universidade federal do rio grande do norte centro de biociÊncias departamento de ... · 2019. 1....
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
Tainá Costa Baia
EFEITO DO ETANOL E FLUNITRAZEPAM NA
ATRATIVIDADE DE DÍPTEROS NECRÓFAGOS À CARCAÇA DE
RATO EM UM FRAGMENTO DE MATA ATLÂNTICA NO
MUNICÍPIO DO NATAL (RN) E DETECÇÃO DESSAS
SUBSTÂNCIAS POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO
PRÓXIMO
Natal
2015
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Baia, Tainá Costa.
Efeito do etanol e flunitrazepam na atratividade de dípteros necrófagos à carcaça de rato em um
fragmento de Mata Atlântica no município do Natal (RN) e detecção dessas substâncias por
espectroscopia no infravermelho próximo / Tainá Costa Baia. – Natal, RN, 2015.
88 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Antonaci Gama.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências.
Programa de Pós Graduação em Biologia Parasitária.
1. Entomologia forense. – Dissertação. 2. Entomofauna cadavérica. – Dissertação. 3. Etanol. –
Dissertação. I. Gama, Renata Antonaci. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 595.7
TAINÁ COSTA BAIA
EFEITO DO ETANOL E FLUNITRAZEPAM NA
ATRATIVIDADE DE DÍPTEROS NECRÓFAGOS À CARCAÇA DE
RATO EM UM FRAGMENTO DE MATA ATLÂNTICA NO
MUNICÍPIO DO NATAL (RN) E DETECÇÃO DESSAS
SUBSTÂNCIAS POR ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO
PRÓXIMO
Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária na área de Entomologia Forense.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Antonaci Gama
Natal 2015
BAIA, T. C. Efeito do etanol e flunitrazepam na atratividade de dípteros
necrófagos à carcaça de rato em um fragmento de Mata Atlântica no
município do Natal (RN) e detecção dessas substâncias por espectroscopia
no infravermelho próximo. 89 f. Dissertação de Mestrado (Curso de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária) – Centro de Biociências, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
BAIA, T. C. Efeito do etanol e flunitrazepam na atratividade de dípteros
necrófagos à carcaça de rato em um fragmento de Mata Atlântica no município
do Natal (RN) e detecção dessas substâncias por espectroscopia no
infravermelho próximo. Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio
Grande do Norte para a obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária.
Aprovado em:
Banca Examinadora:
Profº. Dr. Simão Dias de
Vasconcelos Filho
Instituição: UFPE
Julgamento: _________________
Assinatura: __________________
Prof ͣ. Dr ͣ. Vanessa de Paula
Soares Rachetti
Julgamento: __________________
Assinatura: ___________________
Instituição: UFRN
Prof ͣ. Dr ͣ. Renata Antonaci Gama
Instituição: UFRN
Julgamento: __________________
Assinatura: ___________________
Prof º. Dr. Herbert Tadeu A.
Andrade
Instituição: UFRN
Julgamento:
___________________
Assinatura: ___________________
6
À minha família que sempre foi minha base de incentivo e apoio.
7
AGRADECIMENTOS
À Deus por me conceder grandes conquistas e me guiar sempre.
À minha mãe Vera, ao meu pai Baia e o meu irmão Gustavo pelo amor, carinho
e apoio de sempre. Sem eles nada disso seria possível.
Aos meus avós que estão sempre me encheram de muito carinho.
Ao meu namorado Diego que sempre esteve presente, me incentivando para
que eu concluísse esse projeto.
A professora Renata por me orientar, ajudar, e apoiar sempre que precisei.
Aos colegas Rafael, Alessandra e Clara que me ajudaram no trabalho de
campo.
As minhas amigas, Andrielle, Nathálya, Jéssyca que distantes ou perto sempre
se fazem presentes em todos os momentos de minha vida.
Aos amigos Bruno, Giulia e Anna Aline que foram presentes de Deus na minha
vida.
Aos colegas do LIVe, Alessandra, Fernanda, Paula, Renato, Fellipe, Márjore
que compartilharam comigo esses dois anos entre pesquisa, reunião e
discussões cientificas.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária pelo apoio financeiro
e pela propagação do conhecimento.
Ao Professor Dr. Paulo Guedes, coordenador do programa de pós-graduação,
que sempre foi muito solicito.
À Professora Dra. Vanessa Rachetti, por conceder os ratos para que eu
realizasse minha pesquisa.
Ao Professor Dr. Kássio Lima, que abriu as portas do seu grupo de pesquisas
para que eu fizesse parte dos experimentos em seu laboratório.
À Leomir Aires que quebrou cabeça com os algoritmos e fez o trabalho de
quimiometria.
À Taciano Barbosa que me ajudou na identificação de muitos exemplares, e
com o escalonamento multidimensional não-paramétrico.
8
RESUMO
BAIA, T. C. Efeito do etanol e flunitrazepam na atratividade de dípteros
necrófagos à carcaça de rato em um fragmento de Mata Atlântica no
município do Natal (RN) e detecção dessas substâncias por
espectroscopia no infravermelho próximo. 2015. 89 f. Dissertação
(Mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.
Estudos que demostrem a atratividade de insetos frente a carcaças tratadas
com flunitrazepam e etanol são escassos na literatura, apesar de ambas
substâncias apresentarem um consumo frequente pela sociedade. Dessa
forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito do etanol e do
flunitrazepam na atratividade e diversidade de insetos em carcaças de ratos,
bem como avaliar a presença dessas substâncias nos insetos imaturos usando
a espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) e técnicas de classificação
multivariada: PCA (análise de componente principal), LDA (análise linear
discriminante), SPA (algoritmo das projeções sucessivas) e GA (algoritmo
genético) como ferramenta. Foram utilizados 32 ratos Wistar divididos em
quatro grupos contendo oito animais em cada, sendo: grupo 1: tratado com
etanol; grupo 2: flunitrazepam; grupo 3: etanol e flunitrazepam (conjugado);
grupo 4: água (controle). Os animais foram divididos em 32 armadilhas de
cheiro colocadas em uma área de preservação ambiental, de bioma
predominantemente de Mata Atlântica, no município do Natal - Rio Grande do
Norte (RN), e monitoradas por cinco dias consecutivos, sendo realizadas
coletadas diárias de adultos e de imaturos durante o terceiro e quarto dia. Os
insetos adultos e imaturos foram identificados com auxílio de chaves
dicotômicas, e os imaturos foram utilizados para a análise química através do
NIR. Foram coletados 3.165 dipteros necrófagos, identificados em:
Calliphoridae (61,7%), Fanniidae (10,5%), Sarcophagidae (10,4%),
Anthomyiidae (4,0%), Muscidae (2,2%), Phoridae (0,9%), Ullidiidae (0,4%) e
Drosophilidae (0,1%). Três novos registros de interesse forense foram feitos
9
para o Estado do RN, sendo duas espécies da família Muscidae
(Synthesiomyia nudiseta e Ophyra chalcogaster) e uma Phoridae (Megaselia
scalaris). A maior atratividade de insetos foi observada para o tratamento
utilizando etanol e flunitrazepam juntos (44,3% dos insetos coletados), quando
comparados com o tratamento utilizando etanol (20,8%), flunitrazepam (15,0%)
e ao grupo controle (19,7%). Os dados obtidos no presente estudo nos permite
concluir que o tratamento etanol e flunitrazepam concomitantes provoca maior
atratividade de insetos, no entanto, não há espécie e/ou padrão de sucessão
entomológica exclusivo para um determinado tipo de tratamento. Através das
técnicas de classificação multivariada (PCA, LDA, SPA, e GA) foram
selecionadas cinco variáveis pelo SPA-LDA e dezessete pelo GA-LDA com
características químicas inerente ao flunitrazepam e etanol, permitindo a
separação dos diferentes grupos, evidenciando o NIR e os métodos de
classificação multivariada um método eficaz para a detecção de etanol e
flunitrazepam em larvas de insetos provenientes de exames necroscópicos,
permitindo ainda manter o exemplar de inseto intacto.
Palavra-chave: Entomologia forense, entomofauna cadavérica, etanol, droga de
estupro, espectroscopia do infravermelho próximo (NIR).
10
ABSTRACT
BAIA, T. C. Effect of ethanol and flunitrazepam attractive necrofagous
insect for rats carcasses in a fragment of Atlantic Forest area in Natal (RN)
and detection of these substances by near infrared spectroscopy. 2015.
89 p. Thesis (MS) - Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, 2015.
Studies demonstrating the attractiveness of insects front of carcasses treated
with flunitrazepam and ethanol are scarce in the literature, although both
substances is frequent consumption by society.Thus, this study aimed to
evaluate the effect of ethanol and flunitrazepam in the attractiveness and
diversity of insects in rat carcasses, as well as assessing the presence of this
substance in immature insects using near infrared spectroscopy (NIR) and
multivariate classification: PCA (principal component analysis), LDA (linear
discriminant analysis), SPA (sucessive projections algorithm) and GA (genetic
algorithm) as a tool. For this, 32 Wistar rats were divided into four groups
containing eight animals each: Group 1: ethanol; Group 2: flunitrazepam; Group
3: ethanol and flunitrazepam (conjugate); Group 4: water (control). The animals
were divided into 32 smell of traps placed in an area of environmental
preservation, biome predominantly of Atlantic forest in the city of Natal - Rio
Grande do Norte (RN), and monitored for five consecutive days, being held
collected daily for adults and immature during the third and fourth day. The adult
and immature insects were identified with the aid of dichotomous keys, and
immatures were used for chemical analysis by NIR. We collected 3.165
dipterous scavengers, identified: Calliphoridae (61.7%), Fanniidae (10.5%),
Sarcophagidae (10.4%), Anthomyiidae (4.0%), Muscidae (2.2%), Phoridae
(0.9%), Ullidiidae (0.4%) and Drosophilidae (0.1%). Three new records of
forensic interest were made to the state RN, two species of Muscidae
(Synthesiomyia nudiseta and Ophyra chalcogaster) and a Phoridae (Megaselia
scalaris). The major attraction of insects were observed for treatment using
11
ethanol and together flunitrazepam (44.3% of the collected insects), compared
to treatment using ethanol (20.8%), flunitrazepam (15.0%) and the control group
(19.7%). The data obtained in this study allow us to conclude that ethanol
treatment and concomitant flunitrazepam causes more attractive to insects,
however, there is no species and / or unique entomological succession pattern
for a particular type of treatment. Through multivariate classification techniques
(PCA, LDA, SPA, and GA) five variables were selected by SPA-LDA and
seventeen by GA-LDA with chemical characteristics inherent in the
flunitrazepam and ethanol, allowing the separation of different groups, with the
NIR and multivariate classification methods an effective method for the
detection of ethanol and flunitrazepam in insect larvae from postmortem
examination also allowing to keep the insect copy intact.
Keyword: Forensic entomology, cadaverous entomofauna, ethanol, rape drug,
near infrared spectroscopy (NIR).
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fórmula estrutual do Flunitrazepam..................................... 26
Figura 2- Regiões do espectro eletromagnético com ênfase na
região do
infravermelho...................................................................
29
Figura 3- Arranjo experimental para a aquisição de espectros. Em
A, fluxograma demostrando as etapas para a obtenção
dos espectros, no qual cada número corresponde à
referida etapa em B. 1) exemplos de amostras biológicas
de interesse forense utilizadas no espectofotômetro- larva,
pupa e adulto. 2) Componentes básicos de um aparelho
de espectofotômetro: fonte de luz, seletor de comprimento
de onda, amostra, detector e registrador. No seletor de
comprimento de onda, as setas em vermelho representam
a radiação que é emida na amostra e a radiação refletida
(reflectância difusa) da amostra. 3) Espectro obtidos de
diferentes amostras..............................................................
33
Figura 4- (A) Estado do Rio Grande do Norte, com destaque para a
localização do 7 ͦ Batalhão de Engenharia de Combate.
Fonte: Google Imagens (B) Área do 7 ͦ Batalhão de
Engenharia de Combate no Parque Estadual Dunas do
Natal “Jornalista Luis Maria Alves” e suas imediações no
município do Natal. Fonte: Google Maps (C) Trilha
pertencente ao 7 ͦ Batalhão de Engenharia de Combate
onde foram colocadas as
armadilhas....................................
35
Figura 5- Em destaque a disposição das armadilhas contendo as
13
carcaças de rato para cada tratamento, ao longo da trilha
do 7º Batalhão de Engenharia de Combate no município
do Natal- Rio Grande do
Norte...................................................
37
Figura 6- Armadilha de cheiro feita com garrafa pet utilizada em
campo para coleta de insetos, composta por: saco
plástico, garrafa pet e rato
(carcaça)...................................................
38
Figura 7- Coleta de imaturos da carcaça distribuídas ao longo da
trilha no 7º Batalhão de Engenharia de Combate no
município do Natal- Rio Grande do
Norte..............................
39
Figura 8- Aquisição dos espectros dos imaturos pela espectroscopia
do infravermelho próximo. Em destaque uma larva de
Lucilia eximia posicionada na parte superior da probe
(sonda de reflectância) do aparelho NIR. Laboratório de
Química Analítica – Instituto de Química- UFRN................
40
Figura 9- Componentes do aparelho de espectroscopia do
infravermelho próximo. (A) Fonte de luz; (B) Sonda; (C)
Amostra (D) Detector. Laboratório de Química Analítica –
Instituto de Química-
UFRN..................................................
41
Figura 10- ANCOVA realizado com o total das espécies de
Calliphoridae coletadas em carcaças de ratos submetidos
aos tratamentos controle, etanol, flunitrazepam e etanol e
flunitrazepam, em uma área de Mata Atlântica, no
município do Natal, no estado do Rio Grande do Norte, no
período de 18 de novembro a 22 de novembro de
2013......................................................................................
46
Figura 11- Quantidade total de dípteros coletados em carcaças de
ratos submetidos aos tratamentos controle, etanol,
flunitrazepam e conjugado, em uma área de Mata
Atlântica, no município de Natal, no estado do Rio Grande
14
do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de
novembro de
2013.....................................................................................
48
Figura 12- Análise de Covariância para a distribuição de
Sarcophagidae coletados em carcaças de ratos
submetidos aos tratamentos controle, etanol,
flunitrazepam e etanol e flunitrazepam, em uma área de
Mata Atlântica, no município de Natal, no estado do Rio
Grande do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de
novembro de
2013.....................................................................................
49
Figura 13- Distribuição dos quatro tratamentos baseando-se na
abundância dos insetos coletados durante os cinco dias,
utilizando o método de escalonamento multidimensional
não-paramétrico (nMDS). As letras correspondem aos
tratamentos e os números representam os
dias.......................................................................................
50
Figura 14- Larva de Lucilia sp. Em destaque os espiráculos
respiratório característico: peritrema fechado e com
botão....................................................................................
52
Figura 15- Espectros NIR pré- processados de larvas de Lucilia sp.
coletadas de carcaças de ratos submetidos ao tratamento
de etanol, flunitrazepam, conjugado e controle, em uma
área de Mata Atlântica, no município do Natal, no estado
do Rio Grande do Norte, nos dias 20 e 21 de novembro de
2013.....................................................................................
53
Figura 16- Resultados após aplicação dos algoritmos PCA- LDA das
amostras de larvas de Lucilia sp.: DF1 × amostras
calculadas pelo modelo de PCA-LDA a partir de etanol
(azul), conjugado (vermelho), controle (preto) e
flunitrazepam (amarelo).......................................................
53
Figura 17- Resultados após aplicação dos algoritmos SPA-LDA para
as amostras de larvas de Lucilia sp.: DF1 × amostras
15
calculadas usando os cinco números de onda
selecionados por modelo SPA-LDA a partir de etanol
(azul), conjugado (vermelho), controle (preto) e
flunitrazepam
(amarelo)..............................................................................
54
Figura 18- Resultados após aplicação dos algoritmos GA- LDA: DF1
× amostras calculadas usando os 17 números de onda
selecionados por modelo GA-LDA a partir de etanol (azul),
conjugado (vermelho), controle (preto) e drogas
(amarelo)..............................................................................
54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Abundância de insetos coletados em carcaças de ratos
submetidos aos tratamentos controle, etanol, flunitrazepam
e etanol e flunitrazepam, em uma área de Mata Atlântica,
no município de Natal, no estado do Rio Grande do Norte,
no período de 18 de novembro a 22 de novembro de 2013.
(C): Controle; (E): Etanol; (F): Flunitrazepam; (EF) Etanol e
Flunitrazepam.......................................................................
45
Tabela 2- Abundância absoluta dos insetos coletados em carcaças
de ratos submetidos aos tratamentos controle, álcool,
flunitrazepam e álcool e flunitrazepam, em uma área de
Mata Atlântica, no município de Natal, no estado do Rio
Grande do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de
novembro de 2013...............................................................
50
Tabela 3- Dados meteorológicos sobre umidade, temperatura,
velocidade do vento e precipitação durante o
experimento..........................................................................
51
Tabela 4- Quantidade de larvas coletadas por tratamento durante o
primeiro e segundo dia de coleta de imaturos. C: Controle;
E: Etanol; F: Flunitrazepam; EF: Etanol e
16
Flunitrazepam....................................................................... 51
LISTA DE ABREVIATURAS
ANCOVA Análise de Covariância
ANOVA Análise de Variância
CG Cromatografia gasosa
CG-MS Cromatografia gasosa com espectroscopia de massa
DEA “Drug Enforcement Administration” (tradução livre Órgão
de controle/combate às drogas)
DFAS Drogas facilitadoras de agressões sexuais
GA “Genetic algorithm” (algoritmo genético)
GABA Ácido gama-aminobutírico
HPLC Cromatografia líquida de alta resolução
IPM Intervalo Pós-morte
LDA “Linear discriminant analysis” (análise linear discriminante)
NIR “Near infrared” (espectroscopia do infravermelho próximo)
nMDS Escalonamento multidimensional não métrico
OMS Organização Mundial da Saúde
PCA “Principal component analysis” (análise de componente
principal)
PCR Reação da cadeia da polimerase
SNVS Sistema Nacional de Vigilância Sanitária
17
SPA “Sucessive projections algorithm” (algoritmo das projeções
sucessivas)
TLC Cromatografia de placa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 18
1.1 Conceito de Entomologia
Forense....................................................18
1.2 Atratividade ...................................................................................... 19
1.3 Etanol ............................................................................................... 23
1.4 Flunitrazepam .................................................................................. 25
1.5 Espectroscopia do Infravermelho Próximo (NIR) e classificação
multivariada.............................................................................................28
2 OBJETIVOS .......................................................................................... 34
Objetivos específicos ............................................................................. 34
3 MATERIAIS E
MÉTODOS......................................................................35
3.1 Local de estudo ............................................................................... 35
3.2 Animais utilizados no experimento................................................... 36
3.3 Armadilhas utilizadas ....................................................................... 37
3.4 Monitoramento das armadilhas ........................................................ 38
3.5 Dados meteorológicos.......................................................................39
3.6 Análise química. .............................................................................. 39
18
3.7 Análise
estatística..............................................................................41
3.7.1 Estatística
clássica...............................................................41
3.7.2 Estatística multivariada........................................................42
4
RESULTADOS..........................................................................................45
4.1 Riqueza e abundância de dípteros
necrófagos..................................45
4.2 Análise dos tratamentos e dias de
experimento.................................47
4.3 Dados meterológicos.........................................................................50
4.4 Larvas utilizadas na espectroscopia do infravermelho
próximo..........51
4.5 Espectroscopia do Infravermelho
Próximo.........................................52
5 DISCUSSÃO...........................................................................................55
CONCLUSÕES.......................................................................................65
REFERÊNCIAS.......................................................................................66
ANEXOS.................................................................................................85
1 INTRODUÇÃO
1.1 Conceito de Entomologia Forense
A Entomologia Forense compreende a utilização de insetos e outros
artrópodes como ferramenta relevante para a elucidação de litígios variados na
área criminal ou cível. No âmbito criminal, os insetos permitem a estimativa do
intervalo pós-morte (IPM), a determinação local do crime, causa de morte,
identificação de vítima e suspeito, detecção de drogas no organismo, ou,
podem atuar como bioindicadores de impactos ambientais (CATTS e GOFF,
1992; HALL, 2001; NAKAZA et al., 2009); na esfera cível, podem estar
19
envolvidos na contaminação de alimentos e em danos à estruturas e imóveis
(LORD; STEVENSON, 1986). Dessa forma, a Entomologia Forense está
ganhando, paulatinamente, reconhecimento, e vem sendo aplicada em casos
pericias para a resolução de casos cíveis e criminais (NUORTEVA, 1977;
ERZINÇLIOGLÚ e WHITCOMBE, 1983; KEH, 1985; SMITH, 1986; CATTS;
GOFF 1992; HALL, 2001).
