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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS EMULSIONADOS

LIPÍDICOS CONTENDO PRAZIQUANTEL

AUTOR DISCENTE: MARGARETE MORENO DE ARAUJO

Natal – RN

2013

Margarete Moreno de Araujo



Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da UFRN como parte dos

requisitos para obtenção do Título de Mestre

em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior Coorientadora: Dra. Ana Luiza Porpino Fernandes Caroni

Natal – RN

2013

MARGARETE MORENO DE ARAUJO



Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas da UFRN como parte dos

requisitos para obtenção do Título de Mestre

em Ciências Farmacêuticas.

Comissão Examinadora:

______________________________________________________

Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior (Orientador) - UFRN

______________________________________________________

Prof. Dr. José Luís Cardozo Fonseca - UFRN

______________________________________________________

Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento – UFS

Dedico esse trabalho aos meus pais

Daniel e Lurdinha, e às minhas irmãs,

Magnollya, Magda e Magally. Amo muito

vocês, esse trabalho é fruto de tudo que

me ofereceram.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente ao meu bom Deus que nunca me abandonou e

sempre me deu forças nos momentos mais difíceis.

Aos meus pais, Daniel e Lurdinha, que nunca mediram esforços em

oferecer a mim e a minhas irmãs segurança, apoio, carinho e todo empenho em

nos garantir a melhor educação, tanto acadêmica como moral. Não há como

expressar toda minha felicidade e orgulho em dedicar este trabalho a vocês, como

forma de agradecimento a todo o amor dado. Agradeço às minhas irmãs queridas,

Magnollya, Magda e Magally, por sempre estarem comigo, apesar da distância,

dando-me toda força e apoio que precisei. À minha família agradeço por toda

confiança depositada. A vocês meu eterno agradecimento e amor.

Ao meu orientador Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior, por me

orientar sempre com dedicação, paciência, incentivo, contribuição na ampliação

dos meus conhecimentos, tanto no profissional, como no pessoal. Por valiosas

lições que ultrapassaram as barreiras do laboratório e certamente me

acompanharão para toda a vida.

Às minhas amigas do Programa de Pós-graduação, principalmente as que

convivi diariamente no laboratório, Edilene (pelas boas risadas e almoços no RU),

Polyanne (por ser minha confidente), Letícia (por compartilhar angústias do

mesmo sistema emulsionado), Alice e Lilia (pelo incentivo em expandir meus

horizontes), Karlinha e Ednara (por dividir as tarefas no liofilizador), Mayra,

Ednara, Yamara, Ana Luiza e Mariana. Cada item deste trabalho tem a

contribuição e ajuda de cada uma de vocês. Obrigada pelos momentos de alegria,

e por tornarem o convívio no laboratório momentos de prazer e descontração.

À minha querida aluna de iniciação científica, Izadora, por nunca dizer não

para me ajudar em todos os experimentos, fossem eles durante a madrugada ou

no final de semana. Muito obrigada Iza!

Às minhas amigas, irmãs de coração, Carol e Hiala. Obrigada pelo silêncio

que faziam quando precisava discutir algum resultado em casa, obrigada pela

distração nos momentos em que precisava pensar em outra coisa que não

mestrado, obrigada pela paciência e compreensão quando me encontravam

estressada. E a Carol, principalmente, por ter me dado forças e mostrado que eu

era capaz de continuar. Obrigada meninas!

Ao Núcleo de Processamento Primário e Reúso de Água Produzida e

Residuos (NUPRAR - UFRN) pelas analises reológicas.

Ao Núcleo de Pesquisa em Petróleo e Gás (NUPEG - UFRN) pelas

analises de espalhamento de luz e potencial Zeta.

Aos professores componentes da banca de qualificação Márcio Ferrari,

Márcia Rodrigues e Alcides de Oliveira; e aos professores componentes da banca

de defesa da dissertação, pelas contribuições dadas ao nosso trabalho.

À secretaria de Pós-graduação, aos funcionários, à Faculdade de Ciências

Farmacêuticas e a CAPES pelo suporte financeiro.

Meus sinceros agradecimentos a todos que participaram da minha jornada

e que de muitas formas contribuíram para a realização desta dissertação.

“Eu acredito demais na sorte. E tenho constatado que, quanto mais duro eu trabalho, mais sorte eu tenho.”

Thomas Jefferson

http://pensador.uol.com.br/autor/thomas_jefferson/

RESUMO

O praziquantel (PRZ) é o fármaco de escolha para tratamento da

esquistossomose no Brasil e está disponível comercialmente para administração

oral na forma de comprimidos. No entanto, possui baixa solubilidade aquosa, o

que limita o sucesso terapêutico desta forma farmacêutica e a disponibilização de

formas líquidas. Os sistemas emulsionados lipídicos têm grande potencial para

aumento da solubilização de fármacos lipofílicos, sendo, então, uma estratégia

interessante para tal finalidade. O objetivo do presente estudo foi o

desenvolvimento e a caracterização de sistemas líquidos emulsionados lipídicos

do tipo óleo em água (O/A), a base de óleo de soja como fase interna estabilizada

pelo par de tensoativos Tween® 80 e Span® 80, para melhorar a fase

biofarmacêutica do PRZ. Depois de selecionar o melhor valor do Equilíbrio

Hidrófilo-Lipófilo (EHL=11), os parâmetros de preparação das formulações pela

técnica de emulsificação foram otimizados. As emulsões foram obtidas com

sucesso, as formas líquidas apresentaram comportamento newtoniano e

proporcionaram um aumento de solubilidade do PRZ superior a 20 vezes. O

estudo de estabilidade acelerada demonstrou a estabilidade das emulsões e o

efeito dos cotensoativos investigados. O estudo da dinâmica de interação entre os

componentes pelo diagrama pseudoternário de fase demonstrou regiões de

obtenção de emulsões do tipo O/A, enquanto que o estudo da interação dos

componentes e o seu efeito na estrutura dos sistemas e na eficiência de

incorporação do fármaco levaram a obtenção de sistemas com uma quantidade

de fármaco solúvel ainda maior (cerca de 1,5%), o que demonstra o potencial

deste novo insumo para o tratamento principalmente da esquistossomose, o qual

resultou em um depósito de patente BR 10 2013 000455 3.

Palavras-chave: praziquantel, estabilidade, reologia, esquistossomose, sistema

emulsionado O/A.

ABSTRACT

Praziquantel (PRZ) is the main drug used for treatment of schistosomiasis in

Brazil. It is administered by oral rout as tablets. However, has low aqueous

solubility which limits this therapeutic success dosage form and availability of liquid

forms. The emulsion systems have great potential and represent an interesting

strategy to increase the solubility of drugs. The aim of study was the development

and characterization of lipid-emulsified liquid systems of the type oil in water (O /

W), the base of soybean oil as the internal phase stabilized by surfactants pair

Tween® 80 and Span® 80, for improving the phase biopharmaceutical of PRZ.

After selecting the best value of Hydrophilic-Lipophilic Balance (HLB = 11), the

parameters of the preparation of the formulations were optimized emulsification

technique. The emulsions were successfully obtained; the liquid forms provided

exhibited Newtonian behavior and an increase in solubility of PRZ higher than 20

times. The accelerated stability study demonstrated the stability of the emulsions

and the effect of cosurfactants investigated. The study of the dynamics of

interaction between components in the diagram showed pseudoternary phase

regions to obtain O/W emulsions, whereas the study of the interaction of the

components and their effect on system structure and the efficiency of incorporation

of the drug led to systems with an amount of soluble drug even higher (about

1.5%), which demonstrates the potential of this new input mainly for the treatment

of schistosomiasis, which resulted in the filing of patent BR 10 2013 0004 55 3.

Keywords: praziquantel, stability, rheology, schistosomiasis, emulsified system.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1 - Áreas endêmicas e focais da esquistossomose mansoni. Fonte: SVS/MS, Brasil 2009.

.......................................................................................................................................................... 19

FIGURA 2 - Representação esquemática da estrutura química do PRZ. ....................................... 21

FIGURA 3 - Representação esquemática de emulsões do tipo O/A (a) e A/O (b). Adaptado de

Oliveira et al., 2004. ......................................................................................................................... 24

FIGURA 4 - Representação esquemática do processo de instabilidade física de emulsões do tipo

O/A. Sendo a – floculação, b – cremagem, c – acomodação de Ostwald, d – coalescência.

Adaptado de Taylor, 1998. ............................................................................................................... 27

FIGURA 5 – Estruturas químicas do Tween® 80 (a) e Span

® 80 (b). .............................................. 29

FIGURA 6 – Estruturas químicas do álcool etílico (a) e álcool benzílico (b). .................................. 31

FIGURA 7 - Representação do Diagrama Ternário. O ponto M representa a concentração de 50%

de fase aquosa, 20% de fase oleosa e 30% de tensoativos. .......................................................... 32

FIGURA 8 - Esquematização do ciclo tempo versus temperatura, o qual as emulsões foram

submetidas. ...................................................................................................................................... 40

FIGURA 9 - Espectros de ultravioleta obtidos na região de 200 - 400nm. Sendo: azul = PRZ,

vermelho = Tween® 80 + Span

® 80, verde = tween + span + PRZ, laranja = FS + OS + PRZ, lilás =

FS + OS. ........................................................................................................................................... 49

FIGURA 10 - Curva padrão de PRZ em solução alcoólica obtida por espectrofotometria UV-vis em

264 nm. ............................................................................................................................................. 50

FIGURA 11 - Diagrama pseudoternário contendo água purificada como FA, óleo de soja como FO

e a associação dos tensoativos Tween® 80 + Span

® 80 (Tw80 + Sp80). As áreas delimitadas

representam: SEOB (Sistema Emulsionado Opaco Branco), ST (Sistema Translúcido), SEOA

(Sistema Emulsionado Opaco Amarelo) e SF (Separação de Fases)............................................. 57

FIGURA 12 – Pontos selecionados na região SEOB do diagrama pseudoternário. ....................... 58

FIGURA 13 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de IC e turbidez das emulsões durante

30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como cotensoativos.

Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ● 0,05:1, ▲ 0,1:1, e

■ 0,15:1. ........................................................................................................................................... 60

FIGURA 14 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de pH e condutividade das emulsões

durante 30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como

cotensoativos. Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ●

0,05:1, ▲ 0,1:1, e ■ 0,15:1. .............................................................................................................. 63

FIGURA 15 - Diâmetro das gotículas, turbidez e índice de refração em função da concentração de

óleo de soja (FO) no meio. ............................................................................................................... 69

FIGURA 16 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de óleo de

soja (FO) no meio (aumento de 400x). ............................................................................................ 70

FIGURA 17 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de óleo de

soja (FO) no meio ............................................................................................................................. 71

FIGURA 18 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de óleo

de soja (FO) no meio. ....................................................................................................................... 73


tensoativos no meio. ........................................................................................................................ 74

FIGURA 20 – Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de

tensoativos no meio (aumento de 400x). ......................................................................................... 75

FIGURA 21 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de


FIGURA 22 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de



PRZ no meio. .................................................................................................................................... 78

FIGURA 24 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de PRZ no

meio (aumento de 400x). ................................................................................................................. 79

FIGURA 25 - Valores correspondentes ao potencial zeta, à condutividade elétrica e ao pH versus à

variação de PRZ no meio. ................................................................................................................ 79

FIGURA 26 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A e B) e

viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (A’ e B’). ................................................... 83

FIGURA 27 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A) e

viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (B) para as emulsões onde houve adição

de PRZ. ............................................................................................................................................ 84

FIGURA 28 - Evolução dos módulos de armazenagem G’e de perda G” das emulsões contendo

0,75 e 1% de PRZ. ........................................................................................................................... 86

FIGURA 29 - Gráficos do efeito do fármaco na estabilidade das emulsões Sendo emulsões: (○)

com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ, (■) com 5% de T +

PRZ. ................................................................................................................................................. 87



PRZ. ................................................................................................................................................. 89

FIGURA 31 - Fotomicrografia das emulsões contendo 1% de PRZ e 1; 2,5 e 5% de tensoativos

durante os 30 dias de estudo de estabilidade. Aumento de 400x. .................................................. 90

FIGURA 32 - Gráfico para determinação do teor de fármaco nas emulsões em 30 dias de estudo.

Sendo emulsões: (○) com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ,

(■) com 5% de T + PRZ. .................................................................................................................. 91

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Proporção entre mistura de tensoativos e fase oleosa para determinação do

diagrama de fases. ..........................................................................................................39

TABELA 2 - Quantidade em % dos constituintes para formulação. ..................................43

TABELA 3 - Equações de modelos matemáticos para determinação do comportamento

reológico. .........................................................................................................................46

TABELA 4 - Resultados dos parâmetros analisados na validação da metodologia analítica

do PRZ. ...........................................................................................................................51

TABELA 5 - Valores encontrados para as médias do índice de cremagem (IC) medido

24h (antes e após centrifugação) e 7 dias após o preparo das emulsões. .......................55

TABELA 6 – Porcentagem de PRZ incorporado em emulsão por dois métodos diferentes.

........................................................................................................................................65

TABELA 7 - Resultado do teste para incorporação do PRZ em emulsões diferentes.......66

TABELA 8 – Valores correspondentes aos índices de polidispersão das diferentes

emulsões em estudo. .......................................................................................................80

TABELA 9 - Valores correspondentes ao índice de comportamento (n), coeficiente de

correlação linear (r), tensão de cisalhamento inicial (τ0) e o índice de consistência (K) para

cada sistema emulsionado. ..............................................................................................81

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CV Coeficiente de variação

DP Desvio padrão

EHL Equilíbrio hidrófilo-lipófilo

EF Incoporação do PRZ na emulsão

formada

EM Emulsões

FA Fase aquosa

FO Fase oleosa

FS Fosfatidilcolina de soja

IC Índice de cremagem

O/A Óleo em água

OS Oleato de sódio

PRZ Praziquantel

T Tensoativos

TA Temperatura ambiente

TIF Incorporação de PRZ na fase oleosa da

emulsão

TA Temperatura ambiente

LISTA DE SÍMBOLOS

Tensão de cisalhamento

Taxa de cisalhamento

Viscosidade

K Índice de consistência

N Índice de comportamento ou de fluxo

® Marca registrada

Ζ Potencial zeta

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 16

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................ 18

2.1. ESQUISTOSSOME MANSÔNICA ............................................................. 18

2.2. PRAZIQUANTEL ........................................................................................ 20

2.3. EMULSÕES ............................................................................................... 23

2.3.1 Estabilidade de emulsões ..................................................................... 26

2.3.2 Componentes ....................................................................................... 28

2.3.3 Diagrama de fases ................................................................................ 31

3. OBJETIVOS ................................................................................................... 33

3.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 33

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 33

4. MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 34

4.1. REAGENTES E SOLVENTES ................................................................ 34

4.2. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS ......................................................... 34

4.3. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ANÁLISE

QUANTITATIVA DO PRZ ................................................................................. 35

4.3.1 Especificidade ....................................................................................... 35

4.3.2 Curva padrão ........................................................................................ 35

4.3.3 Linearidade e Intervalo ......................................................................... 36

4.3.4 Precisão ................................................................................................ 36

4.3.5 Exatidão ................................................................................................ 36

4.3.6 Robustez aparente ................................................................................ 37

4.4. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DE EMULSÃO TIPO O/A

COM ÓLEO DE SOJA ...................................................................................... 37

4.4.1 Construção do diagrama de fases ........................................................ 37

4.4.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão .......... 40

4.5. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO PRZ NA EMULSÃO ÓLEO DE

SOJA/ÁGUA ..................................................................................................... 41

4.6. ESTUDO DA INTERAÇÃO DO PRZ COM OS COMPONENTES DA

EMULSÃO ........................................................................................................ 42

4.6.1 Interação fármaco-componentes nas propriedades dos sistemas

emulsionados ................................................................................................. 42

4.6.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão ..................................... 47

4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 47

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 49

5.1. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE

QUANTITATIVA DO FÁRMACO ....................................................................... 49

5.2. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DO SISTEMA

EMULSIONADO ÓLEO DE SOJA/ÁGUA ......................................................... 53

5.2.1 Construção do diagrama de fases ........................................................ 53

5.2.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão óleo de

soja/água ....................................................................................................... 59

5.3. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO FÁRMACO ..................................... 64

5.3.1 Escolha do método de incorporação ..................................................... 64

5.3.2 Efeito do etanol na incorporação do PRZ na emulsão .......................... 66


EMULSÃO ........................................................................................................ 67

5.4.1 Efeito do fármaco nas propriedades físico-químicas dos sistemas ...... 67

5.4.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão ..................................... 87

6. CONCLUSÃO ................................................................................................... 92

PERSPECTIVAS ................................................................................................... 94

ANEXOS ............................................................................................................. 108

ANEXO I ......................................................................................................... 109

Introdução _________________________________________________________________

16

1. INTRODUÇÃO

Considerada uma importante doença no contexto da saúde pública

brasileira, a esquistossomose mansônica é uma enfermidade parasitária tropical

desencadeada pelo helminto Schistosoma mansoni (VITORINO et al., 2012). As

formas adultas deste verme habitam nos vasos mesentéricos do hospedeiro

definitivo, no caso, um hospedeiro vertebrado (homem ou outro animal

suscetível), e as formas intermediárias se desenvolvem em caramujos aquáticos

do gênero Biomphalaria (CLERINX, GOMPEL, 2011). O Ministério da Saúde

estima que cerca de 25 milhões de pessoas vivem em áreas sob o risco de

contrair a doença (SVS – MS, BRASIL, 2009).

O tratamento da esquistossomose consiste na utilização de medicamentos

específicos, para a cura da infecção. Dentre as alternativas terapêuticas

disponíveis, o praziquantel (PRZ) é o fármaco de primeira escolha, sendo

administrado por via oral na forma de comprimido de 600 mg em dose única de 50

mg/kg para adultos e 60 mg/kg para crianças (BRASIL, 2009). Entretanto, por ser

um fármaco de classe biofarmacêutica II, o PRZ apresenta uma baixa solubilidade

em água (0,4 mg/mL) (LINDENBERG, KOPP, DRESSMAN, 2004), limitando

assim, seu sucesso terapêutico, uma vez que o paciente deve ingerir uma alta

dose de fármaco para alcance de efeito farmacológico (MOURÃO et al., 2005).

Os fármacos pouco solúveis em água em especial aqueles enquadrados na

Classe II do Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SBC), para os quais a

dissolução é um fator limitante da absorção, representam um grande desafio para

o farmacêutico e, nesse sentido, a utilização de recursos capazes de promover a

maior solubilização do agente terapêutico e, consequentemente, melhorar a sua

dissolução e biodisponibilidade, representa uma alternativa bastante viável. Tais

recursos envolvem uma vasta gama de tecnologias; os sistemas emulsionados

lipídicos, por exemplo, são amplamente utilizados com esse propósito.

As emulsões lipídicas são sistemas potencialmente interessantes para

liberação de fármacos, devido a sua habilidade para incorporar agentes

terapêuticos de baixa solubilidade aquosa dentro da fase dispersa hidrossolúvel.

Com o uso dessas emulsões, o contato direto do fármaco com os fluidos e tecidos

Introdução _________________________________________________________________

17

corporais podem ser evitados, minimizando os possíveis efeitos adversos, além

de que, quando comparadas com as formulações convencionais, são bem

aceitáveis por aumentar a biodisponibilidade de fármacos e por prolongar o efeito

farmacológico, (WANG et al., 2006; HUNG et al., 2007).

