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UNIVERSDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
Janete Cunha Lima
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES DA IMUNIDADE
INATA EM LINHAGENS DE CAMUNDONGOS SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A INFECÇÃO PELO Schistosoma mansoni
Janeiro de 2016
Janete Cunha Lima
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES DA IMUNIDADE
INATA EM LINHAGENS DE CAMUNDONGOS SUSCETÍVEIS E
RESISTENTES A INFECÇÃO PELO Schistosoma mansoni
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, como requisito para obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes (UFRN)
Co-orientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo (UFMG)
Janeiro de 2016
JANETE CUNHA LIMA
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES DA IMUNIDADE INATA EM
LINHAGENS DE CAMUNDONGOS SUSCETÍVEIS E RESISTENTES A INFECÇÃO
PELO Schistosoma mansoni
Relatório final, apresentado a Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como
parte das exigências para a obtenção do
Título de Mestre em Biologia Parasitária.
Natal, 29 de Janeiro de 2016.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. Paulo marcos da Matta Guedes
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
________________________________________ Profa. Dr. Antônia Cláudia Jácome da Câmara
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
________________________________________ Prof. Dr. Cléber de Mesquita Andrade
Universidade Estadual do Rio Grande do Norte - UERN
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências – CB
Lima, Janete Cunha.
Avaliação da expressão de receptores da imunidade inata em
linhagens de camundongos suscetíveis e resistentes a infecção pelo Schistosoma mansoni / Janete Cunha Lima. - Natal, 2016.
62 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes.
Coorientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Biologia Parasitária.
1. Schistosoma mansoni - Dissertação. 2. Imunidade Inata -
Dissertação. 3. Receptores - Dissertação. 4. Citocinas -
Dissertação. I. Guedes, Paulo Marcos da Matta. II. Melo, Alan Lane
de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616-008.89
DEDICATÓRIA
Aos meus avós: Irene Pinheiro da Cunha (in memoriam) e José Pereira da
Cunha (in memoriam) com todo meu amor e gratidão, por terem me propiciado o
privilégio de viver ao lado deles.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ivaneide da Cunha Lima e João Lima Cunha, pelo amor
incondicional. A minha irmã, Janaína da Cunha Lima, e ao meu irmão, José Cunha
Lima, e a minha tia, Irilene Pinheiro da Cunha, pela cumplicidade.
Ao meu orientador professor Dr. Paulo M. M. Guedes, do Laboratório de
Imunoparasitologia (LIP) do Departamento de Microbiologia e Parasitologia do
CB/UFRN, pelos os esforços dedicados para a realização deste trabalho.
Ao meu co-orientador professor Dr. Alan Lane de Melo, do Laboratório de
Taxonomia e Biologia de Invertebrados do Departamento de Parasitologia do
ICB/UFMG, por ter me acolhido de forma tão generosa, a quem tenho imenso carinho
e admiração.
Aos funcionários do Departamento de Parasitologia do ICB/UFMG, Airton Lobo,
José Carlos dos Reis, Hudson Alves Pinto, Selma Fernandes de Souza e Zenir de
Souza. Agradeço não só pela ajuda durante meu trabalho, mas principalmente pela
convivência tão prazerosa.
A Fabiana Mello de Matos e Marcus Vinícius Andrada Anconi por conversas tão
agradáveis.
As colegas do Laboratório de Imunoparasitologia (LIP), Tamyres Queiroga e
Nathalie de Sena Pereira, pela preciosa ajuda cedida a mim sempre que precisei.
A professora Dra. Janeusa T. Souto, do Departamento de Microbiologia e
Parasitologia do CB/UFRN, por compartilhar comigo conselhos cheios de sabedoria.
A todos os amigos e entes queridos que me ajudaram a vencer desafios. Sou
muito grata a todos.
RESUMO
O presente estudo objetivou avaliar a expressão dos receptores da imunidade
inata em linhagens de camundongos suscetíveis e resistentes à infecção pelo
Schistosoma mansoni. Cerca de 30 cercárias da cepa LE do S. mansoni foram
inoculadas por via subcutânea em camundongos machos das linhagens Balb/c,
C57BL/6 e Swiss. Duas, sete, 12 e 16 semanas após a infecção (SAI) os
camundongos foram mortos e quando possível foram avaliados os seguintes
parâmetros: parasitismo (por meio de perfusão hepática), oograma, presença de
granulomas hepáticos, e expressão do RNA mensageiro (RNAm) de citocinas da
imunidade inata (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL-18 e TNF-α), dos receptores do tipo
Toll (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9), dos receptores do
tipo Nod (NALP1 e NALP3) e moléculas adaptadoras (Myd88, ASC, Caspase-1) em
tecido hepático, por meio de PCR em tempo real. Camundongos Balb/c e C57BL/6
apresentaram sobrevivência de 70%, enquanto camundongos Swiss apresentaram
sobrevivência de 100%, quando avaliados até 16 SAI. Em duas SAI os camundongos
Swiss apresentaram maior expressão do RNAm de NLRP1, NLRP3, Caspase-1, IL-1β
e IL-18, quando comparados aos Balb/c e C57BL/6. Os animais das linhagens Balb/c
e C57BL/6 apresentaram maior expressão do RNAm de TLR2, TLR3, TLR5, NLRP3 e
ASC em sete SAI, quando comparados aos Swiss. Em adição, a linhagem Balb/c
apresentou expressão aumentada do RNAm de TLR6, TLR7, TLR9, Myd88, NLRP1 e
TNF-α. Ademais, camundongos Swiss apresentam menor quantidade de parasitos
adultos no sistema porta hepático e menor quantidade de ovos no fragmento íleo
distal, em sete e 12 SAI, quando comparados aos C57BL/6 e Balb/c. Em conclusão,
os camundongos C57BL/6 e Balb/c apresentam expressão elevada dos receptores
TLRs e NLRs em sete SAI (início da oviposição), sugerindo maior suscetibilidade a
infecção, com consequente aumento na taxa de mortalidade nestes animais.
Outrossim, camundongos Swiss apresentam acentuado perfil inflamatório inicial (em
duas SAI), o que poderia auxiliar no controle do parasitismo. E a supressão da
ativação dos receptores e citocinas da imunidade inata, em sete SAI, poderiam
ocasionar menor mortalidade e maior resistência à infecção neste período.
Palavras-chave: Schistosoma mansoni, Imunidade Inata, Receptores, Citocinas
ABSTRACT
This study aimed to evaluate innate immune receptors expression in
susceptible and resistant mouse strains to infection with Schistosoma mansoni. About
30 S. mansoni cercariae, LE strain, were inoculated subcutaneously into Balb/c,
C57BL/6 and Swiss male mice. Two, seven, 12 and 16 weeks after infection (WAI)
mice were euthanized and when possible evaluated the following parameters:
parasitism by hepatic portal system perfusion, oogram, presence of hepatic
granulomas, and cytokines of innate immunity (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL-18 and
TNF-α) mRNA expression, innate immunity Toll-like receptor (TLR1, TLR2, TLR3,
TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9) mRNA expression, Nod-like receptor (NALP1
and NALP3), and adapter molecules (Myd88, ASC, and Caspase-1) mRNA expression
in liver tissue, by Real-time PCR. Balb/c and C57BL/6 mice showed survival of 70%,
while Swiss mice showed 100% survival when evaluated by 16 WAI. In two WAI Swiss
mice showed higher NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β and IL-18 mRNA expression
when compared to Balb/c and C57BL/6. Balb/c and C57BL/6 mice showed higher
TLR2, TLR3, TLR5, NLRP3 and ASC mRNA expression in seven WAI when
compared to the Swiss. In addition, Balb/c mice showed increased TLR6, TLR7, TLR9,
MyD88, NLRP1 and TNF-α mRNA expression. Moreover, Swiss mice have a lower
number of adult parasites in the hepatic portal system and fewer eggs in the distal
ileum fragment in seven and 12 WAI when compared to Balb/c and C57BL/6. In
conclusion, C57BL/6 and Balb/c mice showed high TLRs and NLRs receptors mRNA
expression in seven WAI (oviposition beginning), suggesting intensify susceptibility to
infection, with consequent increase in the mortality rate in these animals. Furthermore,
Swiss mice exhibited increase initial inflammatory profile (in two WAI), which could
assist in the control of parasitism. And the mRNA activation suppression of cytokines
and receptors of innate immunity, in seven WAI, could cause lower mortality and
greater resistance to infection during this period.