Na área criminal, principalmente para os casos de morte violenta, os
insetos são relevantes nas investigações periciais devido à capacidade desses
se deslocarem rapidamente e serem atraídos pela matéria em decomposição,
da qual utilizam o micro-habitat temporário para nutrição, reprodução e
deposição de ovos, correspondendo aos primeiros indivíduos colonizadores de
um cadáver, e por permanecerem no corpo durante o processo de
decomposição (OLIVEIRA-COSTA, 2013).
No aspecto forense, os insetos nos estágios de larvas, pupas e adultos
são utilizados como fonte de amostras biológicas durante as perícias.
Conhecer as espécies de interesse forense, a bionomia das espécies, os
efeitos que algumas substâncias apresentam sobre o desenvolvimento dos
insetos e na dinâmica de atratividade, correspondem às principais linhas de
pesquisas na Entomologia Forense Médico-legal.
No entanto, na literatura há uma carência de trabalhos que relacionam
substâncias quimioatraentes/quimiorepelentes com a dinâmica de atratividade
de insetos de interesse forense, como acontece com o etanol e flunitrazepam.
Ambas substâncias apresentam uma importância social, visto que o consumo é
frequente e muitas vezes abusivo. O etanol é uma substância lícita, de fácil
acesso e com preço acessível; o flunitrazepam está envolvido nos casos de
“Boa noite, Cinderela!” e ganhou a reputação de droga da violação
(GAHLINGER, 2004), sendo utilizado nos casos de violência sexual. Por esses
motivos, muitos litígios são cometidos em consequência do consumo dessas
substâncias, assim sendo, é relevante compreender como tais substâncias
interferem na atratividade, na taxa de desenvolvimento dos insetos presentes
nas carcaças/cadáveres e a influência direta que terão no processo de
decomposição e na estimativa do intervalo pós-morte.
20
1.2 Atratividade
Na Entomologia Forense, a atratividade de insetos é um importante fator
a ser utilizado para auxiliar nas resoluções de casos periciais, determinando a
causa, local e tempo de morte, assim como, as fases de decomposição do
corpo (SMITH, 1986; KEH, 1985; CATTS e HASKELL, 1990; GOFF, 1992;
OLIVA et al., 1995; NUORTEVA, 1997).
Carcaças e cadáveres em decomposição podem atrair grande
quantidade de organismos, dos quais os artrópodes constituem a fauna
predominante. Os insetos, por terem capacidade olfativa aguçada, são
atraídos a longas distâncias pelo odor dos compostos orgânicos voláteis
liberados durante a decomposição, e sua capacidade de deslocamento permite
que sejam um dos primeiros a colonizarem o recurso (NUORTEVA, 1977;
SMITH, 1986; VAN LAERHOVEN, 1996; DILLON, 1997; OLIVEIRA- COSTA,
2001). Braack e Retief (1986) relatou que dípteros do gênero Chrysomya
foram capturados sobre estímulos olfativos (iscas) a 63,5km do ponto de
liberação. Esse pioneirismo dos insetos é reflexo de suas características
ecológicas e biológicas, e pelo fato de utilizarem o corpo como fonte de
nutrição, reprodução e oviposição (VON ZUBEN, 2001; LIMA, 2009).
Dessa forma, a avaliação da atratividade permite conhecer a
entomofauna cadavérica associada e determinar a comunidade de espécimes
atraídos de acordo com as características físico-química específicas, o que por
conseguinte, pode determinar os eventos de sucessão cadavérica- fator este
que auxilia na determinação do intervalo pós-morte máximo (IPM máximo). A
sucessão cadavérica pode ser definida como o acréscimo ou substituição
sequencial de espécies em uma comunidade, que provoca alterações no
substrato, tornando-o mais ou menos atrativo para as próximas espécies de
insetos. Ou seja, a característica ecológica do inseto irá determinar o momento
da colonização do cadáver: no início - logo após a morte; no auge da
decomposição; ou no final da decomposição- na qual os restos mortais
consistem em cartilagens e ossos (AMENDT et al., 2010; OLIVEIRA-COSTA,
2011). É importante ressaltar que o padrão de sucessão cadavérica leva em
consideração as variações biogeoclimáticas, ou seja, diferentes climas,
21
vegetação, tipo de solo e sazonalidade, influenciam quais espécies de insetos
que serão atraídas para um corpo (GOFF, 2000).
Levantamentos de espécies endêmicas para os diversos biomas são
escassos, principalmente entre as regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste,
sendo as pesquisas concentradas na região Sudeste. Por esse fato, os estados
de São Paulo e Rio de Janeiro já apresentam um relevante banco de dados
que pode auxiliar a Polícia Científica na confecção de laudos periciais
(OLIVEIRA-COSTA, 2013). Porém, o interesse pela pesquisa na área da
entomologia forense esta paulatinamente alçando com grupos de pesquisas
que estão se consolidando na Bahia, Pernambuco, Rio Grande do Norte e
Paraíba (VERAS, CORDEIRO e THE, 2009; OLIVEIRA-COSTA, 2013; BAIA,
2013; CAMPOS, 2015; BARBOSA e VASCONCELOS, 2015). Tais pesquisas
utilizam animais como modelo e são feitas para avaliar a relação da sucessão
entomológica com a decomposição do corpo, das quais se observam as
diferenças na atratividade, na dispersão larval, e diversidade de insetos
dependendo do modo de morte e exposição da carcaça (OLIVEIRA- COSTA,
2013).
A entomofauna cadavérica é composta principalmente por coleópteros e
dípteros, correspondendo a 60% dos insetos coletados em uma carcaça
(PAYNE, 1965; SOUZA, KIRST e KRUGER, 2008; BARBOSA, et al., 2009;
LEDO, BARROS e PUJOL-LUZ, 2012; OLIVEIRA et al., 2012; VASCONCELOS
e ARAUJO, 2012; OLIVEIRA- COSTA, 2014). Dentre os dípteros, as famílias
Calliphoridae e Sarcophagidae apresentam maior número de espécies
necrófagas de interesse forense e destacam-se pela abundância relativa e pela
sucessão cadavérica durante o processo de decomposição (BORNEMISSZA,
1957; REED, 1958; PAYNE, 1965; NUORTEVA, 1974; SOUZA, 1994). Em
relação aos coleópteros, as famílias mais encontradas em carcaças e corpos
em decomposição no Sudeste e Nordeste brasileiro são Dermatidae, Silphidae
e Cleridae (SMITH, 1986; CARVALHO et al., 2000; MEIRA, 2013; OLIVEIRA-
COSTA, 2013).
Nos Estados Unidos e África do Sul foram observadas espécies de
Chrysomya como a fauna associada a carcaças e corpos, sendo Chrysomya
rufifacies (Macquart) e C. megacephala (Fabricius, 1794) para o primeiro, e C.
albiceps (Wiedemann, 1819) e C. marginalis (Wiedemann, 1830) para o
22
segundo, além de Lucilia cuprina (Wiedemann, 1830), L.sericata (Meigen,
1826), Musca domestica (Linnaeus, 1758) e Piophila casei (Linnaeus) (LOUW
e LINDE, 1993). Na Europa, Calliphora vomitoria. (Linnaeus, 1758) e L.
sericata são as espécies que representam interesse forense (FREDERICKX,
2012). Na América do Sul há relativamente poucas informações sobre insetos
associados a cadáveres e carcaças (BARRETO et al., 2002). Em Medellín, na
Colômbia, o primeiro relato de um estudo continuo (durante 207 dias) sobre a
sucessão de insetos em carcaça foi realizado em 2001, no qual se avaliou a
entomofauna presente associada às fases de decomposição. Foram coletados
insetos de seis ordens: Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera,
Dermaptera e Lepdoptera (WOLFF et al., 2001). Também na Colômbia, um
estudo realizado em um ambiente fechado com carcaça de porco (Sus scrofa),
foi coletado Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775), L. eximia (Wiedemann,
1819), C. albiceps, M. domestica, Lepidodexia sp., e Ophyra aenescens
(Wiedemann, 1830) (RAMOS-PASTRANA, VELASQUEZ-VALENCIA e
WOLFF 2014). No Peru, Iannacone (2003) estudou a antropofauna associada
a um cadáver no Callao, relatou a família Calliphoridae como mais abundante
(81,62%).
No cenário brasileiro, os primeiros estudos datam de 1908, com os
trabalhos de Edgard Roquette Pinto e Oscar Freire, realizados
respectivamente no Rio de Janeiro e Bahia, na qual os autores registraram a
diversidade de insetos necrófagos com base em estudos de casos humanos e
animais em região de Mata Atlântica, até então preservada (PUJOL-LUZ,
ARANTES e CONSTANTINO, 2008).
Após o trabalho de Freire, poucos trabalhos foram publicados na região
Nordeste, sendo registrada pesquisa apenas em 2005, quando Andrade e
colaboradores publicaram um trabalho realizado com cadáveres no Instituto
Médico Legal do Rio Grande do Norte (ITEP-RN), na qual identificou espécies
de Chrysomya megacephala, C. albiceps, Co. macellaria, L. eximia e Lucilia
cuprina.
Ainda no Nordeste brasileiro, Cruz (2008) registrou 17 famílias de
insetos associadas à decomposição animal em uma área de Mata Atlântica de
Pernambuco. Foram coletados dípteros das famílias Anthomyiidae, Asilidae,
Calliphoridae, Chloropidae, Drosophilidae, Dixiidae, Fanniidae, Micropezidae,
23
Milichidae, Muscidae, Neridae, Phoridae, Piophilidae, Rodalomeridae,
Sarcophagidae, Stratiomydae e Tabanidae (OLIVEIRA- COSTA, 2013).
Vasconcelos e Salgado (2014) realizaram o primeiro registro de seis espécies
de califorídeos na região de Caatinga do nordeste brasileiro. Foram
identificadas três espécies nativas da Região Neotropical (Cochliomyia
macellaria, Chloroprocta idioidea (Robineau- Desvoidy, 1830) e Lucilia eximia)
e três espécies exóticas (Chrysomya albiceps, C. putoria (Wiedemann, 1818) e
C. megacephala).
As diversas pesquisas visam o conhecimento da entomofauna
cadavérica em diversos ecossistemas, levando em consideração as condições
ambientais de temperatura, umidade e pluviosidade, ou seja, fatores abióticos
que podem apresentar alguma interferência na atratividade de insetos
(VANLAERHOVEN e ANDERSON, 1999; ARCHER, 2004; MORETTI, 2006;
VASCONCELOS et al., 2013; ALVES et al., 2014a; VASCONCELOS,
BARBOSA e OLIVEIRA, 2015) Porém, estudos que avaliam o uso de
substâncias químicas na atratividade ou repulsão de insetos para
corpos/carcaças em decomposição são raros.
A atratividade é um fator intimamente ligado com modo de morte, e que
influencia no processo de decomposição (CARVALHO e LINHARES, 2001;
TURCHETTO e VANIN, 2004) e na estimativa do intervalo pós-morte, como foi
observado em carcaças suínas mortas por overdose de cocaína ou por disparo
de arma de fogo, na qual comparou a taxa de diversidade e abundância entre
espécies associadas (MARTINS, 2009). Os resultados não mostraram
diferenças entre as espécies, entretanto, houve momentos que a carcaça morta
por overdose de cocaína proporcionou quase o dobro de captura de adultos do
que o correspondente morto por disparo, sendo as carcaças de porcos mortas
por cocaína consumidas mais rapidamente (MARTINS, 2009).
1.3 Etanol
O etanol ocupa o primeiro lugar no ranking das substâncias psicoativas
mais consumidas do mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde
24
(OMS), cerca de 2 bilhões de pessoas no mundo consomem bebidas alcoólicas
e o abuso desta substância, assim como sua dependência, afetam mais de 25
milhões de brasileiros, e dessa forma, representa um dos maiores problemas
de saúde pública, tanto no Brasil como no resto do mundo. Estima-se, ainda,
que 3,3 milhões de mortes por ano estão relacionadas à esta substância
(WHO, 2014). O consumo de álcool foi identificado como um dos fatores de
risco mais importantes do mundo para morbidade, incapacidade e mortalidade
prematura, sendo responsável por 4% do total das mortes mundiais, um
percentual maior do que o de mortes causadas por outras doenças, como a
AIDS (WHO, 2002; WHO, 2011; WHO, 2014; RODRÍGUEZ-ÁLVAREZ et al.,
2015).
No cenário brasileiro e nos demais países em desenvolvimento, o
consumo de bebida alcoólica representa uns dos principais fatores de doença e
mortalidade, sendo um problema crescente e preocupante para o nosso país.
Nos últimos 40 anos, houve um crescimento de aproximadamente 154% no
consumo de bebida álcoolica de acordo com a OMS, e os danos psíquicos e
físicos de correntes do uso abusivo de bebida álcoolica passaram de 10 para
15% na população brasileira (PASSAGLI, 2013), sendo a dependência desta
substância responsável por 90% das internações em hospitais e clínicas
psiquiátricas no Brasil (GALDURÓZ e CAETANO, 2004).
Muitos são os problemas sociais atrelados ao consumo de álcool, dentre
eles é a relação com a criminalidade. Nos países desenvolvidos, as estatísticas
mostram uma estreita ligação entre o etanol e atos ilícitos; em países como
Bélgica, Alemanha e Inglaterra, o número de pessoas que cometeram crime
sob influência do álcool corresponde a aproximadamente 46,5, 50,0 e 80,0%,
respectivamente, de todos os casos (PASSAGLI, 2013). No Brasil, no Estado
de São Paulo, um estudo publicado em 2007 que mostrou que das 2.714
pessoas assassinadas em 2001, em 42,5% havia presença de álcool
(PASSAGLI, 2013). Em Curitiba, 130 processos de homicídio ocorridos entre
1990 a 1995 foram analisados, e os resultados apontaram que 58,9% dos
homicidas e 53,6% das vítimas estavam sob efeito do álcool à época do delito
(DUARTE e CARLINI-COTRIM, 2000).
Para a região Nordeste, dados epidemiológicos relacionando o consumo
de álcool com a criminalidade são escassos. Uma pesquisa publicada em 2004
25
mostrou que a prevalência de dependentes no Brasil foi mais alta nas regiões
Norte e Nordeste, com porcentagens acima dos 16%. Fato mais preocupante é
a constatação de que, no Norte e Nordeste brasileiro, aproximadamente 9%
dos adolescentes entre 12 e 17 anos eram dependentes do álcool, superior à
porcentagem nacional de 5,2% (GALDURÓZ e CAETANO, 2004; GOUVEIA et
al., 2009).
O etanol possui características que o tornam mais atraente do que
qualquer outra substância psicoativa: é lícito, com ampla disponibilidade, preço
acessível, apresenta facilidade de produção e muito divulgado pela mídia
(PASSAGLI, 2013).
Do ponto de vista farmacodinâmico, entende-se que o etanol afeta o
controle cognitivo, provocando desinibição comportamental e emocional
(MONGRAIN, 1989; ZHENG et al., 2015). Todavia, sabe-se que o consumo do
álcool interfere de diversas maneiras nos processos de neurotransmissão, em
especial, atuando sobre a neurotransmissão GABAérgica e glutamatérgica
(LOVINGER, 2008), além de outros sistemas neuronais como adrenérgico,
serotoninérgico, dopaminérgico, opioidérgico e colinérgico (PASSAGLI, 2013).
No sistema GABAérgico (principal sistema inibitório do sistema nervoso
central), em um período agudo, o etanol atua como agonista de seus
receptores (principalmente GABAA – ionotrópico permeáveis ao cloreto),
especialmente os localizados no córtex pré frontal e em certos núcleos
hipotalâmicos, provocando os efeitos geralmente característicos em indivíduos
que consomem bebida alcoólica: sedação e efeitos ansiolíticos. Sobre a
transmissão glutamatérgica (sistemas excitatórios do SNC), apresenta uma
ação antagonista, inibindo tanto a transmissão sináptica, em especial aquela
regulada por receptores do tipo NMDA (N-Metil-D-Aspartato), quanto a
plasticidade sináptica que depende da ativação destes receptores, levando a
prejuízos na memória, fato também comumente observado nos usuários desta
droga (FAINGOLD, N'GOUEMO e RIAZ, 1998; SIGGINS, ROBERTO e NIE,
2005; AMINOFF, 2007; LOVINGER, 2008).
No universo da entomologia forense, o etanol é pouco estudado.
Pesquisas in vitro são difíceis pela facilidade de volatilização e oxidação do
álcool, e em análises post mortem o grande problema se deve à degradação da
amostra biológica, que produz mais etanol, além de outros alcoóis
26
(isopropranol, n-propranol) formados por bactérias, caracterizando a
contaminação da amostra (PASSAGLI, 2013).
Nas análises toxicológicas post mortem, recomenda-se a coleta de
sangue de diferentes regiões do corpo, além de urina e humor vítreo, afim de
se verificar a redistribuição post mortem e evitar possíveis contaminações
microbiológicas. Destes, o humor vítreo é a amostra de escolha e de grande
importância para as análises, uma vez que é estéril, e geralmente demora para
ser contaminado por microorganismos (PASSAGLI, 2013; LIANG et al., 2015).
Nessa perspectiva, os insetos de interesse forense pode ser uma
ferramenta alternativa para a análise toxicológica, uma vez que estão em
contato direto com o corpo, se alimentando e participando do processo de
decomposição.
1.4- Flunitrazepam
O flunitrazepam (Figura 1), um medicamento da classe dos
benzodiazepínicos, foi sintetizado inicialmente em 1963 pelo Laboratório
Hofmann La Roche, no intuito de ser utilizado clinicamente como anestésico,
ansiolítico, sedativo e relaxante muscular (SMITH, LARIVE e ROMANELLI,
2002; MALANCIUC et al., 2009), e que veio a substituir a classe dos
barbitúricos devido a sua margem de segurança.