O presente trabalho buscou o desenvolvimento e a caracterização físico-

química de sistemas emulsionados lipídicos (emulsões) para administração do

praziquantel na forma líquida, levando a obtenção de um novo insumo.

Fundamentação teórica _________________________________________________________________

18

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. ESQUISTOSSOME MANSÔNICA

A humanidade convive com a esquistossomose desde a antiguidade, pois

estudos verificaram a presença de ovos de Schistosoma em múmias egípcias de

3.500 a.C. Apesar de estudos destacarem que no Brasil a esquistossomose se

estabeleceu durante o período colonial, seu primeiro relato só foi descrito entre os

anos de 1907 e 1908, por Pirajá da Silva, no Estado da Bahia, que supriu as

incertezas taxonômicas quanto ao parasita. A partir de então surgiram as

investigações sobre a distribuição geográfica e dados parasitológicos da doença.

Todavia, sua importância só foi evidenciada na década de 50 com a realização,

por Pellon & Teixeira (1950), do grande inquérito coproscópico nacional de

prevalência, inicialmente no nordeste do país e, posteriormente, em áreas

supostamente não endêmicas do sul e sudeste. Desde então, houve um

crescimento exponencial nas pesquisas sobre o Schistosoma mansoni e a doença

por ele provocada (KATZ & PEIXOTO, 2000; ANDRADE, 2002; COURA &

AMARAL, 2004; SOUZA et al., 2008).

A esquistossomose mansônica é causada pelo trematódeo Schistosoma

mansoni e constitui uma das doenças parasitárias mais importantes com elevada

prevalência nos países em desenvolvimento. Apesar dos esforços de inúmeros

países, estima-se que cerca de 200 milhões de pessoas estejam infectadas, onde

120 milhões são sintomáticos e 20 milhões sofrem severamente com a doença

(OPAS, 2011). Esta doença é um grande problema de saúde pública, afetando

principalmente as zonas rurais, estando associada à pobreza e a falta de

saneamento devido ao baixo desenvolvimento econômico (MUNIZ-JUNQUEIRA,

TOSTA & PRATA, 2009; PALMEIRA et al. 2010; TIBIRIÇA et al. 2011).

No Brasil, a esquistossomose mansônica afeta mais de 6 milhões de

pessoas e está presente, de forma endêmica, do Maranhão até Minas Gerais,

com focos no Pará, Piauí, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina,

Goiás, Distrito Federal e Rio Grande do Sul (Figura 1). As principais causas de

óbito estão relacionadas às formas clínicas graves. Estima-se que cerca de 25


19

milhões de pessoas vivem em áreas sob o risco de contrair essa doença (SVS –

MS, BRASIL, 2009; WHO, 2010; OPAS, 2011).

FIGURA 1 - Áreas endêmicas e focais da esquistossomose mansoni. Fonte: SVS/MS, Brasil 2009.

O ciclo de vida do Schistosoma mansoni é complexo, envolvendo uma fase

de reprodução sexuada no hospedeiro definitivo, no caso, um hospedeiro

vertebrado (homem ou outro animal suscetível), e uma fase assexuada no

hospedeiro intermediário, este representado pelos moluscos aquáticos do gênero

Biomphalaria. Em humanos infectados, os parasitas na fase adulta se

desenvolvem na luz dos vasos sanguíneos habitando, preferencialmente, as

vênulas do plexo hemorroidário superior e as ramificações mais finas das veias

mesentéricas, onde põem seus ovos. Depois de atravessarem a mucosa

intestinal, os ovos são eliminados com as fezes. Em contato com águas

superficiais, os ovos eclodem e libertam os miracídios, que nadam até encontrar o

hospedeiro intermediário, onde se alojam (SOUZA et al., 2011).

Posteriormente, os moluscos contaminados liberam as cercárias, que

voltam ao meio aquático e infectam um hospedeiro vertebrado. Ao penetrar na


20

pele ou mucosas deste hospedeiro, as cercárias perdem sua cauda bifurcada,

transformando-se em esquistossômulos. Estes atingem a circulação sanguínea e,

posteriormente, o sistema porta intra-hepático, onde se desenvolvem, alcançam a

fase adulta, reproduzem e eliminam seus ovos, reiniciando o ciclo. Devido à sua

localização no corpo humano, o parasita ocasiona obstrução das veias do

intestino e fígado, sendo esta a causa da maioria dos sintomas da doença que

podem tornar-se crônicos e levar à morte (SOUZA et al., 2011).

A fase inicial da doença pode ser assintomática ou sintomática

caracterizada por dermatite cercariana. A fase tardia, caracterizada pelas formas

crônicas, inicia-se a partir dos seis meses após a infecção, podendo durar vários

anos. Podem surgir os sinais de progressão da doença para diversos órgãos,

chegando a atingir graus extremos de severidade, como hipertensão pulmonar e

portal, ascite e ruptura de varizes do esôfago (SVS – MS, BRASIL, 2009).

Atualmente, no Brasil, apenas dois fármacos esquistossomicidas são

utilizados: a oxamniquina e o praziquantel. A oxamniquina apresenta efeitos

colaterais no sistema nervoso central, efeitos mutagênicos e carcinogênicos. A

distribuição deste fármaco não é adequada, uma vez que a única indústria

farmacêutica que o produz e comercializa mantém sua produção reduzida. Assim,

o praziquantel é atualmente o fármaco de escolha para o tratamento da

esquistossomose no Brasil, devido ser altamente efetivo contra esta patologia,

apresenta pouco ou nenhum efeito adverso e, nos últimos anos, seu preço tem

sido reduzido substancialmente.

2.2. PRAZIQUANTEL

O praziquantel (PRZ) foi desenvolvido no início da década de 70, como

resultado de um trabalho cooperativo entre as indústrias farmacêuticas Bayer AG

e a Merck. O medicamento ficou disponível no mercado internacional a partir da

década de 80, e segundo a publicação Tropical Disease Report (Twelfth

Programme for Research and Training in Tropical Diseases, 1995) foi

demonstrada, em pouco tempo, sua maior eficácia e menor toxicidade em relação

aos demais fármacos esquistossomicidas (WHO, 1998; BERGE et al., 2011). É


21

também o único agente ativo contra todas as cinco espécies de esquistossomo,

além de atuar frente a outros helmintos patogênicos ao homem, sendo altamente

eficaz contra as formas adultas e larvares de cestóides tais como Taenia solium,

Taenia saginata e Himenolepis nana (ARAGON et al, 2009).

Conforme visto, o PRZ é a principal forma de tratamento para a

esquistossomose no Brasil. Sua ação anti-helmíntica ocorre, provavelmente,

devido à inibição da bomba de Na+ e K+ dos esquistossomos, aumentando a

permeabilidade da membrana do helminto a certos cátions monovalentes e

bivalentes, principalmente o cálcio que leva à intensificação da atividade

muscular, seguida por contração e paralisia espástica. Como consequência, os

helmintos se separam dos tecidos do hospedeiro e são rapidamente deslocados

das veias mesentéricas para o fígado, ao passo que os helmintos intestinais são

expelidos (LACY et al., 2010; VITORINO et al., 2012).

O PRZ também compromete o tegumento do parasita, disponibilizando

novos antígenos, e como resultado, ele pode torna-se mais suscetível às

respostas imunológicas normais do hospedeiro (GREENBERG, 2005; ARAGON

et al., 2009).

O PRZ [(±)-2ciclo-hexilcarbonil-1, 2, 3, 6, 7,11b-hexa-hidro-4H-pirazino

(2,1-a) isoquinolin-4-ona, C19H24N2O2] (Figura 2), pertence ao grupo químico

isoquinolino-pirazino (VITORINO et al., 2012), apresenta-se como um pó fino

branco, inodoro, solúvel em etanol, facilmente solúvel em clorofórmio e

diclorometano; com faixa de fusão entre 136 °C e 140 °C (FARMACOPÉIA

BRASILEIRA, 2010).

N

N

OH

O

FIGURA 2 - Representação esquemática da estrutura química do PRZ.

No entanto, este fármaco é pouco solúvel em água (0,4 mg/mL), o que

limita a utilização na forma líquida e constitui um desafio para a formulação de

comprimidos (MOURÃO et al., 2005). Isto ocorre devido às suas propriedades


22

biofarmacêuticas (classe II no Sistema de Classificação Biofarmacêutico)

(LINDENBERG, KOPP & DRESSMAN, 2004; SOUZA, FREITAS & STORPIRTS,

2007), o qual possui baixa solubilidade em água e alta permeabilidade; sendo

rapidamente absorvido pelo trato gastrintestinal e também rapidamente excretado

(SILVA, 2006). Estas características tornam necessária a administração de uma

maior dose de fármaco para alcance do efeito terapêutico.

O PRZ, na apresentação de comprimidos de 600 mg, é administrado por

via oral na forma de 20 mg/kg, três vezes em um dia de tratamento com intervalos

de, no mínimo, 4 h e, no máximo, 6 h, ou dose única de 40-60 mg/kg

(KOROLKOVAS, 2000; REY, 2001; MONTRESOR et al., 2002; CINERMAN,

2005; SILVA, 2006; BRASIL, 2009; LACY, 2010), o que potencialmente promove

maior possibilidade de reações adversas.

A pesquisa crescente em sistemas de liberação de fármacos é

impulsionada pelo aumento na quantidade de fármacos lipofílicos e por novas

oportunidades de simplificar o perfil de carreadores provenientes da inovação

tecnológica (CHUAN et al., 2012). Os sistemas de liberação de fármacos e a

nanotecnologia farmacêutica apresentam algumas estratégias para o aumento da

solubilidade aparente ou da velocidade de dissolução do PRZ. Algumas dessas

estratégias já estão descritas na literatura, como: os complexos de inclusão com

ciclodextrinas (BECKET, SCHEP & TAN, 1999; JESUS et al., 2006); as

dispersões sólidas, lipossomas (AMMAR et al., 1994; MOURÃO et al., 2005;

FREZZA et al., 2007); os sistemas micro/nanoparticulados (MAINARDES et al.,

2006; PASSERINI et al., 2006); e, até mesmo, os implantes poliméricos de uso

subcutâneo (CHENG, LEI e GUO, 2010). Além disso, o PRZ também é um

fármaco amplamente utilizado em medicina veterinária.

Recentemente foi aprovada, nos testes clínicos de fase I, a primeira vacina

para prevenção da esquistossomose, mostrando ser segura e capaz de induzir

imunidade à doença (FIOCRUZ, 2012). No entanto, ainda há muito a se fazer

para a completa imunização de todos os habitantes, principalmente das áreas

endêmicas, e eliminação desta doença, o que ainda torna necessário a

disponibilidade de formulações mais efetivas para tratamento dos pacientes

infectados.


23

Na literatura não foi encontrado até o presente, trabalho que envolva

incorporação do PRZ em sistemas emulsionados lipídicos, o que configura

claramente a inovação desta proposta.

2.3. EMULSÕES

A palavra emulsão (EM) deriva do verbo latino emulgeo, que significa

mungir, aplicando-se, de um modo geral, a todas as preparações de aspecto

leitoso com as características de um sistema disperso de duas fases liquidas.

Atribui-se a Grew a obtenção das primeiras emulsões para uso medicinal

(PRISTA et al., 1995).

Uma emulsão é um sistema constituído basicamente por uma fase líquida

dividida na forma de gotículas no interior de outro líquido imiscível, estabilizada

por tensoativos associados ou não a cotensoativos (OLIVEIRA et al., 2004;

MCCLEMENTS, 2012; TANG et al., 2013). Correspondem a sistemas de

liberação convenientes para incorporação, proteção e liberação de fármacos

pouco solúveis em água (LI et al., 2012). Apresentam-se como sistemas

termodinamicamente instáveis cineticamente dependentes da formulação e

técnica de obtenção (FERNANDEZ et al., 2004). Assim, não se formam

espontaneamente e suas propriedades dependem não apenas de condições

termodinâmicas como também do método de preparo, das características de cada

componente e da ordem de adição dos mesmos (LIN, KURIHARA & OHTA, 1975;

SAJJADI, 2006a; MCCLEMENTES, 2012; ZHANG, LIU & FAN, 2013).

A fase que está presente como gotículas nas emulsões é geralmente

chamada de fase interna, descontínua ou dispersa, enquanto a fase na qual as

gotículas encontram-se dispersas é denominada de fase externa, dispersante ou

contínua. A maioria das emulsões tem gotículas com diâmetros de 0,1 a 100 µm e

consiste em sistemas inerentemente instáveis (CONSTANTINIDES, TUSTIAN &

KESSLER, 2004; AULTON, 2005; MCCLEMENTES, 2012).

As emulsões simples são compostas basicamente de três componentes:

água, óleo e tensoativo, sendo que as propriedades físico-químicas destes

influenciam consideravelmente o comportamento do sistema (SAJJADI, ZERFA,


24

BROOKS, 2003). Podem ser classificadas em dois tipos distintos, de acordo com

a natureza da respectiva fase dispersa, como emulsão óleo em água (O/A), no

caso da fase orgânica imiscível dividida no interior da água ou solução aquosa. O

inverso corresponde às emulsões do tipo água em óleo (A/O) (AULTON, 2005;

USHIKUBO & CUNHA, 2012), conforme Figura 3. Nas emulsões lipídicas, a fase

orgânica consiste em um tipo de óleo de origem mineral, vegetal ou sintético.

FIGURA 3 - Representação esquemática de emulsões do tipo O/A (a) e A/O (b). Adaptado de

Oliveira et al., 2004.

A administração parenteral de fármacos lipofílicos é o problema principal no

desenvolvimento de formulações farmacêuticas. As emulsões lipídicas são

sistemas potencialmente interessantes para liberação de fármacos devido a sua

habilidade para incorporar farmacos de baixa solubilidade aquosa dentro da fase

dispersa. Com o uso de emulsões lipídicas, o contato direto do fármaco com os

fluidos e tecidos corporais pode ser evitado minimizando os possíveis efeitos

adversos, além de que são bem aceitáveis por aumentar a biodisponibilidade de

fármacos e por prolongar o efeito farmacológico em comparação com as

formulações convencionais (WANG et al., 2006; HUNG et al., 2007; SCHMIDTS

et al., 2010).

As emulsões lipídicas são usualmente utilizadas como meio para

administração de fármacos insolúveis em água, por dissolução da substância na

fase oleosa de emulsões O/A para prevenir hidrólise, aumentar a fração solúvel

do fármaco ou para a captura do mesmo por infusão (FORMARIZ et al., 2004;

HUNG et al., 2007).


25

Para obtenção destes sistemas emulsionados, as propriedades físico-

químicas e a concentração do tensoativo são fatores relevantes para determinar o

tipo de estruturas e as propriedades reológicas do sistema (FORMARIZ et al.,

2010). Outra variável importante é a escolha da fase oleosa, pois, além de

garantir a biocompatibilidade do sistema, deve levar a obtenção de sistemas

cineticamente estáveis.

Os tensoativos são essenciais para estabilizar os sistemas emulsionados.

Geralmente, estas moléculas se auto-arranjam em água ou em óleo, levando à

formação de microestruturas bem definidas como micelas, cristais líquidos ou

sistemas emulsionados (FORMARIZ et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2004; URBAN,

MAINARDES & GREMIÃO, 2009; YANG et al., 2013; XIN et al., 2013).

Os agentes emulsionantes são moléculas constituidas por uma parte polar

(hidrofílica) e uma parte apolar (lipofílica) razoavelmente equilibradas,

denominados de anfífilicos, atuando na redução da tensão interfacial. Como

resultado desta estrutura anfifílica, na presença de água e óleo, atraem as partes

oleosa e aquosa do sistema, residindo preferencialmente na interface com seus

grupos orientados para as respectivas fases nas quais é solúvel (SILVA &

SOARES, 1996; AZZINI, 1999; RIBEIRO, 2002; PICHOT et al., 2010;

MAINDARKAR et al., 2013).

Os tensoativos atuam na formação de emulsões por meio de diferentes

mecanismos, como redução da tensão interfacial favorecendo a estabilização

termodinâmica; formação de um filme rígido interfacial, favorecimento da

permanência de barreira mecânica que se opõe a coalescência; formação de uma

dupla camada elétrica na superfície dos glóbulos, o que apresenta barreira

elétrica que evitará a aproximação das partículas (SILVA & SOARES, 1996;

YANG et al., 2013; ZÜGE et al., 2013).

Segundo Azzini (1999), a natureza da interface é fator decisivo na

estabilidade da emulsão, e por isso, a escolha adequada dos tensoativos é muito

importante.

Na tentativa de sistematizar a seleção de tensoativos, Griffin em 1947

desenvolveu um método empírico, conhecido como sistema do Equilíbrio

Hidrófilo-Lipófilo (EHL), que reflete a relação entre as propriedades lipofílicas e

hidrofílicas dos mesmos em escala numérica, atribuindo valores de 1 a 20 para


26

aqueles não iônicos. Quanto maior o valor de EHL, maior a hidrofilicidade da

substância. A aplicação de cada tensoativo está relacionada com o valor

calculado para seu EHL: aqueles com valor de EHL baixo tendem a formar

emulsões A/O, enquanto os de valor de EHL alto predispõem a formação de

emulsões O/A. No valor de EHL requerido, o tamanho do glóbulo é mínimo, o que

explica a estabilidade do sistema. Cada matéria prima oleosa possui valor de EHL

requerido para a formação de emulsões estáveis (PRISTA, 1995; LACHMAN,

LIEBERMAN & KANIG, 2001; FLORENCE & ATTWOOD, 2003; AULTON, 2005;

PICHOT et al., 2010; LOSADA-BARREIRO et al., 2013).

2.3.1 Estabilidade de emulsões

Uma emulsão estável pode ser definida como um sistema no qual os

glóbulos dispersos mantêm suas características iniciais, permanecendo

uniformemente distribuídos pela fase contínua (AULTON, 2005; HUCK-IRIART et

al., 2011). A não ser que a tensão interfacial seja zero, os glóbulos tendem a se

aproximar reduzindo a área de contato entre os dois líquidos, favorecendo um

estado de menor energia livre, ou seja, termodinamicamente mais estável

(CAPEK, 2004). Para as emulsões o estado de maior estabilidade termodinâmica

ocorre quando uma camada de óleo está sobre a água. Se as modificações que o

sistema sofre durante o período de análise são mínimas, este sistema pode ser

considerado como cineticamente estável, mesmo que se torne instável num

período de tempo mais prolongado (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001;

ZHANG, LIU & FAN, 2013).

A instabilidade física de um sistema disperso, em particular, das emulsões,

é causada pela separação de fases, promovendo mudança considerável na

aparência, na consistência, na redispersibilidade e na “performance” do produto

(IDSON, 1993a). Este tipo de instabilidade pode apresentar-se sob vários

mecanismos, tais como, a cremagem (creaming), a floculação, a coalescência ou

a inversão de fases (Figura 4) (HUCK-IRIART et al., 2011; ZHANG, LIU & FAN,

2013). Pode resultar ainda, da instabilidade química como, alteração dos valores


27

de pH, hidrólise de tensoativos, contaminação microbiana e processos

fotoquímicos (AZZINI, 1999).