Keywords: Schistosoma mansoni, Innate Immunity, Receptors, Cytokine
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estrutura e localização dos Receptores do tipo Toll ................................. 18
Figura 2 - Representação esquemática das vias de sinalização dos Receptores do
tipo Toll ...................................................................................................................... 19
Figura 3 - Delineamento Experimental ..................................................................... 27
Figura 4 - Sobrevivência de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss
infectados com Schistosoma mansoni. ..................................................................... 35
Figura 5 - Tamanho dos granulomas hepáticos nas linhagens Balb/c, C57BL/6 e
Swiss infectados com Schistosoma mansoni ............................................................ 36
Figura 6 - Número de parasitos adultos recuperados do sistema porta hepático de
camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss infectados com Schistosoma
mansoni ..................................................................................................................... 37
Figura 7 - Expressão do RNAm de Receptores do tipo Toll em fragmento de fígado de
camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss infectados com Schistosoma
mansoni ..................................................................................................................... 40
Figura 8 - Expressão de RNAm de Receptores do tipo NOD em fragmento de fígado
de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss infectados com Schistosoma
mansoni ..................................................................................................................... 41
Figura 9 - Expressão do RNAm de citocinas da imunidade inata em fragmento de
fígado de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss infectados com
Schistosoma mansoni ............................................................................................... 42
Figura 10 - Correlação entre a expressão do RNAm de citocinas e receptores da
imunidade inata com os parâmetros parasitológicos de camundongos das linhagens
Balb/c, C57BL/6 e Swiss infectados com Schistosoma mansoni .............................. 44
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Desenho dos Primers utilizados nas reações de PCR em tempo real ...... 33
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APC - “Antigen Presenting Cells” Células Apresentadoras de Antígenos
ANOVA - “Analysis of Variance” Análise da Variância
CB - Centro de Biociências
DNAc - Ácido Desoxirribonucleico complementar
CLRs - “C-type Lectin Receptors” Receptores de Lectina do tipo C
DALY - “Disability-Adjusted Life Year” Anos de vida ajustados por
incapacidade
DAMPs - “Damage-Associated Molecular Patterns” Padrões Moleculares
Associados ao Dano
DMP - Departamento de Microbiologia e Parasitologia
g - Força-g ou força centrífuga relativa
HSC - “Hepatic Stellate Cells” Células Estreladas Hepáticas
ICB - Instituto de Ciências Biológicas
LIP - Laboratório de Imunoparasitologia
IκB - “Inhibitor of kappa B” Inibidor de kappa B
IKK - “IκB Kinase” Quinase Inibidora de κB
IL - Interleucina
IRAK - “IL-1 Receptor-Associated Kinase” Quinase associada ao receptor de
IL-1
LRR - “Leucine-Rich Repeats” Repetições Ricas em Leucina
M2 - Macrófagos ativados pela via alternativa
MAPKs - “Mitogen-Activated Protein Kinases” Proteínas quinases ativadas por
mitógeno
MyD88 - “Myeloid Differentiation Factor 88” Fator de Diferenciação Mielóide 88
NF-κB - “Nuclear factor-κappaB” Fator Nuclear-κB
NLR - “Nod-like Receptors” Receptores do tipo Nod
ng - Nanograma
OMS - Organização Mundial da Saúde
PAMPs - “Pathogen-Associated Molecular Patterns” Padrões Moleculares
Associados à Patógenos
PBS - “Phosphate-buffered saline” Solução Salina Tamponada com Fosfato
PCR - “Polymerase Chain Reaction” Reação em Cadeia de Polimerase
PRRs - “Pattern Recognition Receptors” Receptores de reconhecimento
padrão
RIP - “Receptor-interacting protein” Proteína de interação com receptor
RLRs - “RIG-I-like Receptors” Receptores do tipo RIG-I
RNAm - Ácido Ribonucléico mensageiro
RT-PCR - “Reverse transcription-PCR” PCR-transcriptase reversa
SAI - Semanas Após a Infecção
SEA - “Soluble egg antigens” Antígenos solúveis dos ovos
TAK1 - “Transforming growth factor beta-activated kinase 1”Quinase 1
ativada pelo fator de crescimento transformador-β
Th1 - “T helper cells type 1” Células T Auxiliares do Tipo 1
Th2 - “T helper cells type 2” Células T Auxiliares do Tipo 2
Th17 - “T helper cells type 17” Células T Auxiliares do Tipo 17
TIR - “Toll-Interleukin 1 Receptor” Receptor de IL-1/Toll
TLR - “Toll-like Receptors” Receptores do tipo Toll
TRAF6 - “Transforming growth factor beta-activated kinase 6” Quinase 6
ativada pelo fator de crescimento transformado beta
TNF-α - “Tumor Necrosis Factor-alpha” Fator de Necrose Tumoral-alfa
TRIF - “TIR domain-containing adaptor protein inducing interferon β”
Proteína adaptadora contendo o domínio TIR indutor de IFN-β
UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais
UFRN - Universidade Federal do Rio grande do Norte
WHO - “World Health Organization” Organização Mundial da Saúde
µg - Micrograma
µL - Microlitro
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO.................................................................................................... 15
1.1 – A Esquistossomíase e o Schistosoma mansoni ............................................... 15
1.2 – Imunidade Inata: Receptores do tipo Toll (TLRs) e Receptores do tipo Nod
(NLRs) ....................................................................................................................... 16
1.3 – Imunidade Adquirida e Resistência a Infecção ................................................. 22
1.4 – Esquistossomíase Murina ................................................................................ 24
2 – OBJETIVOS ....................................................................................................... 26
2.1 – Objetivo Geral ................................................................................................... 26
2.2 – Objetivos Específicos ....................................................................................... 26
3 – MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 27
3.1 – Delineamento Experimental ............................................................................. 27
3.2 – Animais de Experimentação ............................................................................. 27
3.3 – Cepa de Schistosoma mansoni ........................................................................ 28
3.4 – Obtenção das cercárias .................................................................................... 28
3.5 – Grupos Experimentais ...................................................................................... 28
3.6 – Histopatologia ................................................................................................... 29
3.6.1 – Confecção das Lâminas Histológicas ............................................................ 29
3.6.2 – Mensuração dos Granulomas........................................................................ 29
3.7 – Avaliação Parasitológica .................................................................................. 29
3.7.1 – Perfusão do Sistema Porta Hepático ............................................................. 29
3.7.2 – Oograma........................................................................................................ 30
3.8 – Extração no RNA mensageiro (RNAm) e Síntese do DNA complementar (DNAc)
.................................................................................................................................. 30
3.9 – Avaliação Imunológica: Expressão dos Receptores e Citocinas da Imunidade
Inata .......................................................................................................................... 32
3.10 – Análise Estatística .......................................................................................... 33
3.11 – Financiamento ................................................................................................ 34
4 – RESULTADOS .................................................................................................... 35
4.1 – Avaliação da Sobrevivência ............................................................................. 35
4.2 – Mensuração dos Granulomas........................................................................... 35
4.3 – Parâmetros Parasitológicos .............................................................................. 36
4.3.1 – Perfusão do Sistema Porta Hepático..............................................................297
4.3.2 – Oograma.........................................................................................................307
4.4 – Parâmetros Imunológicos ................................................................................. 38
4.4.1 – Expressão do RNAm dos Receptores do Tipo Toll (TLRs) ........................... 38
4.4.2 – Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo Nod (NLRs) ......................... 40
4.4.3 – Expressão Relativa do RNA mensageiro da Citocinas da Imunidade Inata .. 41
4.5 – Correlação entre os Parâmetros Parasitológicos e Imunológicos .................... 43
5 – DISCUSSÃO ....................................................................................................... 46
6 – CONCLUSÃO ..................................................................................................... 52
7 – REFERÊNCIAS ................................................................................................... 53
ANEXO A .................................................................................................................. 62
15
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – A Esquistossomose e o Schistosoma mansoni
A Esquistossomose é uma doença parasitária causada por trematódeos
digeneícos pertencentes à família Schistosomatidae Poche, 1907, sendo descritas
pelo menos seis espécies do gênero Schistosoma Weinland, 1858, que possuem
importância médica e de saúde pública, a saber: Schistosoma haematobium Bilharz,
1852; S. japonicum Katsurada, 1904; S. mansoni Sambon, 1907; S. intercalatum
Fisher, 1934; S. mekongi Voge, Bruckner e Bruce, 1978 e S. guineensis Pagès et al.,
2003. Destas, o S. haematobium é a espécie causadora da forma urogenital da
esquistossomose, estando as demais incriminadas como as causadoras da forma
intestinal da doença (SILVA, NEVES e GOMES, 2008; WHO, 2015).
Apesar de quase dois séculos de estudos acerca das espécies de
Schistosoma, a esquistossomose ocupa a segunda colocação como a parasitose
negligenciada que mais afeta a população mundial – em se tratando de pessoas
infectadas e em risco de se adquirir a infecção (STEINMANN et al., 2006). Não
havendo ainda um consenso do real impacto causado por esta helmintose na vida
dos portadores da doença, visto que o parâmetro utilizado pela Organização Mundial
da Saúde (OMS) – o DALY (Disability-Adjusted Life Year), que leva em consideração
os anos de vida saudáveis perdidos devido às morbidades, incapacidades e
mortalidade causadas por determinada doença – não consegue delimitar claramente
as manifestações clínicas e, consequentemente, definir os prejuízos causados pelas
suas variações fisiopatológicas, ou ainda calcular tais agravos frente à co-infecções.
Por isso, os danos globais causados por esta parasitose, que segundo a OMS em
DALY é entre 1,7 a 4,5 milhões, são tidos como controversos e subestimados (KING,
DICKMAN e TISCH, 2005; WHO, 2013).
Nesse contexto, estima-se que mais de 200 milhões de pessoas no mundo
tenham esquistossomose, sendo esta doença endêmica em 78 países ou territórios
(WHO, 2014), dos quais em média 20 milhões de pessoas possuem morbidades
graves associadas (BRUUN e AAGAARD-HANSEN, 2008). Em se tratando da
Esquistossomose mansoni, estima-se que 54 países sejam endêmicos, estando
distribuída principalmente na América Latina, África e Oriente Médio (BRUUN e
16
AAGAARD-HANSEN, 2008). O Brasil é o país da América do Sul com a maior
prevalência da Esquistossomose mansoni, existindo cerca de seis milhões de
pessoas afetadas pela doença e, aproximadamente, 25 milhões de pessoas vivendo
em áreas de risco de transmissão do parasito (WHO, 2008; CONCEIÇÃO e COURA,
2012).
No homem, assim como em outros mamíferos eventualmente infectados, o S.
mansoni permanece em sua forma adulta (macho e fêmea) no plexo hemorroidário
onde se acasalam, e neste local iniciam a oviposição, entre a quinta e sexta
semanas após a infecção. Os ovos maduros que alcançam o lúmen intestinal
chegam ao ambiente por meio das fezes e, entrando em contato com água, liberam
miracídios, que são larvas ciliadas que nadam a procura do hospedeiro intermediário
– moluscos do gênero Biomphalaria (B. glabrata, B. straminea e B. Tenagophila).
Dentro destes, os miracídios passam por várias gerações de esporocistos (primários,
secundários e/ou terciários) culminando no processo de transformação em cercárias
– que são larvas natatórias, providas de corpo e cauda bifurcada característica, a
procura de hospedeiros definitivos que ao se exporem em águas infestadas podem
ter a pele penetrada pelas mesmas. Posteriormente a penetração, as cercárias
transformam-se em esquistossômulos, os quais iniciam a migração pelos sistemas
linfático e circulatório, passando pelos pulmões e coração, até chegarem ao sistema
porta hepático, onde completam o seu desenvolvimento, ocorrendo o acasalamento
e migração para as ramificações da veia mesentérica, dando prosseguimento ao
ciclo de desenvolvimento (COELHO, 1970; PEARCE e MACDONALD, 2002).
1.2 – Imunidade Inata: Receptores do tipo Toll (TLRs) e Receptores do tipo Nod
(NLRs)
Após a penetração das cercárias de S. mansoni, o sistema imune inato do
hospedeiro começa a reagir em uma tentativa de eliminar os invasores (PAVELEY et
al., 2011). A imunidade inata representa a primeira linha de defesa contra a invasão
de agentes patogênicos e é ativada pelo reconhecimento de padrões moleculares
conservados entre as espécies de patógenos e as moléculas endógenas liberadas a
partir de células danificadas, – conhecidos como Padrões Moleculares Associados à
Patógenos (PAMPs) e Padrões Moleculares Associados ao Dano (DAMPs). O
17
reconhecimento de PAMPs e DAMPs dar-se por meio dos Receptores de
Reconhecimento Padrão (PRRs) contidos nas células apresentadoras de antígenos
(APCs) profissionais, especialmente células dendríticas e macrófagos, em células
imunes não profissionais e em células não imunes, como células epiteliais, células
endoteliais e fibroblastos (TAKEUCHI e AKIRA, 2010; KAWAI e AKIRA, 2011;
AKIRA, UEMATSU, e TAKEUCHI, 2006).