Assim como os demais benzodiazepínicos, o flunitrazepam é um agonista
dos receptores ácido gama-aminobutírico (GABAA), e atua na inibição da
neurotransmissão a nível cerebral e da medula espinal (RALL, 1993; ANGLIN
et al., 1997). A interação entre flunitrazepam e receptor GABA permite a
abertura dos canais de cloreto nos neurônios, resultando no influxo de cloro
para o interior da célula, provocando sua hiperpolarização e
consequentemente, diminuição da excitabilidade celular (BRITT e MCCANCE-
Figura 1- Fórmula estrutural do Flunitrazepam (adaptada Malanciuc et al., 2009).
27
KATZ, 2005; CHAKRABORTY, NEOGI e BASU 2011).
A toxicocinética é determinada pela via de administração do fármaco, que
pode ser oral, sublingual, intravenosa, intramuscular e retal. Na administração
oral, é quase completamente absorvido no trato gastrointestinal (ANGLIN et al.,
1997), 10-15% do fármaco sofre um metabolismo de primeira passagem no
fígado, originando uma biodisponibilidade absoluta de aproximadamente 85%
(SMITH, LARIVE e ROMANELLI, 2002). As concentrações plasmáticas
máximas ocorrem 0.75-2 horas após a administração oral, podendo ser
aumentada pela presença de alimentos no estômago, que reduz a velocidade
de absorção. Trata-se de um composto muito lipofílico, passando rapidamente
a barreira hemato-encefálica, explicando a sua rapidez de ação. O efeito
persiste cerca de 8 horas, podendo ser observadas alterações motoras até 12
horas após ingestão. O flunitrazepam é quase totalmente biotransformado
antes da sua eliminação. Os principais metabólitos plasmáticos são o 7-amino-
flunitrazepam e o N-desmetil-flunitrazepam. O principal metabólito urinário é o
7-amino-flunitrazepam (MALANCIUC et al., 2009).
O flunitrazepam tem como propriedade física ser uma substância cristalina
branca ou ligeiramente amarelada. É praticamente insolúvel em água, sendo
solúvel em acetona, etanol (1:172), metanol (1:100), clorofórmio (1:3) e dietil-
éter (1:300) (MALANCIUC et al., 2009).
Comercializado com o nome de Rohypnol®, está disponível em mais de 60
países da Europa e da América Latina, e encontra-se proibido nos EUA e
Canadá; porém, no Brasil, sua comercialização está restrita de acordo com a
Portaria 344/98 do SNVS (Sistema Nacional de Vigilância Sanitária), com
controle especial Lista B (tarja preta) (PASSAGLI, 2011). Foi o único
benzodiazepínico de substância controlada a sofrer alteração da escala IV para
escala III, na tentativa de melhorar a documentação de distribuição. Ainda há a
possibilidade de ser transferido para escala I, sob avaliação do Drug
Enforcement Administration (DEA) (SMITH et al., 2002; PASSAGLI, 2011). Esta
escala permite a designação de substâncias segundo o potencial abusivo da
mesa, no qual a escala I representa o maior potencial de abuso.
Popularmente apresenta diversos nomes: Roofies, la Rocha, Roche, R2,
Rope, FM2, Forget-mePill, Koofies, Rowie, Ruffies, LaRoche, La Kocha, Rib
28
Roche Run-trip-and-fall, Los Dos e MexicanValium (ANGLIN et al., 1997;
MALANCIUC et al., 2009).
Por ser um hipnótico eficaz e de ação rápida, o flunitrazepam ganhou, nos
últimos anos, a reputação de droga de violação (date rape drug) (DRUID,
2001). O seu consumo ilícito, em altas doses e associado a bebidas alcoólicas,
potencializa os efeitos sedativos, favorecendo a ação de criminosos nos casos
conhecidos como “Boa noite, Cinderela”, nos quais a vítima torna-se incapaz
de reagir, de se defender, devido à falta de controle muscular e perda da
consciência, ficando vulnerável à violação sexual e/ou vítimas de assalto
(ANGLIN et al., 1997; SCHWARTZ, MILTEER e LEBEAU, 2000; SMITH,
LARIVE e ROMANELLI, 2002; BISHOP, LERCH e MCCORD, 2004;
MALANCIUC et al., 2009). A amnésia anterógrada que acomete o individuo
incapacita-o de recordar o que sucedeu após a ingestão e a procurar as
autoridades policiais para realizar notícia-crime do ocorrido.
Nas suas priemrias formulações, o flunitrazepam era de fácil diluição,
incolor, inodoro e insípido (BARNETT e BROAD, 2003), e ao ser adicionado a
bebida alcóolica não mudava as características físicas do líquido. Por essa
preocupação, a indústria farmacêutica adicionou a sua composição um corante
azul, para torna perceptível a diferença de coloração na bebida (BARNETT e
BROAD, 2003), além de tornar mais difícil a diluição (GAUTAM, 2014).
Para além da sua relação com violações, tem sido documentada uma alta
frequência de abuso por parte de adolescentes e jovens adultos, em discotecas
e “raves”. Um estudo realizado em Lisboa, em adolescentes e jovens adultas
do sexo feminino verificou que cerca de 6% utilizou este fármaco, sendo
frequente a associação com etanol e outras drogas ilícitas, 10% das usuárias
reportaram abuso sexual ou físico subsequente (RICKERT, WIEMANN e
BERENSON, 1999). De acordo com o estudo de 2005, Monitoring the Future,
nos EUA 0,7% dos adolescentes no oitavo ano do ensino fundamental e 1,2%
dos adolescentes no 12º ano do ensino médio utilizaram no último ano esta
substância (JOHNSTON et al., 2007; GUERREIRO et al., 2011). Um estudo
realizado em 2002 por Wu e colaboradores nos Estados Unidos, mostrou que
0,4% dos jovens entre 16 e 23 anos já havia consumido flunitrazepam em sua
vida. O flunitrazepam também pode ser ingerido com outras substâncias, como
a cocaína e heroína (SMITH, LARIVE e ROMANELLI, 2002).
29
As formas de detecção do flunitrazepam nos fluidos corporais (sangue e
urina) exigem equipamentos sensíveis, uma vez que são administradas
pequenas dosagens, e o fármaco é rapidamente distribuído pelo corpo,
tornando os métodos de detecção muitas vezes falhos (SMITH, LARIVE e
ROMANELLI, 2002). Um dos métodos de escolha é a cromatografia gasosa-
espectrometria em massa (CG-MS), HPLC ou HPLC-MS que é capaz de
detectar o flunitrazepam ou metabólitos ativos, em dosagem de até 1 mg, 72
horas após a ingestão (SMITH, LARIVE e ROMANELLI, 2002; MALANCIUC et
al., 2009). Por essas limitações, o uso de insetos em análises pós-morte pode
ser uma ferramenta auxiliar potencial na detecção de substâncias, uma vez que
estes estão em contato direto com o corpo, tornando-os capazes de introduzir
no metabolismo substâncias que foram ingeridas pelo indivíduo antes da morte,
e dessa forma, informar se a vítima usou drogas (GOFF et al., 1994; BOUREL
et al., 2001).
1.5 Espectroscopia do infravermelho próximo (NIR) e análise
multivariada
A espectroscopia na região do infravermelho possui uma ampla faixa
espectral no qual é dividida em Infravermelho Próximo (NIR, 780 – 2500 nm),
Infravermelho Médio (MIR, 2500 – 5x104) e Infravermelho Distante (FIR, 5x104
– 1x106) (MARQUES, 2013) (Figura 2).
30
Figura 2- Regiões do espectro eletromagnético com ênfase na região do infravermelho. Fonte: Autora
A descoberta da radiação infravermelha data de 1800, pelo astrônomo e
músico inglês Frederik Willian Herschel, entre suas experiências para descobrir
o planeta Urânio, resultando na determinação da primeira parte não visível do
espectro eletromagnético. Passados 81 anos, Abney e Festing obtiveram o
primeiro espectro do infravermelho próximo, marco relevante na história do NIR
por trazer à tona o reconhecimento dos grupos atômicos e da importância da
ligação de hidrogênio. Apesar da grande descoberta, a utilização do NIR ficou
latente até meados do século 20, pelo fato dos pesquisadores considerarem os
espectros do NIR muito confusos de interpretação, em que apresentavam
muita sobreposição e picos de baixa intensidade. Entretanto, este cenário se
modifica na década de 1980, com a introdução do microprocessador no
desenvolvimento de instrumentos eletrônicos, o que facilitou e permitiu uma
aquisição, manipulação e interpretação dos dados complexos através de
programas computacionais (PASQUINI, 2003).
Devido a capacidade de detectar a “impressão digital” química da
amostra desejada (SHENK, WORKMAN e WESTERHAUS, 2001; PASQUINI,
2003), o NIR apresenta uma vasta possibilidade de aplicação, sendo utilizado
atualmente em diversos ramos: na clínica (SAKUDO et al., 2009), farmácia
(NEVES et al., 2012), microbiologia (MARQUES et al., 2013; MARQUES et al.,
2014), biodiesel (ZHANG, 2012), análise laboratorial (PEZZANITI et al., 2001;
NEVES et al, 2012), agricultura (SALGUERO-CHAPARRO et al., 2013),
entomologia (OLIVEIRA et al., 2014), alimentos (INACIO, MOURA e LIMA
31
2011), petróleo (KHANMOHAMMADI, GARMARUDI e DE LA GUARDIA, 2012),
entre outros.
A espectroscopia do infravermelho próximo tem como fundamento a
utilização de fótons de energia no intervalo de 2.65 x 10-19 a 7.96 x 10-20 J, que
corresponde ao comprimento de onda de 780 a 2500 nm. Essa quantidade de
energia permite que as moléculas alcancem um estado vibracional excitado
(por meio de uma transição vibracional fundamental), no entanto, incapazes de
provocar transições eletrônicas na mesma. Dessa forma, o objetivo geral de
submeter uma determinada amostra a radiação NIR é obter informação
qualitativa e / ou quantitativa proveniente da interação das ondas
eletromagnéticas do infravermelho próximo com seus constituintes, uma vez
que haja interação entre os momentos de dipolo da amostra em questão
(SKOOG, HOLLER e CROUCH, 1992; PASQUINI, 2003; NEVES et al., 2012).
A utilização da espectroscopia NIR como método analítico traz consigo
algumas características vantajosas quando comparadas com outras técnicas
de análise: apresenta natureza não destrutiva, não invasiva, rápida na
obtenção dos espectros, mínimo tratamento das amostras, não gera resíduos
químicos, e ser quase universal em termos de aplicação (considerando que
pode ser aplicada a qualquer molécula contendo as ligações C-H, N-H, O-H e
S-H) (PASQUINI, 2003; NEVES et al., 2012).
As técnicas mais convencionais e amplamente usadas em análises
toxicológicas incluem o radioimunoensaio (RIA), imunohistoquimica,
cromatografia gasosa (CG), de placa (TLC), líquida de alta resolução (HPLC)
ou gasosa com espectroscopia de massa (CG-MS). Essas técnicas permitem
separar, identificar e quantificar as substâncias químicas, mas por outro lado,
apresentam o inconveniente da preparação prévia da amostra, utilização de
reagentes, e consequentemente gerando um custo adicional e um período
maior para a obtenção dos resultados (COLLINS, BRAGA e BONATO, 1997;
SOTO, 2008). A cromatografia gasosa e espectrometria em massa, por
exemplo, utilizam urina ou sangue como amostras biológicas; entretanto, essas
amostras podem não apresentar um resultado fidedigno devido á meia-vida da
maioria dos medicamentos, tornando a detecção problemática (GAUTAM et al.,
2014).
32
No Brasil, as primeiras contribuições da utilização da espectroscopia NIR
se reportam em 1991, quando uma instituição de pesquisa brasileira
determinou a presença de um adoçante natural, esteviosideo, em uma planta
nativa da América do Sul (NISHIYAMA, ALVAREZ e VIEIRA, 1992; PASQUINI,
2003).
Na Entomotoxicologia, a aplicação do NIR mostrou-se uma ferramenta
eficiente e prática. A possibilidade de utilização de espécies adultas, imaturos e
pupas já foi comprovada como excelentes amostras biológicas para detecção
de substâncias químicas. Dessa forma, o NIR é considerado uma ferramenta
promissora para detecção de drogas facilitadoras de agressões sexuais
(DFAS), como o flunitrazepam, em associação com a entomologia forense, em
contrapartida às técnicas convencionais que necessitam de equipamentos
sensíveis, utilização de substâncias químicas, preparação de amostras e
algumas exigem determinado período para a conclusão de laudos (OLIVEIRA
et al., 2014).
O aparelho de espectrofotômetro é composto basicamente de uma fonte
de luz, seletor de comprimento de onda, porta amostra, detector e registrador
(Figura 3). O espectrofotômetro é um instrumento espectroscópico que utiliza
um monocromador ou policromador que dispersa a radiação em seus
comprimentos de onda constituintes, podendo variar o comprimento de onda
sobre uma faixa espectral considerável, juntamente com um transdutor que
converte as intensidades radiantes em sinais elétricos (MARQUES, 2013). Os
sinais elétricos, resultantes da reflectância difusa da amostra, são
transformados em espectros.
Entretanto, para realizar as análises multivariadas, os dados brutos
precisam ser pré-processados para a eliminação de ruídos gerados por
variações de temperatura, pH e tempo, assim como eliminar variações
sistemáticas de linha base, diferentes ordens de grandeza, e outras variações
que podem dificultar a interpretação e modelagem destes sinais. Os pré-
processamentos podem ser aplicados às variáveis ou às variações existentes
nas amostras (MARQUES, 2013).
A partir dos espectros pré-processados, é necessário realizar a
quimiometria, que é uma área de estudo que aplica métodos matemáticos e
estatísticos às ciências químicas, no qual permite converter as informações dos
33
espectros obtidos em uma linguagem mais acessível para se entender a
natureza química, de forma a agrupar ou diferenciar as amostras analisadas.
Portanto, as dificuldades que os pesquisadores tinham para as interpretações
dos espectros gerados, foram sanadas com a introdução de softwares capazes
de manipular e interpretar os dados complexos, sendo a técnica NIR
considerada parte hardware (instrumento) e software (quimiometria)
(MARQUES, 2013).
Para a análise multivariada utilizam-se técnicas quimiométricas com o
emprego de algoritmos como PCA (análise de componentes principais, do
inglês principal component analysis), LDA (análise linear discriminante, do
inglês linear discriminant analysis), SPA (algoritmo das projeções sucessivas,
do inglês sucessive projections algorithm), e GA (algoritmo genético), que são
capazes de distinguir, selecionar variáveis, separar ou agrupar as amostras. Na
literatura, a utilização de tais modelos foi aplicada à identificação de
flunitrazepam em amostras de larvas, pupários e adultos de Chrysomya
megacephala (OLIVEIRA et al., 2013); quantificação de glicose, colesterol e
triglicerídeos em plasma de ratos e humanos (NEVES, 2013); identificação de
Sthaphylococcus aureus em amostras de sangue (MARQUES et al., 2014).
(1) Amostras entomológicas
(2) Equipamento de
espectrofotômetro
(3) Espectros obtidos
1 2
(A)
34
Figura 3- Arranjo experimental para a aquisição de espectros. Em A, fluxograma demostrando as etapas para a obtenção dos espectros, no qual cada número corresponde à referida etapa em B. 1) exemplos de amostras biológicas de interesse forense utilizadas no espectofotômetro- larva, pupa e adulto. 2) Componentes básicos de um aparelho de espectofotômetro: fonte de luz, seletor de comprimento de onda, amostra, detector e registrador. No seletor de comprimento de onda, as setas em vermelho representam a radiação que é emida na amostra e a radiação refletida (reflectância difusa) da amostra. 3) Espectro obtidos de diferentes amostras. (Adaptado Oliveira et al., 2013).
2. OBJETIVOS
(B)
35
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos do etanol e do flunitrazepam na atratividade e
diversidade de insetos em carcaças de ratos e detectar essas substâncias por
espectroscopia no infravermelho próximo.
2.2 Objetivos específicos
1- Avaliar a influência do etanol e do flunitrazepam na diversidade e
abundância de insetos;
2- Avaliar a influência do tempo de exposição da carcaça na atratividade
e diversidade de insetos;
3- Avaliar o NIR e as ferramentas de classificação multivariada na detecção de etanol e flunitrazepam em insetos imaturos coletados nas carcaças.
3 MATERIAL E MÉTODOS
36
3.1 Local do estudo
O experimento de campo foi realizado no 7º Batalhão de Engenharia de
Combate, localizado a 5°49’ 50.2’’S 35°11’41.6’’W, em Natal, Rio Grande do
Norte (Figura 4).
Figura 4- (A) Estado do Rio Grande do Norte, com destaque para a localização do 7 ͦ Batalhão de Engenharia de Combate. Fonte: Google Imagens (B) Área do 7 ͦ Batalhão de Engenharia de Combate no Parque Estadual Dunas do Natal “Jornalista Luis Maria Alves” e suas imediações no município do Natal. Fonte: Google Maps (C) Trilha pertencente ao 7 ͦ Batalhão de Engenharia de Combate onde foram colocadas as armadilhas. Fonte: Gama, 2013.
Esta área corresponde a uma pequena parte da unidade de conservação
ambiental conhecida como Parque Estadual Dunas do Natal “Jornalista Luis
Maria Alves” (Parque das Dunas), ou seja, uma área de preservação de Mata
Atlântica. O Parque Estadual Dunas do Natal é o segundo maior parque urbano
do Brasil, com 9 km de comprimento, abrangendo uma área de 1.172,80 ha, e
constituindo uma área de dunas costeiras colonizados por plantas e animais de
diferentes domínios morfoclimáticos (AB'SABER, 1977), como a Mata Atlântica
e Tabuleiro Litorâneo (FREIRE, 1990). Está situado na fronteira norte da Mata
(B)
(A)
N
S L O
(C)
37
Atlântica, sendo rodeado por uma área urbana, e já mostra indícios da ação
antrópica (LISBOA, SALES e FREIRE, 2012). De acordo com levantamento
florístico, o parque abriga pelo menos 350 espécies nativas distintas, das quais
aproximadamente 200 já estão identificadas em gênero e espécie
(SEARH/COTIC, 2015).
3.2 Animais utilizados nos experimentos
Para a realização dos ensaios foram utilizadas 32 ratas Wistar (Rattus
norvegicus), com peso médio de 255 g ± 30 (Comitê de Ética Protocolo nº
044/2013) (ANEXO A).
As ratas com 60±5 dias no início do experimento provenientes do Biotério
do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, foram alojadas (4 animais/gaiola) em gaiolas-viveiro, com
livre acesso a água (ou às soluções de etanol) e comida (Ração Purina®,
Labina). As gaiolas-viveiro eram forradas com maravalha, e o processo de
higienização das mesmas (trocas) foi realizado a cada dois dias. O biotério
possuía ciclo de luz claro-escuro de 12 horas (claro, das 6:00 às 18:00) e
temperatura (23 °C ± 1 °C) controlados.