FIGURA 4 - Representação esquemática do processo de instabilidade física de emulsões do tipo

O/A. Sendo a – floculação, b – cremagem, c – acomodação de Ostwald, d – coalescência.

Adaptado de Taylor, 1998.

A floculação, representado pela letra a da Figura 4 pode ocorrer quando as

gotículas se agregam em aglomerados que mantém o filme da fase contínua,

dentro da emulsão, conservando sua identidade individual, mas cada aglomerado

comporta-se fisicamente como uma unidade única. Os glóbulos não coalescem e

podem ser redispersos por agitação. (AULTON, 2005; FRANGE & GARCIA, 2009;

HUCK-IRIART et al., 2011). Acontece em emulsões quando a energia de atração

de Van der Waals excede a energia de repulsão entre as micelas, fazendo com

que essas se aproximem. A floculação pode ser reduzida ou eliminada pela

criação de uma barreira de energia entre as gotículas, prevenindo sua

aproximação (TRADOS, 2004; XIN et al., 2013).

A cremagem (creaming) e a sedimentação (letra b da Figura 4) são

processos ocasionados pela ação da gravidade quando a fase dispersa, conforme

sua densidade relativa à fase contínua, sobe até à superfície ou desce até o fundo


28

da emulsão, formando uma camada de emulsão mais concentrada. A floculação

pode ocorrer de modo concomitante ao creaming, mas não necessariamente

(LIEBERMAN et al., 1988; AULTON, 2005).

A acomodação de Ostwald (Ostwald ripening), letra c da Figura 4, acontece

quando as partículas maiores crescem de tamanho devido à dissolução das

partículas menores (WELIN-BERGER & BERGENSTÅHL, 2000; FRANGE &

GARCIA, 2009). A acomodação de Ostwald ocorre devido à diferença de

solubilidade entre pequenas e grandes partículas, ou seja, as gotículas menores,

devido a sua maior solubilidade, tendem a se dissolver durante o armazenamento

e tornam-se depositadas sobre as maiores (TAYLOR, 1998; WEISS,

CANCELIERE & MCCLEMENTS, 2000; TADROS, 2004; LIM et al., 2011; XIN et

al., 2013).

A coalescência, letra d da Figura 4, resulta da redução da espessura e

ruptura do filme líquido entre as gotículas, ocasionando junção dessas gotículas

e, finalmente, separação da fase oleosa. A coalescência é caracterizada por uma

larga distribuição de tamanho das gotículas, resultando na separação de fases de

forma visível ao olho nu (ZÜGE et al., 2013).

A inversão de fases é resultante da troca de posição entre a fase dispersa

e o meio, ou seja, o meio dispersante forma as gotículas, e as gotículas dispersas

formam a fase contínua (por exemplo, uma emulsão O/A revertendo para emulsão

A/O). A instabilidade física desses processos é bastante complexa e pode ocorrer

simultaneamente ao invés de ocorrer consecutivamente. Dois processos de

inversão de fases podem ser distinguidos: indução pelo aumento do volume da

fração da fase dispersa, e transição produzida por alteração de temperatura e/ou

adição de eletrólitos (TRADOS, 2004; AULTON, 2005; ZÜGUE et al., 2013).

2.3.2 Componentes

Embora muitas emulsões tenham sido descritas na literatura, um grande

desafio para o pesquisador farmacêutico é predizer quais os óleos e tensoativos

são os mais adequados para uma determinada aplicação, levando em conta sua

aceitabilidade e o seu potencial tóxico.


29

Os tensoativos não-iônicos são os mais aplicados no desenvolvimento de

sistemas de liberação de fármacos, pois sua concentração micelar crítica é

geralmente muito menor que a dos tensoativos ionicamente carregados, e por

isso são menos irritantes e mais tolerados, apresentam menos problemas de

compatibilidade e são menos sensíveis a mudanças de pH ou à adição de

eletrólitos. Trata-se de um grupo bastante numeroso e integra compostos tanto

hidrossolúveis como lipossolúveis, o que permite obter emulsões A/O ou O/A. É

possível utilizar uma combinação de ambos com o objetivo de obter uma película

interfacial densa, necessário para a formação de emulsões mais estáveis

(MALMSTEN, 1999; AULTON; 2005; ZÜGUE et al., 2013).

Os ésteres de sorbitano também conhecidos como a série Span® (Figura

5), nome como são comercializados, exibem propriedades lipofílicas e tendem a

formar emulsões A/O. Na prática, o mais frequente é utilizá-los em combinação

com polissorbatos para obter emulsões O/A e A/O. Os polissorbatos são

derivados polietilenoglicólicos dos ésteres de sorbitano correspondendo

comercialmente a série dos Tween® (Figura 5). Estes compostos dão melhor

estabilidade à emulsão, assegurando melhor incorporação e liberação controlada

da espécie encapsulada quando comparados com os tensoativos de menor

massa molar (JATO, 1997; BONNET et al., 2010b; ZÜGUE et al., 2013).

(a)

(b)

FIGURA 5 – Estruturas químicas do Tween® 80 (a) e Span

® 80 (b).


30

Os polissorbatos além de apresentarem baixa toxicidade, são compatíveis

com praticamente todos os outros tipos de tensoativos, sendo também solúveis

em água. Possuem, por outro lado, um pH neutro e são estáveis ao calor, às

variações de pH e às elevadas concentrações de eletrólitos (JATO, 1997;

AULTON, 2005; HUCK-IRIART et al., 2011).

Entre os principais óleos estudados, o triglicerídeo de cadeia longa de

origem vegetal e os triglicerídeos de cadeia média têm sido utilizados, assim

como o miristato de isopropila e o óleo de soja (TROTTA et al., 2002; POYATO et

al., 2013). O grau de pureza destes óleos deve ser elevado, no sentido de

prevenir a ocorrência de irritação que pode ser provocada pelos contaminantes

presentes em óleos com baixa pureza (CONSTANTINIDES, TUSTIAN &

KESSLER, 2004).

Os óleos tipicamente utilizados para emulsões farmacêuticas consistem de

óleos digeríveis a partir de fontes naturais, incluindo o óleo de soja, óleo da

semente de sésamo, óleo da semente de algodão e semelhantes

(CONSTANTINIDES, TUSTIAN & KESSLER, 2004). Existe uma necessidade

para surgimento de novas formulações que sejam biocompatíveis, não irritantes, e

susceptíveis de serem esterilizadas antes da aplicação (HUNG et al., 2007).

O óleo de soja é um óleo vegetal bastante popular sendo o segundo mais

consumido mundialmente, atrás apenas do óleo de palma. Esse óleo vegetal é

altamente poli-insaturado, sendo particularmente rico em ácidos graxos ômega 3,

portanto possui boa aceitabilidade por suas propriedades nutricionais. No entanto,

esse atributo é simultaneamente a principal causa da baixa estabilidade oxidativa

do óleo (RODRIGUES et al., 2012). A típica composição de soja é principalmente

de ácidos graxos poliinsaturados, incluindo ácido oléico (C18:1), ácido linoléico

(C18:2) e ácido linolênico (C18:3) (WANG et al., 2006).

A função do cotensoativo é diminuir a tensão interfacial para valores abaixo

dos limites proporcionados pelo agente emulsivo comum (tensoativo). No entanto,

nos casos em que os tensoativos são capazes de cumprir integralmente essa

função, a presença dos cotensoativos não é necessária e a composição da

microemulsão restringe-se aos outros três componentes (OLIVEIRA et al., 2004).


31

O álcool etílico e o álcool benzílico (Figura 6) são amplamente utilizados

em várias formulações farmacêuticas e industriais e são largamente usados como

solventes orgânicos.

(a) (b)

FIGURA 6 – Estruturas químicas do álcool etílico (a) e álcool benzílico (b).

Devido à sua polaridade e baixa toxicidade, o álcool benzílico é usado

como um solvente geral e como um diluente para substâncias aromatizantes em

alguns alimentos e bebidas (MAULA, WESTERLUND & SLOTTE, 2009). O álcool

etílico é amplamente utilizado em formulações farmacêuticas e cosméticas devido

à baixa toxicidade tópica e a propriedade de se combinar facilmente em

proporções variadas com tensoativos para formar misturas com alto poder de

dissolução (RESENDE et al., 2008).

2.3.3 Diagrama de fases

Na preparação das emulsões, a construção de diagramas de fase (Figura

7) pode ser uma ferramenta fundamental para caracterizar em que condições

experimentais as EM existem e em que proporções dos componentes outras

estruturas tais como microemulsões e cristais líquidos podem estar presentes.

O diagrama ternário é representado no plano como um triângulo equilátero,

onde os três constituintes são simétricos. Os três vértices do triângulo

correspondem a 100% dos constituintes: óleo, tensoativos e água. Na Figura 7,

para determinar as concentrações de cada constituinte no ponto M, deve-se traçar

sucessivamente por este ponto as paralelas aos lados opostos aos vértices 100%

de cada constituinte.


32

FIGURA 7 - Representação do Diagrama Ternário. O ponto M representa a concentração de 50%

de fase aquosa, 20% de fase oleosa e 30% de tensoativos.

Os diagramas pseudoternários podem ser obtidos a partir de dados de

titulação ou pela preparação de amplo número de amostras com diferentes

proporções dos componentes. A vantagem do primeiro método é que este pode

ser usado para estudar amplo número de amostras de diferentes composições de

maneira rápida (BHARGAVA et al., 1987; LAWRENCE e REES, 2000).

O presente trabalho propõe um estudo sistemático na busca dos

componentes e técnica de preparo ideal para o desenvolvimento e a

caracterização físico-quimica de um sistema emulsionado lipídico (emulsão do

tipo O/A) para incorporação e aumento da solubilidade aquosa aparente do PRZ,

com a possível administração desse fármaco em uma forma farmacêutica líquida

para tratamento da esquistossomose.

Objetivos _________________________________________________________________

33

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Desenvolver um sistema emulsionado lipídico (emulsão do tipo O/A), para

incorporação e aumento da solubilidade aquosa aparente do praziquantel (PRZ),

com a possível administração desse fármaco em uma forma farmacêutica líquida.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obtenção e estudo da estabilidade de emulsão óleo de soja/água,

empregando a associação de tensoativos não iônicos (Tween® 80 e Span®

80) em diferentes proporções;

Estudo da dinâmica de formação de sistemas coloidais envolvendo os

componentes utilizados, pelo diagrama de fases pseudoternário;

Efeito da adição de cotensoativos na estabilidade do sistema emulsionado;

Validar a metodologia analítica a ser utilizada na quantificação do PRZ;

Avaliar a incorporação do PRZ nos sistemas emulsionados obtidos;

Estudo do efeito da quantidade do PRZ, relação tensoativos/fase oleosa na

estrutura das dispersões coloidais e parâmetros importantes de dispersão

como:

Determinação da distribuição e do tamanho de gotículas

dispersas utilizando a técnica de espalhamento dinâmico da luz

(Dynamic Light Scattering);

Caracterização, através de medidas de potencial zeta, da

superfície das gotículas dispersas;

Determinação do comportamento reológico dos sistemas

emulsionados.

Materiais e métodos _________________________________________________________________

34

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. REAGENTES E SOLVENTES

Praziquantel (Roche, Brasil, doado pela Fio Cruz);

Água obtida por meio de purificador do tipo osmose reversa

(condutividade média:1,25 µS/cm);

Álcool benzílico absoluto (Fenilmetanol, Synth, Brasil);

Álcool etílico absoluto (Etanol, 99,5 %, Synth, Brasil);

Tween® 80 [Monooleato de polioxietileno (20) sorbitano Synth,

Brasil];

Span® 80 (Monooleato de sorbitano, Sigma Aldrich, EUA);

Oleato de sódio (Sigma Aldrich, EUA);

Fosfatidilcolina de soja (Lipóide S®100, Gerbras, Brasil);

Óleo de soja (Sigma Aldrich, EUA).

4.2. EQUIPAMENTOS E ACESSÓRIOS

Balança analítica (GEHAKA, modelo: AG-200);

Espectrofotômetro UV-Vis (Thermo Scientific Evolution 60);

Condutivímetro Microprocessado de Bancada (TECNOPON, modelo:

MCA 150);

Banho-Maria de Bocas Microprocessado (QUIMIS, modelo: Q334M-

28);

Ultra-turrax (IKA T18 basic);

pHmetro de bancada (PG1800, Gehaka);

Centrífuga de Bancada (Excelsa® II modelo 206 BL);

Vortex Motion II (Logen);

Estufa de Esterilização e Secagem Línea (Olidef CZ);

Reômetro (Anton Paar Physica MCR – 301 Rheometer);

ZetaPlus (Brookhaven Instruments Co., EUA);


35

Microscópio óptico Trinocular (DM 500 – Leica);

Refratômetro Abbe Digital de Bancada (Quimis).

4.3. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ANÁLISE

QUANTITATIVA DO PRZ

O método para análise quantitativa do PRZ, em solução alcoólica foi

validado empregando a técnica de espectrofotometria na região do ultravioleta, de

acordo com os parâmetros estabelecidos na resolução RE 899 da Agência

Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) 2003 e no Guia do International

Conference on Harmonisation (ICH) 1996. Estes parâmetros compreenderam:

especificidade, linearidade, intervalo, precisão, exatidão e robustez.

4.3.1 Especificidade

A especificidade do método proposto foi avaliada comparando-se os

espectros de absorção obtidos na região de ultravioleta apresentando um

comprimento de onda de 200 a 400 nm da (a) solução do PRZ na concentração

de 0,4 mg/mL, obtida a partir de uma diluição da solução estoque; (b) matriz do

sistema emulsionado com o PRZ incorporado na concentração de 0,4 mg/mL; e,

(c) matriz do sistema emulsionado. Esta matriz era composta por 70% de água,

25% de óleo de soja e 5% de tensoativos. Foram utilizadas duas associações

diferentes de tensoativos: oleato de sódio e fosfatidilcolina de soja; e, Tween® 80

e Span® 80.

4.3.2 Curva padrão

A solução estoque de fármaco foi preparada com 0,05 g de PRZ

dissolvidos em uma quantidade suficiente de álcool etílico PA e, em seguida,

diluída em balão volumétrico de 50,0 mL com álcool etílico para obter a

concentração de 1,00 mg/mL. Diferentes alíquotas desta solução foram


36

transferidas para balões volumétricos de 10,0 mL e o volume foi completado com

etanol a fim de obter soluções de diferentes concentrações (0,08; 0,16; 0,24; 0,32;

0,40; 0,48; 0,56; 0,64; 0,72 e 0,80 mg/mL). A absorbância das soluções foi

determinada por espectrofotometria na região do ultravioleta em 264 nm, usando

cubeta de quartzo de 1 cm e álcool etílico como branco. A partir da curva padrão

obtida, ou seja, da relação gráfica entre a concentração do fármaco (mg/mL) em

função dos valores de absorbância obtidos, foi realizada uma regressão linear

determinando, assim, a equação da curva e seu coeficiente de correlação. Todas

as concentrações de PRZ utilizadas neste estudo resultaram em valores de

absorbância inferiores a 2, seguindo, desta forma, a Lei de Lambert-Beer.

4.3.3 Linearidade e Intervalo

A linearidade foi determinada por meio da análise do coeficiente de

correlação da curva padrão do PRZ e o intervalo correspondeu à faixa de

concentração compreendida na curva padrão.

4.3.4 Precisão

A precisão foi avaliada para cinco concentrações diferentes de PRZ na

curva padrão (0,16; 0,24; 0,40; 0,56; e, 0,64 mg/mL) e os ensaios foram

realizados em triplicada. Este parâmetro foi estudado em um curto intervalo de

tempo, pelo mesmo analista (precisão intra-corrida) e em dias diferentes (precisão

inter-corrida).

4.3.5 Exatidão

A exatidão foi determinada pelo método do placebo contaminado (Equação

1), avaliando-se a adição e a recuperação do método em cinco níveis de

concentração de PRZ e em quintuplicata (n = 5). Em 1000 mg da matriz do

sistema emulsionado (70% de água + 25% óleo de soja + 5% tensoativos), foram


37

adicionadas quantidades conhecidas da solução estoque do PRZ a fim de obter

diferentes concentrações deste fármaco (0,16; 0,24; 0,40; 0,56; e, 0,64 mg/mL). A

recuperação do método de análise proposto foi obtida para dois tipos de

associações de tensoativos: oleato de sódio e fosfatidilcolina de soja; e, Tween®

80 e o Span® 80; conforme descrito no ensaio de especificidade.

Concentração média experimental de PRZExatidão = 100

Concentração teórica de PRZ (1)

4.3.6 Robustez aparente

Para verificar a robustez do método, foram avaliadas as variações na curva

padrão à medida que também alterava a concentração do PRZ na amostra e a

concentração do álcool etílico utilizado como solvente das soluções analíticas. As

análises foram realizadas em quintuplicata para cinco níveis de concentração de

PRZ (0,16; 0,24; 0,40; 0,56 e 0,64 mg/mL) e três níveis de concentração de álcool

etílico (99,5; 90 e 85 % v/v).

4.4. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DE EMULSÃO TIPO O/A COM

ÓLEO DE SOJA

4.4.1 Construção do diagrama de fases

Com o intuito de se determinar a melhor proporção de tensoativos para a

construção do diagrama de fases, inicialmente realizou-se o estudo para

determinação do melhor valor de EHL.

Para o presente estudo foram escolhidos dois tensoativos não iônicos, um

hidrofílico Tween® 80 ( Tw80EHL 15 ) e um hidrofóbico Span® 80 ( Sp80EHL 4,3 ),

(Figura 5). As concentrações dos componentes utilizados foram: 85% de água,

10% de óleo de soja e 5% de tensoativos. Segundo Griffin, emulsões do tipo O/A


38

são produzidas usando uma combinação de tensoativos com valor de EHL entre 9

e 12.

O estudo da proporção de tensoativos foi determinado anteriormente

dentro do nosso grupo de pesquisa, conforme mudança de valor do EHL, a qual

variou de 4,3 a 15 (STRECK, 2013). Para o presente estudo, foram comparados

apenas os melhores resultados que correspondem aos valores de EHL entre 8 e

11 associando diferentes quantidades de Tween® 80 e Span® 80. O cálculo da

razão de cada tensoativo na mistura foi realizado pela aplicação da Equação 2 e

3:

Sp80

Tw80

Tw80 Sp80

100 ( EHL )% = ,

EHL EHL

x

(2)

Sp80 Tw80% 100 % , (3)

sendo Tw80% a concentração percentual do tensoativo hidrofílico (Tween® 80) e

Sp80% a concentração porcentual do tensoativo hidrofóbico (Span® 80) necessários

para obter uma mistura com valor x de EHL (AULTON, 2005).

As emulsões foram preparadas pelo método de inversão de fases a 70 ± 2

ºC, no qual a fase aquosa (água purificada) foi vertida sobre a oleosa contendo os

tensoativos, sob agitação constante em um ultra turrax a 11000 rpm durante um

minuto, seguido por agitação de 7000 rpm por dez minutos. As condições de

temperatura de inversão de fases, a velocidade e o tempo de agitação foram

previamente padronizados em nosso laboratório (STRECK, 2013). O produto foi

deixado em repouso por 24 horas, em um recipiente hermeticamente fechado à

temperatura ambiente.

