UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA, FISIOLOGIA E PATOLOGIA

BÁSICA

Trabalho de Conclusão de Curso

Avaliação in vitro e in vivo do efeito da cafeína no metabolismo ósseo e

atividade funcional de células osteoblásticas da medula óssea de ratas

ovariectomizadas.

Aluna: Carolina Alves Freiria de Oliveira

Orientadora: Karina Fittipaldi Bombonato Prado

RIBEIRÃO PRETO

2018

Trabalho de conclusão de curso

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1. Resumo

A remodelação óssea garante a renovação do tecido ósseo e o armazenamento de

moléculas essenciais como o cálcio e o magnésio. O processo envolve a atuação de

proteínas, hormônios e outras substâncias capazes de ativar o funcionamento de

osteoblastos e osteoclastos. Um desequilíbrio neste processo pode causar a osteoporose,

uma doença cada vez mais frequente em uma população que atualmente tem maior

longevidade e que provoca, principalmente em mulheres com redução na carga

hormonal, a perda de densidade óssea. O fator nutricional tem influência no

desenvolvimento da osteoporose, entre eles o hábito de consumir café, muito presente

na vida do brasileiro. A cafeína encontrada nesta bebida é amplamente encontrada em

diversos outros produtos consumidos pela população e tem grande importância

econômica. Considerando isso, o projeto tem por objetivo avaliar o efeito in vitro e in

vivo da cafeína no metabolismo de células osteoblásticas da medula óssea em um

modelo experimental de osteoporose. Para os ensaios in vitro e in vivo, ratas da

variedade Wistar foram submetidas ao processo de ovariectomia bilateral de acordo

com protocolos experimentais bem estabelecidos na literatura. Após 60 dias do processo

cirúrgico, células da medula óssea foram coletadas do fêmur das ratas e colocadas em

garrafas com meio de cultura adequado para estas células. Após a confluência, as

células foram cultivadas em placas de 24 poços e divididas em quatro grupos

experimentais: 1) controle/C (sem indução da osteoporose e sem adição da cafeína no

meio); 2) controle/Cc (sem indução da osteoporose e com adição de cafeína ao meio); 3)

ovariectomizado/OVX (sem adição de cafeína no meio); 4) ovariectomizado/OVXc

(com adição de cafeína no meio). Após os tempos experimentais, foram analisados os

seguintes parâmetros: proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total,

Trabalho de conclusão de curso

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atividade de fosfatase alcalina, detecção e quantificação de nódulos mineralizados e

expressão de genes relacionados à atividade osteoblástica através de PCR em tempo

real. Os experimentos in vivo foram realizados após a administração diária por 30 dias

de 50 mg/kg de cafeína por meio de sonda gástrica após 30 dias de ovariectomia para os

grupos Cc e OVXc e água para os grupos C e OVX. Após a eutanásia, os fêmures foram

coletados para avaliação histológica e histomorfométrica das epífises proximais dos

fêmures. Os dados obtidos mostraram que a cafeína apresenta influência sobre a

atividade celular refletindo na qualidade de tecido ósseo femoral, não prejudicando a

formação e manutenção do tecido ósseo em uma situação de osteoporose.

2. Introdução

A cafeína é a substância psicoativa mais usada no mundo (Yang et al., 2010). De

grande importância na economia nacional, está presente no café, no chá, no chocolate e

em medicamentos contra a dor de cabeça e alergia e até mesmo em suplementos

alimentares (Hogan et al., 2002). Esta substância é usada para promover a vigília,

melhorar o humor e a cognição e produzir efeitos estimulantes (Haskell et al., 2005).

Segundo Migliardi et al. (1994), pode ser usada para tratar a apneia precoce neonatal e

como coadjuvante anestésico. Em pequenas doses pode provocar alguns efeitos

psicológicos como euforia, aumento da atenção (Lieberman et al., 1987) e em

quantidades elevadas produz náuseas, tremores, ansiedade e nervosismo (Daly et al.,

1998). Entre os produtos nutricionais, a concentração deste alcalóide natural é maior no

café, apesar de poder ser encontrado em folhas de chá e outras plantas. Segundo Cano-

Marquina et al. (2013), a quantidade de cafeína em uma xícara de café é influenciada

pelo seu método de preparação (e.g. 60 mg no café torrado, 3mg no descafeinado e até

300 mg no café expresso). A cafeína foi acusada por muito tempo de ser responsável por

Trabalho de conclusão de curso

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causar males a saúde tais como hipertensão arterial, infarto do miocárdio, câncer,

hiperglicemia e derrame, sendo relacionada até mesmo com casos de óbito (Snel et al.,

2009) e possíveis alterações genéticas (Yang et al., 2010), fazendo com que o consumo

do café fosse até mesmo condenado.