As ratas foram divididos em quatro grupos com 8 ratos em cada, onde
cada grupo recebia um tratamento diferente: (1) etanol – onde foi utilizado o
álcool etílico (Alcoolabor®, Segmenta) em concentrações crescentes de 2% (3
dias), 4% (3 dias) e 6% (15 dias) durante um período de 21 dias (TIRAPELLI et
al., 2008); (2) flunitrazepam – receberam dosagem de 2 mg/kg (SHINOMIYA et
al., 2004) via oral; (3) conjugado (etanol mais flunitrazepam) – utilizado o álcool
etílico (Alcoolabor®, Segmenta) em concentrações crescentes de 2% (3 dias),
4% (3 dias) e 6% (15 dias) durante um período de 21 dias (TIRAPELLI et al.,
2008) e que receberam dosagem de 2 mg/kg flunitrazepam por via oral
(SHINOMIYA et al., 2004); (4) controle – recebe apenas água ad libitum.
Após uma hora da administração do flunitrazepam, as ratas foram
eutanasiadas através de decapitação com auxílio de guilhotina e cada rato foi
38
colocado em um saco plástico individualizado. Animais pertencentes aos quatro
tratamentos foram transportados separadamente.
Em campo, as armadilhas contendo os ratos foram distribuídas em 8 grid
ao longo de uma das trilhas no 7º Batalhão de Engenharia de Combate,
distantes 50 metros aproximadamente (Figura 5), e a 1,50 metros de altura do
chão. Cada grid continha uma rata de cada tratamento: controle, etanol,
flunitrazepam, e conjugado distantes 5 metros entre si. As armadilhas
permaneceram em campo por cinco dias consecutivos (18 a 22 de novembro
de 2013), período de estação seca.
Figura 5- Em destaque a disposição das armadilhas contendo as carcaças de rato para cada tratamento, ao longo da trilha do 7º Batalhão de Engenharia de Combate no município do Natal- Rio Grande do Norte. Fonte: Gama, 2013.
3.3 Armadilhas utilizadas
Para as coletas em campo foram utilizadas armadilhas de cheiro
adaptadas de Ferreira (1978) confeccionadas com garrafa pet, com abertura na
lateral de aproximadamente 10 cm para permitir a entrada dos insetos, e outra
abertura na parte superior onde foi colocado saco de coleta (Figura 6).
39
Figura 6- Armadilha de cheiro feita com garrafa pet utilizada em campo para coleta de insetos, composta por: saco plástico, garrafa pet e rato (carcaça). Fonte: Gama, 2013.
3.4 Monitoramento das armadilhas
Após 24 horas de instalação, as armadilhas foram vistoriadas diariamente
e sempre às nove horas da manhã. O monitoramento foi realizado através da
retirada dos sacos de plásticos com insetos adultos e a substituição por um
novo. Os sacos plásticos eram acondicionados em caixas de isopor (de acordo
com o tratamento) e encaminhados para laboratório para a identificação com o
auxílio de chaves dicotômicas especificas (CARVALHO e RIBEIRO, 2000;
CARVALHO e MELLO- PATIU, 2008; VAIRO, MELLO-PATIU e CARVALHO,
2011; VAIRO MOURA e MELLO-PATIU, 2015).
Durante o terceiro e quarto dia, também foram coletadas 10 imaturos
(resultantes da oviposição e larviposição, com preferência pelas maiores lavas,
por representarem as primeiras gerações que chegaram na carcaça) de cada
armadilha (Figura 7). As larvas foram colocadas em frascos de vidro contendo
Saco plástico
Garrafa pet
Saco plástico
Rato
Saco plástico
40
glicerina e encaminhadas para laboratório para identificação e análise química
para detecção de flunitrazepam e etanol através da técnica de espectroscopia
no infravermelho próximo.
Figura 7- Coleta de imaturos das carcaças distribuídas ao longo da trilha no 7º Batalhão de Engenharia de Combate no município do Natal- Rio Grande do Norte. Fonte: Gama, 2013.
3.5 Dados meteorológicos
Os dados meteorológicos (umidade relativa do ar, temperatura,
velocidade do vento e precipitação) foram obtidos junto a Estação
Climatológica Principal, no Departamento de Geografia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
3.6 Análise química
41
As larvas coletadas em campo, após identificação, foram encaminhadas
para a ánalise química. Dois exemplares de cada tratamento foram limpos com
papel absorvente para a retirada do excesso de glicerina, e realizados três
incidências do feixe de luz ao longo da larva– anterior, mediana e posterior
(Figura 8).
A análise química foi realizada em conjunto com o Grupo de Pesquisa
Química Biológica e Quimiometria, no Laboratório de Química Analítica, no
Instituto de Química, na Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Figura 8- Aquisição dos espectros dos imaturos pela espectroscopia do infravermelho próximo. Em destaque uma larva de Lucilia eximia posicionada na parte superior da probe (sonda de reflectância) do aparelho NIR. Laboratório de Química Analítica – Instituto de Química- UFRN. Fonte: Baia, 2015.
Foi utilizada a técnica da espectroscopia do infravermelho próximo (NIR) e
métodos de classificação multivariadas para avaliar a composição química das
larvas, e detectar a presença do flunitrazepam e do etanol nos imaturos (Figura
9).
42
Figura 9- Componentes do aparelho de espectroscopia do infravermelho próximo. (A) Fonte de luz; (B) Sonda; (C) Amostra (D) Detector. Laboratório de Química Analítica – Instituto de Química- UFRN. Fonte: Baia, 2012.
Os espectros brutos obtidos correspondiam à composição química da
larva, além de alguns ruídos e variações de linha base, que precisaram ser pré-
processados com a aplicação de derivadas e suavizações. As análises foram
feitas por software específico (MatLab R2014a) e com o emprego de algoritmos
como PCA, SPA, LDA e GA, para detectar, separar ou agrupar os grupos que
continham a substância química flunitrazepam e etanol.
3.7 Análises estatísticas
3.7.1 Estatística clássica
O presente estudo avaliou a relação dos quatro diferentes tratamentos:
etanol, flunitrazepam, conjugado e controle com a diversidade de espécie e
famílias de insetos coletados nas armadilhas, e os dias em que as carcaças
ficaram expostas.
(D)
(B) (A)
(C)
43
Para avaliar as influências dos quatro tratamentos nas espécies/famílias
coletadas durante dos dias, utilizou-se a Análise de Covariância (ANCOVA),
que é uma extensão da Análise de Variância (ANOVA), na qual inclui uma ou
mais variáveis quantitativas correlacionadas ao desfecho de interesse. Estas
variáveis contínuas são incluídas na análise devido a sua influência que elas
possuem sobre o desfecho e são conhecidas como covariáveis (AGRANONIK;
MACHADO, 2011). O ANCOVA foi realizado com auxílio do programa XLSTAT
2015 (utilizado como um suplemento do Excel 2013).
Para a análise dos quatro tratamentos com base nos espécimes
coletados, com o intutito de avaliar a similaridade entre as espécies coletadas,
realizou-se o escalonamento multidimensional não métrico (nMDS) que
preserva a similaridade das amostras e utiliza matriz de abundância numérica
das espécies de moscas. Este teste pretende gerar gráficos na qual as
espécies similares agrupam os tratamentos, enquanto as distintas se
posicionem distante do espaço de ordenação (GOTELLI; ELLISON, 2011).
Para permitir essa análise, foi realizada a transformação de log (x+1) a
quantidade de insetos coletados em cada tratamento e utilizamos como medida
de similaridade Bray-Curtis para comparar a similaridade entre os tratamentos
(controle, etanol, flunitrazepam, etanol e flunitrazepam). Além disso, foi
conduzida a análise de ANOSIM para comprovar a confiabilidade do resultado
do nMDS. Para isso, foi utilizado o software Primer® 6.0.
Para a avaliação da interferência das variáveis ambientais na abundância
de insetos coletados, foi realizada uma regressão linear múltipla, pelo
programa estatístico BioEstat® 5.3.
3.7.2 Estatística multivariada
A estatísitica multivariada apresenta uma quantidade de amostras menor,
no entanto, um elevado número de variáveis. Enquanto que na estatística
clássica ocorre o contrário, com um número de amostras maior e quantidade
de variáveis menor.
44
A análise estatística multivariada realizada com os espectros obtidos pelo
espectrofotômetro NIR é um procedimento importante em virtude dos espectros
carregarem informações química e físicas das amostras, sendo a análise
explanatória utilizada para detecção de padrões de associação nos conjuntos
de dados e, a partir desses padrões, tornar possível o estabelecimento de
relações entre as amostras e variáveis, descobrir amostras anômalas ou
agrupá-las conforme determinada característica (MARQUES, 2013).
Os espectros NIR foram pré-processados entre os comprimentos de onda
900 e 1.700 nm, e dentre as técnicas de pré-processamento testadas, o PCA,
SPA-LDA e GA-LDA mostraram melhor separação quando combinadas com a
segunda derivada de Savitzky-Golay e suavização de Savitzky-Golay (LIMA et
al., 2015).
O PCA (principal component analysis) compreende à análise de
componentes principais, de forma que cada PC carrega informações diferentes
sobre as amostras e variáveis originais. De maneira geral, o princípio do PCA é
realizar uma aproximação da matriz original das respostas instrumentais (X)
como um produto de duas outras matrizes, de menores dimensões, os scores e
loadings. Portanto, a maior parte das informações (variabilidade) presente no
conjunto de dados está contida no primeiro PC, com decaimento das
informações nos PCs seguintes (CHAMINADE, BAILLET e FERRIER, 1998;
MATTHIAS, 2007). O SPA (do inglês sucessive projections algorithm) é um
algoritmo de seleção de variáveis, que através de diversas projeções vetoriais,
seleciona as variáveis espectrais mais relevantes, com o mínimo de
colinearidade e redundância, para a construção de modelos multivariados (LIU,
HE e SUN, 2009). O LDA (linear discriminant analysis) é utilizado no intuito de
encontrar uma combinação linear, que captura as principais diferenças entre as
classes e as separa. Neste modelo, ocorre uma classificação individual das
amostras, e o algoritmo tenta diferenciá-las. O LDA está intimamente ligado ao
PCA, no entanto, no PCA não há uma discriminação das classes (não
supervisionada), enquanto no LDA ocorre essa discriminação, sendo uma
análise supervisionada. O GA é um algoritmo genético de seleção de variáveis.
O modelo designa as variáveis determinados valores: código 1 quando a
variável for selecionada, e 0 quando for excluída. Este modelo pode ser
comparado com os constituintes genéticos, na qual a variável seria um gene, e
45
apenas os cromossomos mais bem adaptados e com maior aptidão são
selecionados. Dessa forma, são selecionados cromossomos “parentes” na
tentativa de gerar uma nova população (MARTEN e NAES, 2002).
46
4 RESULTADOS
4.1 Riqueza e abundância de dípteros necrófagos
Compilados todos os quatro tratamentos, durante os cinco dias, foram
coletados 3.165 dipteros necrófagos, identificados em: Calliphoridae (61,7%),
Fanniidae (10,5%), Sarcophagidae (10,4%), Anthomyiidae (4,0%), Muscidae
(2,2%), Phoridae (0,9%), Ullidiidae (0,4%) e Drosophilidae (0,1%).
Tabela 1- Abundância de dípteros coletados em carcaças de ratos submetidos aos tratamentos controle, etanol, flunitrazepam e conjugado, em uma área de Mata Atlântica, no município do Natal, no estado do Rio Grande do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de novembro de 2013. (C): Controle; (E): Etanol; (F): Flunitrazepam; (EF) Conjugado. Os valores conrrespondem à soma dos exemplares nas 8 réplicadas de cada tratamento.
Família/Espécie C E F EF Total %
Calliphoridae 377 373 202 1.003 1.955 61,7
Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) 288 183 121 633 1.225 38,7
Chrysomya albiceps (Wiedemann, 1819) 71 151 43 294 559 17,6
Chrysomya putoria (Wiedemann, 1818) 16 14 11 47 88 2,7
Lucilia eximia (Wiedemann, 1818) 2 24 26 28 80 2,5
Cochliomyia macellaria (Fabricius, 1775) 0 1 1 1 3 0,1
Sarcophagidae* 71 70 73 116 330 10,4
Peckia (Peckia) chrysostoma (Wiedemann, 1830) 1 4 3 4 12 0,3
Oxysarcodexia timida (Aldrich, 1916) 1 0 1 0 2 0,1
Oxysarcodexia amorosa (Schiner, 1868) 0 1 0 0 1 0,1
Oxysarcodexia introna (Curran & Walley, 1934) 0 4 0 0 4 0,1
Muscidae* 14 40 6 11 71 2,2
Musca domestica (Linnaeus, 1758)
Ophyra aenescens (Wiedemann, 1830)
3
2
1
30
1
0
0
7
5
39
0,1
1,2
Ophyra chalcogaster (Wiedemann, 1824)1 1 0 0 0 1 0,1
Atherigona orientalis (Schiner, 1868) 4 8 1 4 17 0,5
Synthesiomyia nudiseta (Wulp, 1883)1 0 1 0 0 1 0,1
Fanniidae* 83 70 74 106 333 10,5
Fannia pusio (Wiedemann, 1830) 0 3 2 1 6 0,1
Fannia sp. 0 25 0 9 34 1,0
Phoridae* 6 13 4 8 31 0,9
47
(continuação) Tabela 1
Megaselia scalaris (Loew, 1866)1 0 1 0 0 1 0,1
Ulidiidae 0 1 8 4 13 0,4
Anthomyiidae 34 29 21 43 127 4,0
Drosophilidae 0 3 0 1 4 0,1
Não identificados 40 61 87 113 301 9,5
Total 625 660 475 1.405 3.165 100
*Apenas alguns exemplares foram identificados em espécie.
1 Espécies
que são primeiro registro para o Estado do Rio Grande do Norte.
A família Calliphoridae foi a mais coletada, sendo representada por cinco
espécies: Chrysomya megacephala (n = 1.225), C. albiceps (n = 559), C.
putoria (n = 88), Lucilia eximia (n = 80) e Cochliomyia macellaria (n = 3)
(Gráfico 1).
Figura 10- ANCOVA realizado com o total das espécies de Calliphoridae coletadas em carcaças de ratos submetidos aos tratamentos controle, etanol, flunitrazepam e etanol e flunitrazepam, em uma área de Mata Atlântica, no município do Natal, no estado do Rio Grande do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de novembro de 2013.
Chrysomya megacephala
Chrysomya albiceps Chrysomya putoria
Cochliomyia macellaria Lucilia eximia
48
As espécies de Calliphoridae tiveram uma atratividade crescente, com
exceção de L. eximia que tem um crescimento e pico até o segundo dia,
decrescendo de maneira considerável nos dias seguintes. Exemplares de Co.
macellaria foram coletados apenas no quarto e quinto dia, em pequena
quantidade (Figura 10).
Fanniidae foi a segunda família mais abundante, com duas espécies
identificadas Fannia pusio e Fannia sp. Muitos foram identificados apenas em
gênero Fannia.
Os sarcofagídeos apresentaram 330 indivíduos coletados, dos quais
foram identificados em Peckia (Peckia) chrysostoma (Wiedemann, 1830),
Oxysarcodexia tímida (Aldrich, 1916), Oxysarcodexia amorosa (Schiner, 1868),
e Oxysarcodexia introna (Curran & Walley, 1934) (Tabela 1).
A família Muscidae (n = 71) teve a representatividade distribuída em
cinco espécies: Musca domestica, Ophyra aenescens, Atherigona orientalis
(Schiner, 1868), Ophyra chalcogaster (Wiedemann, 1824) e Synthesiomyia
nudiseta (Wulp, 1883).
Para a família Phoridae (n = 31), foi identificado um exemplar de
Megaselia scalaris (Loew, 1866).
Os espécimes das famílias Anthomyiidae, Ullidiidae, Drosophilidae,
apresentaram respectivamente, 127, 13 e 4 indivíduos coletados, não sendo
identificados em espécies.
4.2 Análise dos tratamentos e dias de experimento
Levando em consideração os tratamentos aplicados, a atratividade foi
maior para o tratamento conjugado, representando 44,3% de todos os insetos
coletados, mostrando-se prevalente em relação aos demais (p < 0,05), como
observado no Figura 11. Em seguida aparece o grupo etanol (20,8%), controle
(19,7%) e flunitrazepam (15,0%).
49
Figura 11- Quantidade total de dípteros coletados em carcaças de ratos submetidos aos tratamentos controle, etanol, flunitrazepam e conjugado, em uma área de Mata Atlântica, no município de Natal, no estado do Rio Grande do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de novembro de 2013.
O grupo conjugado apresentou maior atratividade e foi estatisticamente
relevante. No total foram coletados 1.405 dipteros necrófagos, com ênfase para
C. megacephala (n = 633), C. albiceps (n = 294), C. putoria (n = 47), L. eximia
(n = 28), Co. macellaria (n = 1), Sarcophagidae ( n = 116) e Fanniidae (n =
106). Este grupo atraiu mais sarcofagídeos quando relacionado com os demais
(Figura 12).
A atratividade no grupo etanol propiciou a coleta de 660 indivíduos
identificados em 373 Calliphoridae, 70 Sarcophagidae, 70 Fanniidae, 40
Muscidae, 29 Anthomyiidae, 13 Phoridae, 3 Drosophilidae e 1 Ullidiidae.
O grupo flunitrazepam foi o que apresentou menor atratividade,
perfazendo um total de 475 dipteros necrófagos, dos quais 388 foram
identificados em califorídeos (n = 202), sarcofagídeos (n = 73), e fanídeos (n =
74).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6
Qu
anti
dad
e
Dia
Regressão de quantidade por dia (R²=0.498)
a c f af
Modelo(a) Modelo(af) Modelo(c) Modelo(f)
Conjugado Etanol Flunitrazepam
Controle
50
Figura 12- Análise de Covariância para a distribuição de Sarcophagidae coletados em carcaças de ratos submetidos aos tratamentos controle, etanol, flunitrazepam e etanol e flunitrazepam, em uma área de Mata Atlântica, no município de Natal, no estado do Rio Grande do Norte, no período de 18 de novembro a 22 de novembro de 2013.
No grupo controle foram coletados 625 dipteros, dentre os quais 377
indivíduos eram da família Calliphoridae, com as respectivas espécies: C.
megacephala (n = 288), C. albiceps (n = 71), C. putoria (n = 16) e Lucilia eximia
(n = 2); 83 Fanniidae, 71 Sarcophagidae, 34 Anthomyiidae, 14 Muscidae e 6
Phoridae.
Dentre as espécies identificadas, a C. megacephala foi predominante em
todos os tratamentos. Estatisticamente, a proporção desta foi sempre maior
que as demais (P < 0,05).
A Tabela 2 mostra a dinâmica de atratividade de dípteros necrófagos
para todos os quatro grupos analisados durante os cinco dias de experimento.