Os PRRs são formados por várias famílias de receptores da imunidade inata,
sendo mais conhecidas as famílias dos: Receptores do tipo Toll (TLRs), Receptores
de Lectinas do tipo C (CLRs), Receptores do tipo RIG (RLRs) e Receptores do tipo
Nod (NLRs) (ISHII et al., 2008; NEWTON e DIXIT, 2012). O reconhecimento de
PAMPs ou DAMPs pelos PRRs pode induzir o aumento da transcrição de genes que
codificam citocinas pró-inflamatórias [Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α),
interleucina (IL)-1 e IL-6], interferon (IFN) do tipo I (IFN-α e IFN-β), quimiocinas e
proteínas antimicrobianas. A resposta inflamatória gerada atua regulando a morte
celular de tecidos inflamados, modificando a permeabilidade do endotélio vascular,
recrutando mais células imunes para os tecidos inflamados, e induzindo a produção
de proteínas de fase aguda (TAKEUCHI e AKIRA, 2010; RODRIGUES, OLIVEIRA e
BELLIO, 2012).
Os TLRs são glicoproteínas transmembrana responsáveis por detectar agentes
patogênicos invasores dentro e fora do microambiente celular, sendo identificados
nove membros funcionais conservados no homem e em camundongos (TLRs 1-9), e
existindo ainda o TLR10, que é seletivamente expresso em humanos, enquanto o
TLR11, TLR12 e TLR13 estão presentes apenas em camundongos (QIAN e CAO,
2013). A expressão desses receptores também varia de acordo com o tipo de célula
ou tecido ao qual estão presentes, e quanto à localização na célula, podendo ocorrer
na superfície celular (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 e TLR11) ou em
compartimentos endossomais (TLR3, TLR7-10) (JIN e LEE, 2008a). Estruturalmente
os TLRs são formados por homodímeros ou heterodímeros, contendo: um domínio
extracelular denominado ectodomínio, que é composto por três porções, as quais
apresentam regiões de repetição ricas em leucina (LRR) e tem por função interagir
com o ligante (PAMP ou DAMP); um domínio transmebranar único, que liga o
ectodomínio à porção intracelular; e um domínio de sinalização intracelular,
18
conhecidos como receptor de IL-1/Toll (TIR), que tem por função interagir com o
domínio TIR igualmente presente nas moléculas adaptadoras envolvidas na via de
sinalização dos TLRs (JIN e LEE, 2008a, b; BOTOS, SEGAL e DAVIES, 2011)
(Figura 1).
Figura 1 - Estrutura e localização dos TLRs. Estrutura e localização dos TLRs. (A) Em vermelho, o domínio extracelular ou ectodomínio, contendo regiões de repetição ricas em leucina (LRR) subdivididas em motivos contendo LRR com N-terminal (LRR-NT), LRR central, e LRR com C-terminal (LRR-CT). Em azul, o domínio transmembranar. Em laranja, o domínio intracelular contendo o TIR. (B) Localização de TLR2/TLR1, TLR2/TLR6, TLR4 e TLR5 na membrana celular, e TLR3, TLR7 e TLR9 localizados no compartimento endossomal. Adaptado de: JIN e LEE, 2008b; KAWAI e AKIRA, 2010; TAKEUCHI e AKIRA, 2010; BOTOS, SEGAL e DAVIES, 2011.
A interação do ligante com os TLRs faz com que estes sofram mudanças
conformacionais, permitindo o recrutamento de moléculas adaptadoras
intracelulares, como Myd88 (fator de diferenciação mielóide 88) ou TRIF (proteína
adaptadora contendo o domínio TIR indutor de IFN-β), que iniciam a cascata
bioquímica de sinalização intracelular (Figura 2). MyD88 relaciona-se com a família
de proteína quinase associada ao receptor de IL-1 (IRAK), como a IRAK4 que
favorece a fosforilação de IRAK1, permitindo a ligação de TRAF6 (fator 6 associado
ao receptor de TNF) ao complexo, ativando TAK1 (Quinase 1 ativada pelo fator de
crescimento transformador-β) e IKK (Quinase inibidora de κB) que, por sua vez, ativa
o Fator Nuclear-κB (NF-κB). Simultaneamente, TAK1 ativa membros da família das
proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) e todos esses eventos induzem
a produção de mediadores inflamatórios (KAWAI e AKIRA, 2010). Outro resultado da
19
interação dos TLRs, por meio de MyD88, é a melhora da função e acidificação do
fagossoma (maturação do fagossoma), – que é necessário para a esterilização
eficaz de seus conteúdos (BLANDER e MEDZHITOV, 2004; MAGANTO-GARCIA et
al., 2008; QIAN e CAO, 2013) – ou ainda, a indução da maturação de células
dendríticas e, consequente, ativação das APCs profissionais a diferentes tipos de
resposta imune mediada pelos linfócitos T auxiliares ou helper (Th1, Th2, Th17,
linfócitos T reguladores), representando o elo entre a imunidade inata e a imunidade
adaptativa (KAWAI e AKIRA, 2010).
Figura 2 - Representação esquemática das vias de sinalização dos TLRs. A interação dos TLRs com os PAMPs induz mudanças conformacionais nos receptores que permitem o recrutamento de proteínas adaptadoras, tais como MyD88, TIRAP, TRIF e TRAM. O TLR5, que é expresso na
superfície celular e utiliza MyD88 para ativar o NF-κB através IRAKs, TRAF6, TAK1 e complexo IKK,
resultando em indução de citocinas inflamatórias. Heterodímeros de TLR1-TLR2 e TLR2-TLR6
também são expressos na superfície celular e induzem a ativação de NF-κB por meio de
recrutamento de TIRAP e MyD88. O TLR2 é encontrado no compartimento endossomal e induz a produção de IFN tipo I, via IRF3 e IRF7. O TLR4 pode ser expresso na superfície celular (onde ativa
NF-κB através do recrutamento de TIRAP e MyD88, e induz citocinas inflamatórias) ou pode ser
transportado para a membrana de fagossomas (dependente da molécula Rab11a, onde recruta TRAM e TRIF, e ativa o eixo-TRAF3-TBK1-IRF3 para produção de IFN tipo I, ou utiliza TRAF6 na
ativação de NF-κB com indução de citocinas inflamatórias). No retículo endoplasmático (RE) os TLRs
permanecem em estado estacionário, dependentes da interação com as moléculas PRAT4A (TLR1,
20
TLR4, TLR7 e TLR9) e UNC93b1 (TLR3, TLR7 e TLR9). A ativação do NF-κB durante a sinalização
por TLR7 e TLR9 é iniciada a partir do endossoma, sendo também encontrados na organela
relacionada com lisossoma [LRO (via dependente da molécula AP3)] e ativam NF-κB e IRF7 através
MyD88 para induzir citocinas inflamatórias e interferon do Tipo I, respectivamente. O TLR3, no compartimento endossomal, ativa a via dependente de TRIF para induzir IFN tipo I e citocinas inflamatórias. Adaptado de: KAWAI e AKIRA, 2011.
Os TRLs envolvidos no reconhecimento dos antígenos de S. mansoni, até
agora descritos, são o TLR2, TRL3, TLR4 e TLR9 (JENKINS, HEWITSON e
FERRET-BERNARD, 2005; JOSHI et al., 2008a). O TLR2 reconhece o componente
Lisofosfatidilserina, presente nos ovos de S. mansoni (VAN DER KLEIJ et al., 2002),
levando ao desenvolvimento da resposta do tipo Th2 (GAO et al., 2012).
Camundongos deficientes para o TLR2 e infectados com S. mansoni apresentaram
imunopatologia mais acentuada, devido ao desenvolvimento da resposta Th1
exacerbada, que ocorreu devido a ausência da produção de IL-10 e não expansão
das células T regulatórias (LAYLAND et al., 2007; GAO et al., 2012). O TLR3 pode
interagir com o RNA de fita dupla liberado pelos ovos de S. mansoni (AKSOY et al.,
2005). Segundo JOSHI et al. (2008b) camundongos deficientes para o TRL3 e
infectados peloS. mansoni possuem aumento no tamanho do granuloma formado
em torno dos ovos, os quais apresentam maior deposição de colágeno, devido ao
aumento nos níveis de citocinas e quimiocinas do perfil Th2, além do aumento no
número de macrófagos M2 (ativados diante das citocinas do perfil Th2) e maior
liberação de IL-17, resultando em acentuada patologia. O TLR4 pode reconhecer
antígenos do tegumento de esquistossômulo, induzindo a produção de IL-12 e TNF-
α por meio da via de sinalização de MyD88 (DURÃES et al., 2009). Em
contrapartida, o TLR4 também pode estar envolvido na supressão da produção e
maturação de citocinas (IL-6, IL-12 e TNF-α) em células dendríticas (VAN LIEMPT et
al., 2007) na presença do componente lacto-N-fucopentose III (LNFPIII) presente
nos antígenos solúveis dos ovos (SEA) de Schistosoma (THOMAS et al., 2003). Foi
determinado que o TLR9 é sensível a ativação pelo SEA (JOSHI et al., 2008a;
ANTHONY, RAMM e MCMANUS, 2012), não estando com seu papel bem
determinado durante a infecção esquistossomótica. Em relação a MyD88,
camundongos deficientes para esta molécula e infectados pelo S. mansoni,
apresentaram lesões mais brandas devido a supressão do perfil Th1 e aumento dos
níveis de IL-10 e IL-13. Assim, os granulomas formados foram significativamente
21
menores, mais fibróticos e com menos eosinófilos (LAYLAND, WAGNER e DA
COSTA, 2005).
Os receptores do tipo NOD (NLRs) fazem parte do grupo de sensores
citosólicos compostos por um domínio central de oligomerização de nucleotídeos,
denominado de NOD; um domínio efetor N-terminal o qual pode ser constituído por
um domínio pirina (PYD), ou domínio recrutador e ativador de Caspase (CARD), ou
por repetições de inibidores de Bacilovírus (BIRs), ou ainda por um domínio ácido,
ou domínio sem homologia significativa com qualquer domínio conhecido (X), que
liga-se a moléculas da cascata de sinalização; e o domínio C-terminal, que é
caracterizado por uma região rica em leucina, a qual reconhece os padrões
moleculares associados à patógenos (PAMPs) (PROELL et al., 2008; FRANCHI et
al., 2009b). Em humanos a família NLR é formada por 22 proteínas distribuídas em 5
grupos: NLRA (N-terminal com domínio ácido), NLRB (N-terminal com BIRs), NLRC
(N-terminal com CARD), NLRP (N-terminal com PYD), e NLRX (N-terminal X)
(CHEN et al., 2009; FRANCHI et al., 2009b).