No entanto, alguns estudos recentes revelaram que muitas vezes não há

associação entre o consumo de cafeína e essas doenças. Boekema et al. (1999) sugerem,

por exemplo, não haver associação entre ingestão de café e a formação de úlceras

estomacais. Com isso, vê-se a necessidade de estudar mais essa substância ainda não tão

explorada, apesar de seu amplo consumo.

Ao mesmo tempo, a osteoporose é uma doença cada vez mais comum na

sociedade com cerca de 300 milhões de pessoas afetadas (Merheb et al., 2014). Essa

doença se caracteriza pela desregulação do processo de remodelação óssea em que a

formação do tecido ósseo por osteoblastos é inferior à quantidade reabsorvida por

osteoclastos. A osteoporose pode ser primária ou secundária, se desencadeada por outro

tipo de doença. Uma causa recorrente é a diminuição da produção de hormônios como

estrógeno em mulheres após a menopausa. Estima-se que uma em cada seis mulheres

brancas terão fratura no osso do quadril durante a vida (Cummings et al., 1989). Tais

lesões provocadas pela perda de densidade óssea podem levar ao desconforto, dor,

redução na qualidade de vida e até mesmo aumentar o risco de morte no primeiro ano de

fratura (Le Blanc et al., 2011; Haentjens et al., 2010). O enfraquecimento do tecido

tende a ocorrer em ossos longos como o fêmur, mas em estágios mais avançados da

doença é possível que se tenha perda da densidade óssea até mesmo em ossos menores

da face como a mandíbula e as maxilas o que pode levar a perda dos órgãos dentais

(Merheb et al., 2014). Seu tratamento é feito com moduladores de receptores de

estrógeno, bifosfonatos e calcitonina, o que impede a reabsorção óssea.

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Existem muitos dados controversos na literatura sobre os efeitos da cafeína no

organismo. Por aumentar a excreção de cálcio pela urina, seu consumo exagerado pode

diminuir a densidade óssea e favorecer a ocorrência de fraturas por osteoporose

(Folwarczna et al., 2013). Por outro lado, estudos epidemiológicos sugerem que o

consumo de café pode contribuir para a prevenção de várias doenças crônicas como

diabetes tipo II, mal de Parkinson e cirrose hepática (Higdon et al., 2006). Além disso,

alguns estudos têm demonstrado que não se tem associação entre o consumo de café e o

risco de se ter fraturas ósseas. Folwarczna et al. (2013) mostraram que a administração

diária de 20 mg de cafeína por 4 semanas provocou aumento da densidade mineral

óssea da tíbia de ratas ovariectomizadas.

Sendo assim, é interessante a realização de novas pesquisas envolvendo os efeitos

da cafeína em células do tecido ósseo para verificar seus possíveis efeitos e aplicá-los

no tratamento e prevenção de doenças como a osteoporose.

3. Objetivos

A osteoporose é uma doença comum e preocupante na atualidade. A cafeína é

uma substância amplamente encontrada em diversos produtos existentes no mercado,

porém não muito explorada quanto ao seu potencial de atuação no tecido ósseo. Alguns

estudos apontam que ela pode alterar o metabolismo de osteoblastos, podendo amenizar

um quadro osteoporótico, dependendo da dose administrada. Dessa forma, o objetivo

desta investigação foi avaliar o efeito in vitro e in vivo da cafeína no metabolismo do

tecido ósseo femoral assim como de células osteoblásticas da medula óssea de ratas

previamente ovariectomizadas, por meio dos seguintes parâmetros:

Ensaios in vitro:

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-Viabilidade celular (MTT);

-Atividade de fosfatase alcalina;

-Detecção in situ de fosfatase alcalina

- Quantidade de proteína total;

-Detecção e quantificação de nódulos mineralizados.

-Expressão de genes relacionados ao metabolismo ósseo.

Ensaios in vivo:

-Análise histológica qualitativa das epífises proximais dos fêmures de ratas

ovariectomizadas.