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5 6
Qu
anti
dad
e
Dia
Regressão de quantidade por dia (R²=0.550)
a c f af
Modelo(a) Modelo(af) Modelo(c) Modelo(f)
Conjugado Etanol
Controle Flunitrazepam
50
Tabela 2- Abundância absoluta dos insetos coletados em carcaças de ratos submetidos aos tratamentos controle, etanol, conjugado e flunitrazepam, em uma área de Mata Atlântica, no município do Natal, no estado do Rio Grande do Norte, durante o experimento. Valores referentes a soma das oito réplicas para cada tratamento.
Controle Etanol Flunitrazepam Conjugado
Espécimes/Dia 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Chrysomya megacephala 0 14 34 103 137 1 35 55 74 18 0 23 31 48 19 0 21 99 73 440
Chrysomya albiceps 0 1 14 21 35 3 8 41 79 20 0 2 20 16 5 0 2 45 39 208
Chrysomya putoria 0 1 2 5 8 2 0 2 7 3 0 1 4 3 3 0 0 3 9 35
Lucilia eximia 1 0 1 0 0 1 23 0 0 0 0 21 2 3 0 0 21 6 0 1
Cochliomyia macellaria 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1
Sarcophagidae 3 5 12 26 25 4 4 16 17 29 11 4 24 26 8 3 13 37 13 50
Anthomyiidae 5 17 0 2 10 2 12 0 1 14 1 1 7 10 2 3 9 3 4 24
Muscidae 0 1 3 5 5 1 0 7 18 14 0 3 1 1 1 0 1 6 1 3
Fanniidae 0 0 35 15 33 0 8 15 30 17 0 19 35 20 0 0 16 57 8 25
Phoridae 0 0 2 1 3 0 3 8 0 2 0 0 2 0 2 4 0 1 1 2
Não identificados* 4 13 1 12 10 4 12 38 2 5 9 25 13 20 20 5 26 3 11 68
*Não identificados por falta de caracteres morfológicos.
50
A distribuição dos insetos necrófagos entre os tratamentos apresentando
um padrão heterogêneo de distribuição. A análise multivariada, efetuada pelo
escalonamento multidimensional (nMDS) com o fator “drogas” (presença de
etanol e flunitrazepam) e levando em consideração a abundância de insetos
coletados, mostrou que não é possível ver uma ordenação dos tratamentos
(Figura 13).
Figura 13 - Distribuição dos quatro tratamentos baseando-se na abundância dos insetos coletados durante os cinco dias, utilizando o método de escalonamento multidimensional não-paramétrico (nMDS). As letras correspondem aos tratamentos e os números representam os dias.
Na comparação entre os dias, a atratividade de insetos necrófagos foi
crescente durante os cinco dias, no entanto, não houve uma tendência de
agrupamento das réplicas entre os tratamentos observados no mesmo dia.
4.3 Dados Meteorológicos
Os dados meteorológicos não influenciaram significativamente a
atratividade da entomofauna cadavérica durante o período de realização do
teste (p>0,05).
Transform: Log(X+1)
Resemblance: S17 Bray Curtis similarity
Tratamentos
Controle
Etanol
Flunitrazepam
Conjugado
C1E1
F1
EF1
C2E2
F2
EF2
C3E3
F3EF3C4
E4
F4EF4C5
E5
F5
EF5
2D Stress: 0.09
51
A temperatura média foi de 26,3 ͦ C, variando entre 25 ͦ C e 28 ͦ C. A
umidade variou de 78% a 94%. O nível de precipitação alcançou 12 mm no
segundo dia de experimento, porém no primeiro e quarto foram 0 mm. A média
foi de 3, 92 mm. A velocidade do vento manteve-se entre 3,3km/h e 5,9km/h
(Tabela 3).
Tabela 3- Dados meteorológicos sobre umidade, temperatura, velocidade do vento e precipitação durante o experimento.
Fator Dias
1 2 3 4 5
Temperatura (ͦC) 25 25 28 27 25.4
Umidade (%) 78 94 78 82 92
Precipitacao (mm) 0 12 6.1 0 1.5
Velocidade do vento (Km/h) 5 5.8 5.9 5 3.3
4.4 Larvas usadas na espectroscopia do infravermelho próximo
(NIR)
Um total de 541 imaturos foram coletados de forma ativa durante o terceiro
e quarto dia de experimento, e os espécimes foram identificados em famílias e
espécies de acordo com a chave de identificação para larvas. As famílias
Sarcophagidae e Calliphoridae foram as encontradas, dos quais apresentaram
25 e 504 indivíduos respectivamente. Os califorídeos foram representados por
Lucilia sp. (n = 457), C. albiceps (n = 38), e C. megacephala (n = 9). Larvas no
estádio L2 não puderam ser identificadas (n = 12) devido à chave de
identicação ser exclusiva para imaturos L3 (Tabela 4).
Tabela 4- Quantidade de larvas coletadas por tratamento durante o terceiro e quarto dia de experimento. C: Controle; E: Etanol; F: Flunitrazepam; EF: Conjugado.
Família/Espécies/ Estádio
Dia 3 Dia 4
C E F EF C E F EF
Chrysomya megacephala (L3) 1 0 0 1 0 0 7 0
Chrysomya albiceps (L3) 0 0 1 0 16 11 0 10
Lucilia sp. (L3) 61 80 69 79 41 29 39 59
52
(continuação) Tabela 3
Sarcophagidae (L3) 0 0 0 0 11 0 3 11
L2 (Não identificada) 6 0 3 0 2 0 1 0
Devido a abundância de indivíduos da espécie Lucilia sp., esta foi a espécie
escolhida para realizar a análise química através da técnica da espectroscopia
NIR. A figura abaixo ilustra um exemplar de imaturo de Lucilia sp (Figura 14).
Figura 14- Larva de Lucilia sp. Em destaque os espiráculos respiratório característico: peritrema fechado e com botão. Fonte: Baia, 2014.
4.5 Espectroscopia NIR Para a espectroscopia NIR foram utilizadas 2 larvas da espécie Lucilia sp.
de cada tratamento, com a aquisição de espectros da parte anterior, mediana e
posterior de cada larva. Após o pré-processamento (Figura 15), os espectros
foram submetidos à análise do PCA (análise dos componentes principais), na
qual o modelo utilizou 10 PCs (componentes principais) e cumulativamente
explicam 95% da variância entre dados depois de aplicado o pré-
processamento de suavização de Savitzky-Golay. A figura abaixo representa
os espectros obtidos a partir da média dos três espectros obtidos de cada
imaturo em cada tratamento.
53
Figura 15- Espectros NIR pré- processados de larvas de Lucilia sp. coletadas de carcaças de ratos submetidos ao tratamento de etanol, flunitrazepam, conjugado e controle, em uma área de Mata Atlântica, no município do Natal, no estado do Rio Grande do Norte, nos dias 20 e 21 de novembro de 2013.
A figura 16 mostra a sobreposição dos grupos. Devido a pequena
separação, o conjunto de dados foi submetido ao SPA (análise de sucessivas
projeções) e GA (algoritmo genético) com as quatro categorias: controle,
droga, etanol, e etanol e droga (LIMA et al., 2015).
Figura 16- Resultados após aplicação dos algoritmos PCA- LDA das amostras de larvas de Lucilia sp.: DF1 × amostras calculadas pelo modelo de PCA-LDA a partir de etanol
(azul), conjugado (vermelho), controle (preto) e flunitrazepam (amarelo).
SPA resultou em cinco variáveis, determinadas em 900, 1317, 1482, 1631 e
1700 nm, resultando na figura 17. Utilizando apenas esses comprimentos de
onda, pelo teste de Fisher foi possível obter uma melhor separação quando
comparado PCA com LDA (linear discriminant analysis) (LIMA et al., 2015).
Etanol Conjugado Controle Flunitrazepam
Absorbância (a.u)
Comprimento de onda (nm)
Etanol
Conjugado Flunitrazepam
Controle
54
Figura 17- Resultados após aplicação dos algoritmos SPA-LDA para as amostras de larvas de Lucilia sp.: DF1 × amostras calculadas usando os cinco números de onda selecionados por modelo SPA-LDA a partir de etanol (azul), conjugado (vermelho), controle (preto) e flunitrazepam (amarelo).
Realizando um LDA sobre as variáveis de GA selecionadas, obteve-se
17 comprimentos de onda 917, 1007, 1039, 1066, 1161, 1171, 1173, 1181,
1200, 1230, 1352, 1404, 1475, 1491, 1493, 1617 e 1625 nm. Aplicando o teste
de Fisher, foi possível obter uma ótima separação, principalmente para o grupo
controle (Figura 18) (LIMA et al., 2015). Na figura seguinte observa-se que
houve separação no eixo vertical, que dividiu o grupo controle dos demais que
apresentavam etanol e/ou flunitrazepam na sua constituição; assim como no
eixo horizontal, entre os tratamentos etanol e flunitrazepam.
Figura 18- Resultados após aplicação dos algoritmos GA- LDA: DF1 × amostras calculadas usando os 17 números de onda selecionados por modelo GA-LDA a partir de etanol (azul) conjugado (vermelho), controle (preto) e drogas (amarelo).
Etanol
Conjugado Flunitrazepam
Controle
Etanol
Conjugado Flunitrazepam
Controle
55
5 DISCUSSÃO
Conforme demonstrado na Tabela 1, as carcaças de ratos foram
frequentadas e decompostas por uma grande variedade de insetos necrófagos,
principalmente dípteros representados pelas famílias Calliphoridae, Fanniidae e
Sarcophagidae, evidenciando que a carcaça é um substrato básico para a
colonização e desenvolvimento desses insetos, além de reafirmar a
importância em casos forense e no processo de decomposição.
Dos espécimes coletados, três primeiros registros foram identificados para o
estado do Rio Grande do Norte: Muscidae- Ophyra chalcogaster e
Synthesiomyia nudiseta; e Phoridae- Megaselia scalaris. As espécies de
muscídeos são consideradas sinantrópicas (LINHARES, 1981; D’ALMEIDA,
1992; MENDES e LINHARES, 1993; CARVALHO, MOURA e RIBEIRO, 2002;
LEANDRO e D’ALMEIDA, 2005), e seus indivíduos podem ser predadores,
saprófagos ou necrófagos e as larvas podem ocupar diversos habitats, dos
quais se destaca matéria orgânica de origem animal (COURI e CARVALHO,
2005). Por essa última característica, demonstram sua importância forense
(KRÜGER et al., 2002; OLIVEIRA; VASCONCELOS, 2010). Dessa forma,
podemos inferir a importância de realizar mais levantamentos faunísticos no
estado, no intuto de catalogar as espécies de interesse forense, assim como
predeterminar que a área do Parque das Dunas sofre impacto de ação
antrópica, visto que o mesmo esta inserido em uma área urbana. A
importância forense da espécie O. chalcogaster já foi reportada por Carvalho e
colaboradores (2000) pela associação com cadáveres no estado de São Paulo,
e em carcaças de suínos, principalmente nas primeiras fases de
decomposição, em um fragmento de floresta tropical no nordeste brasileiro
(VASCONCELOS et al., 2013). A outra espécie de Muscidae, Synthesiomyia
nudiseta, foi reportada por Freire (1914) em seu trabalho pioneiro no nordeste,
na qual observou sua abundância em cadáveres, especialmente no estágio
inicial de decomposição, semelhante aos resultados encontrados por Krüger et
al. (2010), na região sul do Brasil, que citam a importância forense dessa
espécie, uma vez que as larvas são encontradas na carcaça nos primeiros dois
56
dias de decomposição. Estudo realizado no Rio de Janeiro mostrou que S.
nudiseta – além de Musca domestica e Ophyra aenescens- foram as únicas
espécies de Muscidae associadas com cadáveres nas cenas de crime
(OLIVEIRA-COSTA e LOPES, 2000; OLIVEIRA-COSTA, MELLO-PATIU e
LOPES, 2001)
Dentre as pesquisas na área forense até então realizadas no estado do Rio
Grande do Norte, nenhuma havia reportado a família Phoridae. Seu primeiro
registro em cadáveres na região nordeste do Brasil foi feito por Vasconcelos et
al. (2014), no estado de Pernambuco. No entanto, a espécie Megaselia scalaris
já foi catalogada em cadáveres e utilizada como prova em casos forenses
(GREENBERG e WELLS, 1998; CARVALHO et al., 2000; VASCONCELOS,
SOARES e COSTA, 2014), e foi caracteretizada por apresentar predileção
pelos últimos estágios de decomposição e geralmente está associada a corpos
de difícil acesso para moscas maiores (GREENBERG e WELLS, 1998;
OLIVEIRA-COSTA, 2008).
As pesquisas desenvolvidas no estado do RN sobre a entomofauna
cadavérica limitavam-se a identificar, principalmente, algumas espécies de
Calliphoridae– Chrysomya megacephala, C. albiceps, C. putoria, Cochliomyia
macellaria, Lucilia eximia, L. cuprina (ANDRADE et al., 2005; MEIRA, 2009;
MEIRA, 2013) – e somente uma espécie de Muscidae- Musca domestica. Os
exemplares de Sarcophagidae eram relatados em nível de família (MEIRA,
2013). Somente Campos (2015) registrou 10 novas espécies de
Sarcophagidae, uma espécie de Fanniidae, e três de Muscidae coletadas de
isca forense em áreas de manguezal.
No presente trabalho, para os Dipteros, a família Calliphoridae
contabilizou maior número de espécimes coletadas, como pode ser visto na
Tabela 1, e esteve presente durante todo processo de decomposição (Figura
10). Isso se deve ao fato dos califorídeos compreendem 1.526 espécies de
moscas com distribuição mundial e além de serem frequentemente associados
com cadáveres em decomposição (CARVALHO et al., 2012; VASCONCELOS,
SOARES e COSTA, 2014). Sabe-se que, em virtude do seu olfato apurado,
geralmente, são os pioneiros na colonização de um cadáver em decomposição,
permanecendo até o estágio de esqueletização, corroborando com os achados
deste trabalho (MONTEIRO-FILHO e PENEREIRO, 1987; SALVIANO, 1996;
57
MEIRA, 2013). A espécie Chrysomya megacephala foi a mais abundante,
seguida de C. albiceps, C. putoria, Lucilia eximia e Cochliomyia macellaria.
Essa elevada quantididade de espécimes coletados deve-se, provavelmente,
pelas características ecológicas dos califorídeos por apresentarem
comportamento cosmopolita, pela alta capacidade de dispersão e adaptação
aos novos ambientes (GUIMARÃES, PRADO e BURALLI, 1979). Da mesma
forma, Andrade et al. (2005) e Campos (2015) obtiveram resultados
semelhantes quando coletaram mais C. megacephala de cadáveres e iscas em
área de manguezal no estado do RN, respectivamente. No entanto,
comparando com os resultados de Meira (2013), ainda no estado do RN, essa
coletou mais espécies de C. albiceps em cadáveres. Apesar da abundância de
insetos serem convergentes, ambas espécies são as principais observadas em
cadáveres no Brasil (CARVALHO et al., 2000; VASCONCELOS et al., 2014) e
em diversos países incluindo Colômbia (BARRETO et al., 2002), Itália (VANIN
et al., 2009) e Malásia (KUMARA et al., 2012).
Essa variedade de predominância de espécies forense em um mesmo
Estado pode ocorrer pelos diferentes biomas estudados (área de mangue,
Mata Atlântica e área urbana, por exemplo), assim como pelo tipo de substrato
utilizado (iscas, cadáveres e carcaças). Como pode ser observado quando
comparamos com o estudo realizado por Moretti (2006) em uma área de
vegetação secundária no município de Campinas, em que obteve grande
quantidade de Lucilia eximia e Peckia (Pattonella) intermutans, utilizando
carcaças de ratos.
Outro aspecto relevante observado na Tabela 1 e Figura 10, é pequena
quantidade de Co. macellaria e L. eximia coletadas. Ambas são espécies
nativas, que já foram consideradas as mais frequentes e constantes espécies
encontrada em carcaças nos estágios de putrefação e fermentação, raramente
ocorrendo no estágio de decomposição inicial (FREIRE, 1914; MORETTI,
2006). Todavia, após a introdução das espécies de Chrysomya no Brasil por
volta de 1975, este quadro foi alterado, provavelmente devido à competição
entre essas e Co. macellaria, a qual possivelmente tenha sido deslocada pelas
espécies invasoras (BAUMGARTNER e GREENBERG, 1984; SERRA, COSTA
e GODOY, 2011), experimentando inclusive declínio populacional em certas
regiões brasileiras. No entanto, a menor abundância não significa que a
58
espécie esteja sofrendo declínio populacional na região estudada. Individuos
dessa espécie podem ser menos vorazes e competitivos que espécimes do
gênero Chrysomya; ou serem meros frequentadores, e não colonizadores da
carcaça. Outro ponto observado é que adultos desta espécie foram coletados
apenas nos últimos dois dias de experimento, quando a carcaça já estava nos
estágios finais de decomposição. Tais resultados contrariam o trabalho de
Souza (1994), que mostrou que Co. macellaria não foi encontrada na fase final
de decomposição, e para o trabalho de Thyssen (2000), que não coletou
nenhum exemplar dessa espécie. Entretanto, para Meira (2009), a espécie foi
coletada no começo, meio e fim da decomposição, assim como para Alves et
al. (2014b), sendo a espécie mais coletada em carcaças de porcos durante a
estação seca em área de caatinga no nordeste brasileiro.
Para os fanídeos, poucos exemplares dessa família foram identificados
em nível de espécie devido a dificuldades taxonômicas e poucos taxonomistas
especializados, o que a torna pouco estudada, principalmente na região
Nordeste. Apenas a espécie Fannia pusio foi catalogada, registro também feito
por Campos (2015), em um estudo em duas áreas de manguezais no Rio
Grande do Norte. Em uma pesquisa feita no litoral pernambucano, F. pusio foi
a mais abundante e frequente entre as espécies de Fanniidae (BARBOSA,
2015). Essa família é comumente associada à decomposição de carcaças de
vertebrados (BARBOSA et al., 2009; ROSA et al., 2009; ALVES et al., 2014b;
BARBOSA, 2015), e já foi coletada em carcaças de porco (CARVALHO et al.,
2000) e em cadáveres no Rio de Janeiro (OLIVEIRA-COSTA, 2005). F. pusio
apresenta um pico populacional na primavera (SALVIANO et al., 1996), e é
capaz de suportar altas temperaturas (MARCHIORI e PRADO, 1999).