Os receptores NOD1 e NOD2 foram os primeiros reguladores de apoptose a
serem descobertos e pertencem ao grupo NLRC (FRANCHI et al., 2009b). O NOD1
é expresso em muitos tipos de células e organismos, enquanto o NOD2 parece ser
mais restrito, tendo sido descrito em células hematopoiéticas. O NOD1 reconhece
moléculas relacionadas aos peptideoglicanos que contém o ácido meso-
diaminopimélico, encontrados em todas as bactérias gram-negativas e também em
algumas gram-positivas. Por sua vez, o NOD2 reconhece muramildipeptídeo (MDP)
MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln, conservados em peptídeoglicano de todos os tipos de
bactérias (OGURA et al., 2001; MCDONALD et al., 2005). A estimulação de NOD1 e
NOD2 resulta na ativação de NF-κB e MAPKs, resultando na produção de citocinas
e quimiocinas pró-inflamatórias, além da produção de peptídeos antimicrobianos
(VOSS et al., 2006; FRANCHI et al., 2009a, 2009b), refletindo na ativação de
numerosos genes envolvidos na resposta imune inata e na resposta imune
adaptativa (HAYDEN e GHOSH, 2004).
Os NLRs podem formar complexos multiprotéicos chamados de inflamassoma
que se organizam no citosol celular após dois sinais: o primeiro é o reconhecimento
de antígenos/PAMPs por meio de TLRs, resultando na ativação do NF-κB, com
22
consequente produção da pró-IL-1β, pró-IL18 e de moléculas como o NLRP3
(BAUERNFEIND et al., 2009; CIRACIA et al., 2012); o segundo sinal – que pode ser
representado pelo efluxo de potássio, espécies reativas de oxigênio (ROS), ATP,
cristais de urato monossódico, dentre outros estímulos (MARTINON, MAYOR e
TSCHOPP, 2009) – propiciam a montagem e ativação do inflamassoma por meio de
NLRs (NLRP1, NLRP3, NLRP6, NLRP12, NLRC4 e NLRC5), que normalmente se
oligomerizam com a proteína adaptadora ASC (proteína Speck-like associada a
apoptose com domínio de recrutamento de Caspase), levando ao engajamento da
pro-Caspase-1, que depois de ativada tem por função a clivagem da pró-IL-1β e pró-
IL18 em suas formas ativas (CARNEIRO et al., 2008; LATZ, 2010; BAUERNFEIND e
HORNUNG, 2013; LIU, RHEBERGEN e EISENBARTH et al., 2013). A IL-1β é uma
citocina pró-inflamatória que está intimamente envolvida com a resposta imune inata,
além de atuar no desenvolvimento da resposta Th17 (DINARELLO, 2009), podendo
ser induzida pelo SEA (RITTER et al., 2010). A IL-18 também está ligada ao
desenvolvimento do perfil Th1, sendo um fator indutor de IFN-ɣ (DINARELLO et al.,
1998).
Segundo RITTER et al. (2010) existe a formação do inflamassoma NLRP3-
ASC-Caspase-1, durante a esquistossomose murina, resultando na liberação de IL-
1β; em consonância, camundongos deficientes para NLRP3 e ASC demonstraram
diminuição considerável na liberação da IL-1-β, em 8 semanas após a infecção pelo
S. mansoni, culminando em lesão hepática mais branda devido ao controle entre as
resposta Th1, Th2 e Th17, quando comparados aos camundongos geneticamente
íntegros.
1.3 – Imunidade Adquirida e Resistência a Infecção
Os esquistossômulos que escapam da ação da resposta imune celular –
desencadeada pela resposta T helper (Th)1 nas semanas inicias (3a–5a semanas)
após a infecção – passam pela diferenciação sexual, amadurecimento, e
acasalamento no sistema porta intra-hepático, com o início da oviposição, e em
seguida ocorre a alteração da resposta imune que é modulada para o tipo Th2 –
mudança propiciada principalmente pelos antígenos dos ovos de Schistosoma
23
(PEARCE e MACDONALD, 2002; RITTER et al., 2010; HAMS, AVIELLO e FALLON,
2013).
Em condições experimentais, observou-se que à resposta do tipo Th2
acentuada, a qual apresenta elevados níveis da IL-13 (citocina fibrogênica) com
ausência ou baixos níveis da IL-10, leva ao surgimento de fibrose hepática devido à
ativação da produção de colágeno e componentes da matriz extracelular por parte
das células hepáticas residentes (como as células de Kupffer, células estreladas
hepáticas e fibroblastos (ANTHONY et al., 2007). Em contrapartida, a ausência da
modulação para a resposta Th2, seja por polarização da resposta Th1 ou por
incapacidade imunológica das células T CD4+, pode resultar em imunopatologia
fulminante, levando ao desenvolvimento de hepatoxicidade causada pela liberação
de SEA para o espaço intersticial, com consequente morte por endotoxemia logo
após o início da oviposição (FALLON e DUNNE, 1999; HOFFMANN, CHEEVER e
WYNN et al., 2000; RUTITZKY, HERNANDEZ e STADECKER, 2001; HAMS,
AVIELLO e FALLON, 2013). Assim, a IL-10 (pertencente ao perfil Treg) é tida como
citocina reguladora do equilíbrio entre as resposta Th1/Th2, impedindo o
desenvolvimento de maiores danos ao hospedeiro (WILSON et al., 2007); além de
ser importante na transição da fase aguda para a fase crônica da esquistossomose
(SADLER et al., 2003). Por outro lado, o equilíbrio entre as respostas Th1/Th2,
realizado pelas células Treg, pode ser afetado pelo perfil Th17, que tem como
citocina principal a IL-17, a qual está aliada a intensa inflamação granulomatosa em
volta dos ovos de S. mansoni, assim como, a sua ausência esta ligada a
imunopatologia mais branda em murinos (BURKE et al., 2009; RUTITZKY e
STADECKER, 2011; LARKIN et al., 2012). Dessa forma, o desequilíbrio no perfil Th2
está intimamente relacionado com o surgimento de fibrose, morbidade e mortalidade
crônica, ou morte fulminante por endotoxemia na esquistossomose (WILSON et al.,
2007; HAMS, AVIELLO e FALLON, 2013).
Segundo KARANJA et al. (2002) o perfil de resistência a infecção pelo S.
mansoni pode ser classificado em três grupos, vistos normalmente em pessoas que
residem em regiões endêmicas: (i) indivíduos que tornam-se resistentes após ciclos
de re-infecções e tratamento; (ii) indivíduos suscetíveis de acordo com a idade, onde
crianças são os principais atingidos; e (iii) pessoas resistentes independente da
24
idade. Sendo definido que altos níveis de IL-10 pode dificultar o desenvolvimento da
resistência durante re-infecções, e a presença de níveis aumentados de IgG e IgE,
junto a eosinofilia pode estar relacionada ao perfil de resistência (WILSON et al.,
2010). De fato, hospedeiros resistentes a re-infecções pelo Schistosoma apresentam
maior destruição dos esquistossômulos ainda na pele, quando expostos a pequenas
quantidades de cercárias, enquanto indivíduos expostos a infecção primaria com
quantidade elevada de larvas podem rapidamente evoluir para forma
hepatoesplênica descompensada (ANDRADE, 1970). Todavia, esses achados são
muito variáveis devido à influência de diversos fatores como a cepa do parasito,
carga parasitária, estado nutricional, genética do hospedeiro, e ocorrência de
infecções concomitantes (ABATH et al., 2006).
1.4 – Esquistossomose Murina
A reprodução experimental da esquistossomose em modelo animal é de
fundamental importância para o esclarecimento da dinâmica da infecção em
humanos, e para tal faz-se o uso comumente de camundongos, os quais são
permissíveis a infecção pelo S. mansoni (FALLON et al., 2000; CHEEVER et al.,
2002; SOUZA et al., 2006; ABDUL-GHANI e HASSAN, 2010). Nos camundongos a
resposta granulomatosa em torno dos ovos de S. mansoni é bem conhecida, mas a
imunopatologia da doença e a carga parasitária podem ser variáveis, e onde nem
sempre é reproduzível a fibrose periportal principalmente em camundongos
isogênicos (SANTOS, SOUZA e ZILTON, 2000; COUTINHO et al., 2010; BARROS
et al., 2014).
FANNING E KAZURA (1984) demonstraram que camundongos de diferentes
linhagens infectados subcutaneamente por 30 cercárias de S. mansoni,
apresentaram diferenças no parasitismo sanguíneo e, consequentemente, na
resistência à infecção. Neste experimento os camundongos da linhagem Balb/c
apresentaram elevado parasitismo (média de oito a dez parasitos por animal) e o
C57BL/6 redução no parasitismo (três a quatro parasitos por animal). DAJEM,
MOSTAFA e EL-SAID (2008), utilizando 100 cercárias para a infecção, constataram
que a linhagem C57BL/6 tinha elevado parasitismo (aproximadamente vinte e cinco
parasitos por animal), enquanto a linhagem Balb/c mostrou-se resistente (com cerca
25
de cinco parasitos por animal). Quanto aos aspectos patológicos, os camundongos
das linhagens C57BL/6 e Balb/c são considerados menos suscetíveis por
apresentarem poucas lesões granulomatosas, devido a melhor balanço entre os
perfis imunes Th1 e Th2 (STADECKER et al., 2004), enquanto animais de outras
linhagens, como CBA/J e C3H apresentam lesões mais acentuadas (HERNANDEZ
et al., 1998; RUTITZKY, HERNANDEZ e STADECKER, 2001). Dentre os
camundongos não isogênicos, a linhagem Swiss parece representar o modelo mais
apropriado para reprodução da esquistossomose, pois quando bem nutridos e
expostos a longos períodos de infecção (superiores a 16 semanas de infecção) pelo
S. mansoni, cerca de 50% dos camundongos desta espécie podem desenvolver
fibrose periportal, semelhante aos humanos (COUTINHO et al., 2010).
Com isso, os diferentes padrões de desenvolvimento da resposta imune entre
as linhagens isogênicas e não isogênicas levam ao surgimento de diferentes
padrões imunopatológicos durante a infecção que representam maior ou menor
suscetibilidade do hospedeiro ao parasito. A suscetibilidade do hospedeiro a
infecção pode ser avaliada pela quantidade de parasitos adultos que se
desenvolvem no sistema porta hepático, o número e viabilidade dos ovos liberados,
fibrose e formação de granulomas hepáticos e taxa de mortalidade (COLLEY e
FREEMAN, 1980; ELOI-SANTOS et al., 1992; SANTOS, SOUZA e ZILTON, 2000;
DAJEM, MOSTAFA e EL-SAID, 2008; COUTINHO et al., 2010; BARROS et al.,
2014).
A análise das diferenças na resposta imunológica é um fator relevante que
pode explicar as diferenças na carga parasitária, patologia e, consequentemente,
suscetibilidade ou resistência a infecção pelo S. mansoni. Assim, o presente estudo
objetivou analisar a expressão dos receptores da imunidade inata (TLRs e NLRs)
durante infecção experimental pelo S. mansoni, utilizando linhagens de
camundongos que desenvolvem lesões leves (Swiss) e moderadas (C57BL/6 e
Balb/c). Este conhecimento poderá servir de base para estudos envolvendo
adjuvantes e/ou vacinas visando proteção contra a infecção pelo S. mansoni, que
são de extrema importância pela dificuldade em controlar esta parasitose, devido à
complexidade do ciclo biológico do helminto, complexa relação parasito-hospedeiro,
e a ocorrência de re-infecções constantes em áreas endêmicas.