Para escolha do melhor EHL, as emulsões foram submetidas a ensaios de

estabilidade preliminar utilizando o índice de cremagem como parâmetro. As

analises foram realizadas, 24 horas antes e após a centrifugação [950 (x g) por 30

min] e 7 dias depois da preparação das emulsões. O ensaio foi realizado em

duplicata.

O índice de cremagem (IC) foi mensurado por meio de um paquímetro

digital, sendo calculado de acordo com a Equação 4.


39

c

t

100 ,h

ICh

(4)

sendo IC corresponde ao valor em porcentagem do índice de cremagem, ch ao

valor da altura da camada de creme e th é o valor total da altura da emulsão

contida no tubo. De acordo com esta equação, é importante notar que um valor

menor de IC é indicativo de uma emulsão mais estável.

Depois de estabelecido o melhor EHL para estudo e consequentemente a

melhor proporção de tensoativos, partiu-se para a construção de um diagrama de

fases para determinação da região de emulsão utilizando-se dos mesmos

constituintes (água, óleo de soja e Tween 80® + Span 80®), sendo que cada

vértice do diagrama indica um destes componentes.

As amostras foram preparadas partindo-se de uma mistura de tensoativos

e fase oleosa variando a proporção entre 1:9 a 9:1 de acordo com a Tabela 1.

TABELA 1 - Proporção entre mistura de tensoativos e fase oleosa para determinação do diagrama

de fases.

Proporção da mistura de tensoativos: fase oleosa

1:9 2:8 3:7 4:6 5:5 6:4 7:3 8:2 9:1

Cada ponto do diagrama foi obtido por titulação com água purificada obtida

em aparelho de osmose reversa a 70 ± 5ºC, utilizando micropipetas automáticas.

Após cada titulação a amostra foi homogeneizada a 7000 rpm em um aparelho

Ultra turrax.

Durante o processo de titulação, os tipos de sistemas formados e suas

fluências foram analisados visualmente. Os volumes de água adicionados às

preparações e que provocaram tais alterações foram anotados.

Após a titulação aquosa foram calculadas as concentrações de cada

componente da formulação obtendo-se pontos os quais foram utilizados na

delimitação das diferentes regiões existentes no diagrama de fases. Dessa forma

delimitaram-se os pontos em que se deu a transição de fases de sistema

emulsionado opaco branco (SEOB), sistema emulsionado opaco amarelo (SEOA),

sistema translúcido (ST) ou separação de fases (SF).


40

4.4.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão

Depois de selecionado o melhor valor de EHL para a emulsão em estudo,

foi realizada a análise do efeito da adição de cotensoativos (álcool etílico ou álcool

benzilico) na estabilidade preliminar do sistema emulsionado.

O estudo do efeito da presença de álcool etílico e do álcool benzílico

(Figura 6) como cotensoativos na estabilidade aparente da emulsão foi realizado

para cada substância em três diferentes concentrações (5, 10 e 15% m/m) em

relação à concentração de tensoativos. Os ensaios foram realizados em triplicata

e a emulsão sem cotensoativos foi utilizada como controle.

As emulsões foram preparadas de acordo com o item 4.4.1, sendo os

cotensoativos adicionados diretamente na fase oleosa momentos antes da

inversão de fases. Logo após foram acondicionadas em frascos de vidro

hermeticamente fechados.

O ensaio consistiu em submeter as amostras a ciclos de 72 horas (Figura

8), em diferentes condições de temperatura, a fim de avaliar a estabilidade

acelerada das amostras frente a mudanças bruscas de temperatura (ANVISA,

2004).

FIGURA 8 - Esquematização do ciclo tempo versus temperatura, o qual as emulsões foram

submetidas.

24 horas

AQUECIMENTO

45ºC

24 horas

TEMPERATURA AMBIENTE

25 ± 2ºC

24 horas

Ciclo de 72 horas

REFRIGERAÇÃO

4 ± 2ºC


41

Cada ciclo correspondeu a 24 h sob temperatura ambiente (25 ± 2 °C), 24

h sob aquecimento (45 °C) e 24 h sob refrigeração (4 ± 2 °C), completando assim

um ciclo, de acordo com a Figura 8.

As amostras foram avaliadas em intervalos de tempo pré-determinados: 1º,

7º, 15º e 30º dia. O 1º dia do teste, nesta metodologia, corresponde a vinte e

quatro horas após o preparo das formulações. Os parâmetros avaliados foram pH,

condutividade elétrica, índice de cremagem e turbidez.

O índice de cremagem foi aferido por meio de um paquímetro digital e

calculado conforme a Equação 4.

Para medida da condutividade elétrica, aferiu-se o condutivímetro com uma

solução padrão de KCl 0,1N, em seguida determinou-se a condutividade elétrica

das emulsões inserindo o eletrodo diretamente na amostra à temperatura

ambiente (25 ± 2 °C). Já para medir o pH, as emulsões foram diluídas com água

(1:10 v/v), e as análises foram também realizadas à temperatura ambiente (25 ± 2

°C). Para verificar a turbidez, as emulsões foram diluídas com água purificada

(1:20 v/v) e as medidas foram realizadas em um espectrofotômetro UV-Vis no

comprimento de onda de 860 nm, utilizando cubeta de vidro com caminho óptico

de 1 cm (POLICONTROL, 2006).

4.5. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO PRZ NA EMULSÃO ÓLEO DE

SOJA/ÁGUA

Neste estudo, o PRZ foi adicionado às emulsões por meio de dois métodos

diferentes. No primeiro, o PRZ foi adicionado diretamente na fase oleosa da

emulsão (TIF) antes da inversão de fases; enquanto que no segundo, o PRZ foi

adicionado diretamente na emulsão formada à temperatura ambiente (EF). Em

ambos os testes, o fármaco foi adicionado em excesso e a emulsão submetida a

uma agitação no vortex periodicamente durante um minuto, seguida de quinze

minutos em banho de ultrassom a cada 12 horas durante um período de 72 horas.

Após essa etapa, as emulsões foram centrifugadas por 30 minutos na velocidade

de 950 (x g) e uma alíquota foi retirada da porção média do tubo. Em seguida,


42

cada alíquota foi filtrada em uma membrana apresentando um diâmetro de poro

de 0,45 µm para obter 0,5 g do filtrado, o qual foi transferido para um balão

volumétrico de 25,0 mL e o volume completado com álcool etílico. Os valores de

concentração de PRZ foram determinados usando um espectrofotômetro UV-

visível, a um comprimento de onda de 264 nm, a partir de uma curva de

calibração, conforme a metodologia analítica validada (item 4.3.).

Em decorrência do resultado obtido no estudo 4.4.2, o efeito da adição de

álcool etílico como cotensoativo na concentração de 15% m/m (em relação à

concentração da associação dos tensoativos Tween® 80 e Span® 80) foi também

avaliado, para verificação do aumento do teor de fármaco incorporado. Neste

estudo, o fármaco foi adicionado na fase oleosa antes da inversão de fases.

Todos os ensaios foram realizados em triplicata.


EMULSÃO

Ao adicionar o fármaco nos sistemas emulsionados foi observada a

alteração da viscosidade dos sistemas. Um estudo foi realizado para avaliar o

efeito da composição na eficiência de incorporação do PRZ e da sua presença na

estrutura dos sistemas.

4.6.1 Interação fármaco-componentes nas propriedades dos sistemas

emulsionados

Preparo das amostras

Com o intuito de verificar o comportamento do fármaco no sistema

emulsionado, diferentes proporções entre os componentes foram estudadas.

Sendo que todas permaneceram na região de emulsão O/A presente no diagrama

de fases obtido (Figura 12).

Primeiramente, a quantidade da associação dos tensoativos Tween® 80 e

Span® 80 foi fixada em 5% m/m e foi variada a quantidade da fase oleosa em 5%,

10%, 20% e 30% m/m (respectivamente pontos A, B, C e D da Figura 12).


43

Posteriormente, a quantidade de fase oleosa foi fixada em 10% m/m e foi variada

a concentração da associação dos tensoativos Tween® 80 e Span® 80 em 1%,

2,5%, 5% e 10% m/m (respectivamente pontos E, F, B, G da Figura 12). Em

seguida, as quantidades de óleo de soja e associação de tensoativos foram

fixadas em 10% e 5% m/m, respectivamente, enquanto que a quantidade de PRZ

incorporada foi variada em 0,125%, 0,250%, 0,500%, 0,750% e 1,0% m/m. Para

melhor ilustração, todas essas formulações estão indicadas na Tabela 2.

Após a preparação das formulações, ensaios de pH, microscopia óptica,

turbidez, condutividade elétrica, índice de refração, potencial Zeta, diâmetro

médio da gotícula por espalhamento de luz dinâmico e comportamento reológico

dos sistemas foram realizados para acessar as características físico-químicas

desses sistemas.

TABELA 2 - Quantidade em % dos constituintes para formulação.

Grupo de

formulações

Tensoativos

(%)

Tween® 80 +

Span® 80

Fase oleosa

(%)

Óleo de soja

Fármaco

(%)

PRZ

Fase aquosa

(%)

Água purificada

1º

FO 5%

FO 10%

FO 20%

FO 30%

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

10

20

30

0,0

0,0

0,0

0,0

90,0

85,0

75,0

65,0

2º

T 1%

T 2,5%

T 5%

T 10%

1,0

2,5

5,0

10,0

10

10

10

10

0,0

0,0

0,0

0,0

89,0

87,5

85,0

80,0

3º

PRZ 0,125%

PRZ 0,25%

PRZ 0,5%

PRZ 0,75%

PRZ 1%

5,0

5,0

5,0

5,0

5,0

10

10

10

10

10

0,125

0,250

0,500

0,750

1,000

84,87

84,75

84,50

84,25

84,00

Adicionalmente, PRZ em excesso foi adicionado ao primeiro e ao segundo

grupo de formulações com o intuito de averiguar a quantidade de fármaco que


44

essas emulsões foram capazes de incorporar. A metodologia empregada foi a

mesma do item 4.5. (estudo anterior).

Ensaios de pH, condutividade, microscopia óptica, turbidez e índice de

refração

Para os ensaios de condutividade elétrica, índice de refração e microscopia

óptica, não houve necessidade de diluição das emulsões para adequar aos

parâmetros do aparelho.

Para avaliação microscópica, uma pequena quantidade de cada

formulação foi colocada sobre uma lâmina de vidro e coberta com uma lamínula

sob ligeira pressão, em seguida foi submetida a análise microscópica na lente de

aumento de 400x de um microscópio óptico com câmera acoplada.

O índice de refração foi determinado nas amostras após 24 h de preparo,

utilizando-se de um refratômetro calibrado com água purificada, cujo índice de

refração a 20 °C é de 1,3330 (KOROLKOVAS, 1988). Conforme metodologia

descrita na Farmacopéia Brasileira (2010), as leituras foram realizadas em

triplicata, colocando-se quantidade suficiente de cada amostra individualmente

para cobrir a face do prisma (KOROLKOVAS, 1988).

Para determinação do pH e da turbidez, as amostras foram diluídas com

água purificada na proporção de 1:10 e foram lidas em um pHmetro digital e em

um espectrofotômetro no comprimento de onda de 860 nm (POLICONTROL,

2006).

Ensaios de diâmetro hidrodinâmico médio e potencial zeta

A análise do diâmetro médio das gotículas e do índice de polidispersidade

foi realizada pela técnica de espalhamento dinâmico de luz (Dinamic Light

Scattering), também denominada espectroscopia de correlação de fótons (PCS do

inglês Photon Correlation Spectroscopy), com um feixe de luz de comprimento de

onda de 659 nm, a 25 ºC, com um ângulo de incidência de 90º, por meio do

software 90Plus/BI-MAS. A aquisição e o tratamento de dados foram realizados


45

através do software ZetaPALS. Todas as medidas foram realizadas a uma

temperatura constante de aproximadamente 25 °C.

Na obtenção do tamanho da gotícula e do potencial zeta (ζ) as amostras

foram diluídas com água purificada na proporção de 1:100, para uma melhor

condição de preparo da amostra, e foram mensuradas em um Zeta Plus. Se o

sistema é concentrado, ou seja, se a fase dispersa está em elevadas

concentrações, a interpretação torna-se dificultada em razão das interações

intergotículas. Para suprimir a interação entre gotículas, a diluição do sistema com

a fase dispersante foi necessária (LAWRENCE, REES, 2000; FORMARIZ et al.,

2005).

Ensaios de reologia

Para determinação do comportamento reológico, a quantidade de amostra

analisada foi cerca de um grama de cada emulsão. Para todas as emulsões com

exceção das emulsões que continham 0,75 e 1% de PRZ, a geometria de medida,

de material aço inox, utilizada foi a do tipo cone placa de 5 centímetros de

diâmetro com o cone apresentando ângulo de curvatura de 1º e distancia entre as

placas de 0,102 mm. A vantagem desta geometria é que não ocorre variação na

tensão de cisalhamento através da amostra, porque à distância entre o cone e a

placa é muito pequena (da ordem de dezenas ou centenas de microns), fazendo

com que a tensão de cisalhamento seja praticamente uniforme por toda a amostra

(TOKUMOTO, 1996).

Para as outras duas emulsões (PRZ 0,75% e PRZ 1%) foi utilizada a

geometria placas paralelas de material aço inox com diâmeto de 3,5 centímetros,

devido a viscosidade dessas amostras ser diferente e, portanto, não haver uma

correta aferição da reologia para os sistemas.

Durante o ensaio, a temperatura foi mantida constante em 25,0 ± 0,1 ºC

com o auxílio de um banho termostatizado. Os dados do segmento ascendente e

descendente do gradiente de cisalhamento foram plotados em um modelo de leis

de potência utilizando o software Rheoplus/32 (dados V3.60 da versão) para

descrever as características de fluxo das EM. As leituras foram feitas no intervalo

de 0 a 100 s-1 (curva ascendente) e 100 s-1 a 0 (curva descendente).


46

Para os testes de fluxo e escoamento, os modelos matemáticos utilizados

para determinação do comportamento reológico estão apresentados na Tabela 3,

onde corresponde à tensão de cisalhamento, à taxa de cisalhamento e à

viscosidade.

TABELA 3 - Equações de modelos matemáticos para determinação do comportamento reológico.

Modelo matemático Equação do modelo

Newton

Bingham

Ostwald de Waele

Herschel-Bulkley

Os parâmetros reológicos da lei de potência são o índice de consistência,

K, que indica o grau de resistência do fluido frente ao escoamento, quanto maior o

valor de K mais “consistente” é o fluido, e o índice de comportamento ou de fluxo,

n, que indica fisicamente o afastamento do fluido do modelo newtoniano. O

modelo de potência pode ser usado para representar fluidos pseudoplásticos (n <

1), fluidos newtonianos (n = 1) ou fluidos dilatantes (n > 1) (KELESSIDIS et al.,

2006; KELESSIDIS, POULAKAKIS, CHATZISTAMOU, 2011).

Apenas as formulações que tiveram comportamento pseudoplástico (PRZ

0,75% e PRZ 1%) foram submetidas ao teste de análise oscilatória. Sendo

realizada na temperatura de 25,0 ± 0,1 ºC, utilizando um reômetro no modo

oscilatório, com geometria de placas paralelas de 2,0 cm de diâmetro, separadas

por uma distância fixa de 0,102 mm. O teste de oscilação realizado foi o de

varredura de frequência. As formulações foram estudadas com solicitações

oscilatórias para determinar a evolução dos módulos de armazenagem (G’) e de

perda (G”) em função da frequência (0,1 Hz a 100 Hz) a uma tensão de amplitude

oscilatória fixa (1,00 Pa) obtida a partir da região viscoelástica linear. As amostras

foram cuidadosamente aplicadas à placa inferior, assegurando o mínimo

cisalhamento.


47

4.6.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão

O aspecto dos sistemas após a incorporação do fármaco levou à suspeita

de que o PRZ poderia estar interagindo com os componentes da formulação

como um tensoativo. Assim, um estudo de estabilidade foi realizado modificando-

se a concentração da associação dos tensoativos Tween® 80 e Span® 80 na

emulsão na presença de fármaco. Para isto, três diferentes emulsões foram

produzidas alterando a quantidade da associação dos tensoativos (1%, 2,5% e

5% m/m) onde todas possuíam 1% de PRZ. Os ensaios foram realizados em

triplicata.

Depois de acondicionadas em frascos de vidro hermeticamente fechados,

as formulações foram submetidas a ciclos de 24 horas em diferentes condições

de temperatura como esquematizado na Figura 8. Medidas de índice de

cremagem, turbidez, pH, condutividade elétrica, teor do fármaco e análises de

microscopia óptica foram realizadas à temperatura ambiente (25 ± 2 °C) após o

1º, 7º, 15º e 30º dia da preparação. A preparação das amostras para análise nos

parâmetros citados procedeu à mesma metodologia descrita no item 4.4.2 e 4.5.

4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados experimentais e analíticos foram expressos como os valores

médios acrescidos dos valores de desvio padrão. Para as comparações entre dois

grupos, foi utilizado o teste t Student´s, enquanto que para a comparação entre

mais de três grupos foi realizada a análise de variância com uma entrada

(ANOVA-One Way), sendo os resultados apresentados da seguinte maneira:

[F(x,y)= valor de F; (p= valor de p)], onde “F” corresponde à variância dos

resultados, “x” corresponde ao número de tratamentos menos um (k - 1), “y”

equivale ao resíduo, ou seja, o numero de amostras (n) menos o numero de

tratamentos (n - k) e “p” equivale ao índice de confiança.

Para confronto dos valores médios estatisticamente diferentes foi utilizado

quando apropriado, o teste Student-Newman-Keus (SNK) para comparações


48

múltiplas e o teste de Dunnet para comparações em relação a um grupo controle,

sendo considerados significativamente diferentes os valores de p < 0,05.

Resultados e discussão _________________________________________________________________

49

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO PARA ANÁLISE

QUANTITATIVA DO FÁRMACO

A validação do método analítico é um passo obrigatório para avaliar a

capacidade do método desenvolvido de fornecer resultados precisos para a sua

aplicação de rotina. A utilidade de um método analítico baseia-se nos valores dos

parâmetros de validação (ROZET et al., 2011). A validação deve garantir, por

meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das

aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto,

deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade,

limite de quantificação, exatidão, adequados à análise (ANVISA - BRASIL, 2003;

ICH, 1996). Dessa forma, iniciou-se a validação do método analítico realizando

uma varredura do comprimento de onda do PRZ com e sem a presença das

matrizes.

A Figura 9 apresenta o espectro de absorção na região do ultravioleta.

200 225 250 275 300 325

0,0

0,2

0,4

0,6

Ab

so

rba

nc

ia (

A)

Comprimento de onda (nm)

264 nm

FIGURA 9 - Espectros de ultravioleta obtidos na região de 200 - 400nm. Sendo: azul = PRZ,

vermelho = Tween® 80 + Span

® 80, verde = tween + span + PRZ, laranja = FS + OS + PRZ, lilás =

FS + OS.


50

Tal espectro foi obtido na faixa de 200-400nm da solução matriz com 1,00

g de emulsão (70% água destilada; 25% óleo de soja; 2,5% fosfatidilcolina de

soja; 2,5% oleato de sódio) e (70% água destilada; 25% óleo de soja; 2,5%

Tween® 80; 2,5% Span® 80), solução de PRZ (0,4 mg/mL) e solução do fármaco

juntamente com as matrizes (PRZ + MATRIZ).