Os sarcofagídeos estiveram presentes durante todo o processo de
decomposição e foi a família de dípteros mais representativa no primeiro dia de
experimento. Por apresentarem algumas restrições para identificação, onde é
limitada, pois existe apenas chave de identificação através da genitália de
machos (CARVALHO et al., 2008; VAIRO, MELLO-PATIU e CARVALHO,
2011). Para as fêmeas, há poucas descrições morfológicas e raras chaves de
identificação (VAIRO, MOURA e MELLO-PATIU 2015). Foram identificadas
quatro espécies: Peckia (Peckia) chrysostoma, Oxysarcodexia timida,
Oxysarcodexia amorosa e Oxysarcodexia introna, porém, a maioria dos
59
exemplares foram identificados apenas em nível de família – muitos por serem
fêmeas - não permitindo uma comparação entre as espécies, e não destacando
uma mais prevalente para a região. Esta família é amplamente distribuída com
certa de 3.100 espécies descritas em 400 gêneros, no entanto é mais
concentrada em regiões de clima tropical temperado e quente, e na região
Neotropical mais de 800 espécies são encontradas, das quais, apenas a
subfamília Sarcophaginae tem espécies de importância médica e forense
(PAPE, 1996; VAIRO, MOURA e MELLO-PATIU, 2015). Trabalhos anteriores
sobre Entomologia Forense realizados no Estado do Rio Grande do Norte
registraram a presença de espécimes da família Sarcophagidae, porém não
identificados até espécie (ANDRADE et al., 2005; MEIRA, 2013). Somente em
2015, Campos catalogou 10 espécies dessa família, representando os
primeiros registros para o Estado do Rio Grande do Norte. Na região
Neotropical, os gêneros Oxysarcodexia e Peckia são os mais representativos
com 83 e 69 espécies conhecidas, respectivamente (PAPE, 1996; SOARES e
MELLO-PATIU, 2010; BUENAVENTURA e PAPE, 2013). O gênero Peckia
possui interesse forense e médico-veterinário (MOURA, CARVALHO e
MONTEIRO-FILHO 1997; BARROS, MELLO-PATIU e PUJOL-LUZ 2008) uma
vez que seus espécimes utilizam como fontes alimentares excrementos e
matéria orgânica em decomposição, inclusive cadáveres (SALVIANO, 1996;
CARVALHO et al., 2000). Já o gênero Oxysacordexia se sobressai por sua alta
riqueza e abundância nas pesquisas realizadas no Brasil, apresentando
espécies relatadas nos estudos relacionados à decomposição de vertebrados
(BARROS, MELLO-PATIU e PUJOL-LUZ, 2008; ROSA et al., 2009; MELLO-
PATIU et al., 2014; BARBOSA, 2015).
No geral, comparando com pesquisas de entomofauna associada a
carcaça animal (porcos) realizadas no Sudeste, muitas espécies de interesse
forense se assemelham: Calliphoridae- C. albiceps, C. megacephala, C.
putoria, L. eximia; Muscidae- O. chalcogaster; Phoridae – M. scalaris (SOUZA,
1994; CARVALHO et al., 2000; CARVALHO e LINHARES, 2001). Fazendo a
comparação com o mesmo tipo de substrato utilizado nesse estudo, Moretti et
al. (2008) observaram que a diversidade de Calliphoridae e Sarcophagidae foi
elevada independente da estação do ano. Foram coletadas 53 espécies das
famílias: Sarcophagidae, Calliphoridae, Muscidae, Fanniidae, Syrphidae,
60
Richardiidae, Sepsidae, Micropezidae, Otitidae, Drosophilidae, Phoridae,
Dolichopodidae, Anthomyiidae, Asilidae e Lauxaniidae (Diptera), Formicidae,
Ichneumonidae, Encyrtidae e Apidae (Hymenoptera), Staphylinidae
(Coleoptera) e Gonyleptidae (Opiliones), das quais 7 famílias de dípteros foram
identificados neste estudo.
Trabalhos utilizando atratividade de insetos são relevantes para
determinar a entomofauna cadavérica de uma região. No entanto, trabalhos
que incorporam o uso de substâncias químicas como atraentes ou repelentes
são escassos. Muitos trabalhos utilizam apenas as variações abióticas -
estação climática, umidade, sombra, sol, ambiente fechado ou aberto, que não
versam sobre as condições biológicas da carcaça ou cadáver. Dessa forma,
levando em consideração o tratamento aplicado, o comportamento dos insetos
não sugeriu nenhuma espécie ou característica exclusiva para determinado
grupo, apesar do tratamento conjugado ter atraído maior número de espécimes
e ter sido estatisticamente diferente dos demais (Figura 11 e 13).
Estudos sobre estímulo olfativo que utilizem etanol e flunitrazepam em
moscas varejeiras são inexistentes, no entanto, foi possível observar no
presente estudo que as duas substâncias concomitantes apresentaram
capacidade de atração de insetos maior quando comparado com os demais
grupos. Por meio disso, podemos inferir que durante a prática de uma perícia
criminal em local de crime – por exemplo, estupro favorecido pelo consumo de
drogas recreativas e bebida alcoólica, o corpo da vítima poderá apresentar uma
maior quantidade de insetos necrófagos, e que a abundância de insetos
presentes poderá auxiliar na estimativa do intervalo pós-morte, assim como,
acelerar o processo de decomposição cadavérica.
Não se sabe ao certo quais mecanismos desencadeiam esse sinergismo
entre o etanol e flunitrazepam. Podemos inferir que essas quando conjugadas
apresentam características que podem retardar o processo de volatização das
substâncias no organismo; ou por formação de algum composto que torna a
carcaça mais atrativa. Quando as substâncias foram analisadas
separadamente, o grupo etanol, controle e flunitrazepam apresentaram,
respectivamente, uma atratividade decrescente em quantidade de insetos
coletados no geral.
61
Segundo estudo de Detheir (1961), os quimiorreceptores olfativos da
mosca rejeitam substratos que apresentam altas concentrações de álcool. No
presente trabalho, esse fato pode ter ocorrido pela quantidade de etanol
ingerido pelo rato antes da eutanásia, assim como, em decorrência do próprio
processo de decomposição, em virtude da atividade dos microrganismos
(Cândida albicans, Clostridium sp, Escherichia coli, Streptococcus faecalis,
Lactobacillus sp) capazes de produzir etanol por meio da degradação dos
tecidos (CORRY,1978; BYRD e CASTNER, 2009).
No entanto, do ponto de vista da avaliação da do grupo etanol isolado,
foi o que atraiu mais que o grupo controle e flunitrazepam. De forma
semelhante, Tabor et al. (2005) avaliaram os efeitos antemortem da ingestão
de etanol em suínos, e o padrão de sucessão de insetos nos Estados Unidos, e
observaram que porcos que ingeriram etanol atraíram mais dípteros e
coleópteros. Vale ressaltar ainda, que das 32 espécies identificadas, apenas
três foram semelhantes às coletadas neste trabalho: Cochliomyia macellaria,
Musca domestica e Synthesiomya nudiseta, evidenciando as diferenças
ecológicas, e a importância de realizar levantamentos faunísticos em diferentes
biomas.
Comparando com modo de morte e ingestão de droga de abuso, Martins
(2009) comparou a taxa de diversidade e abundância entre espécies
associadas às carcaças de suínos mortos por overdose de cocaína e por
disparo de arma de fogo. Naquele estudo, não houve diferenças entre as
espécies, porém, as carcaças de porcos mortas por cocaína foram consumidas
mais rapidamente. Houve momentos que a carcaça morta por overdose de
cocaína proporcionou quase o dobro de captura de adultos do que o
correspondente morto por disparo. Em outro estudo no qual se comparou o
padrão de sucessão entomológica em suínos carbonizados e não carbonizados
(controle), observou-se que os carbonizados apresentaram uma maior
atratividade, abundância e riqueza, devido a uma exposição maior dos tecidos,
e consequentemente o IPM poderia ser subestimado caso fosse calculado
como um suíno não carbonizado (OLIVEIRA-COSTA et al., 2014).
Apesar de alta atratividade e coleta de insetos durante os cinco dias,
destacamos a necessidade de se aperfeiçoar a armadilha de cheiro utilizada,
pois essa permite perdas de insetos, tanto pela possibilidade deles fugirem da
62
armadilha, como pela morte quando se misturam com o material em
decomposição e líquidos produzidos.
Portanto, para a avaliação da atratividade entre os tratamentos no
presente estudo, foi possível fazer um pequeno mapeamento da entomofauna
cadavérica presente no ambiente de Mata Atlântica, e notar que a presença de
etanol e flunitrazepam, concomitantemente, atrai mais insetos do que as duas
substâncias separadas. Porém, não ocorreu evidência de nenhuma espécie
exclusiva para um determinado grupo, assim como um padrão de sucessão
estabelecido. Portanto, não houve uma homogeneidade entre os diferentes
tratamentos, conforme demonstrado na Figura 13.
Levando em consideração o fator “dias de decomposição”, não ocorreu
agrupamento entre os tratamentos e isso evidencia que não há um padrão
entre a entomofauna cadavérica atraída.
No presente estudo, as variáveis abióticas não interferiram na
abundância de insetos coletados, uma vez que não ocorreram variações nas
condições climáticas, além do pequeno intervalo de tempo analisado (Tabela
3). Resultado semelhante foi observado por Ferreira et al. (1995) e Campos
(2015).
As espécies de larvas coletadas entre o terceiro e quarto dia de
experimento não foram condizentes com o número e espécie de adultos
coletados. Enquanto para as larvas a espécie Lucilia sp. e C. albiceps esteve
mais presente, para os adultos foi C. megacephala. Esperava-se que a
quantidade de imaturos de C. megacephala fosse maior, visto que muitos
adultos foram coletados, e consequentemente responsável por um maior
número de oviposição. No entanto, essa diferença pode ser explicada pelo
local de preferência de deposição dos ovos pelas moscas, que pode ter
coincidido com o local de melhor acesso para a retirada das larvas; a presença
de algumas vespas, que são insetos onívoros e predam a fauna associada,
tanto adulto quanto imaturos, podem ter predado a maioria dos imaturos de C.
megacephala; e bem como através de fatores ecológicos, como a densidade
larval e as interações interespecíficas. Estudos anteriores mostraram que a
espécie C. albiceps é predadora facultativa de outras larvas de dípteros
(FULLER, 1934; COE, 1978; GAGNÉ, 1981; ERZINÇLIOGLU e WHITCOMBE,
1983). Essa predação intraguilda de C. albiceps exibe maiores taxas de ataque
63
sobre larvas de Co. macellaria, seguida de C. putoria. A espécie C.
megacephala tem mostrado melhores habilidades para desvencilhar-se de C.
albiceps durante o ataque larval (FARIA et al., 1999; DIAS, 2001). Segundo
Souza (2009), L. eximia e C. albiceps também foram as espécies de imaturos
mais abundantes em um experimento com carcaças de suínos.
Visto a grande abundância de adultos e imaturos presentes nas
carcaças, é crescente a utilização desse tipo de amostra biológica durante as
perícias, e a possibilidade de se obter informações durante um inquérito
policial. Dessa forma, a introdução de novas metodologias se fazem
necessárias, tanto para otimizar as técnicas já existentes, assim como torná-las
mais rápidas, baratas e acessíveis para os institutos de polícias técnicas.
Dentro dessa ótica, foi utilizada a espectroscopia NIR associada à
análise multivariada, que permite uma análise química da amostra, sem
destruí-la, e com a utilização de software que propicia a diferenciação entre os
grupos. Dessa forma, a análise dos imaturos da espécie Lucilia sp. permitiu
uma separação dos quatro diferentes tratamentos, como observado na Figura
19, tanto no eixo horizontal quanto no vertical. No eixo vertical, é possível
distinguir o grupo controle dos demais grupos que apresentam etanol e/ou
flunitrazepam na sua composição, mostrando que a ferramenta NIR e os
métodos de classificação são capazes de identificar a presença química de
substâncias que não são caracteristicas das propriedades bioquímicas das
larvas. No eixo horizontal, verificamos que houve separação e diferenciação
entre os grupos etanol e flunitrazepam, a qual pode ser justificada pela
detecção do comprimento de onda característico do flunitrazepam, em 1617 e
1625 nm, que representa o primeiro sobretom da cadeia C-H alongada do
flunitrazepam. Houve algumas sobreposições entre os todos grupos em
decorrência, possivelmente, da composição química característica da larva da
espécie Lucilia sp., na qual os comprimentos de onda 917, 1007 e 1039 nm são
peculiares ao hidrocarboneto cuticular dessa espécie, ou por substâncias
formadas – etanol, n-propanol, isopropanol, e butanol- pelo processo natural de
decomposição realizado por microrganismo (LEIKIN e WATSON, 2003;
FLANAGAN e CONNALLY, 2005). Como demonstrado em outros trabalhos do
nosso grupo de pesquisa de entomologia forense, o NIR já foi capaz de
identificar o flunitrazepam em larvas, pupário e adultos de C. megacephala
64
criados em dieta artificial contendo essa substância (OLIVEIRA et al., 2014).
Além disso, é uma técnica eficaz na classificação de espécies de adultos e
imaturos coletados em local de crime, como também dos estágios do ciclo de
vida (PICKERING et al., 2015). Além disso, é capaz de auxiliar na estimativa do
intervalo pós-morte em amostras biológicas de tecido de ratos em diferentes
estágios de decomposição (HUANG et al., 2009).
Na classificação multivariada, foram usadas quatro ferramentas –PCA,
LDA, SPA e GA- para separar os tratamentos. Ao realizar o PCA, todas as
variáveis espectrais no infravermelho entraram no modelo matemático,
entretanto, nem todas as variáveis foram úteis para realizar a classificação,
pois algumas não são informativas na capacidade de discriminar os grupos.
Dessa forma, foram utilizados o LDA, SPA e GA que selecionam as variáveis
específicas que apresentam uma relação direta com uma informação química
ou biológica da amostra, e que são capazes de fazer a diferenciação dos
grupos.
Dessa forma, o NIR e as técnicas de classificação multivariadas
despontam como uma nova ferramenta que pode ser utilizada nos institutos de
perícia, e auxiliará na determinação do intervalo pós-morte, na análise
toxicológicas de espécimes entomológicas, assim como material biológico
proveniente do cadáver. Como principal vantagem, diferentemente dos
métodos convencionais, o NIR é uma técnica não destrutiva, não utiliza
reagentes químicos, não produz resíduos, além de ser rápida e barata. O
radioimunoensaio (RIA), imunohistoquimica, cromatografia gasosa (CG), de
placa (TLC), líquida de alta resolução (HPLC) ou gasosa com espectroscopia
de massa (CG-MS) necessitam, geralmente, de preparação da amostra
biológica, com uso de reagentes químicos, e com produção de resíduos, assim
como, na análise molecular- PCR (reação em cadeia da polimerase) por
exemplo, utilizados na identificação molecular de espécies de Sarcophagidae,
precisam de reagentes e equipamentos caros para realizar o procedimento.
No presente trabalho, foi observado que o tratamento conjugado atraiu
uma elevada quantidade de insetos dípteros necrófagos, o que pode acelerar a
decomposição e dificultar a estimativa do intervalo pós-morte por métodos
convencionais. A atividade larval além de consumir a matéria orgânica, pode
introduzir no metabolismo as substâncias – ou metabólitos - consumidas pela
65
vítima antes da morte. Essa característica viabiliza a utilização dos insetos no
âmbito da entomologia forense, e em conjunto com o NIR, permite detectar a
presença de drogas nos insetos, no entanto, a técnica ainda precisa ser
validada por outros métodos convencionais.
CONCLUSÕES
Avaliando os efeitos do etanol e flunitrazepam na atratividade de carcaças
de ratos para insetos necrófagos, observa-se que as duas substâncias usadas
concomitantemente são mais atrativas para insetos necrófagos do que quando
analisadas separadamente. A entomofauna cadavérica atraída para as
carcaças foi constituída principalmente de espécimes das famílias
Calliphoridae, Fannidae e Sarcophagidae, com ênfase para a espécie
Chrysomya megacephala sendo a espécie mais coletada entre todos os
tratamentos. O padrão de atratividade foi homogêneo, não havendo nenhuma
espécie atraída exclusivamente para um único tratamento. Entretando, três
novos registros foram feitos para o Estado do Rio Grande do Norte: duas
espécies da família Muscidae (Synthesiomyia nudiseta e Ophyra chalcogaster)
e uma da família Phoridae (Megaselia scalaris).
No geral, o tempo de exposição da carcaça foi um fator diretamente
proporcional a quantidade de insetos coletados, ou seja, com o avançar das
fases do processo de decomposição, mais insetos eram atraídos.
A espectroscopia do infravermelho próximo associado aos métodos de
classificação multivariada, utilizados para detectar o etanol e o flunitrazepam,
mostra-se uma ferramenta viável para a análise química e toxicológica de
larvas de moscas, onde consegui separar e diferenciar os quatro diferentes
grupos estudados.
É importante ressaltar que, para a continuação desse trabalho, como
perspectiva futura, o método NIR e as ferramentas de classificação
multivariadas serão validados por métodos toxicológicos convencionais, como
o HPLC, e otimizado para que seja aplicado nos casos periciais pelos institutos
de Polícia Técnica, além da necessidade de ampliar as observações para as
quatro estações do ano, verificando se diferentes períodos interferem na
66
atratividade, e desenvolver uma armadilha mais eficaz para as coletas, sem
perda de dados.
REFERÊNCIAS
AB´SABER, N.A. Os domínios morfoclimáticos na América do Sul. Geomorfologia, v. 52, p. 1-23, 1977. AGRANONIK, M.; MACHADO, L. R. Análise de covariância: uma aplicação a dados de função pulmonar, ajustados por idade. Revista do Hospital das Clínicas de Porto Alegre, v. 31, n. 2, p. 248-253, 2011. ALVES, A. C. F.; SANTOS, W. E.; CREÃO-DUARTE, A. J. Diptera (Insecta) de importância forense da Região Neotropical. Entomotropica, v. 29, n. 2, p. 77-94, 2014a. ALVES, A. C. F.; SANTOS, W. E.; FARIAS, R. C. A. P.; CREÃO-DUARTE, A. J. Blowflies (Diptera, Calliphoridae) associated with pig carcasses in a Caatinga area, Northeastern Brazil. Neotropical Entomology, v. 43, p. 122–126, 2014b. AMENDT, J.; CAMPOBASSO, C. P.; GOFF, M. L.; GRASSBERGER, M. Current Concepts in Forensic Entomology. Springer. 376p. 2010. AMINOFF, M. J. Neurology and General Medicine. 4th. Ed.: Churchill Livingstone Elsevier, Filadélfia, 2007. ANDRADE, H. T. A.; VARELA-FREIRE, A. A.; BATISTA, M. J. A.; MEDEIROS, J. F. Calliphoridae (Diptera) coletados em cadáveres humanos no Rio Grande do Norte. Neotropical Entomology, v. 34, n.5, p. 855-856, 2005. ANGLIN, D.; SPEARS, K. L.; HUTSON, H. R. Flunitrazepam and its involvement in date or acquaintance rape. Academic Emergency Medicine, v. 4, n. 4, p. 323-326, 1997.