26
2 - OBJETIVOS
2.1 – Objetivo Geral
Avaliar a expressão do RNA mensageiro dos receptores da imunidade inata em
linhagens de camundongos suscetíveis e resistente a infecção experimental pelo
Schistosoma mansoni.
2.2 – Objetivos Específicos
Observar a sobrevivência dos camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss
infectados pelo S. mansoni por até 16 semanas após a infecção (SAI).
Verificar o parasitismo, por meio de oograma e da recuperação dos parasitos adultos
por perfusão do sistema porta hepático nas linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss
Webster.
Avaliar inflamação no fígado pela mensuração dos granulomas nas linhagens Balb/c,
C57BL/6 e Swiss.
Avaliar a expressão de receptores do tipo Toll (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5,
TLR6, TLR7, TLR8 e TRL9) e da molécula adaptadora MyD88 no fígado.
Avaliar a expressão de receptores do tipo NOD (NALP1 e NALP3), e das moléculas
adaptadoras ASC e Caspase-1 no fígado.
Avaliar a expressão das citocinas da imunidade inata (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p35,
IL-18, TNF-α) no fígado.
Correlacionar a expressão do RNA mensageiro dos receptores e citocinas da
imunidade inata ao parasitismo e aos diferentes níveis de suscetibilidade ou
resistência nas linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss Webster durante a infecção
experimental pelo S. mansoni.
27
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Delineamento Experimental
Figura 3 - Delineamento Experimental
3.2 – Animais de Experimentação
Foram utilizados 114 camundongos machos adultos, pesando cerca de 25
gramas, das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss Webster (38 animais de cada
linhagem), oriundos Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) e
posteriormente mantidos no biotério do Departamento de Parasitologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os experimentos foram conduzidos
de acordo com o Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) protocolo n.º 049/2014
(2).
28
3.3 – Cepa de Schistosoma mansoni
Para os experimentos utilizou-se a cepa LE de S. mansoni (isolada de um
paciente em Belo Horizonte) e mantida em condições laboratoriais há
aproximadamente 50 anos, em passagens sucessivas em hamsters (Mesocricetus
auratus) e caramujos (Biomphalaria glabrata) segundo FREITAS (1973) no
Laboratório de Esquistossomose do Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG.
3.4 – Obtenção das cercárias
As cercárias foram obtidas de acordo com Pellegrino e Katz (1968), de forma
que os planorbídeos previamente infectados foram transferidos para recipientes
contendo água desclorada, e submetidos à luz artificial por cerca de duas horas.
Posteriormente, foi realizada a contagem das mesmas em alíquotas de 0,5 mL de
água desclorada, com o auxílio de placa de Kline e lupa sendo ajustada a
quantidade a ser utilizada.
3.5 – Grupos Experimentais
Doze camundongos não infectados de cada linhagem foram mantidos como
grupo controle, e 26 camundongos de cada linhagem foram submetidos à infecção
experimental. Uma alíquota de 0,5mL de água desclorada contendo
aproximadamente 30 cercárias foi inoculada subcutaneamente na região dorsal,
utilizando-se, para isto, de uma seringa BD Cornwall de 2 cc e agulha 30x10. Os
animais foram mantidos em gaiolas separadamente de acordo com a linhagem, e
água e ração ad libitum, foram fornecidos aos animais durante todo o período de
estudo.
Dos animais infectados, seis de cada linhagem foram monitorados
diariamente por até 16 SAI, com o intuito de observar a mortalidade. Os demais
foram mortos por deslocamento cervical nos períodos experimentais determinados,
sendo selecionados aleatoriamente cinco animais infectados e três animais não
infectados por linhagem.
29
3.6 – Histopatologia
3.6.1 – Confecção das Lâminas Histológicas
As amostras de fígado foram fixadas em formalina a 10%, desidratadas em
série crescente de etanol (70%, 80%, 95%, álcool absoluto), onde cada amostra
permaneceu por trinta minutos em cada concentração de álcool, e quando no álcool
absoluto realizou-se três passagens. Em seguida, as amostras foram diafanizadas
em xilol, e imersas em parafina líquida (56° C) durante 1 hora e, em sequência,
foram emblocadas. Posteriormente, os blocos de parafina foram cortados com o
auxílio do micrótomo. As lâminas foram, então, submetidas ao xilol, e reidratados em
sequência alcoólica (álcool absoluto, 95%, 80% e 70%), coradas com hematoxilina,
submetidas à água corrente, coradas pala eosina e, seguidamente, lavadas em água
e secas a temperatura ambiente. Essa etapa foi realizada no Laboratório de
Taxonomia e Biologia de Invertebrados do Departamento de Parasitologia do
ICB/UFMG.
3.6.2 – Mensuração dos Granulomas
Em cada corte histológico obtido foram contados 10 granulomas definidos,
com ovo contendo miracídio, utilizando-se de microscopia de luz (objetiva de 10X).
Realizou-se, então, a mensuração longitudinal e transversal de cada granuloma,
com o auxílio de ocular milimetrada, sendo os valores obtidos posteriormente
corrigidos levando-se em consideração o coeficiente micrométrico. A mensuração
final foi expressa pela média e desvio padrão das duas medidas obtidas.
3.7 – Avaliação Parasitológica
3.7.1 – Perfusão do Sistema Porta Hepático
A perfusão do Sistema Porta Hepático foi realizada em sete, 12 e 16 SAI, e de
acordo com Pellegrino e Siqueira (1956), utilizando-se salina a 0,85% e máquina
perfusora Brewer (BBL – USA). Resumidamente, os camundongos após
deslocamento cervical tiveram aberta a região ventral, sendo o intestino, amarrado
30
na altura do reto, em seguida, a veia porta foi cortada e a agulha do perfusor foi
inserida na aorta, para realização do procedimento.
O conteúdo da perfusão de cada camundongo foi acumulado em recipientes
plásticos de igual numeração a do camundongo perfundido. Tal conteúdo foi lavado
com salina e transferido para placa de Petri, sendo os parasitos, recuperados,
contados e diferenciados, entre macho e fêmea, com o auxilio de lupa.
3.7.2 – Oograma
As lâminas para oograma foram montadas e contadas seguindo as seguintes
etapas: um fragmento íleo distal do intestino de cada camundongo de
aproximadamente 1cm foi aberto longitudinalmente, lavado em salina a 0,85%,
pesado em balança de precisão Marte BL3200H, colocado entre lâmina e lamínula
plástica, prensado de acordo com Pellegrino e Faria (1965) e, seguidamente,
realizou-se a contagem dos ovos, utilizando-se do microscopia de luz (objetiva de
10x).
Para a classificação dos ovos em imaturos (1º, 2º, 3º ou 4º estádios), assim
como, em maduros, mortos ou cascas utilizou-se dos critérios determinados por
Pellegrino et al. (1962). E para a contagem relativa dos ovos por grama de tecido
íleo distal foi usada a fórmula de acordo com Mati (2009):
3.8 – Extração no RNA mensageiro (RNAm) e Síntese do DNA complementar
(DNAc)
A extração de RNAm e síntese DNAc foram realizadas no Laboratório de
Imunoparasitologia (LIP) e no Laboratório de Biologia Molecular de Doenças
Infecciosas e do Câncer (LADIC) do Departamento de Microbiologia e Parasitologia
e (DMP) do Centro de Biociências (CB) na Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN). A extração do RNAm total foi realizada a partir de tecido hepático de
Ovos/grama = Número total de ovos no fragmento íleo distal x 1000
Peso do fragmento (miligrama)
31
camundongos infectados pelo S. mansoni, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EUA) e Kit SV Total RNA Isolation System (PROMEGA). Brevemente,
para cada amostra, em tubos de microcentrifugação de 2,0mL, adicionou-se 500µL
do reagente Trizol (Sigma) seguido de trituração com auxílio de macerador
automático (tecido hepático). Posteriormente, foi adicionado 200µL de clorofórmio
PA e as amostras foram agitadas durante 30 segundos. Os tubos foram
centrifugados a 12.000g por 15 minutos a 4°C. A fase aquosa foi transferida para
tubo novo, onde adicionou-se 200L de etanol 95%. Em sequência, as amostras
foram colocadas em novo tubo contendo uma coluna, a qual tinha uma membrana
para a aderência do RNAm. As colunas foram novamente centrifugadas a 12.000g
por 2 minutos a 4°C, sendo desprezado o filtrado. Em seguida, as colunas foram
lavadas com 400L de RNA Wash Solution e centrifugadas a 12.000g por 2
minutos a 4°C. Após isso, foram adicionados 50L de solução DNAse sobre a
membrana de cada coluna, as quais foram incubadas durante 15 minutos em
temperatura ambiente. Seguidamente foi colocado 200L de DNAse Stop Solution e
os tubos foram centrifugados a 12.000g por 2 minutos a 4°C. Posteriormente, o
filtrado foi desprezado e 500L de RNA Wash Solution foram adicionados às
colunas, seguindo-se centrifugação a 12.000g por 2 minutos a 4°C. As colunas
foram colocadas em novos tubos de microcentrifugação e sobre a membrana da
coluna foram acrescidos 20L de Água Nuclease Free. Depois os tubos de
microcentrifugação contendo as colunas foram centrifugados a 12.000g por 2
minutos a 4°C. O filtrado contendo o RNAm foi então armazenado a -70 °C até a
confecção do DNA complementar (DNAc).
Para a confecção do DNAc foi utilizado o Kit High Capacity cDNA Reverse
Transcription (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido), e seguida as
especificações do fabricante para preparação do mix para transcrição do RNAm para
DNAc. Após acrescentar o mix de transcrição (10µL) e as amostras (10µL) em tubos
de microcentrifugação, as amostras foram levadas ao termociclador com o primeiro
passo (desnaturação) realizado em 25°C durante 10 minutos, o segundo passo
(anelamento) em 37°C durante 120 minutos e o terceiro passo (extensão) em 85°C
durante 5 minutos, e por fim o quarto passo (término) em 4°C ao∞. O DNAc foi então
armazenado a -70°C até a realização das reações de PCR em tempo real.