O método de análise proposto mostrou-se seletivo e específico para ambos

os tipos de emulsões, mostrando que a matriz não absorve energia no

comprimento de onda selecionado para a análise quantitativa do PRZ e assim os

componentes da matriz não influenciam na determinação do fármaco.

Depois de observada a especificidade e seletividade do método, a curva

padrão do fármaco em solução alcoólica foi obtida por espectrofotometria na

região ultravioleta. A Figura 10 apresenta a curva padrão do fármaco em solução

alcoolica obtida por espectrofotometria na região ultravioleta.

0,0 0,3 0,6 0,9

0,0

0,4

0,8

1,2

Ab

so

rba

nc

ia (

A)

Concentraçao (mg/mL)

FIGURA 10 - Curva padrão de PRZ em solução alcoólica obtida por espectrofotometria UV-vis em

264 nm.

A equação da reta foi y = 1,1912x + 0,0993 e a análise quantitativa do PRZ,

proposta pelo método de espectrofotometria, mostrou linearidade na faixa de

concentração de trabalho, de 0,08 a 0,80 mg/mL, o coeficiente de correlação

calculado foi r2 > 0,99984, valor que se encontra de acordo com limite adequado

estabelecido (ANVISA - BRASIL, 2003). Os dados foram ainda submetidos à


51

análise de variância, a qual demonstrou não haver diferença estatística

significante [F (5,54) = 0,00504, (p = 1)].

Os resultados experimentais para os diferentes parâmetros analisados

estão apresentados na Tabela 4.

TABELA 4 - Resultados dos parâmetros analisados na validação da metodologia analítica do PRZ.

DP = Desvio padrão; CV = coeficiente de variação

Parâmetros analíticos Concentração + DP

(CV%)

0,16 mg/mL 0,24 mg/mL 0,4 mg/mL 0,56 mg/mL 0,64 mg/mL

Precisão (mg/mL)

Intra-dia 0,17 + 0,01 0,24 + 0,01 0,40 + 0,01 0,56 + 0,01 0,65 + 0,01

(4,9) (0,4) (1,2) (2,5) (1,5)

Inter-dia 0,16 + 0,01 0,24 + 0,01 0,40 + 0,01 0,57 + 0,01 0,64 + 0,01

(2,8) (1,4) (2,4) (0,9) (1,0)

Exatidão (%)

PRZ + FS e OS 91,16 + 1,39 94,47 + 3,10 97,04 + 2,15 96,75 + 2,29 97,68 + 2,90

(1,5) (3,2) (2,2) (2,4) (3,0)

PRZ + Tween® e Span® 96,58 + 1,69 99,01 + 2,58 99,21 + 1,87 98,45 + 1,70 99,96 + 2,11

(1,8) (2,6) (1,8) (1,7) (2,1)

Robustez (mg/mL)

etanol 85% 0,16 + 0,01 0,23 + 0,01 0,39 + 0,01 0,55 +0,01 0,62 + 0,01

(0,6) (0,6) (1,0) (1,3) (1,0)

etanol 90% 0,16 + 0,01 0,23 + 0,01 0,39 + 0,01 0,55 +0,01 0,62 + 0,01

etanol 99,5%

(1,6) (1,5) (1,1) (1,0) (0,8)

0,17 + 0,01 0,24 + 0,01 0,40 + 0,01 0,56 + 0,01 0,65 + 0,01

(4,9) (0,4) (1,2) (2,5) (1,5)


52

A precisão é a concordância entre os resultados dentro de um curto

período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. A

repetibilidade do método é verificada por, no mínimo, 9 determinações,

contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 concentrações, baixa,

média e alta, com 3 réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da

concentração do teste (ANVISA - BRASIL, 2003). E é normalmente expressa pelo

desvio padrão relativo (coeficiente de variação) (USP, 1990; ICH,1996). O valor

máximo aceitável para o coeficiente de variação (CV) é 5% (ANVISA - BRASIL,

2003).

Os resultados obtidos pelo método espectrofotométrico UV mostraram-se

precisos para análise quantitativa do fármaco, sendo que os valores de CV foram

menores que 5%, encontrando-se dentro do limite especificado pelas normas

(ICH, 1996; ANVISA - BRASIL, 2003). Adicionalmente, os resultados obtidos no

estudo de precisão foram submetidos a uma análise estatística, onde não foi

observado diferença significativa para os valores intra-dia [F (2,12) = 0,00588, (p

= 0,994)] e para os valores inter-dia [F (2,12) = 0,00153, (p = 0,998)].

A exatidão de um método pode ser definida como a proximidade dos

resultados obtidos em relação ao valor verdadeiro (ICH, 1996; ANVISA - BRASIL,

2003). Os compêndios oficiais e a legislação vigente preveem que o ensaio de

determinação da exatidão pode ser realizado para análise quantitativa de

fármacos, formas farmacêuticas e para impurezas (ICH, 1996; ANVISA - BRASIL,

2003).

Para análise quantitativa do fármaco em formas farmacêuticas, o ensaio de

recuperação pode ser realizado pelo método de adição de padrão ou pelo método

do placebo contaminado. O primeiro consiste em analisar uma amostra a qual foi

adicionada quantidade conhecida de fármaco (padrão de referência) à forma

farmacêutica e o segundo consiste em adicionar quantidade conhecida de

fármaco (padrão de referência) a uma mistura dos excipientes da forma

farmacêutica (ICH, 1996; ANVISA - BRASIL, 2003). Dessa forma, nesse estudo a

exatidão foi avaliada pelo método do placebo contaminado, adicionando

concentrações conhecidas da solução padrão do fármaco a uma solução

contendo os componentes da matriz (25% de óleo de soja, 5% de tensoativos e

70% de água destilada).


53

De acordo com os valores apresentados na Tabela 4, o método de análise

proposto pode ser considerado exato, para ambos os conjuntos de tensoativos, já

que a recuperação encontrada na totalidade das concentrações estudadas

mostrou-se adequada para análise quantitativa do PRZ nas matrizes

emulsionadas. Não houve diferença estatística significante para o uso do OS e FS

[F (2,12) = 0,0113, (p = 0,989)], valor mínimo de 91,16 ± 1,39% e valor máximo de

97,68 ± 2,9%, e nem para Tween® 80 e Span® 80 [F (2,12) = 0,00693, (p = 0,993)]

sendo o valor mínimo de 96,58 ± 1,69% e valor máximo de 99,96 ± 2,11%.

Robustez é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e

deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Durante o desenvolvimento da

metodologia deve-se considerar a avaliação da robustez. Constatando que a

susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas, estas deverão

ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento (ANVISA -

BRASIL, 2003).

A avaliação da robustez (Tabela 4) foi realizada pela análise do coeficiente

de variação entre as médias das concentrações, observando que não ocorreu

interferência com a variação do grau alcoólico, o coeficiente de variação foi menor

que 5% seguindo os padrões da ANVISA. Os valores não apresentaram

diferenças estatísticas quando comparados entre si [F (2,12) = 0,00440, (p =

0,996)]. Portanto, o método analítico proposto foi considerado robusto frente a

variação do teor alcoólico nos sistemas emulsionados.

O estudo, dos diferentes parâmetros analíticos, confirmou que a

metodologia foi validada com sucesso e pode ser utilizada para a análise

quantitativa do PRZ nos sistemas emulsionados, garantindo a confiabilidade dos

resultados.

5.2. ESTUDO DA OBTENÇÃO E ESTABILIDADE DO SISTEMA EMULSIONADO

ÓLEO DE SOJA/ÁGUA

5.2.1 Construção do diagrama de fases


54

Com o intuito de se determinar a melhor proporção de tensoativos para a

construção do diagrama de fases, inicialmente realizou-se o estudo para

determinação do melhor valor de EHL.

Numa fase inicial do processo de desenvolvimento da formulação é de

grande importância avaliar o valor de EHL dos tensoativos utilizados e também o

valor requerido de EHL da fase oleosa, isso caracterizará o tipo de emulsão que

se deseja produzir (A/O ou O/A). Por meio dessas determinações, o número de

experimentos pode ser reduzido precocemente durante a escolha da formulação

(SCHMIDTS et al., 2010).

O valor de EHL necessário para emulsificar um determinado óleo pode ser

determinado empiricamente, isto é, pela preparação de emulsões com tensoativos

de diferentes valores de EHL, e assim determinar em qual destes valores se

obtém a emulsão mais estável (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001).

Nesse caso, o EHL para a formulação desejada foi escolhido pelo ensaio

de estabilidade preliminar, o qual foi determinado pelo índice de cremagem das

emulsões em estudo. Este parâmetro foi medido 24 h após o preparo, antes e

depois da centrifugação [950 (x g) por 30 min], e após 7 dias.

Foi utilizado como conjunto de tensoativos o Tween® 80 e o Span® 80 para

o sistema em estudo, pois é mais frequente o preparo de emulsões estáveis

recorrendo a uma combinação de um tensoativo lipofílico com um hidrofílico,

especialmente para emulsões O/A. Essas combinações produzem interfaces

mistas revestindo a fase interna devidamente, para conferir ao sistema uma

viscosidade suficiente para evitar a cremagem e assim promover a estabilidade

da emulsão (LACHMAN, LIEBERMAN, KANIG, 2001). Além de que, a

estabilização de emulsões pelo uso de tensoativos não iônicos se faz através de

impedimento estérico e ligações de hidrogênio. A porção não polar do tensoativo

se insere nas partículas do óleo e os grupos de óxido de etileno na fase aquosa.

Os grupos de óxido de etileno causam impedimento estérico que inibe as

partículas de óleo sofrerem colisão e coalescer, além de formarem ligações de

hidrogênio com a água (FOX, 1986; SILVA & SOARES, 1996; GULLAPALLI &

SHETH, 1999).

O processo de cremagem é causado devido à ação da gravidade e pode

ocorrer quando a densidade da fase dispersa é menor do que a fase dispersante.


55

A centrifugação pode ser aplicada para acelerar a taxa de cremagem ou

sedimentação e é considerada um método para determinar a estabilidade

preliminar das emulsões baseado no processo de separação acelerada, que

normalmente ocorre sob condições de armazenamento (BRASIL, 2004; CASTELI

2008; SINKO, 2008; BONTORIM 2009).

As emulsões recém-preparadas não devem ser submetidas a testes de

estabilidade, seja pela exposição imediata às condições de tensão ou a

procedimentos de teste, pois esses sistemas podem apresentar uma instabilidade

intrínseca, não adquirindo uma estabilidade logo após a obtenção. É desejável um

período inicial de espera para que ocorra a estabilização, sendo usualmente

aceito um período de 24 a 48 horas após o preparo (RIEGER, 1996; MASSON,

2005). Assim, tanto para este estudo, quanto para os estudos seguintes,

padronizou-se um período de 24 horas, após o preparo, para a realização das

análises nas emulsões.

Neste trabalho, o EHL para a formulação desejada foi escolhido pelo

ensaio de estabilidade preliminar, o qual foi determinado pelo índice de cremagem

(IC) das emulsões em estudo. Este parâmetro foi medido 24 horas após o

preparo, antes e após a centrifugação [950 (x g) por 30 min], e 7 dias após a

obtenção das emulsões. Os valores dos IC encontrados estão apresentados na

Tabela 5.

TABELA 5 - Valores encontrados para as médias do índice de cremagem (IC) medido 24h (antes e

após centrifugação) e 7 dias após o preparo das emulsões.

EHL

Antes da

centrifugação

(24h)

Após

centrifugação

(24h)

7 dias

Média (± DP)

8 13,40 ± 0,00 10,75 ± 0,21 12,15 ± 2,33

9 12,35 ± 1,77 9,95 ± 1,77 11,12 ± 3,80

10 11,00 ± 1,56 9,05 ± 2,19 9,90 ± 5,09

11 6,35 ± 2,05 7,35 ± 2,90 8,95 ± 3,04

Valores semelhantes de IC foram observados para os EHL 8, 9 e 10

durantes os sete dias de estudo, enquanto que a formulação obtida com o EHL 11


56

apresentou valores menores de IC, quando comparado aos demais, indicando

maior estabilidade, uma vez que de acordo com a equação para cálculo do índice

de cremagem, quanto menor o valor do IC, menor o valor da porção de creme

(TC) na emulsão.

O presente estudo permitiu estabelecer que a emulsão com EHL 11

apresentou uma maior estabilidade, uma vez que este sistema apresentou um

índice de cremagem significativamente menor, quando comparado aos valores

das amostras com EHL 8, 9 e 10. Sendo o EHL 11, portanto, o valor usado para

realização dos demais estudos.

Após estabelecer o melhor EHL para estudo, deu-se continuidade ao

trabalho com o estudo termodinâmico dos sistemas coloidais.

Quando se modifica progressivamente a composição de uma mistura de

solventes imiscíveis, as mudanças que produzirão na dispersão podem ser

traduzidas por importantes variações nas propriedades termodinâmicas dos

constituintes que a compõe (OLIVEIRA et al., 2004). Normalmente, o diagrama de

fases, representado por um triangulo equilátero, é chamado de diagrama ternário,

pois haverá a mistura de três componentes: fase aquosa, fase oleosa e

tensoativo. Esses diagramas também podem ser chamados de pseudoternários,

pois o ponto, que representa normalmente apenas um tensoativo, passa a ser

representado por uma mistura de tensoativos. Portanto, o diagrama será a

representação da mistura de quatro substâncias no triângulo equilátero

(LAWRENCE & REES, 2000; CORREA et al., 2005; SILVA et al., 2009;

DAMASCENO et al., 2011).

A Figura 11 representa um triângulo equilátero onde cada região contém

pontos cuja composição corresponde a uma mistura pseudoternária (Tween® 80 +

Span® 80, óleo de soja e água purificada) em porcentagem. Cada vértice do

triângulo representa 100% de cada um dos componentes. A construção desse

diagrama teve como objetivo definir a região de emulsão O/A para posterior

caracterização.


57

FIGURA 11 - Diagrama pseudoternário contendo água purificada como FA, óleo de soja como FO

e a associação dos tensoativos Tween® 80 + Span

® 80 (Tw80 + Sp80). As áreas delimitadas

representam: SEOB (Sistema Emulsionado Opaco Branco), ST (Sistema Translúcido), SEOA

(Sistema Emulsionado Opaco Amarelo) e SF (Separação de Fases).

A construção do diagrama de fases é importante, pois com ela é possível

prever o comportamento de fases dos sistemas quando seus constituintes são

alterados. Como observado na Figura 11, cada área demarcada corresponde a

pontos no diagrama que representam uma forma de organização diferente do

sistema, detectada visualmente após cada titulação. A região SEOB corresponde

a área onde houve a formação de sistema opaco branco o que pode indicar,

devido a concentração de cada componente, a formação de sistemas

emulsionados do tipo O/A; a área ST refere-se à presença de sistemas

translúcidos, o que indica a possível formação de sistemas

micro/nanoemulsionados; e, a região SF corresponde à área com ocorrência de

separação de fases. Ainda nessa figura, pode ser observado o predomínio da

região SEOA, o que indica a possível formação de sistemas emulsionados do tipo

A/O, devido à alta concentração de FO, e/ou à formação de sistemas

emulsionados do tipo O/A, que foram caracterizados com uma coloração amarela,

devido à alta quantidade de tensoativos.


58

No diagrama observou-se que a região de emulsões O/A foi formada em

altas concentrações de água (acima de 45%). A região de ST se encontra em

altas concentrações tensoativos (30 a 75%) e em concentrações intermediárias

de água e óleo. Com o par de tensoativos em estudo, Tween® 80 e Span® 80, foi

possível obter sistemas homogêneos com concentrações de óleo abaixo de 75%.

Foi observada também uma região de separação de fases, onde a proporção dos

tensoativos é baixa, não sendo suficiente para a estabilização do sistema.

Por meio do diagrama, a região SEOB foi estudada selecionando-se pontos

conforme Figura 12.

FIGURA 12 – Pontos selecionados na região SEOB do diagrama pseudoternário.

A construção do diagrama pseudoternário mostrou que é possível se obter

emulsões do tipo O/A com as concentrações de 5% de tensoativos, 10% de óleo

de soja e 85% de água purificada (ponto B, Figura 12). Portanto, essas

concentrações foram as padronizadas para a realização dos demais estudos. Os

demais pontos serão abordados no decorrer da discussão.

Emulsões estáveis são melhor formuladas com tensoativos os quais

possuam valores de EHL próximo ao do chamado EHL requerido da fase oleosa

usada. No entanto, não só o valor EHL, mas também o tipo de emulsionante

químico pode influenciar na estabilidade das emulsões (SCHMIDTS et al., 2010).

Dessa forma, foi realizado o estudo seguinte.


59

5.2.2 Efeito dos cotensoativos na estabilidade acelerada da emulsão óleo de

soja/água

Os estudos de estabilidade preliminar consistem na realização dos testes

da fase inicial do desenvolvimento do produto, utilizando diferentes formulações

com durações reduzidas (30 dias). É um estudo planejado para acelerar a

degradação química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em

condições forçadas de armazenamento, sendo empregadas condições extremas

de temperatura. Pelas condições em que é conduzido, o estudo não tem

finalidade de estimar a vida útil do produto, mas auxiliar a triagem das

formulações (BRASIL, 2004; CASTELI 2008; BONTORIM, 2009).

Vários fatores podem comprometer a estabilidade físico-química e

microbiológica de um sistema emulsionado: a escolha de constituintes

incompatíveis, tipo e concentração de emulsificantes, velocidade de agitação,

tempo de aquecimento e arrefecimento, quantidades das fases, temperatura e

ambiente de estocagem e contaminação por microrganismos (ALVAREZ et al.

2007; PIANOVSKI et al, 2008).

O ensaio foi realizado em um período de 30 dias avaliando a estabilidade

da emulsão na presença ou ausência de cotensoativos, no caso, álcool etílico e

álcool benzílico. Os parâmetros avaliados foram índice de cremagem, turbidez,

pH e condutividade elétrica. Os valores obtidos para o índice de cremagem e

turbidez estão apresentados na Figura 13.

De acordo com a Figura 13-A, a análise do índice de cremagem das

emulsões obtidas permitiu inferir que não houve mudanças na estabilidade dos

sistemas quando adicionado álcool etílico como cotensoativo em diferentes

concentrações, os valores para tal ficaram entre 10-20%. A análise estatística dos

valores corroborou com os resultados não havendo diferença estatística

significante [F (3,12) = 0,214 (p = 0,885)]. Verificou-se que durante todo o estudo,

as emulsões apresentaram-se branco leitosas.


60

FIGURA 13 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de IC e turbidez das emulsões durante

30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como cotensoativos.

Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ● 0,05:1, ▲ 0,1:1, e

■ 0,15:1.

Por meio da Figura 13-B, observa-se que houve um ligeiro aumento do

índice de cremagem, com o passar do tempo, nas emulsões onde houve a adição

de álcool benzílico Esses valores apresentaram diferenças estatísticas

significantes (ANOVA one-way e Dunnet pós-teste). É interessante a análise dos

próximos parâmetros para sugerir se o álcool benzílico interfiriu na estabilidade do

sistema.