67
ARCHER, M. S. The effect of time after body discovery on the accuracy of retrospective weather station ambient temperature corrections in forensic entomology. Journal of Forensic Sciences, v. 49, p. 1–7, 2004. BAIA, T. C. Efeito da droga Rohypnol® (Flunitrazepam) no ciclo de desenvolvimento de Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) (Diptera: Calliphoridae) e suas implicações na Entomologia Forense. 2013. 50 f. Monografia (Bacharel em Biomedicina), Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2013. BARBOSA, R. R.; CARRIÇO, C.; SOUTO, R. N. P.; ANDENAC, S. R.; URURAHY-RODRIGUES, A.; QUEIROZ, M. M. C. Record of postmortem injuries caused by the Neotropical social wasp Agelaia fulvofasciata (Degeer) (Hymenoptera, Vespidae) on pig carcasses in the Eastern Amazon region: implications in forensic taphonomy. Revista Brasileira de Entomologia, v. 59, p. 257–259, 2015. BARBOSA, R. R.; MELLO-PATIU, C. A.; MELLO, R. P.; QUEIROZ, M. M. C. New records of calyptrate dipterans (Fanniidae, Muscidae and Sarcophagidae) associated with the decomposition of domestic pigs in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 104, p. 923- 926, 2009. BARBOSA, T. M. Diversidade e Potencial Forense de Dípteros Necrófagos (Fanniidae, Muscidae e Sarcophagidae) em Ambientes Litorâneos de Pernambuco sob Diferentes Graus de Antropização. 2015. 77 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal) - Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2015. BARBOSA, T. M.; VASCONCELOS, S. D. An updated checklist of myiasis-inducing Diptera species in livestock in Northeastern Brazil. Revista Archivos de Zootecnia, v. 64, n. 246, p. 187-190, 2015. BARNETT, J. M.; BROAD, R. M. Flunitrazepam used in a case of poisoning.CASE REPORT. Journal of Clinical Forensic Medicine, v. 10, p. 89–91, 2003. BARRETO, M.; BURBANO, M. E.; BARRETO, P. Flies (Calliphoridae, Muscidae) and beetles (Silphidae) from human cadavers in Cáli, Colombia, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, p. 137–138, 2002.
68
BARROS, R. M.; MELLO-PATIU, C. A.; PUJOL-LUZ, J. R. Sarcophagidae (Insecta, Diptera) associados à decomposição de carcaças de Sus scrofa Linnaeus (Suidae) em área de Cerrado do Distrito Federal, Brasil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 52, p. 606–609, 2008. BAUMGARTER, D. L.; GREENBERG, B. O gênero Chrysomya (Diptera: Calliphoridae). Journal of Medical Entomology, v. 21, p. 105- 113, 1984. BISHOP, S. C.; LERCH, M.; MCCORD, B. R. Detection of nitrated benzodiazepines by indirect laser-induced fluorescence detection on a microfluidic device. Forensic Science International, v. 141, p.7–15, 2004.
BORNEMISSZA, G.F. An analysis of arthropod succession in carrion and the effect of its decomposition on the soil fauna. Australian Journal of Zoology, v. 5, p. 1-12, 1957. BOUREL, B.; TOURNEL, G.; HÉDOUIN, V.; DEVEAUX, M.; GOFF, M. L.; GOSSET, D. Morphine extraction in necrophagous insects remains for determining ante-mortem opiate intoxication. Forensic Science International, v. 120, p. 127–131, 2001. BRAACK, L. E.; RETIEF, P. F. Dispersal, density and habitat preference of the blow-flies Chrysomyia albiceps (Wd.) and Chrysomyia marginalis (Wd.) (Diptera: Calliphoridae). Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 53, n. 1, p. 13-8, 1986. BRITT, G. C.; MCCANCE-KATZ, E. F. A brief overview of the clinical pharmacology of club drugs. Subst Use Misuse, v. 40(9-10), p. 1189-1201, 2005. BUENAVENTURA E.; PAPE T. Revision of the New World genus Peckia Robineau Desvoidy (Diptera: Sarcophagidae). Zootaxa, v. 3622, p. 001-087, 2013. BYRD, J. H.; CASTNER, J. L. Forensic Entomology: The Utility of Arthropods in Legal Investigations. CRC press, 2009. CAMPOS, A. Comparação da Dipterofauna de Importância Forense entre Duas Áreas de Manguezal no Rio Grande Do Norte. 2015. 24 f. Monografia
69
(Bacharel em Ecologia) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal. 2015. CARVALHO, C. J. B.; MOURA, M. O.; RIBEIRO, P. B. Chave para adultos de dípteros (Muscidae, Fanniidae, Anthomyiidae) associados ao ambiente humano no Brasil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 46, n. 1, p. 107-114, 2002. CARVALHO, C. J. B.; RAFAEL, J. A.; COURI, M. S.; SILVA, V. C. Diptera (2012) In: RAFAEL, J. A.; MELO, G. A. R.; CARVALHO, C. J. B.; CASARI, S.A.; CONSTANTINO, R. (eds) Insetos do Brasil, Diversidade e Taxonomia. Ribeirão Preto: Ed. Fapeam/Holos, p. 701–743, 2012. CARVALHO, C. J. B; MELLO-PATIU, C. A. Key to the adults of the most common forensic species of Diptera in South America. Revista Brasileira de Entomologia, v. 52, p. 390-406, 2008. CARVALHO, L. M. L.; THYSSEN, P. J.; LINHARES, A. X.; PALHARES, F. A. B. A checklist of arthropods associated with pig carrion and human corpses in Southeastern Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 95, n. 1, p. 135-138, 2000. CARVALHO, L. M.; LINHARES, A. X. Seasonality of insect succession and pig carcass decomposition in a natural forest in Southeastern Brazil. Journal of Forensic Sciences, v. 46, p. 604-608, 2001. CATTS, E. P.; GOFF, M. L. Forensic Entomology in criminal investigation. Annual Review of Entomology, v. 37, p. 253-272, 1992. CATTS, E. P.; HASKELL, N. H. Entomology and Death: A Procedural Guide. Joyce Print Shop, Estados Unidos, 1990. CHAKRABORTY, K.; NEOGI, R.; BASU, D. Club drugs: review of the “rave” with a note of concern for the Indian scenario. The Indian Journal of Medical Research, v. 133, n. 6, p. 594–604, 2011. CHAMINADE, P.; BAILLET, A.; FERRIER, D. Data treatment in near infrared spectroscopy. Analusis Magazine, v. 26, p. 33-38, 1998. COE, R. L. The decomposition of elephant carcases in the Tsavo (East) National, Kenya. Journal of Arid Environments, v. 1, p. 71-86, 1978.
70
COLLINS, C. A.; BRAGA, G. L.; BONATO, O. S. Introdução a Métodos Cromatográficos. 7 ed. Editora Unicamp, Campinas, 1997. CORRY, J. E. L. A review – possible sources of ethanol ante and postmortem: its relationship to the biochemistry and microbiology of decomposition. Journal of Applied Bacteriology, v.44, p.1-56, 1978. COURI, M. S.; CARVALHO, C. J. B. Diptera Muscidae do estado do Rio de Janeiro (Brasil). Biota Neotropica, v. 5, p. 205-222, 2005. CRUZ, T. M. Diversidade e sucessão ecológica de insetos associados à decomposição animal em um fragmento de Mata Atlântica de Pernambuco. 2008. 102f. Dissertação de Mestrado (Biologia Animal) - Universidade Federal de Pernambuco- UFPE, Recife, PE, 2008. D’ALMEIDA, J. M. Calyptrate Diptera (Muscidae and Anthomyidae) of the State of Rio de Janeiro - I. Synanthropy. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 87, n. 3, p. 381-386, 1992. DETHIER, V.G. The role of olfaction in alcohol ingestion by the blowfly. Journal of Insect Physiology, v.6, n.3, p. 222–230, 1961. DIAS, P. C. Força de interações interespecíficas e agregação larval em moscas-varejeiras. 2001. 56 f. Dissertação metrado (Ciências Biológicas). UNESP -Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Botucatu/ SP, 2001. DILLON, L.C. Insect sucession on carrion in three biogeoclimatic zones in British Columbia. 1997. 76 f. M. Sc. Thesis, Departament of Biological Sciences, Simon Fraser University, Burnaby. B.C, 1997. DRUID, H.; HOLMGREN, P.; AHLNER, J. Flunitrazepam: an evaluation of use, abuse and toxicity, Forensic Science International, v. 122, p. 136-141, 2001. DUARTE, P. C.; CARLINI-COTRIM, B. Álcool e violência: estudo dos processos de homicídio julgados nos tribunais do Júri de Curitiba, PR, entre 1995 e 1998. Jornal Brasileiro de Dependência Química, v. 1, n. 1, p. 17-25, 2000.
71
ERZINÇLIOGLU, Y. Z. E; WHITCOMBE, R. P. Chrysomya albiceps (Wiedemann) (Dipt., Calliphoridae) in dung and causing myiasis in Oman. Entomologist’s Monthly Magazine, v. 119, p.51-52, 1983. FAINGOLD, C. L.; N'GOUEMO, P.; RIAZ, A. Ethanol and neurotransmitter interactions--from molecular to integrative effects. Progress in Neurobiology, v. 55, n. 5, p. 509-35, 1998. FARIA, L. D. B.; ORSI, L.; TRINCA, L. A. E GODOY W. A. C. Larval predation by Chrysomya albiceps on Cochliomyia macellaria, Chrysomya megacephala and Chrysomya putoria. Entomologia Experimentalis et Applicata, v. 90, p. 149-155, 1999. FERREIRA, M. J. M. Sinantropia de dípteros muscoides de Curitiba, Paraná. I: Calliphoridae. Revista Brasileira de Biologia, v. 38, n. 2, p. 445-454, 1978. FERREIRA, M. J. M.; SANTOS, B. B.; CUNHA, H. F. Flutuação populacional de espécies de Chrysomya Robineau-Desvoidy (Diptera, Calliphoridae) em pomar de Goiânia, Goiás, Brasil. Revista Brasileira de Zoolologia, Curitiba, v. 12, n. 3, p. 557-562, 1995. FLANAGAN, R. J; CONNALLY, G. Interpretation of analytical toxicology results in life and at postmortem. Toxicological Reviews, v. 24, n. 1, p. 51–62, 2005. FREDERICKX, C.; DEKEIRSSCHIETER, J.; VERHEGGEN, J. F.; HAUBRUGE, E. Responses of Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae) to cadaveric volatile organic compounds. Journal of Forensic Science, v. 57, n. 2, p. 386-390, 2012. FREIRE, M. S. B. Levantamento florístico do Parque Estadual das Dunas do Natal. Acta Botânica Brasileira, v. 4, p. 41-59, 1990. FREIRE, O. Algumas notas para o estado da fauna cadavérica na Bahia. Gazeta Médica da Bahia, v. 46, p. 110-125, 1914. FULLER, M. E. The insect inhabitants of carrion, a study in animal ecology. Bulletin of the Council for Scientific and Industrial Research, v. 82, p. 5-62, 1934.
72
GAGNÉ, R. J. Chrysomya spp., Old World blowflies (Diptera, Calliphoridae), recently established in the Americas. Bulletin of Entomological Society of America, v. 27, p. 21-22, 1981. GAHLINGER P. M. Club Drugs: MDMA, Gamma-Hydroxybutirate (GHB), Rohypnol, and Ketamine, American Family Physician, v. 69, n. 11, p. 2619-2626, 2004. GALDURÓZ, J. C. F; CAETANO, R. Epidemiologia do uso de álcool no Brasil. Revista Brasileira de Psiquiatria, v. 26, n. 1, p. 3-6, 2004. GAUTAM, L.; SHARRATT, S. D.; COLE, M. D. Drug facilitated sexual assault: detection and stability of benzodiazepines in spiked drinks using gas chromatography-mass spectrometry. PLoS ONE, v. 9, n. 2, 2014. GOFF, M. L.; BROWN, W. A.; OMORI, A. I.; LAPOINTE, D. A. Preliminary observations on the effects of phencyclidine in decomposing tissues on the development of Parasarcophaga ruficornis (Diptera: Sarcophagidae). Journal of Forensic Sciences, v. 39, p. 123-8, 1994. GOFF, M. L. A fly for the prosecution: how insect evidence helps solve crimes. Cambridge: Harvard University Press. 225 p, 2000. GOTELLI, N.J.; ELLISON, A. M. Princípios de estatística em ecologia. Artmed, Porto Alegre, 1ª ed., 2011. GOUVEIA, V. V.; SILVA, L. D.; VIONE, K. C.; SOARES, A. K. S.; ATHAYDE, R. A. A. Atitudes frente ao álcool e o potencial bebedor-problema: correlatos demográficos e psicossociais. Revista Bioética¸v. 17, n. 2, p. 251– 266, 2009. GREENBERG, B.; WELLS, J. D. Forensic use of Megaselia abdita and M. scalaris. Journal of Medical Entomology, v. 35, n. 3, p. 205-209, 1998. GUERREIRO, D. F., CARMO, A. L., SILVA, J. A., NAVARRO, R., GÓIS, C. Um novo perfil de abuso de substâncias em adolescentes e jovens adultos. Acta Médica Portuguesa, v. 24, p. 739-756, 2011. GUIMARÃES, J. H.; PRADO, A. P.; BURALLI, G. M. Dispersal and distribution of three newly introduced species of Chrysomya Robineau-Desvoid in Brazil
73
(Diptera: Calliphoridae). Revista Brasileira de Entomologia, v. 23, p. 245-255, 1979. HALL, R. D. Perceptions and status of forensic entomology. In: BYRD, J. H.; CASTNER, J. L. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. CRC, Boca Raton, FL, p. 1-15, 2001. HUANG, P.; WEIPING, T.; YA, T.; WANG, Z.; GUANGDE, Y. Estimation of postmortem interval in rat liver and spleen using Fourier transform infrared spectroscopy. Spectroscopy Letters, v. 42, n. 2, p. 108-116, 2009. IANNACONE, J. Artropofauna de importancia forense en un cadáver de cerdo en el Callao, Perú. Revista Brasileira de Zoologia, v. 20, n. 1, p. 85-90, 2003. INACIO, M. R. C.; MOURA, M. F.; LIMA, K. M. G. Classification and determination of total protein in milk poder using nearinfrared reflectance spectrometry and the successive projections algorithm for variable selection. Vibrational Spectroscopy, v. 57, n. 2, p. 342–345, 2011. JOHNSTON, L. D; O’MALLEY, P. M.; BACHMAN, J. G.; SCHULENBERG, J. E. ed: Monitoring the Future national results on adolescent drug use: Overview of key findings, 2007 (NIH Publication No. 08-6418). Bethesda: National Institute on Drug Abuse 2008. KEH, B. Scope and applications of forensic entomology. Annual Review of Entomology, v. 30, p. 137-154, 1985. KHANMOHAMMADI, M.; GARMARUDI, A. B.; DE LA GUARDIA, M. Characterization of petroleum based products by infrared spectroscopy and chemometrics. Trends in Analytical Chemistry, v.35, p. 135-145, 2012. KUMARA, T. K.; DISNEY, R. H.; ABU HASSAN, A.; FLORES, M.; HWA, T. S.; MOHAMED, Z.; CHESALMAH, M. R.; BHUPINDER, S.Occurrence of oriental flies associated with indoor and outdoor human remains in the tropical climate of north Malaysia. Journal of Vector Ecology, v. 37, n. 1, p. 62-68, 2012. LEANDRO, M. J. F.; D’ALMEIDA, J. M. Levantamento de Calliphoridae, Fanniidae, Muscidae e Sarcophagidae em um fragmento de mata na Ilha do Governador, Rio de Janeiro, Brasil. Iheringia, Série Zoologia, v. 95, n. 4, p. 377-381, 2005.
74
LEDO, R. M. D.; BARROS, R. M.; PUJOL-LUZ, J. R. Sarcophagidae and Calliphoridae related to Rhinella schneideri (Anura, Bufonidae), Bothrops moojeni (Reptilia, Serpentes) and Mabuya frenata (Reptilia, Lacertilia) carcasses in Brasília, Brazil. Revista Brasileira de entomologia, v. 56, n. 3, p. 377-380, Sept. 2012 . LEIKIN, J. B.; WATSON, W. A. Post-mortem toxicology: what the dead can and cannot tell us. J Toxicol Clin Toxicol, v. 41, n. 1, p. 47–56, 2003. LIANG, H.; KUANG, S.; GUO, L.; YU, T.; RAO, Y. Assessment of the Role Played by N-propanol Found in Postmortem Blood in the Discrimination Between Antemortem Consumption and Postmortem Formation of Ethanol Using Rats. Journal of Forensic Science, 2015. LIMA, C.G.P. Detecção e estudo sobre o efeito da metanfetamina e do ecstasy no desenvolvimento de imaturos de três espécies de Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) de importância forense. 2009. 68 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Geral e Aplicada) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu/ SP, 2009. LIMA, L. A. S.; BAIA, T. C.; GAMA, R. A.; SILVA GASPAROTTOA, L. H.; LIMA , K. M. Near infrared spectroscopy as an emerging tool for forensic entomotoxicology. Alcohol, v. 40, n. 10, p. 10, 2015.
LINHARES, A. X. Synanthropy of Muscidae, Fanniidae and Anthomyiidae (Diptera) in the city of Campinas, São Paulo, Brazil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 25, n. 4, p. 231-243, 1981. LISBOA, C. M. C. A.; SALES, R. F. D.; FREIRE, E. M. X. Feeding ecology of the pygmy gecko Coleodactylus natalensis (Squamata: Sphaerodactylidae) in the Brazilian Atlantic Forest. Zoologia (Curitiba), v. 29, n. 4, p. 293-299, 2012. LIU, F.; HE, Y. SUN, G. Determination of protein contente of Auricalia auricalia using near infrared spectroscopy combined with linear and nonlinear calibrations. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 57, n. 11, p. 4520-4527, 2009. LORD, W. D.; STEVENSON, J. R. Directory of forensic entomologists. 2 ed. Misc. Publ. Armed Forces Pest Mgt. Board, Washington, D.C, 42 p, 1986.
75
LOUW, S.; LINDE, T. C. Insects frequenting decomposing corpses in Central South Africa. African Entomology, v.1, p. 265-296, 1993. LOVINGER, D.M. Communication networks in the brain. Alcohol research and health, v. 31, n. 3, p. 196-214; 2008. MALANCIUC, C.; AMARA, C.; SARMENT, I.; MONCIU, C.; NEDELCU, A.; CONSTANTINESCU, C. Analytical characterization of flunitrazepam. Farmacia, v. 57, n. 2, p. 167-183, 2009. MARCHIORI, C.H.; PRADO, A. P. “Tabelas de vida de Fannia pusio(Wied.) (Diptera: Fannidae)”. Annais da Sociedade Entomologica do Brasil, v. 28, n. 3, p. 557-563, 1999. MARQUES, A. S.; MELO, M. C.; CIDRAL, T. A.; LIMA, K. M.Feature selection strategies for identification of Staphylococcus aureus recovered in blood cultures using FT-IR spectroscopy successive projections algorithm for variable selection: a case study. Journal of microbiological methods, v. 98, p. 26-30, 2014. MARQUES, A. S.; NICÁCIO, J. T.; MELO, M. C.; CIDRAL, T. A.; LIMA, K. M. The use of near infrared spectroscopy and multivariate techniques to differentiate Escherichia coli and Salmonella Enteritidis inoculated into pulp juice. Journal of microbiological methods, v. 93, n. 2, p. 90-94, 2013. MARQUES, A. S. Uso da Espectroscopia do Infravermelho Próximo e técnicas multivariadas para diferenciar Escherichia coli e Salmonella Enteritidis inoculadas em polpa de fruta (abacaxi). 2013. 67f. Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 2013. MARTEN, H.; NAES, T. Multivariate Calibration and Classification, 1. ed. Chichester-UK: NIR Publication, 2002. MARTINS, E. Análise dos processos de decomposição e sucessão ecológica em carcaças de suíno (Sus scrofa L.) mortos por disparo de arma de fogo e overdose de cocaína e protocolo de procedimento diante de corpo de delito. 2009. 120 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Geral e Aplicada), UNESP, Botucatu. 2009.