32
3.9 – Avaliação Imunológica: Expressão dos Receptores e Citocinas da Imunidade
Inata
A expressão quantitativa dos genes dos receptores da imunidade inata e das
moléculas adaptadoras foi analisada por meio de reações de PCR em tempo real,
utilizando-se o sistema SYBR Green e o aparelho ABI Prism 7500 Fast Sequence
Detection System (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Para tal,
empregou-se os iniciadores específicos para os receptores do tipo Toll (TLR1, TLR2,
TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 e TRL9), para os receptores do tipo NOD
(NALP1 e NALP3), e para as moléculas adaptadoras (Myd88, ASC e Caspase-1),
como seus respectivos desenhos contidos na tabela 1. O DNAc (2,5ng/reação)
sintetizado a partir do RNAm e oligonucleotídeos específicos (1-2g/reação) foram
utilizados juntamente com os tampões de reação contendo (SYBR Green” Applied
Biosystems) como determinado pelo fabricante. As condições de PCR para cada
oligonucleotídeo utilizado foram padronizadas de acordo com a concentração,
temperatura de anelamento, ausência de formação de dímeros, eficiência de
amplificação dos genes alvos e controle interno (gene constitutivo). A determinação
dos níveis de expressão dos genes alvo realizou-se por meio da normalização das
amostras quanto à expressão constitutiva de β-actina. Após a normalização dos
resultados baseado na expressão do gene constitutivo da β-actina, a expressão das
proteínas estudadas foi calculada baseada na fórmula 2-(Ct).
33 Tabela 1 - Desenho dos Iniciadores utilizados nas reações de PCR em tempo real
Iniciadores Direto Reverso G
en
e
β-actina AGGCAAACCGTGAAAAGATG CTGTGGTACGACCAGAGGAATA
Cito
cin
as
IL-1β GCAACTGTTCCTGAACTCAACT ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT
IL-18 GTGAAGTAAGAGGACTGGCTGTG TTTTGGCAAGCAAGAAAGTGT
IL-12p35 TCTCTGGACCTGCCAGGTGT CCTGTTGATGGTCACGACGCG
IL-6 CCATCCAGTTGCCTTCTTG AAGTGCATCATCGTTGTTCATAC
IL-10 TGGACAACATACTGCTAACC GGATCATTTCCGATAAGGCT
TNF-α TGTGCTCAGAGCTTTCAACAA CTTGATGGTGGTGCATGAGA
Rece
pto
res d
o t
ipo
To
ll
TLR1 TCTCTTCGGCACGTTAGC CGTAAGAAATAAGAGCAGCCC
TLR2 CGAGTGGTGCAAGTACG GGTAGGTCTTGGTGTTCATTATC
TLR3 GGTGGTCCCGTTAATTTCCT CCCGAAAACATCCTTCTCAA
TLR4 CCTCTGCCTTCACTACAGAGACTTT TGTGGAAGCCTTCCTGGATG
TLR5 CGCACGGCTTTATCTTCTCC GGCAAGGTTCAGCATCTTCAA
TLR6 CCGGTGGAGTACCTCAAT TCAGCAAACACCGAGTATAGC
TLR7 TGGAAATTTTGGACCTCAGC TTGCAAAGAAAGCGATTGTG
TLR8 CACGTGTGACATAAGTGATTTTCG TTTGATCCCCAGGATTGGAA
TLR9 CTGCCGCTGACTAATCTG CTGAAATTGTGGCCTATACCC
MyD88 TGATGCGGAGCCAGATT GAGGAGGCATGTGTGTACT
Rece
pto
res
do
tip
o N
od NALP1 TGGCACATCCTAGGGAAATC TCCTCACGTGACAGCAGAAC
NALP3 AGCCTTCCAGGATCCTCTTC GGGCAGCAGTTTCTTTC
ASC AAGCTGCTGACAGTGCAAC GCCACAGCTCCAGACTCTTC
Caspase-1 AGATGGCACATTTCCAGGAC CCTCCAGCAGCAACTTC
3.10 – Análise Estatística
O Software de bioestatística GraphPad Prism 5.01 foi utilizado para avaliação
dos dados e construção dos gráficos. A análise da variância (ANOVA) foi utilizada
para a análise de diferenças das médias entre os grupos, e o teste de Tukey, para a
comparação dos grupos (dois a dois) com o intuito de verificar possível diferença
estatística entre eles. Para a mensuração do grau de relação entre duas variáveis
distintas foi utilizada a Análise de Regressão Linear. Em todos os casos, as
diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando o valor de
P<0,05.
34
3.11 – Financiamento
Este trabalho foi realizado com o apoio da Fundação Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Laboratório de Taxonomia e
Biologia de Invertebrados do Departamento de Parasitologia do ICB/UFMG e
Laboratório de Imunoparasitologia (LIP) do Departamento de Microbiologia e
Parasitologia do CB/UFRN.
35
4 – RESULTADOS
4.1 – Avaliação da Sobrevivência
Os camundongos das linhagens Swiss, Balb/c e C57BL/6 infectados com a
cepa LE do S. mansoni foram observados até a 16a SAI para determinação da
mortalidade. Os camundongos Swiss apresentaram 100% de sobrevivência,
enquanto animais das linhagens Balb/c e C57BL/6 apresentaram mortalidade de
30% (Figura 4).
Figura 4 - Sobrevivência de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea e observados até em dezesseis semanas após a infecção.
4.2 – Mensuração dos Granulomas
Quanto ao tamanho dos granulomas hepáticos nas linhagens Balb/c, C57BL/6
e Swiss infectados com a cepa LE do S. mansoni, nos períodos de sete, 12 e 16 SAI
foi observado que a linhagem Swiss apresentou granulomas maiores na sétima SAI,
quando comparada as linhagens Balb/c e C57BL/6. Enquanto a linhagem C57BL/6
apresentou granulomas maiores na décima sexta SAI em relação às linhagens
Balb/c e Swiss (Figura 5).
36
Figura 5 - Tamanho dos granulomas hepáticos, em milímetros, nas linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea, mortos por deslocamento cervical em sete, 12 e 16 semanas após a infecção. Os
dados são apresentados como média desvio padrão. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05, **=p<0,01 e ***=p<0,001].
4.3 – Parâmetros Parasitológicos
4.3.1 – Perfusão do Sistema Porta Hepático
A recuperação dos parasitos adultos do sistema porta hepático demonstrou a
presença de menor número de parasitos nos camundongos Swiss, quando
comparados aos camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6 na sétima SAI,
enquanto animais da linhagem C57BL/6 apresentaram maior quantidade de
parasitos adultos em 12 SAI em relação à linhagem Swiss (Figura 6A).
4.3.2 – Oograma
A análise do oograma demonstrou que a linhagem C57BL/6 apresentou maior
número total de ovos de S. mansoni contados no fragmento íleo distal em 12 SAI,
quando comparados com a linhagem Swiss (Figura 6B). Camundongos C57BL/6
apresentaram uma maior quantidade de ovos imaturos de S. mansoni na sétima e
12a SAI, quando comparados aos animais da linhagem Swiss (Figura 6C). Animais
da linhagem C57BL/6 apresentaram maior número de ovos imaturos na sétima SAI,
em relação à Balb/c. Quanto ao número de ovos maduros de S. mansoni contados
no fragmento íleo distal, é possível observar que a linhagem C57BL/6 apresentou
maior quantidade de ovos em sete SAI em relação a linhagem Swiss, que por sua
37
vez teve uma baixa produção durante toda a infecção (Figura 6D). Também é
possível observar que a linhagem Swiss apresentou maior número de ovos mortos
de S. mansoni contados no fragmento íleo distal na 16a SAI, quando comparada a
linhagem C57BL/6 (Figura 6E). Animais da linhagem Swiss apresentaram menor
número de ovos por grama de tecido distal, na sétima e 12a SAI, quando
comparados a linhagem C57BL/6 (Figura 6F).
Figura 6 - Quantidade de parasitos adultos recuperados do sistema porta hepático de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea, mortos por deslocamento cervical em sete, 12 e 16 semanas após a infecção (A). Número total de ovos (B), número de ovos imaturos (1º, 2º, 3º e 4º estádios) (C), número de ovos mortos (D), número de ovos maduros (E) e número de ovos por grama de tecido íleo distal (F) contados em lâmina de oograma, realizado a partir de fragmento íleo distal, de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea, mortos por deslocamento cervical em sete, 12 e 16 semanas após a infecção.
38
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05 e **=p<0,01].
4.4 – Parâmetros Imunológicos:
4.4.1 – Expressão do RNAm dos Receptores do Tipo Toll (TLRs)
A infecção de camundongos Swiss, Balb/c e C57BL/6 com a cepa LE do S.
mansoni levou supressão da expressão do RNAm de TLR1 em duas, sete, 12 e 16
SAI quando comparados a animais não infectados (Figura 7A). A expressão do
RNAm de TLR2 esteve reduzida na linhagem Swiss em relação aos camundongos
Balb/c e C57BL/6 na sétima SAI, também foi observada maior expressão do RNAm
de TLR2 em sete SAI em camundongos Balb/c, quando comparados a linhagem
C57BL/6 (Figura 7B). Camundongos Swiss apresentaram menor expressão do
RNAm de TLR3 na sétima SAI, quando comparados com as linhagens Balb/c e
C57BL/6 (Figura 7C). A expressão do RNAm de TLR4 mostrou-se aumentada nos
animais da linhagem C57BL/6 em 16 SAI,quando comparados a linhagem Balb/c
(Figura 7D). De maneira similar a TLR2 e TLR3, camundongos da linhagem Swiss
apresentaram supressão na expressão do RNAm de TLR5 na sétima SAI quando
comparados aos camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6 (Figura 7E). Os
animais da linhagem Balb/c apresentaram maior expressão do RNAm de TLR6
(Figura 7F), TLR7 (Figura 7G) e TLR9 (Figura 7I) em sete SAI, quando comparado
as linhagens C57BL/6 e Swiss. A expressão do RNAm de TLR8 nas três linhagens
de camundongos infectados pelo parasito foram semelhantes a expressão
apresentada pelo grupo de animais não infectados em todos os períodos avaliados
(Figura 7H). Camundongos Balb/c possuem expressão aumentada do RNAm da
molécula adaptadora MyD88 em relação as linhagens C57BL/6 e Swiss na sétima
SAI, enquanto a linhagem C57BL/6 expressa maior quantidade do RNAm que a
linhagem Balb/c na 16a SAI (Figura 7J).
.
39
40 Figura 7 - Expressão do RNAm de TLR1 (A), TLR2 (B), TLR3 (C), TLR4 (D), TLR5 (E), TLR6 (F), TLR7 (E), TLR8 (G), TLR9 (I), e da molécula adaptadora MyD88 (J) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea, mortos por deslocamento cervical em sete, 12 e 16 semanas após a infecção. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05, **=p<0,01 e **=p<0,001].