Esses resultados podem ser atribuídos à natureza menos polar do etanol

(constante dielétrica em torno de 24) em relação ao álcool benzílico, que favorece

uma possível localização na interface, sendo as interações ocasionadas tanto por

ligações de hidrogênio quanto por interações hidrofóbicas. Indicando que o álcool

etílico favorece a uma maior estabilização da vesícula emulsionada. Este

cotensoativo é organizado com seu grupo OH localizado entre o grupo polar dos

A’ B’

A B


61

tensoativos e as moléculas de água e seu grupo apolar localizado entre as

cadeias apolares dos tensoativos. No entanto, todas as moléculas de álcool etílico

não residem apenas dentro da região interfacial, uma fração encontra-se

distribuida entre as fases de óleo e da água de acordo com sua solubilidade

relativa (RESENDE et al., 2008; WIA CEK, 2012).

Sabe-se que um aumento nos valores de índice de cremagem durante um

estudo de estabilidade é ocasionado pelo aumento das forças de interação entre

as gotículas dispersas resultantes da diminuição da repulsão eletrostática, ou

devido à fragilidade do filme interfacial responsável pela estabilização estérica em

emulsões não iônicas (LACHMAN, LIEBERMAN & KANIG, 2001; CAPEK, 2004).

Dessa forma, a análise desse parâmetro indica que o álcool benzílico não

contribuiu para a estabilização do filme interfacial das emulsões.

Além da análise de IC, a estabilidade ao longo do tempo foi também

avaliada pela turbidez, pH e pela condutividade elétrica. Na turbidimetria, também

conhecida por opacimetria, mede-se a intensidade da luz transmitida no mesmo

sentido da luz incidente. Embora existam turbidímetros destinados

especificamente à medida de turbidez, colorímetros e espectrofotômetros

convencionais são satisfatórios para medida da luz transmitida, desde que

ajustados para comprimento de onda apropriado (FARMACOPÉIA BRASILEIRA,

2010).

Analisando-se os dados obtidos na turbidimetria, observa-se que não

houve modificações dos valores de turbidez para as formulações que utilizaram

álcool etílico como cotensoativo (Figura 13-A’). Sendo que estas não

apresentaram diferenças estatísticas significantes ([F (3,12) = 2,269, (p = 0,133)]),

durante os 30 dias, em diferentes tempos e temperaturas. Este resultado

corrobora com o obtido para índice de cremagem, uma vez que não foi observado

alterações acentuadas nos valores durante os 30 dias de estudo.

Na Figura 13-B’, é possível observar que a adição do álcool benzílico não

alterou o valor da turbidez das emulsões quando adicionado em diferentes

concentrações. Quando analisados estatisticamente não apresentaram diferenças

significantes ([F (3,12) = 1,284, (p = 0,324)]). Para esse parâmetro, permitiu-se

inferir que o cotensoativo em estudo não promoveu modificação na estabilidade

das emulsões. Se as modificações que o sistema sofre durante o período de


62

análise são mínimas, este sistema pode ser considerado como cineticamente

estável, mesmo que se torne instável num período de tempo mais prolongado

(LACHMAN, LIEBERMAN & KANIG, 2001).

Por meio das medidas de pH (Figura 14) é possível presumir alterações na

estrutura do sistema, como oxidação, que nem sempre são visualmente

detectáveis. As avaliações físico-químicas permitem ao detectar futuros

problemas que podem afetar a estabilidade e a qualidade do seu produto

(BRASIL, 2004; BONTORIM, 2009). A diminuição do pH pode representar uma

oxidação da fase de óleo com a formação de hidroperóxidos ou a hidrólise de

triglicéridos que conduz à formação de ácidos graxos (MASMOUDI et al., 2005;

FORMIGA et al., 2007).

O valor de condutividade também foi determinado (Figura 14), pois

alterações em tal valor permitem a detecção de cremagem, sedimentação ou

inversão de fases. Esta técnica é muito utilizada para verificar a integridade da

fase interna, visto que esta é dependente da natureza da fase externa da

formulação (FERRARI, 1998). A condutividade é frequentemente utilizada para

determinar a natureza da emulsão (O/A ou A/O) e para controlar a sua

estabilidade durante o período de armazenagem. Através desse método é

possível avaliar a variação no conteudo de água livre do sistema emulsionado e,

desta maneira, identificar mudanças estruturais que possam ocorrer (CASTELI,

2008; MASMOUDI et al., 2005; MASSON, 2005).

Dessa forma, o pH e a condutividade das quatro diferentes emulsões com

diferentes proporções de cotensoativos foi medido (Figura 14).

Como mostrado na Figura 14-A, o valor de pH, para as emulsões onde

utilizou-se alcool etilico como cotensoativo, permaneceu constante durante os

trinta dias de estudo não apresentando diferenças estatísticas significantes [F

(3,12) = 0,784, (p = 0,526)], indicando que o etanol não promoveu alteração na

estabilidade química da fase oleosa, uma vez que esse álcool encontra-se na

interface da vesícula emulsionada (RESENDE et al., 2008; WIA CEK, 2012).


63

FIGURA 14 - Gráficos correspondentes aos valores obtidos de pH e condutividade das emulsões

durante 30 dias de estudo utilizando álcool etílico (A e A’) e álcool benzílico (B e B’) como

cotensoativos. Sendo que ○ corresponde à emulsão 0:1 (razão de cotensoativo : tensoativo), ●

0,05:1, ▲ 0,1:1, e ■ 0,15:1.

Com a adição do álcool benzílico à formulação (Figura 14-B), houve uma

redução gradativa dos valores do pH, a partir do sétimo dia de estudo. As

diferenças entre os valores de pH para as quatro emulsões da Figura 14-B foram

estatisticamente significantes (ANOVA one-way e Dunnet pós teste) em relação

ao grupo controle.

Tais resultados podem ser atribuídos a uma provável hidrólise parcial do

óleo de soja gerando ácidos graxos na FO. Este fato é comum em sistemas

emulsionados lipídicos (FORMIGA et al., 2007), uma vez que, devido à presença

do anel aromático na estrutura do álcool benzílico, não houve uma boa inserção

deste álcool junto aos tensoativos contribuindo, assim, para uma desestabilização

da vesícula emulsionada e uma provável exposição da FO às moléculas de água

(ZHANG et al., 2000). Atribui-se também, esta diminuição nos valores de pH, a

ocorrência de uma oxidação do álcool benzílico transformando-o em ácido

A’ B’

A B


64

benzóico, tanto que esse composto é amplamente utilizado em formulações

farmacêuticas como agente antioxidante (MAULA, WESTERLUND, SLOTTE,

2009).

Os valores para condutividade variaram de 34,98 a 79,69 µS/cm para o

álcool benzílico e 33,58 a 74,56 µS/cm para o álcool etílico. Esses altos valores

encontrados confirmam que as emulsões são do tipo O/A (FUJII, OKADA &

FURUZONO, 2007).

Tanto para as quatro formulações da Figura 14-A’ quanto para as

formulações da Figura 14-B’ não houve diferenças estatisticamente significantes

([F (3,12) = 0,626, (p = 0,608)]) e ([F (3,12) = 1,361, (p = 0,290)]),

respectivamente, durante os 30 dias de estudo, em diferentes tempos e

temperaturas, sugerindo-se que não houve modificações na estruturação dos

sistemas (MASMOUDI et al., 2005; CASTELI, 2008). Masmoudi e colaboradores

(2005) relataram que é dificil avaliar a estabilidade de emulsões somente pela

condutividade elétrica, porque não há uma relação linear entre o aumento da

condutividade elétrica e o fenômeno de instabilidade.

O presente estudo permitiu estabelecer que os cotensoativos escolhidos

não levaram ao aumento na estabilidade física ou química dos sistemas. Ao

contrário do que ocorreu com o álcool benzílico, não ocorreu nenhum efeito

negativo na presença do álcool etílico, quando levado em conta os resultados

obtidos para o índice de cremagem, turbidez, pH e condutividade elétrica, o que

possibilita o seu uso na formulação na tentativa de aumentar a eficiência de

incorporação do fármaco.

5.3. ESTUDO DE INCORPORAÇÃO DO FÁRMACO

5.3.1 Escolha do método de incorporação

De acordo com a metodologia utilizada, o PRZ foi adicionado em excesso

às emulsões por meio de dois métodos diferentes: no primeiro, o fármaco foi

adicionado diretamente na fase oleosa da emulsão (TIF) no momento da inversão

de fases; e, em um segundo método, o fármaco foi adicionado diretamente na


65

emulsão pronta (EF). Em seguida, foram feitas soluções com essas emulsões e

submetidas à leitura no espectrofotômetro a 264 nm (comprimento de onda

selecionado e validado para análise quantitativa do PRZ). A solubilidade do

fármaco foi determinada por meio da equação da reta obtida pela análise de

regressão linear da curva de calibração (y = 1,1912x + 0,0993). Os resultados

encontram-se na Tabela 6.

TABELA 6 – Porcentagem de PRZ incorporado em emulsão por dois métodos diferentes.

Tipo de incorporação

% do PRZ na emulsão Média ± Desvio

padrão N1 N2 N3

EF 0,755 0,776 0,769 0,766 ± 0,011

TIF 0,898 0,900 0,887 0,895 ± 0,007*

*Diferença estatística TA x FO: t valor = -17,393; P = < 0,001

O estudo permitiu observar que o método de incorporação do fármaco na

fase oleosa da emulsão (TIF) incorpora uma maior quantidade de fármaco (0,895

± 0,007%) quando comparado ao método de adição do fármaco na emulsão a frio

(EF) (0,766 ± 0,011%). Esse resultado deve-se, provavelmente, ao fato de a

energia necessária para o PRZ ser solubilizado na fase oleosa ser menor do que

a energia necessária para o fármaco ser incorporado nas vesículas emulsionadas,

uma vez que as emulsões comportam-se como sistemas reservatórios, onde as

vesículas emulsionadas encontram-se separadas do meio por uma interface,

assim o fármaco deve transpor essa barreira para então ser solubilizado

(OLIVEIRA et al., 2004). Dessa forma, há uma facilidade maior em solubilizar o

fármaco antes do momento da inversão de fases do que na emulsão pronta, como

já era esperado, uma vez que o PRZ apresenta maior afinidade pela FO.

Pestana e colaboradores (2008), estudando o comportamento da

Anfotericina B em sistemas emulsionados O/A, observaram que fármacos neutros

interagem fortemente com a fase interna do sistema por meio de um efeito

hidrófobo, sendo típico da sua incorporação em agregados supramoleculares

como micelas.

C. Washington (1996), para fins de formulação de emulsão, classificou

fármacos com base em suas características de solubilidade e as suas

propriedades de ionização, as quais não são completamente independentes.


66

Fármacos da Classe II do Sistema de Classificação Biofarmacêutica são

predominantemente solúveis em óleo, dessa forma, em uma emulsão O/A seria

particionado preferencialmente para a fase oleosa. Tais materiais são bons

candidatos para serem incorporados em emulsão e pode normalmente ser

formulado por dissolução do fármaco no óleo antes da emulsificação. No entanto,

é interessante destacar que a solubilidade do fármaco na fase interna depende

das interações com este solvente, a qual muitas vezes não está relacionada

apenas com suas propriedades físico-químicas como o coeficiente de partição.

A solubilidade aquosa do PRZ descrito na literatura é 0,4 mg/mL

(LINDENBERG, KOPP & DREESMAN, 2004). No entanto, em nosso laboratório

foi encontrado o valor analítico de 0,2 mg/mL, para tanto o método da TIF

aumentou em 44,75 vezes a fração solúvel do fármaco, enquanto que o método

de incorporação por EF aumentou em 38,3 vezes, o que demonstra o potencial

destes sistemas.

5.3.2 Efeito do etanol na incorporação do PRZ na emulsão

Uma vez que foi demonstrado que o etanol, quando utilizado como

cotensoativo, não afetou a estabilidade da emulsão em estudo, foi proposta a

análise do efeito deste cotensoativo na incorporação do PRZ, ou seja, se tal

álcool influenciaria na quantidade de fármaco solubilizado no sistema.

A Tabela 7 apresenta os valores encontrados para o estudo da

incorporação do fármaco na emulsão simples e na emulsão com adição de etanol

como cotensoativo, utilizando o método de adição de PRZ na fase oleosa da

emulsão (TIF).

TABELA 7 - Resultado do teste para incorporação do PRZ em emulsões diferentes.

Tipo de emulsão % do PRZ na emulsão

Média ± Desvio padrão N1 N2 N3

Emulsão simples 0,898 0,900 0,887 0,895 ± 0,007

Emulsão com

etanol 0,751 0,779 0,807 0,779 ± 0,028


67

Como mostrado na Tabela 7, observa-se que houve diferença estatística

significante entre os valores de teor de PRZ entre a emulsão simples e a emulsão

com o cotensoativo (t valor = 6,961; p = 0,002). Por meio desse resultado,

percebe-se que a adição do álcool etílico à emulsão não contribuiu para um

aumento da concentração de fármaco incorporado.


EMULSÃO

5.4.1 Efeito do fármaco nas propriedades físico-químicas dos sistemas

Avaliando o aspecto de fluidez vertendo-se os tubos que continham as

emulsões, observou-se que à medida que o PRZ era adicionado ao sistema,

havia um aumento relativo da viscosidade. Dessa forma, um estudo foi planejado

com o objetivo de avaliar a interação do PRZ com os demais componentes da

formulação. Para tanto, o estudo foi baseado nas diferenças de concentração dos

constituintes nas formulações quanto à fase oleosa, quanto à concentração dos

tensoativos (pontos A, B, C, D, E, F e G da Figura 12) e quanto à concentração do

fármaco.

Para todos os grupos de formulações os parâmetros analisados foram pH,

turbidez, condutividade elétrica, índice de refração, diâmetro médio da gotícula e

potencial zeta. Parâmetros esses importantes como técnicas de caracterização

física dos sistemas (CONSTANTINIDES et al., 1995; FORMARIZ, et al., 2005).

Adicionalmente, foi realizada a incorporação de PRZ no primeiro e no segundo

grupo de formulação.

O fenômeno de dispersão da luz pelas emulsões pode ser avaliado de

maneira eficiente através da técnica de espalhamento de luz dinâmico (Dynamic

Light Scattering), a qual fornece informações diretas sobre o movimento

translacional das gotículas da emulsão e permite o cálculo do tamanho da

gotícula através de relações teóricas fundamentadas no movimento Browniano

das gotículas em dispersão, sendo o coeficiente de difusão das gotículas no meio

o principal parâmetro levado em consideração (FORMARIZ et al., 2005). O índice


68

de polidispersão fornece informações sobre a homogeneidade da distribuição dos

tamanhos das gotículas (NEMEN & LEMOS-SENNA, 2011). Já a técnica do

índice de refração corresponde a uma relação entre a velocidade da luz no vácuo

pela velocidade da luz no meio, no caso a emulsão.

A maioria das partículas em contato com um líquido adquire uma carga

elétrica na sua superfície, este potencial elétrico é chamado de potencial zeta e é

influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da

dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de

espécies iônicas presentes no meio aquoso de dispersão (HEURTAULT et al.,

2003; SCHAFFAZICK et al., 2003). A medida de potencial zeta pode ser utilizada

para prever a estabilidade físico-química de suspensões e emulsões coloidais. De

acordo com a teoria DLVO, a fronteira entre emulsões estáveis é considerada

como sendo o valor de potencial zeta de ± 30 mV (WANG et al., 2006). Sendo

assim, emulsões com valores acima de +30 mV, bem como com valores inferiores

a -30 mV são consideradas estáveis. Já emulsões com valores entre -30 e +30

mV são instáveis, sendo o valor de 0 mV como o de maior instabilidade, o

chamado ponto isoelétrico. Evidentemente essa não é uma regra, considerando

que partículas também podem ser preparadas com materiais que proporcionam

um impedimento estérico que desfavorece fenômenos de agregação.

Na Figura 15, encontram-se os resultados para as análises de diâmetro da

gotícula, turbidez e índice de refração para o primeiro grupo de sistema

emulsionado (Tabela 2). A análise do diâmetro médio da gotícula, assim como o

índice de refração foram realizadas em associação com a turbidez, para que as

três metodologias em conjunto pudessem oferecer maiores informações a

respeito da caracterização das emulsões.


69


óleo de soja (FO) no meio.

O aumento dos valores da turbidez, do diâmetro hidrodinâmico e do índice

de refração em relação à FO (Figura 15), pode ser explicado pelo fato de que se

elevando a quantidade de fase oleosa para uma quantidade fixa de tensoativos,

haverá um aumento do número e do tamanho dessas gotículas, resultado esse

comprovado pelas fotomicrografias dos sistemas (Figura 16). O aumento no

diâmetro médio das gotículas em função do aumento da FO foi também

observado por Pestana e colaboradores (2008).

Esse resultado deve-se a quantidade de tensoativos para recobrir aquela

gotícula de óleo ser fixa, dessa forma a vesícula emulsionada tende a aumentar

de tamanho para que a área interfacial do meio permaneça a mesma. Assim, se

aumentasse ainda mais a quantidade de FO para uma mesma quantidade de

tensoativos a emulsão provavelmente apresentaria indícios de instabilidade (HSU,

NACU, 2003).

O aumento da quantidade e do tamanho das gotículas ofereceu resistência

à passagem da luz nas análises de turbidez e índice de refração (Figura 15) o que

justifica o aumento progressivo para ambos os valores. Além de que para o índice

de refração, a organização das microgotículas na fase interna da emulsão refrata


70

mais luz do que a água destilada, isto pode ser constatado pelo maior índice de

refração do óleo (1,470) do que da água (1,3321) (RESENDE et al., 2008).

Havendo uma redução da quantidade de fase aquosa nas formulações haverá um

aumento do índice de refração, tornado-o mais próximo do índice de refração do

óleo de soja.

A Figura 16 representa a avaliação microscópica de cada emulsão do

primeiro grupo de formulação.

FIGURA 16 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de óleo de

soja (FO) no meio (aumento de 400x).

A análise microscópica das formulações (Figura 16) revelou um

crescimento do diâmetro dos glóbulos proporcional à quantidade de óleo no

sistema, confirmando o resultado encontrado na determinação do diâmetro da

gotícula encontrado pela técnica de espalhamento de luz. Para as amostras de

10, 20 e 30% de FO os glóbulos encontram-se, floculados, com distribuição

heterogênea de tamanho.

Dessa maneira, para esse primeiro grupo de formulação, os dados das

Figuras (15 e 16) sugerem que com o aumento da proporção de fase oleosa, a

mistura de tensoativos torna-se cada vez mais ineficaz na diminuição da tensão

5% 10%

20% 30%


71

interfacial. Assim, a curvatura do filme interfacial não se faz suficiente para

conferir as gotículas da fase interna tamanhos diminutos e as mesmas acabam

por assumir um tamanho maior.

Na Figura 17, encontram-se os resultados dos parâmetros analisados para

o primeiro grupo de formulação: pH, condutividade elétrica e potencial zeta.

FIGURA 17 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de óleo de

soja (FO) no meio

Analisando a Figura 17 é possível perceber que os valores de pH, potencial

zeta e condutividade diminuíram, o que pode indicar que houve ou uma redução

de cargas no meio ou que houve uma diminuição da condutividade à medida que

houve aumento da FO.