76
MATTHIAS, O. Chemometrics, Statistics and Computer Application in Analytical Chemistry, 2. ed. Weinheim: WILEY- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2007. MEIRA, L. R. R. Entomofauna cadavérica humana coletada no ITEP- Instituto Técnico Científico de Polícia- do Rio Grande do Norte. 2009. 45f. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2009. MEIRA, L. R. R. A entomofauna cadavérica do Rio Grande do Norte e suas aplicações em casos de morte violenta. 2013. 63f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2013 MELLO-PATIU, C. A.; PASETO, M. L.; FARIA, L. S.; MENDES, J.; LINHARES, A. X. Sarchophagid flies (Insecta, Diptera) from pig carcasses in Minas Gerais, Brazil, with nine new records from the Cerrado, a threatened Neotropical biome. Revista Brasileira de Entomologia, 58(2): 142–146, 2014. MENDES, J.; LINHARES, A. X. Atratividade por iscas, sazonalidade e desenvolvimento ovariano em várias espécies de Muscidae (Diptera). Revista Brasileira de Entomologia, v. 37, n. 2, p. 289-297, 1993. MONGRAIN S., Standing L. Impairment of cognition, risk-taking, and self perception by alcohol.Perceptual and Motor Skills, v. 69, n. 1, p. 199–210, 1989. MONTEIRO-FILHO, E. L. A.; PENEIREIRO, J. L. Estudo da decomposição e sucessão sobre uma carcaça animal numa área do estado de São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de Biologia, v. 47, p. 289–295, 1987. MORETTI, T. C. Artrópodes associados às carcaças de pequenos roedores expostas em área de formação vegetal secundária no município de Campinas, SP. 2006. 86 f. Dissertações (Mestre em Parasitologia) - Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, 2006. MORETTI, T. C.; RIBEIRO, O. B.; THYSSEN, P. J.; SOLIS, D. R. Insects on decomposing carcasses of small rodents in a secondary forest in Southeastern Brazil. European Journal of Entomology, v. 105, p. 691-696, 2008.
77
MOURA, M. O.; CARVALHO, C. J. B.; MONTEIRO-FILHO, E. L. A. A preliminary analysis of insects of medico-legal importance in Curitiba, State of Paraná. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 92, n. 2, p. 269-274, 1997. NAKAZA, E.; DIAS FILHOS, C. R.; FONTES, L. R.; SILVA, S. F. S. M. Aplicação da Entomologia Forense nos Crimes Contra o Meio Ambiente: Perspectivas para o Brasil. Arquivos da Policia Civil, v.51, p. 11-24, 2009. NEVES, A. C. O. Espectroscopia do infravermelho próximo e métodos de calibração mmultivariada aplicados à determinação simultânea de parâmetros bioquímicos em plasma sanguíneo. 2013. 106 f. Dissertação (Mestrado em química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, 2013. NEVES, A. C. O.; SOARES, G. M.; MORAIS, S. C.; COSTA, F. S.; PORTO, D. L.; LIMA, K. M. Dissolution testing of isoniazid, rifampicin, pyrazinamide and ethambutol tablets using near-infrared spectroscopy (NIRS) and multivariate calibration. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, v. 57, p. 115-119, 2012. NEVES, A. C. O.; ARAÚJO, A. A.; SILVA, B. L.; VALDERRAMA, P.; MARÇO, P. H.; LIMA, K. M. Near infrared spectroscopy and multivariate calibration for simultaneous determination of glucose, triglycerides and high-density lipoprotein in animal plasma. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, v. 66, p. 252-257, 2012. NISHIYAMA, P.; ALVAREZ, M.; VIEIRA, L. G. E. Quantitative analysis of stevioside in the leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 59, n. 3, p. 277-281, 1992. NOURTEVA, P. Sarcophagus insects as forensic indicators. Forensic Medicine: a study in trauma and environmental hazards. Vol II. W.S. Saunders Company, p 1072-1095, 1977. NUORTEVA, P. Age determination of blood stain in a decaying shirt by entomological means. Forensic Science, v. 3, p. 89-94, 1974.
OLIVA, A.; RAVIOLI, J.; TEREZA, F.; NAVARRI, C. Entomologia forense. La Prensa Médica Argentina, v.82, p. 229-234, 1995.
78
OLIVEIRA, J. S.; BAIA, T. C.; GAMA, R. A.; LIMA, K. M. G. Development of a novel non-destructive method based on spectral fingerprint for determination of abused drug in insects: an alternative entomotoxicology approach. Microchemical Journal, v.115, p. 39–46, 2014. OLIVEIRA, R. GONÇALVES; RODRIGUES, ANSELMO PEREIRA; OLIVEIRA-COSTA, J.; BASTOS, C.; GENEROSO, B. C. Entomofauna cadavérica no instituto Médico Legal do Estado do Rio de Janeiro. Novo Enfoque, v. 15, P. 54-57, 2012. OLIVEIRA-COSTA, J. Entomologia forense: quando os insetos são vestígios. 2ª Edição. Campinas: Millennium, 2008. OLIVEIRA-COSTA, J. Entomologia forense: quando os insetos são vestígios. 3ª Edição. Campinas: Millennium, 2011. OLIVEIRA-COSTA, J. Insetos “Peritos”. A Entomologia Forense no Brasil. 1a Edição. Campinas: Millennium, 2013. OLIVEIRA-COSTA, J., LAMEGO, C.M.D., COURI, MS. AND MELLO-PATIU, CA. Differential Diptera succession patterns onto partially burned and unburned pig carrion in southeastern Brazil. Brazilian Journal of Biology, v. 74, n. 4, p. 870-876, 2014. OLIVEIRA-COSTA, J.; LOPES S. M. A relevância da entomologia forense para a perícia criminal na elucidação de um caso de suicídio. Entomologia y Vectores, v. 7, p. 203-209, 2000. OLIVEIRA-COSTA, J.; MELLO-PATIU, C. A.; LOPES, S. M. Dípteros muscóides associados com cadáveres humanos na cena da morte no estado do Rio de Janeiro - Brasil. Boletim do Museu Nacional, v. 464, p. 1-6, 2001. OLIVEIRA-COSTA. Levantamento da entomofauna cadavérica com vistas à formação de um banco de dados de aplicação em investigações de morte violenta do estado do Rio de Janeiro. 2005. 133p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Rio de Janeiro- UFRJ, 2005. PAPE, T. Catalogue of the Sarcophagidae of the world (Insecta: Diptera). Memoirs on Entomology, International, v. 8, 558p, 1996.
79
PASQUINI, C. Near Infrared Spectroscopy: fundamentals, practical aspects and analytical applications. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 14, n. 2, p. 198-219, 2003. PASSAGLI, M.F. Toxicologia Forense: Teoria e Prática. Editora Millennium, 3 ed. Campinas/ SP, 2011. PASSAGLI, M.F. Toxicologia Forense: Teoria e Prática. Editora Millennium, 4 ed. Campinas /SP, 2013. PAYNE, J. A. A summer carrion study of the baby pig Sus scrofa Linnaeus. Ecology, p. 592-602, 1965. PEZZANITI, J. L.; JENG, T.; MCDOWELL, L.; OOSTA, G. M. Preliminary investigation of near-infraredspectroscopicmeasurementsofurea, creatinine, glucose, protein, and ketone in urine. Clinical Biochemistry, v. 34, p. 239–246, 2001. PICKERING, C. L.; HANDS, J. R.; FULLWOOD, L. M.; SMITH, J. A.; BAKER, M. J. Rapid discrimination of maggots utilising ATR-FTIR spectroscopy. Forensic Science International, v. 249, p. 189–196, 2015. PUJOL-LUZ, J. R; ARANTES, L. C. H.; CONSTANTINO, R. Cem anos da entomologia forense no Brasil (1908- 2008). São Paulo, Revista Bras. Entomologia, v. 52, n.4, p. 485-492, 2008. RALL, T. W. Hypnotics and sedatives; ethanol. In: GOODMAN GILRNAN A, RALL TW, NIES AS, TAYLOR P (eds). Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics. New York: McGraw-Hill, 1993. RAMOS-PASTRANA, Y.; VELASQUEZ-VALENCIA, A.; WOLFF, M. Preliminary study of insects associated to indoor body decay in Colombia. Revista Brasileira de entomologia, v. 58, n. 4, p. 326-332, 2014. REED, H. B. A study of dog carcass communities in Tennessee, with special reference to the insects. The American Midland Naturalist, v. 59, p. 213-245, 1958. RICKERT, V. I.; WIEMANN, C. M.; BERENSON, A. B. Prevalence, patterns, and correlates of voluntary flunitrazepam Use. Pediatrics, 103(1), 1999.
80
RODRÍGUEZ-ÁLVAREZ, T.; RACAMONDE, I.; GONZÁLEZ-MARIÑO, I.; BORSOTTI, A.; RODIL, R.; RODRÍGUEZ, I.; ZUCCATO, E.; QUINTANA, J. B.; CASTIGLIONI, S. Alcohol and cocaine co-consumption in two European cities assessed by wastewater analysis. Science of The Total Environment, v. 536, p. 91-98, 2015. ROSA, T. A.; BABATA, M. L. Y.; SOUZA, C. M.; SOUSA, D.; MELLO-PATIU, C. A; MENDES J. Dípteros de interesse forense em dois perfis de vegetação de Cerrado em Uberlândia, MG. Neotropical Entomology, v. 38, n. 6, p. 859-866, 2009. SAKUDO, A.; KURATSUNE, Y. H.; KATO, Y. H.; IKUTA, K. Non-invasive prediction of hematocrit levels by portable visible and near-infrared spectrophotometer. Clinica Chimia Acta, v.48, n. 1-2, p 123-127, 2009. SALGUERO-CHAPARRO, L; GAITÁN-JURADP, A. J.; ORTIZA-SOMOVILLA, V.; PENA- RODRIGUEZ, F. Feasilityo fusing NIR spectroscopy to detect herbicide residues in intactlives. Food Control, v. 30, n. 2, p. 504-509, 2013. SALVIANO, R. J. B. Sucessão de Diptera Caliptrata em carcaça de Sus scrofa L. 1996. 124f. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 1996. SCHWARTZ, R. H.; MILTEER, R.; LEBEAU, M. A. Drug-facilitated sexual assault (date rape). Southern Medical Journal, v. 93, n. 6, p. 558-561, 2000. RIO GRANDE DO NORTE. Secretaria De Estado Da Administração e Dos Recursos Humanos e Coordenadoria de Tecnologia da Informação e Comunicação (SEARH/COTIC). Parque das Dunas. 2015. Disponível em <http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_report/msb_gsr_2014_1.pdf?ua=1> Acesso dia 13 de set de 2015. SERRA, H; COSTA, M. I. S.; GODOY, W. A. C. Allee effect in exotic and introduced blowflies. Neotropical entomology, v. 40, n. 5, p. 519-528, 2011. SHENK, J. S.; WORKMAN, J. J.; WESTERHAUS, M. O. Application of NIR Spectroscopy to Agricultural Products. CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
81
SHINOMIYA, K.; SHIGEMOTO, Y.; OMICHI, J.; UTSU, Y.; MIO, M.; KAMEI C. Effects of three hypnotics on the sleep-wakefulness cycle in sleep-disturbed rats. Psychopharmacology (Berl), v. 173, n. 1-2, p. 203-9, 2004.
SIGGINS, G.R.; ROBERTO, M.; NIE, Z. The tipsy terminal: presynaptic effects of ethanol. Pharmacology & Therapeutics, v.107, n. 1, p. 80-98; 2005. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Principles of instrumental analysis. 5 ed. Philadelphia: Saunders College Publishing, 1992. SMITH, K. G. V. A manual of forensic entomology. Cornell Univ. Press, Ithaca, NY, 1986. SMITH, K. M.; LARIVE, L. L.; ROMANELLI, F. Club drugs: methylenedioxymethamphetamine, flunitrazepam, ketaminehydrochloride, and γ-hydroxybutyrate. American Journal of Health-System Pharmacy, v. 59, n. 1, p. 1067-1076, 2002. SOARES, W. F.; MELLO-PATIU, C. A. Two new Neotropical species of the genus Oxysarcodexia Towsend (Diptera, Sarcophagidae). Revista Brasileira de Entomologia, v. 54, n. 1, p. 72-75, 2010. SOTO, D. A. E. Avaliação da taxa de desenvolvimento de três espécies de califorideos (díptera) de importância forense sob o efeito de dois barbitúricos. 2008. 82 f. Tese (Doutorado em Biologia Animal). UNICAMP, Campinas, 2008. SOUZA, A. M. Sucessão entomológica na decomposição de carcaça animal. 1994. 96 f. Dissertação (Mestrado em Parasitologia) - Universaidade de Campinas- UNICAMP, Campinas, 1994. SOUZA, A. S. B. Calliphoridae (Diptera) associados a cadáver de porco doméstico Sus scrofa (L.) na cidade de Manaus, Amazonas, Brasil. 2009. 55f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - INPA- Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus/ AM, 2009.
SOUZA, A. S. B.; KIRST, F. D.; KRUGER, R. F. Insects of forensic importance from Rio Grande do Sul state in southern Brazil. Revista Brasileira de entomologia, v. 52, n. 4, p. 641-646, 2008.
82
TABOR, K. L.; FELL, R. D.; PELZER, K. BEHONICK, G.S. Effescts of antemortem ingestion of ethanol on insect successional patterns and development of Phormia regina (Diptera: Calliphoridae). Journal of Medical Entomology, v. 42, n. 3, p. 481-489, 2005. THYSSEN, P. J. Decomposição e sucessão entomológica em carcaças de suínos (Sus scrofa L.) de tamanhos diferentes: estudos em ambiente de mata natural na região de Campinas, SP. 2000. F. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal) – Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, 2000. TIRAPELLI, C. R.; FUKADA, S. Y.; CHIGNALIA, A. Z.; TOSTES, R. C.; BONAVENTURA, D.; LANCHOTE, V. L.; CUNHA, F. Q.; OLIVEIRA, A. M.
Gender‐specific vascular effects elicited by chronic ethanol consumption in rats: a role for inducible nitric oxide synthase. British Journal of Pharmacology, v. 153, n. 3, p. 468-479, 2008. TURCHETTO, M.; VANIN, S. Forensic entomology and climatic change. Forensic Science International, v. 146, p. 207-9, 2004. VAIRO, K. P.; MELLO-PATIU, C. A.; CARVALHO, C. J. B. Pictorial identification key for species of Sarcophagidae (Diptera) of potential forensic importance in southern Brazil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 55, p.333–347, 2011. VAIRO, K. P.; MOURA, O. M.; MELLO-PATIU, C. A. Comparative morphology and identification key for females of nine Sarcophagidae species (Diptera) with forensic importance in Southern Brazil. Revista Brasileira de Entomologia, v. 59, p.177–187, 2015. VANIN, S.; CAENAZZO, L.; ARSENI, A.; CECCHETTO, G.; CATTANEO, C.; TURCHETTO, M. Records of Chrysomya albiceps in Northern Italy: an ecological and forensic perspective. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 104, p. 555–557, 2009. VANLAERHOVEN, S. L.; ANDERSON, G. S. Insect sucession on buried carrion in two biogeoclimatic zones of British Columbia. Journal of Forensic Sciences, v. 44, p. 32-43, 1999. VASCONCELOS, S. D.; ARAUJO, M. C. S. Necrophagous species of Diptera and Coleoptera in northeastern Brazil: state of the art and challenges for the Forensic Entomologist. Revista Brasileira de entomologia, v. 56, n. 1, p. 7-14, 2012.
83
VASCONCELOS, S. D.; BARBOSA, T. M.; OLIVEIRA, T. P. B. Diversity of forensically-important dipteran species in different environments in northeastern Brazil, with notes on the attractiveness of animal baits. Florida Entomologist, v. 98, n. 2, p. 70-775, 2015. VASCONCELOS, S. D.; CRUZ, T. M.; SALGADO, R. L.; THYSSEN, P. J. Dipterans associated with a decomposing animal carcass in a rainforest fragment in brazil: notes on the early arrival and colonization by necrophagous species. Journal of Insect Science, v. 13, n. 145, 2013. VASCONCELOS, S. D.; SALGADO, R. L. First record of six Calliphoridae (Diptera) species in a seasonally dry tropical forest in brazil: evidence for the establishment of invasive species. Florida Entomologist, v. 97, p. 814-816, 2014. VASCONCELOS, S. D.; SOARES, T. F.; COSTA, D. L. Multiple colonization of a cadaver by insects in an indoor environment: first record of Fannia trimaculata (Diptera: Fanniidae) and Peckia (Peckia) chrysostoma (Sarcophagidae) as colonizers of a human corpse. International Journal of Legal Medicine, v. 128, n. 1, p. 229-33, 2014. VERAS, T. F.; CORDEIRO, F. M. P.; THE, T. S. Métodos de Coleta e conservação de insetos de importancia forense em seus diferentes estágios de desenvolvimento: Aplicação do cálculo de estimativa de intervalo pós-morte por método entomológico. Prova Material, v. 1, p. 08-13, 2009. VON ZUBEN, C. J. Zoologia Aplicada: Recentes avanços em estudos de entomologia forense. Entomologia y Vectores, v.8, n. 2, p. 173-183, 2001.
WOLFF, M.; URIBE, A.; ORTIZ, A.; DUQUE, P. Um estudo preliminar da entomologia forense em Medellín, Colômbia. Forensic Science International, v. 120, n.1-2, p. 53-9, 2001.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Global status report on alcohol and health. 2011. Geneva. Disponível em: <
http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_report/msbgsruprofiles.pdf> Acesso em 03 de mar de 2014. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Global Status Report on Alcohol and Health. 2014. Geneva. Disponivel em:
84
<http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_report/msb_gsr_2014_1.pdf?ua=1> Acesso dia 13 de set de 2015. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). The World Health Report 2002. Reducing Risks, promoting healthy life. Geneva. Disponível em: <
http://www.who.int/whr/2002/en/whr02_en.pdf?ua=1> Acesso em 03 mar de 2014. WU, L. T.; SCHLENGER, W. E.; GALVIN, D. M. Concurrent Use of Methamphetamine, MDMA, LSD, Ketamine, GHB, and Flunitrazepam among American Youths. Drug and alcohol dependence, v. 84, n. 1, p. 102-113, 2006. ZHANG, W. Review on analysis of biodiesel with infrared spectroscopy. Renewable Suntainable Energy Reviews, v.16, n.8, p. 6048-6058, 2012. ZHENG, H.; KONG, L.; CHEN, L.; ZHANG, H.; ZHENG, W. Acute Effects of Alcohol on the Human Brain: A Resting-State fMRI Study. BioMed Research International, 2015.
85
ANEXO
86
ANEXO A- Protocolo emitido pela Comissão de Ética no uso de animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para a realização do projeto.
87
ANEXO B- Artigo publicado na Revista NIR NEWS
88
ANEXO B – (continuação) Artigo publicado na Revista NIR NEWS
89
ANEXO B- (Continuação) Artigo publicado na Revista NIR NEWS B