4.4.2 – Expressão de RNAm dos Receptores do Tipo Nod (NLRs)
Os camundongos Swiss apresentaram maior expressão do RNAm de NALP1
na segunda em 16 SAI quando analisados conjuntamente com as linhagens Balb/c e
C57BL/6, enquanto os animais da linhagem Balb/c apresentaram maior expressão
do RNAm de NALP1 na sétima SAI (Figura 8A). Os animais da linhagem Swiss
apresentaram maior expressão do RNAm de NALP3 na segunda SAI, quando
comparados com os camundongos das linhagens C57BL/6 e Balb/c, enquanto nos
camundongos das linhagens C57BL6 e Balb/c verificou-se maior expressão do
RNAm de NALP3 na sétima SAI, quando comparados aos camundongos Swiss
(Figura 8B). A infecção pelo S. mansoni ocasionou a redução da expressão do
RNAm de Caspase-1 nas três linhagens avaliadas na segunda, sétima, 12 e 16 SAI
(Figura 7C). Contudo, os animais da linhagem Swiss expressaram maiores níveis do
RNAm de Caspase-1 na segunda e 16a SAI, quando comparados aos camundongos
das linhagens C57BL/6 e Balb/c (Figura 8C). A expressão do RNAm da molécula
adaptadora ASC esteve aumentada na sétima SAI em camundongos Balb/c e
C57BL/6, quando comparados ao grupo de animais Swiss (Figura 8D).
41
Figura 8 - Expressão de RNAm de NALP1 (A), NALP3 (B), Caspase-1 (C) e ASC (D) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea, mortos por deslocamento cervical em sete, 12 e 16 semanas após a infecção.Os dados
são apresentados como média desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05 e **=p<0,01].
4.4.3 - Expressão Relativa do RNA mensageiro da Citocinas da Imunidade Inata
Camundongos Swiss infectados com a cepa LE do S. mansoni apresentam
maior expressão do RNAm de IL-1β no fígado na segunda, sétima e 12a SAI,
quando comparados aos camundongos Balb/c e C57BL/6 nos mesmos períodos
após a infecção (Figura 9A). Ocorreu maior expressão do RNAm de IL-18 na
segunda SAI em camundongos Swiss infectados quando comparados aos linhagens
Balb/c e C57BL/6 (Figura 9B). A infecção pelo S. mansoni levou a inibição da
expressão do RNAm de IL-18, IL-6 e IL-12p35 em camundongos Swiss, Balb/c e
C57BL/6 na segunda, sétima, 12a e 16a SAI (Figura 9B, Figura 9C e Figura 9D,
respectivamente), quando comparados aos animais não infectados (linha
pontilhada). A expressão do RNAm de IL-10 esteve aumentada em camundongos
C57BL/6 na segunda e 12a SAI, quando comparados aos camundongos Swiss e
42
Balb/c infectados, e também aos controles não infectados (Figura 9E).
Camundongos Swiss apresentaram menor expressão do RNAm de TNF-α no fígado
na sétima SAI quando comparados aos camundongos Balb/c e C57BL/6 infectados.
De modo contrário, os camundongos Swiss mostraram maior expressão do RNAm
de TNF-α no fígado, quando comparados aos animais da linhagem Balb/c (Figura
9F).
Figura 9 - Expressão do RNAm da IL-1β (A), IL-18 (B), IL-6 (C), IL-12p35, (D), IL-10 (E) e TNF-α (F) realizado por meio de PCR em tempo real, a partir de fragmento do fígado de camundongos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss, infectados com ± 30 cercárias de Schistosoma mansoni (cepa LE) por via subcutânea, mortos por deslocamento cervical em sete, 12 e 16 semanas após a
43 infecção. Os dados são apresentados como média desvio padrão. CN: grupo Controle não infectado. [As diferenças estatísticas são marcadas por asterisco (*), onde *=p<0,05, **=p<0,01 e ***=p<0,001].
4.5 – Correlação entre os Parâmetros Parasitológicos e Imunológicos
Houve correlação negativa entre a expressão do RNAm de IL-1β em relação
ao número total de ovos S. mansoni no fragmento íleo distal na 12a SAI (Figura
10A), e de maneira similar, foi observada correlação negativa entre a expressão do
RNAm de IL-1β e o número de ovos de S. mansoni por grama de tecido no íleo distal
na 12a SAI (Figura 10B); ou seja, existe correlação inversamente proporcional entre
a expressão do RNAm de IL-1β e o números ovos no fragmento íleo distal. Foi
observada uma correlação positiva diretamente proporcional em relação à expressão
de RNAm de TLR2 e a quantidade de ovos mortos de S. mansoni no fragmento íleo
distal na 16a SAI (Figura 10C). Por outro lado, verificou-se correlação negativa entre
a expressão de RNAm de TLR4 em relação ao número de ovos mortos na décima
sexta SAI (Figura 10D). A análise da correlação entre a expressão do RNAm de
TNF-α, demonstrou a existência de correlação positiva entre a expressão do RNAm
desta citocina com parasitos adultos de S. mansoni resgatados do sistema porta
hepático na sétima e 12a SAI (Figura 10E e Figura 10F). Ademais, observou-se que
a expressão do RNAm de TNF-α esteve correlacionada positivamente com a
quantidade de ovos viáveis na sétima SAI (Figura 10G).
44
Figura 10 - Correlação entre a expressão do RNAm de IL-1β e o número total de ovos de Schistosoma mansoni no fragmento íleo distal em 12 semana após a infecção (A). Correlação entre a
45 expressão do RNAm de IL-1β e o número de ovos de S. mansoni por grama de tecido íleo distal em 12 semana após a infecção (B). Correlação entre a expressão do RNAm de TLR2 e o número de ovos mortos de S. mansoni no fragmento íleo distal em 16 semana após a infecção (C). Correlação entre a expressão do RNAm de TLR4 e o número de ovos mortos de S. mansoni no fragmento íleo distal em 16 semana após a infecção (D). Correlação entre a expressão do RNAm de TNF-α e o número total de parasitos adultos de S. mansoni resgatados do sistema porta hepático em sete semana após a infecção (E). Correlação entre a expressão do RNAm de TNF-α e o número total de parasitos adultos de S. mansoni resgatados do sistema porta hepático em 12 semana após a infecção (F). Correlação entre a expressão do RNAm de TNF-α e o número de ovos viáveis de S. mansoni no fragmento íleo distal em sete semana após a infecção (G). [Os resultados são expressos com valores individuais em Gráficos de Dispersão, mostrando o Coeficiente de Correlação (r) com p<0,05. As linhas de ligação representam os índices de correlação positivos e negativos].
46
5 – DISCUSSÃO
A análise da sobrevivência dos animais infectados com S. mansoni
demonstrou que os camundongos da linhagem Swiss suportaram melhor a infecção,
visto que apresentaram 100% de sobrevivência em até 16 SAI, enquanto os
camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6 mostraram-se mais sensíveis ao
parasitismo, tendo sido verificado mortalidade de 30% dos animais infectados
nessas duas linhagens nas semanas de início da oviposição. Por se tratar de
infecção experimental, na qual procura-se controlar os fatores inerentes ao parasito
e ao hospedeiro como, cepa do parasito, carga parasitária, estado nutricional do
hospedeiro, reinfecções e coinfecções, os resultados aqui obtidos, aparentemente,
estão fortemente ligados as diferenças imunológicas intrínseca a cada linhagem.
Dessa forma, presente estudo buscou evidenciar diferenças imunológicas,
principalmente em relação a expressão de receptores da imunidade inata (TLRs e
NLRs), correlacionando aos achados parasitológicos entre as linhagens murinas
Swiss, BALB/c e C57BL/6 durante a infecção pelo S. mansoni, contribuindo para a
geração de novos conhecimentos acerca dos mecanismos imunológicos
desencadeados em resposta ao desenvolvimento do parasito no hospedeiro
definitivo.
Os dados parasitológicos mostram que os camundongos da linhagem Swiss
apresentaram menor quantidade de parasitos adultos recuperados do sistema porta
hepático. Tal resultado pode estar relacionado com a produção de citocinas
proinflamatórias verificada em camundongos Swiss, que apresentaram maior
produção do RNAm da IL-18 na segunda SAI, quando comparados aos
camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6. De fato, a IL-18 apresenta
importante papel na esquistossomose, por induzir a resposta do tipo celular (ou Th1)
protetora contra o parasito, havendo maior expressão desta citocina nos dias iniciais
após a penetração das cercárias, e forte infiltrado de polimorfonucleares
(principalmente neutrófilos) e linfócitos (DUPRÉ et al., 2001).
Os camundongos da linhagem C57BL/6 apresentaram o maior quantidade de
parasitos adultos na sétima e 16a SAI, e em consonância foi nessa linhagem que
ocorreu a menor produção do RNAm da IL-18 na segunda SAI, – o que poderia
interferir no desenvolvimento da resposta Th1 efetiva contra os esquistossômulos,
47
podendo justificar a maior quantidadede parasitos adultos encontrados nos
camundongos dessa linhagem. Em adição, foi vista nos camundongos C57BL/6 a
maior produção do RNAm da IL-10 em duas, sete e 12 SAI. A IL-10, produzidas
pelas células Treg, tem por função regular as respostas imunes T helper, fato que
também poderia influenciar em menor efetividade da resposta Th1 na eliminação do
parasito.
Quanto ao número total de ovos no oograma, assim como, em relação à
quantidade de ovos por grama de tecido íleo distal e do número de ovos imaturos,
os camundongos da linhagem C57BL/6 apresentaram as maiores quantidade na
sétima e 12a SAI; em contrapartida, os camundongos da linhagem Swiss
apresentaram as menores contagens para os mesmos parâmetros nos mesmos
períodos. Estes resultados estão em proporcionalidade ao número de parasitos
adultos contados nas suas respectivas linhagens.
O RNAm da IL-1β foi produzida durante toda a infecção pelas três linhagens,
porém, foi vista de modo marcante em camundongos Swiss na segunda, sétima e
12a SAI. A expressão da IL-1β que pode ser desencadeada pela presença do SEA
(RITTER et al., 2010) e está envolvida com o aumento da expressão de moléculas
de adesão em células endoteliais, tais como, molécula-1 de adesão intracelular
(ICAM-1), molécula-1 de adesão vascular (VCAM-1) e E-selectina, as quais facilitam
à adesão do ovo de Schistosoma a parede do endotélio vascular (LEJOLY-
BOISSEAU et al., 1999), e deste local as células inflamatórias ajudam a carrear os
ovos através da parede intestinal até o lúmen (FALLON E DUNNE, 1999). Ademais,
a IL-1β pode induzir diferentes quimiocinas (que promovem a infiltração celular e
inflamação) além de ativar a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS)
(DINARELLO, 2009). De fato, a presença do óxido nítrico, pode ser desencadeada
pela IL-1β/α, em conjunto com o IFN-ɣ ou TNF-α, resultando na morte de larvas
recém transformada em até duas SAI (OSWALD et al., 1994). Dessa forma, nossos
resultados sugerem que, além da IL-18, a IL-1β atuou de modo eficiente no início da
infecção, protegendo o hospedeiro e fazendo-o suportar melhor a parasitose.