A redução do valor do pH de 7,01 para 5,60 pode ter ocorrido devido a um

aumento proporcional da presença de ácidos graxos solúveis decorrentes da

hidrólise da FO (FORMIGA et al., 2007), uma vez que nas formulações não foi

adicionado agentes antioxidantes (RODRIGUES et al., 2012).

O parâmetro mais influente no potencial zeta é o pH, considerando que o

pH do colóide pode fornecer informações quanto a cargas positivas ou negativas

que irão interagir com as partículas. No caso, o pH diminuiu indicando que houve

um aumento de H + no meio promovendo assim uma consequente diminuição do


72

potencial zeta de |-33,09| a |-15,01|. O valor negativo significa que as vesículas

apresentam superfície externa com predominância de cargas negativas. Além do

impedimento estérico dos tensoativos, pode-se inferir que esse fator proporciona

uma proteção iônica às partículas e desta forma, quando uma partícula em

difusão encontra outra na emulsão, ambas se auto-repelem devido à carga

superficial.

Os estudos que relacionam análise de potencial zeta e pH de emulsões

demonstram que geralmente, o potencial Zeta tende a se tornar mais negativo

com o aumento do pH (WASHINGTON, 1996; WIACEK & CHIBOWSKI, 1999;

WIACEK & CHIBOWSKI, 2002) o que corresponde ao resultado encontrado para

esses parâmetros.

Avaliando o parâmetro de condutividade elétrica (Figura 17), observou-se

também uma diminuição de 74,60 para 40,51 µS/cm. O óleo de soja não é um

bom condutor de eletricidade (0,5 µS/cm) e se houvesse um aumento da

quantidade de FO na emulsão, esse sistema mudaria de fase interna (CASTELLI,

2008). O mecanismo sugerido para a condução elétrica na água, conforme

proposta de Agmon (1995), é que há transferência de próton entre duas

moléculas de água vizinhas quando uma molécula tem posição que permite que

uma ligação de hidrogênio -O-H O- se transforme em uma ligação -H H-O- ,

como houve uma redução da quantidade de fase aquosa à medida que se

aumentou a massa de fase oleosa, contribuiu-se também para uma redução dos

valores de condutividade elétrica (DJORDJEVIC et al., 2004).

A análise da Figura 18, que apresenta os resultados para teor de fármaco

incorporado nesse grupo de formulação, permite inferir que a concentração de

PRZ dissolvido foi notavelmente aumentada pela adição de FO, aumentando

provavelmente até um patamar de alta proporção deste componente. Estas

características demonstram claramente que o PRZ (fármaco da Classe II do

Sistema de Classificação Biofarmacêutica) interage com a fase interna (óleo de

soja) do sistema através de um efeito hidrófobo (WASHINGTON, 1996).


73

FIGURA 18 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de óleo

de soja (FO) no meio.

A estabilização de emulsões pelo uso de tensoativos não-iônicos se faz

através de impedimento estérico e ligações de hidrogênio. A porção apolar do

tensoativo se insere nas gotículas de óleo e os grupos de óxido de etileno na fase

aquosa. Os grupos de óxido de etileno causam impedimento estérico que inibe as

gotículas de óleo sofrerem colisão e coalescer, além de formarem ligações de

hidrogênio com a água (FOX, 1986; SILVA & SOARES, 1996; GULLAPALLI &

SHETH, 1999). Entretanto, a estabilização de emulsões pode também ser obtida

usando concentração mais elevada de agentes emulsificantes, pois isso resultará

num filme ao redor das gotículas de óleo mais firme e compacto reduzindo a

coalescência (FOX, 1986).

Na Figura 19, encontram-se os resultados das análises de diâmetro

hidrodinâmico, turbidez e índice de refração para o segundo grupo de sistemas

emulsionados (Tabela 2), quando foi variada a quantidade de tensoativos (T).


74


tensoativos no meio.

No processo de emulsificação as moléculas do tensoativo interagem com

as gotículas de óleo e entre si durante a etapa de homogeneização de modo a

formar uma interface em torno dos glóbulos que protela processos como

floculação e coalescência (FLORENCE & ATTWOOD, 2003).

Analisando os resultados (Figura 19) encontrados para turbidez, índice de

refração e diâmetro médio hidrodinâmico, sugere-se que o excesso de

tensoativos no meio foi adsorvido na interface óleo-água levando a uma redução

do tamanho da gotícula, devido ao aumento da área interfacial do tensoativo e

diminuição na tensão interfacial do sistema (TADROS et al., 2004).

Consequentemente, elevaram-se os valores do índice de refração e da turbidez

uma vez que se acentuou o numero de gotículas e um crescimento proporcional

da viscosidade das emulsões indicando maior estruturação do sistema.


segundo grupo de formulações.


75

FIGURA 20 – Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de tensoativos no meio (aumento de 400x).

As fotomicrografias (Figura 20) apresentaram, de maneira geral, diminuição

no tamanho dos glóbulos conforme aumento na concentração de tensoativo,

confirmando o resultado encontrado na determinação do diâmetro da gotícula

encontrado pela técnica de espalhamento de luz. Este foi um resultado esperado

e vastamente descrito na literatura (TADROS et al., 2004; FERNANDEZ et al.,

2004; IZQUIERDO et al., 2005; LIU et al., 2006; PESTANA, et al., 2008). As

amostras de 1, 2,5 e 5% de tensoativos apresentam glóbulos com distribuição

heterogênea de tamanho.

Na Figura 21 encontram-se os resultados encontrados para pH,

condutividade elétrica e potencial zeta do segundo grupo de formulações.

1% 2,5%

5% 10%


76

FIGURA 21 - Potencial zeta, condutividade elétrica e pH em função da concentração de


Os resultados apresentados na Figura 21, mostram que com um aumento

dos tensoativos no sistema houve uma leve alteração do valor do pH (5,58 a

5,82), um aumento da condutividade (29,51 a 87,35 µS/cm), e uma redução do

potencial zeta. Os valores do pH não apresentaram diferença estatística

significantes [F (3,8) = 1,636 (p = 0,257)], indicando que a quantidade de

tensoativos no meio não influenciou no valor desse parâmetro.

Analisando os resultados encontrados para tais parâmetros, permite-se

inferir que o uso de tensoativo não iônico (Tween® 80 e Span® 80) resulta na

formação da dupla camada elétrica ao redor da gotícula dispersa. Essa maior

estabilização da fase interna pode impedir uma maior interação dos ácidos graxos

na interface com a fase aquosa, o que levou a redução do potencial zeta.

Segundo a literatura, tal observação se deve ao pH e à força iônica da fase

aquosa. A carga elétrica mensurada em emulsões estabilizadas com tensoativos

não iônicos tem sido atribuída à adsorção dos íons H3O+ (em pH baixo) ou OH-

(em pH alto) da água (FRANGE & GARCIA, 2009), o que pode indicar possíveis

alterações na estruturação do sistema (ZHANG & MICHNIAK-KOHN, 2011).


77

A Figura 22 apresenta os resultados encontrados para teor de fármaco

incorporado nesse grupo de formulação.

FIGURA 22 - Quantidade de PRZ incorporado nas emulsões em função da concentração de


É possível observar, por meio da Figura 22, que à medida que se

aumentou a quantidade de tensoativos no meio, houve um aumento da

quantidade de PRZ incorporado. Isso porque, conforme mostrado nas Figuras 19

e 20, sugere-se que o excesso de tensoativos no meio foi adsorvido na interface

óleo-água levando a um aumento da área interfacial das gotículas (TADROS et

al., 2004), proporcionando assim a possibilidade de se incorporar uma maior

quantidade de fármaco. Isto demonstra que o fármaco possui não somente uma

boa interação com a fase interna, mas também com a interface.

Na Figura 23, encontram-se os resultados do efeito da quantidade de

fármaco nos parâmetros de diâmetro hidrodinâmico, turbidez e índice de refração

para o terceiro grupo de formulações de sistemas emulsionados (Tabela 2).


78


PRZ no meio.

Analisando a Figura 23 é possível perceber que à medida que se aumentou

a quantidade de PRZ incorporado às emulsões houve uma diminuição do

diâmetro médio das gotículas e um crescimento dos valores de índice de refração

e de turbidez. Esse resultado pode ter ocorrido devido a alta solubilidade do PRZ

tanto na FO quanto também nos tensoativos o que acarretou com que o fármaco

tivesse uma localização inicialmente no interior da gotícula devido a sua

hidrofobicidade e com o aumento da concentração do PRZ no meio, esse passou

a se localizar na interface da gotícula, competindo com os tensoativos,

acarretando na diminuição do tamanho devido a um aumento da área interfacial

dessas gotículas.

A maior interação do fármaco na interface ficou comprovada com este

resultado. Este fenômeno pode fazer com que o fármaco atue como um

cotensoativo ou atue deslocando as moléculas de tensoativos aumentando assim

a concentração aparente dessas moléculas no meio. Isto explica a diminuição do

tamanho de gotículas.


terceiro grupo de formulação.


79

FIGURA 24 - Fotomicrografias dos sistemas emulsionados em função da concentração de PRZ no meio (aumento de 400x).

A análise microscópica das formulações (Figura 24) revelou uma

diminuição do diâmetro dos glóbulos proporcional à quantidade de PRZ no

sistema, confirmando o resultado encontrado na determinação do diâmetro da

gotícula encontrado pela técnica de espalhamento de luz (Figura 23).

Na Figura 25, encontram-se os resultados encontrados para pH,

condutividade elétrica e potencial zeta do terceiro grupo de formulação.

FIGURA 25 - Valores correspondentes ao potencial zeta, à condutividade elétrica e ao pH versus à

variação de PRZ no meio.

0% 0,125%

0,75% 1,0%

0,25%

0,50%


80

Por meio da Figura 25, é possível observar que está havendo uma

mudança de cargas quando a concentração do PRZ está entre 0,125 e 0,5%

sendo, provavelmente, este o intervalo de concentração que o fármaco satura a

FO e parte para a interface da vesícula emulsionada.

Não foi observada uma tendência em toda a faixa de concentração de

fármaco estudada, mas sim uma inflexão depois de 0,5%, o que potencialmente

indica uma mudança relevante da estrutura do sistema coloidal. Para investigar

isso, as amostras foram submetidas ao estudo reológico.

Analisando-se os valores para potencial Zeta observou-se diferenças

estatísticas significantes (ANOVA one-way, Dunnet pós-teste).

Na Tabela 8 encontram-se os resultados encontrados para índice de

polidispersidade das emulsões.

TABELA 8 – Valores correspondentes aos índices de polidispersão das diferentes emulsões em

estudo.

Índice de polidispersão

1º Grupo 2º Grupo 3º Grupo

FO 5% 0,323 ±

0,018 T 1% 0,376 ± 0,006 PRZ 0,125% 0,321 ± 0,018

FO 10% 0,338 ± 0,021 T 2,5% 0,345 ± 0,014 PRZ 0,25% 0,318 ± 0,026

FO 20% 0,315 ± 0,008 T 5% 0,332 ± 0,030 PRZ 0,5% 0,319 ± 0,021

FO 30% 0,291 ± 0,017 T 10% 0,330 ± 0,013 PRZ 0,75% 0,328 ± 0,015

- - - - PRZ 1% 0,312 ± 0,037

Em geral, os índices de polidispersão observados (Tabela 8) para as

emulsões obtidas (1º, 2º e 3º grupo) foram acima de 0,300, sendo este um

indicativo que as formulações estudadas são sistemas polidispersos (NEMEN &

LEMOS-SENNA, 2011). Esta característica pode também ser observada pelas

fotomicrografias das emulsões (Figuras 16, 20 e 24).

A reologia consiste no estudo do escoamento ou deformação do material

em estudo quando submetido a uma tensão. Este método é aplicável na

caracterização de sistemas emulsionados, pois o comportamento do fluido está

relacionado com o tipo e grau de organização do sistema. Também pode ser

empregado para checar a qualidade durante o processo de produção, além de

permitir o estudo do efeito de aditivos na formulação (MACHADO, 2002;

FORMARIZ et al., 2005).


81

Dessa forma, o estudo do comportamento reológico dos sistemas aplicado

ao modelo matemático de Herschel-Bulkley está apresentado na Tabela 9.

TABELA 9 - Valores correspondentes ao índice de comportamento (n), coeficiente de correlação

linear (r), tensão de cisalhamento inicial (τ0) e o índice de consistência (K) para cada sistema

emulsionado.

Grupo de formulações n r τ0 K

1º

FO 5% 1,146 0,991 0,020 0,001

FO 10% 1,020 0,991 0,004 0,002

FO 20% 1,009 0,998 0,004 0,003

FO 30% 0,992 0,999 0,543 0,005

2º

T 1% 1,617 0,943 0,048 0,001

T 2,5% 1,879 0,956 0,059 0,001

T 5% 1,020 0,991 0,004 0,002

T 10% 1,030 0,999 0,011 0,003

3º

PRZ 0,125% 1,167 0,988 0,021 0,001

PRZ 0,250% 1,148 0,991 0,020 0,001

PRZ 0,500% 1,083 0,991 0,011 0,001

PRZ 0,750% 0,747 0,759 0,708 0,056

PRZ 1,0% 0,532 0,907 0,158 0,164

O modelo matemático que mais se adequou ao comportamento dos

sistemas foi a equação de Herschel-Bulkley, isso pode ser notado pelo valor de r

que está próximo a 1. Por meio desse modelo matemático, foi possível extrair os

valores de K (índice de consistência) que indica o grau de resistência do fluido

diante do escoamento. Para todos os sistemas os valores de K estiveram abaixo

de 1, indicando que não há resistência ao fluxo. Foi possível extrair também o

valor de n, que para todas as amostras, está próximo a 1, indicando que os

sistemas possuem comportamento de fluidos newtonianos. No entanto, as

amostras contendo 0,75 e 1,0 % de fármaco apresentaram valores característicos

de fluido pseudoplástico, confirmando a hipótese antes levantada nos resultados

apresentados na Figura 26.

Os dados da Tabela 9 mostram que os valores de n para as EM contendo

PRZ na concentração de 0,75 e 1,0 % são menores do que 1, indicando que


82

estes sistemas apresentam comportamento pseudoplástico. O grau de

“pseudoplasticidade” pode ser medido pelo comportamento de fluxo (n) que

aumenta com a diminuição da pseudoplasticidade. Assim, de maneira geral, à

medida que aumenta a quantidade de PRZ no sistema, o grau de

pseudoplasticidade torna-se maior.

Por meio do modelo matemático utilizado também foi possível extrair o

valor de τ0 que indica a tensão de cisalhamento inicial necessária para que o

escoamento ocorra. Para todos os sistemas o valor da tensão de cisalhamento

ficou abaixo de 1, confirmando que esses sistemas não apresentam resistência

ao fluxo.

Analisando os resultados dos índices de consistência (K) mostrados na

Tabela 9, observa-se que, para os três grupos de formulações, tal parâmetro

apresenta um leve aumento à medida que há um aumento de cada constituinte no

sistema.

Como já era esperado para o primeiro grupo, uma vez aumentando-se a

fase oleosa, aumenta-se também a quantidade e o tamanho das gotículas no

meio. Correa e colaboradores (2005) mostraram que a viscosidade aparente de

sistemas microemulsionados e emulsionados é dependente do volume de fase e

da natureza da fase oleosa, visto que o aumento do volume de fase interna

oleosa provocou aumento da viscosidade aparente. Este comportamento foi

identificado anteriormente nas análises de índice de refração e turbidez (Figura

15), confirmando o aumento na estruturação do sistema.

Para o segundo grupo de formulações, o aumento do valor de K corrobora

com os resultados obtidos para o tamanho da gotícula (Figura 19), indicando que

houve aumento da estruturação do sistema, conforme discutido anteriormente. Já

para o terceiro grupo, o aumento do índice de consistência pode indicar que o

fármaco foi de fato incorporado nas vesículas emulsionadas, modificando, assim,

a estruturação do sistema e, consequentemente, a viscosidade do meio.

A construção de reogramas é útil para caracterizar quaisquer tipos de

emulsões. Neste sentido, realizou-se um estudo mostrando a relação entre a

tensão de cisalhamento e a taxa de cisalhamento (curvas ascendente e

descendente) e a viscosidade versus à taxa de cisalhamento para emulsões onde


83

se variou a quantidade de fase oleosa, a quantidade de tensoativos e a

quantidade de fármaco, respectivamente (Figura 26 e 27).

FIGURA 26 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A e B) e

viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (A’ e B’).

Pode ser observado que as amostras estudadas apresentaram

comportamento newtoniano, não sofrendo deformação em função da tensão

aplicada. Segundo a lei de Newton, para líquidos ideais a tensão de cisalhamento

é diretamente proporcional à velocidade de cisalhamento (ALMEIDA et al., 2003).

A viscosidade é independente da velocidade de deformação. Sabe-se que as

curvas de líquidos newtonianos são linhas retas que passam através da origem

(SCOTT, 2000).

Por meio da determinação da viscosidade das amostras Figura 26-A’ e B’,

confirma-se que as mesmas são fluidos Newtoniano mantendo a viscosidade

constante com a velocidade de cisalhamento aplicada. Pode-se notar também

que a viscosidade aumentou à medida que se aumentou a concentração dos

0 20 40 60 80 100

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Ida (simbolo cheio)

Volta (simbolo vazio)

FO 5%

FO 10%

FO 20%

FO 30%

Te

ns

ao

de

cis

alh

am

en

to (

Pa

)

Taxa de cisalhamento (1/s)

20 40 60 80 100

-0,008

-0,004

0,000

0,004

0,008

0,012

FO 5%

FO 10%

FO 20%

FO 30%

Vis

co

sid

ad

e (

Pa

x s

)


0 20 40 60 80 100

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Ida (simbolo cheio)


T 1%

T 2,5%

T 5%

T 10%

Te

ns

ao

de

cis

alh

am

en

to (

Pa

)


20 40 60 80 100

-0,008

-0,004

0,000

0,004

0,008

0,012

T 1%

T 2,5%

T 5%

T 10%

Vis

co

sid

ad

e (

Pa

x s

)


A A’

B B’


84

componentes no sistema (Figura 26-A’ e B’). Estes resultados confirmam que o

aumento da fase oleosa provoca um aumento da viscosidade das EM, pois

promove um maior empacotamento das moléculas de tensoativos e induzem a

formação de uma estrutura mais organizada, mais rígida e com menor mobilidade

(TIROSH et al., 1997). Hung e colaboradores (2007) e Wang e colaboradores

(2006) observaram que o aumento do diâmetro da gotícula também acarretava

um aumento da viscosidade de suas emulsões.

Na Figura 27 encontra-se a relação entre a tensão de cisalhamento e a

taxa de cisalhamento e a viscosidade versus à taxa de cisalhamento para

emulsões onde se variou a quantidade de fármaco.

FIGURA 27 - Reogramas da tensão de cisalhamento versus taxa de cisalhamento (A) e

viscosidade versus taxa de cisalhamento dos sistemas (B) para as emulsões onde houve adição

de PRZ.

