the Major Storage Protein. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.56, p.2175–2182, 2008. REEVES, P.G. Components of the AIN-93 Diets as Improvements in the AIN-76A Diet. Journal of Nutrition, v.127, p.838S-841S, 1997. REN, D. et al. PPARg knockdown by engineered transcription factors: Exogenous PPARg2 but not PPARg1 reactivates adipogenesis. Genes & Development, v.16, p.27–32, 2002.
89
RIBEIRO, J.A. et al. Trypsin inhibitor from Tamarindus Indica L. seeds reduces weight gain and food consumption and increases plasmatic cholecystokinin levels. Clinics, v.70, p. 136–143, 2015. ROSSINI, T.C.; SILVA, A.S.R.; MORAES, C. Diet-induced obesity: rodent model for the study of obesity- related disorders. Revista da Associação Médica Brasileira, v.58, p.383-387, 2012. SAKURAI, M.; NAKAMURA, K.; NAKAGAWA, H. et al. Dietary carbohydrate intake, presence of obesity and the incident risk of type 2 diabetes in Japanese men. Journal of Diabetes Investingation, v. 7, n. 3, p. 343-351, 2016. SAMPAIO, H.A.C. et al. . Índice glicêmico e carga glicêmica de dietas consumidas por indivíduos obesos. Revista de Nutrição, v.20, p.615- 624, 2007. SANTOS, E.A. et al. Affinity Chromatography as a Key Tool to Purify Protein Protease Inhibitors from Plants. Affinity Chromatography, 2012. Disponível em: < http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/id/33057>. Acesso em: 01 Fev 2019. SARTORELLI, D. S.; CARDOSO, M. A. Associação entre carboidratos da dieta habitual e diabetes mellitus tipo 2: evidências epidemiológicas. Arquivo Brasileiro de Endocrinologia e Metabolismo, São Paulo, v. 50, n .3, 2006. SCARAFONI, A. et al. Identification and characterization of a Bowman-Birk inhibitor active towards trypsin but not chymotrypsin in Lupinus albus seeds. Phytochemistry, v.69, n.9, p.1820-5, 2008. SCHOONJANS, K.; STAELS, B.; AUWERX, J. Role of the peroxisome proliferators activated receptor (PPAR) in mediating effects of fibrates and fatty acids on gene expression. The Journal of Lipid Research, v.37, p.907–925, 1996. SCHOONJANS, K.; WATANABE, M.; SUZUKI, H. Induction of the acyl-coenzyme A synthetase gene by fibrates and fatty acids is mediated by a peroxisome proliferators response element in the C promoter. The Journal of Biological Chemistry, v.270, p.19269–19276, 1995. SERQUIZ, A.C. et al. Supplementation with a new trypsin inhibitor from peanut is associated with reduced fasting glucose, weight control, and increased plasma CCK secretion in an animal model. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, v.29, p.1–9, 2016. SETHI, J.K.; HOTAMISLIGIL, G.S. The role of TNF alpha in adipocyte metabolism. Seminars in Cell Developmental Biology, v.10, p.19–29, 1999. SHAH, A.; MEHTA, N.; REILLY, M.P. Adipose inflammation, insulin resistance, and cardiovascular disease. JPEN. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, v.32, p.638–644, 2008. SHUKLA, A.P. et al. Food order has a significant impact on postprandial glucose and insulin levels. Diabetes care., v.38, p.98-99, 2015.
90
SILVA, R.G. et al. Como diagnosticar e tratar artrite reumatóide. Revista Brasileira de Medicina, v.60, p.554–577, 2003. STOECKEL, L.E. et al. Widespread reward-system activation in obese women in response to pictures of high-calorie foods. Neuroimage, v.41, p.636–47, 2008. STOECKMAN, A.K.; TOWLE, H.C. The role of SREBP-1c in nutritional regulation of lipogenic enzyme gene expression. The Journal of Biological Chemistry, v.277, p. 27029–27035, 2002. TAVARES, V.; HIRATA, M.H.; HIRATA, R.D.C. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARg): Molecular study in glucose homeostasis, lipid metabolism and therapeutic approach. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabolismo, v.51, p.526–533, 2007. TAY, J.; THOMPSON, C.H.; BRINKWORTH, G.D. Glycemic Variability: Assessing Glycemia Differently and the Implications for Dietary Management of Diabetes. Annual Review of Nutrition, v.35, p.389–424, 2015. THE UNIVERSITY OF SYDNEY. About Glycemic Index: measuring the GI. 2015. Disponível em: <http://www.glycemicindex.com/about.php.> Acesso em: 10 Mar 2019. TILG, H.; MOSCHEN, A.R. Adipocytokines: Mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nature Reviews Immunology, v.6, p.772–783, 2006. TONTONOZ, P.; HU, E.; SPIEGELMAN, B.M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPARg2, a lipid activated transcription factor. Cell, v.79, p.11147–11156, 1994. UEHBE, A.I.; PIMENTA, M.E.; GIORGI, R.D. DMARDs (fármacos anti-artrite reumatóide modificadores da doença ou drogas anti-reumáticas modificadoras da doença). Revista Temas de Reumatologia Clínica, v.7, p.57–61, 2006. UYEDA, K.; YAMASHITA, H.; KAWAGUCHI, T. Carbohydrate responsive element-binding protein (ChREBP): a key regulator of glucose metabolism and fat storage. Biochemical Pharmacology, v.63, p.2075-2080, 2002. VARGHESE, F.; BUKHARI, A.B.; MALHOTRA, R.A. IHC profiler: An open source plugin for the quantitative evaluation and automated scoring of immunohistochemistry images of human tissue samples. PLoS ONE, v.9, 2014. VIRDIS, A. et al. Microvascular endothelial dysfunction in human obesity: Role of TNF-α. The Journal of Clinical Endocrinology &Metabolism, v.104, p.341–348, 2018. WEISBERG, S.P. et al.Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation, v.112, p.1796–1808, 2013. WOLEVER, T.M. et al. The glycemic index: Methodology and clinical implications. The American Journal of Clinical Nutrition, v.54, p.846–854, 1991. WHO. World Health Organization. Global action Plan for the Prevention and Control ofNCDs 2013 2020, 2016. Disponível
91
Em: <http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/WHA66/A66_R10-en.pdf.> Acesso em: 1 Fev 2019. YANOVSKI, S.Z.; YANOVSKI, A. Obesity.The New England Journal of Medicine, v.346, p.591–602, 2002. ZOHRAMEENA, S. et al. Medicinal uses & pharmacological activity of Tamarindus indica. World Journal of Pharmaceutical Sciences, v.5, n.2, p.121-133, 2017.