A produção acentuada do RNAm da IL-1β na linhagem Swiss é indicativo da
existência de um estímulo (PAMP ou DAMP) anterior a presença dos ovos de S.
mansoni, visto que ovos congelados, assim como suas cascas, e antígenos do
48
parasito não induzem a produção da IL-1β, de forma tão eficaz quanto o SEA
(RITTER, 2012). Um provável estímulo a produção da IL-1β, é o pigmento
esquistossomótico, derivado do metabolismo da hemoglobina por parte do parasito,
igualmente visto na malária (OLIVEIRA et al., 2000). O pigmento malárico pode
ativar os inflamassomas NLRP3, AIM2 e NLRP12 utilizando o TLR9 como via de
internalização da hemozoína, associada ao DNA do parasito (DOSTERT et al., 2009;
KALANTARI et al., 2014; ATAIDE et al., 2014). Segundo DOSTERT et al. (2009) o
pigmento malárico é internalizado como cristal, e no citosol celular leva a produção
de espécies reativas de oxigênio e efluxo de potássio, que são estímulos para a
ativação do inflamossoma NLRP3 e clivagem da pro-IL-1β (JIN e FLAVELL, 2010;
HARIJITH, EBENEZER e NATARAJAN, 2014). Dessa forma, antígenos presentes
nos ovos de Schistosoma - como omega-1 e IPSE/alpha-1, com atividade
hepatotóxica, (ABDULLA et al., 2011) - podem interagir com TLRs ou outros PRRs,
estimulando-os ou levando a produção estímulos primários e/ou secundários para a
ativação do inflamossoma.
A expressão do RNAm de TLR9 esteve aumentada na linhagem Balb/c, mas
apresentou uma baixa expressão na linhagem Swiss, sendo esta a linhagem que
apresentou os maiores níveis do RNAm da IL1-β, indicando que o TLR9 não
participa efetivamente da via de sinalização que ativa inflamassoma nos
camundongos Swiss infectados com S. mansoni. Desse modo, a internalização do
pigmento esquistossomótico poderia ocorrer por intermédio de outros receptores da
imunidade inata, como exemplo, o receptor Dectina-2 (da família dos CLRs) que
interage com componentes do SEA e ativa o inflamossoma NLRP3, com
consequente liberação da IL-1β (RITTER et al., 2010).
A expressão do RNAm de NLRP3 e ASC esteve aumentada para os
camundongos das linhagens Balb/c e C57BL/6 na sétima SAI, enquanto para os
camundongos da linhagem Swiss a produção do RNAm de NLRP3 e ASC
apresentou-se suprimida, no mesmo período. Esse resultado indica que a liberação
da IL-1β nos camundongos Swiss não se dá, de forma principal, por meio do
inflamossoma NLRP3-ASC, sugerindo que exista outro inflamossoma que atue na
clivagem da pró-IL-1β. Como exemplo, o inflamossoma NLRP1-Caspase-1 pode
atuar na clivagem da forma inativa da IL-1β (SCHRODER e TSCHOPP, 2010).
49
Ademais, a produção do RNAm de NLRP1 esteve aumentada nos camundongos da
linhagem Swiss na segunda e 16a SAI, enquanto para os camundongos da linhagem
Balb/c houve aumento da expressão na setima SAI. Por sua vez, a produção do
RNAm da Caspase-1 esteve suprimida durante toda a infecção nos camundongos
Balb/c e C57BL/6, podendo existir outra caspase que trabalhe igualmente a
Caspase-1. Segundo GRINGHUIS et al. (2012) existe a formação do inflamossoma
não convencional, formado por MALT1-ASC-Caspase-8, o qual leva a liberação de
IL-1β, após o reconhecimento de PAMPs de fungos pelo receptor Dectina-1. Ou
seja, existem diversas vias de sinalização entre os componentes da imunidade inata
que venham a convergir para uma mesma resposta – a liberação da IL-1β.
Em relação aos granulomas formados em torno dos ovos de S. mansoni
verificou-se em camundongos da linhagem Swiss os maiores tamanhos quando
comparados aos C57BL/6 e Balb/c. Este resultado está em conformidade com a
produção do RNAm da IL-1β, apesar de não ser decisiva em manter a resposta
inflamatória aos antígenos dos ovos em longo prazo pois na 12a SAI ocorreu
diminuição do tamanho dos granulomas nas três linhagens, apesar da expressão do
RNAm da IL-1β permanecer aumentada na linhagem Swiss. É possível que a
diminuição do granuloma na fase crônica da infecção, ocasione redução na
magnitude da resposta imune do tipo Th2, entrando em equilíbrio com Th1 e com a
consequente diminuição da inflamação granulomatosa em volta dos ovos de
Schistosoma (PEARCE e MACDONALD, 2002; COLLEY et al., 2014).
Quanto à expressão dos TLRs os camundongos da linhagem Balb/c
apresentaram aumento da expressão do RNAm de TLR2, TLR3, TLR5, TLR6, TLR7,
TLR9 e MyD88 na sétima SAI. Os camundongos C57BL/6 apresentaram aumento da
expressão do RNAm de TLR2, TLR3 e TLR5 em 7 SAI, além de TLR4 e MyD88 em
16 SAI. Por fim, os camundongos da linhagem Swiss apresentaram supressão de
todos os TLRs testados, durante toda a infecção, podendo-se inferir que a
supressão desses receptores pode ser importantes no perfil de resistência
desenvolvido pelos camundongos dessa linhagem.
O TLR2, na esquistossomose, participa no reconhecimento de
Lisofosfatidilserina presente no SEA (VAN DER KLEIJ et al., 2002), mas não tem-se
definido qual o outro TLR interage com o TLR2 para a formação do heterodímero
50
funcional (OLIVEIRA-NASCIMENTO, MASSARI e WETZLER, 2012). Com isso, de
acordo com a expressão do RNAm de TLR2 e TLR6, nos camundongos das
linhagens Balb/c e C57BL/6 em sete SAI, é provável que exista a formação do
heterodímero entre TLR2-TLR6, pois estes receptores tiveram aumento proporcional
da expressão do RNAm, enquanto a expressão do RNAm de TLR1 (outro candidato
a formação de heterodímero com TLR2) apresento-se baixa nas três linhagens
avaliadas. O TLR3 é endossomal e está envolvido no reconhecimento de
componentes que causam dano celular (KAWASAKI e KAWAI, 2014) e no
reconhecimento do RNA de dupla fita de Schistosoma (AKSOY et al., 2005). Dessa
forma, entende-se que existiu dano celular que tornou o RNA de dupla fita acessível
ao TLR3. O TLR4 tem seu papel definido em lesões envolvidas tais como injúria e
fibrose hepática (GUO e FRIEDMAN, 2010), o que é condizente com a
Esquistossomose mansoni, na qual o TLR4 reconhece o componente lacto-N-
fucopentose III (LNFPIII) presente nos SEA (THOMAS et al., 2003). Mas, segundo
VAN LIEMPT et al. (2007) células dendríticas humanas expostas ao SEA
apresentaram aumento da expressão CLRs (DC-SIGN, MGL e MR), e supressão da
expressão dos TLRs (TLR2, TLR3 e TLR4), fato que interferiu na maturação das
células dendríticas via TLRs (KANE et al., 2008). Em consequência a exposição das
células dendríticas humanas inativas ao SEA ocorreu a não secreção de IL-10, IL-6,
IL-12p70 e TNF-α por estas células (VAN LIEMPT et al., 2007). Esse dado justifica a
supressão da expressão do RNAm da IL-6 e IL-12p35, durante toda a infecção, nas
três linhagens de camundongos aqui avaliadas.
A expressão do RNAm da moléluca adaptora MyD88 foi similar a maioria dos
TLRs que fazem uso desta molécula como via de sinalização celular, estando,
portanto, o RNAm do MyD88 suprimido nos camundongos Swiss, e aumentada,
principalmente, na linhagem Balb/c na sétima SAI. A produção do RNAm de MyD88
também esteve aumentada para os camundongos da linhagem C57BL/6 em 16 SAI,
fato que pode estar ligado ao aumento da expressão do RNAm de TLR4 nesses
camudongos em 16 SAI, indicando que existe uma via de sinalização ativa entre
TLR4-MyD88 na fase crônica da infecção, o que é sugestivo a existência de
lesão/fibrose hepática.
51
A correlação negativa entre a expressão da IL-1β do RNAm com a quantidade
total de ovos de S. mansoni verificada no fragmento íleo distal, assim como, uma
menor quantidade de ovos por grama detecido poderia devido a facilitação de
adesão destes à parede parede intestinal pela expressão de IL-1β (LEJOLY-
BOISSEAU et al., 1999) e, por conseguinte, a reação inflamatória presente ao redor
dos ovos facilita a passagem dos mesmos para o lúmen intestinal (LENZI, SOBRAL
e LENZI, 1987; FALLON e DUNNE, 1999).
Também correlação positiva entre a quantidade de ovos mortos na 16a SAI e
a expressão do RNAm do TLR2, poderiaser explicada pela participação deste
receptor no reconhecimento da Lisofosfatidilserina, presente nos ovos de S.
mansoni. Em relação ao TLR4 a correlação negativa no mesmo período, é sugestiva
de falta de interação com o receptor por motivos ainda desconhecidos.
Por outro lado, a correlação positiva entre a expressão do RNAm de TNF-α e
a quantidade de parasitos adultos na sétima e 12a SAI, e de de ovos viáveis e
imaturos no fragmento íleo distal em sete SAI é também sugestiva e suporta a ideia
de que o TNF favorece a postura e excreção dos ovos no hospedeiro (OLIVEIRA et
al., 2009; ABDUL-GHANI e HASSAN, 2010). O TNF-α pode ser considerado um
sinal que influencia as fêmeas de Schistosoma a iniciarem a oviposição (AMIRI et
al., 1992), e sua produção pode ser a tribuída a presença do parasito, atuando na
maturação do mesmo, além de atuar na formação e maturação do granuloma
hepático (LEPTAK e MCKERROW, 1997; DAVIES et al., 2004; OLIVEIRA et al.,
2009).
De posse desses dados vê-se que os camundongos Balb/ c e C57BL/6 se
mostraram mais permissivos ao desenvolvimento do S. mansoni e, em
consequência, são mais suscetíveis a infecção devido ao parasitismo mais
acentuado.
52
6– CONCLUSÃO
Camundongos Swiss são mais resistentes a infecção pelo S. mansoni por
apresentarem sobrevivência de 100%.
Camundongos Swiss apresentam supressão do RNAm de todos os TLRs
avaliados, e aumento na expressão do RNAm de NLRP1, Caspase-1, IL-1β e IL-
18.
Animais das linhagens Balb/c e C57BL/6, são mais suscetíveis a infecção pelo
S. mansoni e apresentam maior expressão de RNAm de TLR2, TLR3, TLR5,
TLR6, TLR7, TLR9, MyD88, NALP3, ASC e TNF-α no fígado durante o início da
oviposição (7 SAI).
53
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ANEXO A