Na Figura 27, nas concentrações de 0 a 0,5% foi observado uma

sobreposição nas curvas indicando que a viscosidade dessas emulsões não

sofreu alteração de valor, corroborando com a teoria proposta de que o fármaco

inicialmente é solubilizado no interior da vesícula emulsionada para depois que

saturada, próximo a 0,5% de PRZ, passa para a interface da gotícula competindo

com os tensoativos. Nas concentrações de 0,75 a 1,0% há um aumento da

viscosidade, sugerindo-se que ocorreu a formação de microestruturas mais

volumosas provocada pelas interações do PRZ com a interface dos sistemas,

podendo perturbar a organização da interface, promovendo espaçamento entre as

moléculas de tensoativo, formando uma estrutura mais organizada, que reflete

0 20 40 60 80 100

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 20 40 60 80 1000

1

2

3

4

Ida (simbolo cheio)


PRZ 0%

PRZ 0,125%

PRZ 0,25%

PRZ 0,5%

Te

ns

oم d

e c

isa

lha

me

nto

(P

a)


PRZ 0,75%

PRZ 1,0%

0 20 40 60 80 100

-0,008

-0,004

0,000

0,004

0,008

0,012

0 20 40 60 80 100-0,50

-0,25

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

PRZ 0%

PRZ 0,125%

PRZ 0,25%

PRZ 0,5%

Vis

co

sid

ad

e (

Pa

x s

)


PRZ 0,75%

PRZ 1,0%

A B


85

diretamente sobre a viscosidade do sistema, corroborando com os resultados

obtidos para turbidez e índice de refração na Figura 23.

Por serem sistemas que se comportam como fluidos pseudoplásticos (PRZ

0,75% e PRZ 1%), as altas taxas de cisalhamento aplicadas provocam além da

desestruturação, a diminuição da viscosidade. No caso dessas emulsões, isto se

deve ao alinhamento das gotículas coloidais na direção do escoamento,

diminuindo a resistência interna e consequentemente a viscosidade (SCHRAMM,

2006).

As alterações que ocorrem sobre as propriedades reológicas ao longo do

tempo podem ser verificadas determinando a viscosidade em função da

velocidade de cisalhamento de modo ascendente e descendente continuamente.

Quando as curvas se sobrepõem, o sistema é caracterizado como tempo

independente e indica que apresenta uma rápida reestruturação. Quando a curva

ascendente indica valores maiores que os da curva descendente, o sistema é

chamado de tixotrópico, e quando ocorre o contrário, o sistema tem

comportamento reopético. A diferença entre as curvas ascendentes e

descendentes dos reogramas ilustra o fenômeno de histerese e sua área indica a

energia requerida para a quebra da estrutura do sistema (LABBA, 1993).

Os resultados apresentados na Figura 26 e 27 indicam que a maioria das

amostras são tempo independentes, o que já era esperado uma vez que essas

amostras apresentam comportamento newtoniano. Já as amostras PRZ 0,75% e

PRZ 1%, comportam-se como fluidos pseudoplásticos e apresentam área de

histerese com comportamento tixotrópico. Dessa maneira, resolveu-se estudar

também as propriedades tixotrópicas dessas emulsões por meio de testes

oscilatórios.

Nos ensaios oscilatórios podem ser obtidos os módulos elásticos (G´) e

viscosos (G´´) e a magnitude destes módulos é uma indicação qualitativa da

estrutura do sistema. Se G’ >> G”, pode-se sugerir que o sistema está interligado

quimicamente, ou se G’ > G” o sistema está estruturado por ligações secundárias,

mas se G’ ≤ G”, diz-se que as moléculas do sistema estão ligadas apenas por

interações físicas (CEULEMANS; VINCKIER; LUDWIG, 2002). A viscoelasticidade

é usada para descrever comportamento de materiais, os quais apresentam

comportamento intermediário entre os elásticos clássicos extremos, que são


86

chamados de sólidos hookeanos e líquidos newtonianos. Materiais viscoelásticos

têm simultaneamente propriedades elástica e viscosa (KORHONEN, 2003).

A Figura 28 mostra a evolução dos módulos de armazenagem (G’) e de

perda (G”) das EM contendo PRZ na concentração de 0,75% e 1%.

FIGURA 28 - Evolução dos módulos de armazenagem G’e de perda G” das emulsões contendo

0,75 e 1% de PRZ.

Analisando o gráfico plotado para o teste oscilatório (Figura 28) é possível

perceber que o módulo de perda (habilidade do material dissipar energia) é maior

do que o modulo de armazenagem (habilidade do material armazenar energia)

para as duas amostras em estudos, o que confirma que o sistema apresenta

comportamento viscoelástico.

O comportamento viscoelástico das formulações é coerente com a análise

visual das amostras que continham PRZ, podendo-se observar a relação entre o

aumento de fármaco na formulação, que a torna mais viscosa, ou seja, mais

organizada e com o aumento da componente elástica. Sugere-se então, que ao

se aumentar a quantidade de PRZ, o fármaco organiza-se de maneira a saturar a

parte hidrofóbica dos tensoativos, formando mesofase cristalinas, o que justifica o

aumento na viscoelasticidade apresentada por essas formulações. Pode-se

sugerir também que a interação do PRZ com a FO provoca a formação de


87

microestruturas mais volumosas, que se refletem diretamente no índice de

consistência (PESTANA, et al., 2008).

Por fim, partiu-se para a análise da estabilidade acelerada da emulsão com

fármaco incorporado.

5.4.2 Efeito do fármaco na estabilidade da emulsão

A partir da suspeita de que o PRZ poderia estar interagindo com os

componentes da formulação como um tensoativo, um estudo de estabilidade foi

realizado modificando-se a concentração de tensoativos na emulsão na presença

de fármaco.

O ensaio foi realizado em um período de 30 dias avaliando-se o índice de

cremagem, o pH, a condutividade elétrica, a turbidez, o teor do fármaco e a

microscopia óptica com aumento de 400x. Todas essas foram realizadas em

associação, para que essas metodologias em conjunto pudessem oferecer

maiores informações a respeito da caracterização das emulsões. A Figura 29

apresenta os resultados para dois desses parâmetros: o índice de cremagem

(Figura 29 - A) e a turbidez (Figura 29 -B).



PRZ.

Na Figura 29-A, observou-se que a emulsão sem o fármaco apresentou

índice de cremagem quase constante durante os 30 dias, variando esse índice na

faixa de 12-14%. Para os sistemas com PRZ e adição de 1 e 2,5% de tensoativos,

A B


88

observa-se um aumento gradativo de ambos os índices, ficando próximo de 15%

ao longo dos 30 dias de avaliação. Para as emulsões com 5% de tensoativos não

foi observado variação do IC, indicando que tal emulsão foi a mais estável frente

às demais emulsões analisadas. Isso porque, a estabilização de emulsões pelo

uso de tensoativos não-iônicos se faz através de impedimento estérico e ligações

de hidrogênio. A porção apolar do tensoativo se insere nas partículas de óleo e os

grupos de óxido de etileno na fase aquosa. Os grupos de óxido de etileno causam

impedimento estérico que inibe as partículas de óleo sofrerem colisão e

coalescer, alem de formarem ligações de hidrogênio com a água (FOX, 1986;

SILVA & SOARES, 1996). Entretanto, a estabilização de emulsões pode também

ser obtida usando concentração mais elevada de agentes emulsificantes, pois

isso resultará num filme ao redor das gotículas de óleo mais firme e compacto

reduzindo a coalescência (FOX, 1986).

Estes resultados demonstram que o fármaco aumenta a estabilidade dos

sistemas, pois aquelas contendo 1% de tensoativos foram mais estáveis do que

aquelas contendo 5% de tensoativos sem fármaco. Este resultado demonstra

claramente que o fármaco interage preferenciamente na interface e que age como

um tensoativo nos sistema.

Analisando a Figura 29-B, é possível afirmar que o menor valor de turbidez

é para a emulsão sem PRZ, no entanto, para as emulsões com o fármaco, com o

aumento da concentração dos tensoativos, os valores da turbidez aumentaram

relativamente. Indicando, conforme visto no estudo anterior (5.4.1), que o

aumento da quantidade de tensoativos promoveu uma maior estruturação no

sistema. Pode-se observar essa estruturação do sistema, também, na Figura 31,

uma vez que existe uma maior uniformidade do tamanho e quantidade de

gotículas para 5% de tensoativos. Os resultados de turbidez confirmam os

resultados obtidos para IC.

Estudou-se também o pH e a condutividade das diferentes emulsões, com

o objetivo de se avaliar também processos de instabilidade. Os resultados do

estudo estão apresentados na Figura 30.


89



PRZ.

Avaliando estatisticamente os valores obtidos do pH para as diferentes

emulsões (Figura 30-A), não foi observado alteração significativa [F (3,12) =

0,665, (p = 0,590)], indicando que a mudança na quantidade de tensoativos no

meio não é um indicativo de instabilidade para esse parâmetro.

Percebe-se na Figura 30–B que a condutividade aumentou com o aumento

da concentração de tensoativos, resultado esse observado também no estudo do

item anterior (5.4.1) onde houve variação de tensoativos de 1 a 10%. Esse

aumento da condutividade está relacionado à formação de uma camada elétrica

ao redor da gotícula dispersa ocasionado pelo uso dos tensoativos não iônicos

(FRANGE, GARCIA, 2009).

Para uma análise morfológica, foram obtidas as fotomicrografias dos

diferentes sistemas emulsionados em função do tempo (Figura 31).

A B


90

FIGURA 31 - Fotomicrografia das emulsões contendo 1% de PRZ e 1; 2,5 e 5% de tensoativos

durante os 30 dias de estudo de estabilidade. Aumento de 400x.

Por meio da Figura 31, é possível observar que para as emulsões contendo

1 e 2,5% de tensoativos, os glóbulos encontram-se heterogêneos, variando de

tamanho durante os 30 dias de estudo. Já para as emulsões contendo 5% de

tensoativos observa-se uma maior homogeneidade dos glóbulos durante os 30


91

dias de estudo. Esse resultado indica que na concentração de 5% de tensoativo e

1% de PRZ há uma boa estabilização do sistema emulsionado.

Avaliou-se também a eficiência de incorporação do fármaco nos sistemas

obtidos com o intuito de averiguar se o aumento da quantidade de tensoativos no

meio alterava a eficiência de incorporação do PRZ. O resultado dessa avaliação

está apresentado na Figura 32.

FIGURA 32 - Gráfico para determinação do teor de fármaco nas emulsões em 30 dias de estudo.

Sendo emulsões: (○) com 5% de T, sem PRZ; (●) com 1% de T + PRZ, (▲) com 2,5% de T + PRZ,

(■) com 5% de T + PRZ.

Na Figura 32 observou-se que somente as emulsões contendo 5% de

tensoativos foram capazes de incorporar cerca de 1% de fármaco, a quantidade

de PRZ incorporado ao sistema está associada ao aumento de tensoativos. Tal

efeito pode ser explicado pela ocorrência de uma maior estabilização da vesícula

emulsionada, o que proporcionou um aumento da quantidade de fármaco

incorporado. Isso pode ser observado na Figura 30 onde as gotículas parecem

mais homogêneas para os sistemas com 5% de tensoativos.

Para tal estudo, o sistema que apresentou melhor estabilidade quando

observado todos os parâmetros analisados foi o sistema contendo 5% de

tensoativos. Para uma quantidade de tensoativos inferior a 5%, observaram-se

processos de instabilidade e um menor teor de fármaco incorporado ao longo dos

30 dias.

Conclusão _________________________________________________________________

92

6. CONCLUSÃO

O método de análise por espectrofotometria UV proposto foi validado para

doseamento do PRZ, demonstrando ser simples, rápido, específico, preciso,

exato e robusto. Dessa forma, o método analítico constituiu uma ferramenta útil,

de baixo custo e fácil execução para a quantificação do fármaco nos sistemas

emulsionados.

O estudo de estabilidade aparente ao longo de 7 dias das emulsões,

contendo Tween® 80 e Span® 80, por meio do índice de cremagem, possibilitou a

determinação do melhor EHL, estando em 11.

O emprego do diagrama pseudoternário se mostrou bastante simples

ajudando na escolha das concentrações água/óleo/tensoativos que foram

empregadas para formulação emulsões O/A. Através do diagrama, foi também

possível determinar e identificar as várias regiões geradas como sistemas

emulsionados opaco brancos, sistemas translúcidos, sistemas emulsionados

opaco amarelos e separação de fases. Além de indicar a melhor combinação dos

componentes das fórmulas em suas respectivas quantidades a fim de produzir um

sistema mais estável.

O sistema emulsionado apresentou estabilidade, quando submetido a um

estresse térmico, durante trinta dias de estudo sem cotensoativo, bem como

quando adicionado álcool etílico como cotensoativo. O melhor método para a

incorporação do fármaco foi a adição do mesmo na fase oleosa antes da inversão

de fases, entretanto, a adição de álcool etílico não contribuiu para o aumento da

quantidade de fármaco incorporado.

No estudo da interação do fármaco com o sistema, foi observado através

da caracterização físico-química por medidas de turbidez, condutividade, índice

de refração, reologia e análise morfológica que o fármaco encontra-se

incorporado à vesícula emulsionada promovendo uma modificação na

estruturação do sistema proporcional à quantidade incorporada.

No estudo de estabilidade da emulsão com o fármaco incorporado,

mediante a avaliação do índice de cremagem, pH, condutividade, turbidez, índice

Conclusão _________________________________________________________________

93

de refração, teor de fármaco e microscopia óptica, o sistema que apresentou

maior estabilidade foi aquele contendo 5% de tensoativos na sua formulação.

Dessa forma, o sistema emulsionado em estudo apresentou estabilidade e

capacidade de incorporar alta quantidade de PRZ, sendo interessante para

desenvolvimento de uma nova formulação farmacêutica para o combate da

esquistossomose.

Perspectivas _________________________________________________________________

94

PERSPECTIVAS

Considerando a experiência profissional adquirida por ocasião da

realização deste trabalho, experiência esta que veio se somar à minha formação

escolar e superior anteriormente adquirida, pretendo continuar desenvolvendo

projetos na área de tecnologia farmacêutica no doutorado.

Somado a esse trabalho existem resultados que não foram aqui

divulgados, mas que serão publicados em um artigo cientifico, segue resumo:

Obtention and characterization oil-in-water soybean nanoemulsions as a potential delivery system for drug water insoluble

Nanoemulsion systems composed of water, polysorbate 80 (tween® 80), sorbitan

monooleate (span® 80) and soybean oil, were investigated as potential drug

delivery vehicles for insolubles drugs. Pseudo-ternary phase diagram of the

investigated system, was constructed at room temperature by titration, and the oil-

to-surfactants mass ratios (O/SC) that exhibit the maximum in the solubilization of

water were found. This allowed the investigation of the continuous structural

inversion from water-in-oil to oil-in-water nanoemulsions on dilution with water

phase. The microstructures of the system were characterized by polarized light

microscopy, zeta potential, dynamic light scattering (DLS) and rheological

behavior that the size of the oil droplets increased proportionally with increase in

amount of oil phase and decreased with increase amount of surfactants. In all

cases the Zeta potential resulted below |-40 mV|. For all samples a Newtonian

behavior was found. The obtained results suggest that the samples show droplets

with an interior capable of incorporating hydrophobic drugs with low aqueous

solubility. The investigated nanoemulsions should be very interesting as new drug

carrier systems.

Key-words: phase diagram, nanoemulsion, soybean oil.

Referências bibliográficas _________________________________________________________________

95

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108

ANEXOS

Anexo I - Resumo e reivindicações da patente intitulada: COMPOSIÇÃO E

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMA LÍQUIDA DE ADMINISTRAÇÃO A

BASE DE SISTEMAS LIPÍDICOS EMULSIONADOS, DO TIPO EMULSÃO,

MICROEMULSÃO E/OU NANOEMULSÃO CONTENDO PRAZIQUANTEL,

depositada no INPI BR 10 2013 000455 3.

109

ANEXO I

RESUMO

COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMA LÍQUIDA DE

ADMINISTRAÇÃO A BASE DE SISTEMAS LIPÍDICOS EMULSIONADOS, DO

TIPO EMULSÃO, MICROEMULSÃO E/OU NANOEMULSÃO CONTENDO

PRAZIQUANTEL

A patente de invenção refere-se a uma forma líquida de administração do

praziquantel [(±)-2ciclo-hexilcarbonil-1,2,3,6,7,11b-hexa-hidro-4H-pirazino[2,1-

a]isoquinolin-4-ona] contido no interior de uma fase oleosa, emulsificada no

interior de uma fase aquosa com o auxilio de tensoativos, podendo estar

associados a cotensoativos e a moleculas de direcionamento do fármaco para o

parasita. O sistema lipídico emulsionado pode se apresentar como emulsão,

microemulsão e/ou nanoemulsão, dependendo da composição e o do método de

fabricação empregados. Os referidos sistemas aumentam a quantidade de

fármaco solúvel em um sistema aquoso por até mais de 100 vezes, o que

potencialmente intensifica sua absorção oral e possibilita sua administração

parenteral, modificando desta forma biodisponibilidade em relação às formas de

administração disponíveis.

REIVINDICAÇÕES

1 COMPOSIÇÃO E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE FORMA LÍQUIDA DE

ADMINISTRAÇÃO A BASE DE SISTEMAS LIPÍDICOS EMULSIONADOS, DO

TIPO EMULSÃO, MICROEMULSÃO E/OU NANOEMULSÃO CONTENDO

PRAZIQUANTEL, caracterizado por uma forma líquida de administração do

praziquantel incorporado em uma fase oleosa emulsificada por tensoativos no

interior de uma fase aquosa, a qual pode ser administrada por via oral e/ou

parenteral para todas as faixas etárias de humanos ou animais (uso veterinário).

2 Sistema lipídico emulsionado para a administração do praziquantel de acordo com

a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sistema pode se apresentar na

forma de emulsão, microemulsão e/ou nanoemulsão, de acordo com a

composição, estabilidade termodinâmica ou método de produção utilizados para a

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concepção dos mesmos.


a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida fase externa aquosa é

composta por água, podendo ser acrescida de agentes estabilizantes, como

conservantes, antioxidantes e tampões, equanto a fase interna oleosa pode ser

constituída por óleo sintético, preferencialmente a base de triglicerídeos de cadeia

média (MCT) como fase oleosa, o qual compreende ésteres de glicerídeos

predominantemente saturados com número de carbonos igual a oito (50-80%) e

dez (20-45%) podendo variar conforme a disponibilidade do mercado, ou por óleo

vegetal de uso farmacêutico, preferencialmente o óleo de soja; ou ainda por por

óleo mineral de uso farmacêutico.


a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que o referido agente tensoativo é

selecionado de um ou mais do grupo que consiste em polissorbatos, monoesteres

do sorbitano, oleato de sódio, fosfatidilcolina de soja e fosfatidilcolina de gema de

ovo, podendo estar associados a agentes cotensoativos.


a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de alguma molécula de direcionamento

como por exemplo o colesterol estar contida, preferencialmente adsorvida na

interface óleo/água pela sua potencial capacidade de promover o direcionamento

do sistema lipídico contendo o fármaco para o parasita.

6 Método de fabricação de sistema lipídico emulsionado para a administração do

praziquantel de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os

componentes da fase oleosa são misturados com os componentes da fase

aquosa, em uma faixa de temperatura de 25 a 75ºC, preferencialmente a 75ºC,

utilizando agitadores do tipo magnético, mecânico com hélices e ou pás, do tipo

ultra-turrax, sonda de ultrassom ou ainda extrusão em alta pressão, nos quais o

fármaco pode ser incorporado no momento da mistura ou depois de obtidos os

sistemas emulsionados.

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