-Análise quantitativa da porcentagem de trabéculas ósseas nas epífises proximais dos

fêmures de ratas ovariectomizadas.

3. Material e Métodos

3.1. Animais Utilizados

Foram utilizadas ratas Wistar pesando aproximadamente 300g. Os animais foram

procedentes do Biotério Central do Campus da USP de Ribeirão Preto. Eles foram

tratados com ração especial para roedores e água filtrada Ad libitum. Foram separados

em duas caixas grandes com cama de maravalha nas dimensões 41 x 34 x 16 cm, em

número de três por caixa. A temperatura do local de alojamento dos animais é mantida à

23,5-24,5 ºC, controlada por condicionador de ar quente/frio de janela, além de um

sistema de exaustão de ar. Os animais foram mantidos no Biotério da Faculdade de

Odontologia de Ribeirão Preto-USP.

3.2. Indução da osteoporose - Grupo Tratado

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Os animais foram ovariectomizados bilateralmente. Primeiramente eles foram

pesados e então anestesiados com a solução anestésica de Coopazine (Xylazina) -

sedativo, analgésico e relaxante muscular; e Dopalen (Ketamina)- anestésico geral,

fornecido pela Agibrands do Brasil LTDA- Campinas, SP, Brasil, na proporção de

75mg/Kg de Ketamina e de 10mg/Kg de Xylazina, injetada por via intraperitoneal.

Também foi feita a aplicação em ambos os olhos dos animais, durante a cirurgia, de

uma gaze estéril embebida em soro fisiológico a 0,9% com o objetivo de prevenir o

ressecamento das córneas.

Após a anestesia os animais foram submetidos à tricotomia das regiões laterais.

Foi feita a assepsia dos locais a serem incisionados com álcool iodado (PVPI). Foram

realizadas incisões cutâneas bilaterais, sendo o tecido muscular divulsionado para a

exposição dos ovários e excisão dos mesmos (Kalu, 1991). Procedeu-se a sutura dos

tecidos com fio de seda 4.0 (Ethicon, Johnson & Johnson, São José dos Campos, SP,

Brasil) de modo a fechar devidamente as margens do retalho. Em seguida, cada animal

recebeu, via intramuscular, uma única dose de 24.000UI/Kg de peso de penicilina

(Pentabiotic Veterinário Pequeno Porte - Fort Dodge®, Campinas, SP, Brasil), como

pode ser visto na Figura 1. Os animais foram mantidos em número de três por caixa, por

sessenta dias e receberam ração e água “ad libitum”. Os animais operados ficaram sob

observação constante, sendo feita a limpeza de suas caixas, com troca da maravalha, três

vezes por semana. A comprovação do sucesso do procedimento de ovariectomia foi

feita pelo exame do ciclo estral e exame macroscópico dos cornos uterinos.

Duas semanas após a cirurgia, os animais foram submetidos ao exame do ciclo

estral, por meio da coleta de líquido vaginal por um período de 5 dias consecutivos.

Para o desenvolvimento desta técnica de observação foi introduzido, com o auxílio de

uma borracha de conta-gotas acoplada a uma ponteira pequena, uma dose de solução

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salina (cerca de 1ml) no interior da vagina da rata. Após a introdução, a solução foi

rapidamente aspirada e seu conteúdo transferido para uma lâmina de vidro e

imediatamente observado em microscopia óptica. Este procedimento foi realizado bem

no início da manhã, por volta das 7 horas.

A literatura mostra que esta técnica é ideal para investigar as mudanças ocorridas

no ciclo reprodutivo. O período do ciclo estral das ratas dura de 4 a 5 dias. Este ciclo

pode ser dividido em quatro fases: metaestro, diestro, proestro e estro. Cada uma das

fases se caracteriza por apresentar um tipo de célula predominante que pode ser

facilmente observado nos esfregaços da vagina, assim como o nível de hormônios

sexuais presentes no animal. Na fase metaestro, observam-se leucócitos e algumas

células epiteliais anucleadas remanescentes. Nesta fase inicia-se o aumento da secreção

de estrógeno e o primeiro pico de progesterona. Na fase diestro observam-se

basicamente leucócitos e algumas células epiteliais nucleadas, sendo marcado pelo final

do primeiro pico de progesterona e baixos níveis de estrógeno. Na terceira fase,

proestro, o número de células epiteliais nucleadas aumenta enquanto os leucócitos

praticamente desaparecem, ocorrendo neste momento o pico de secreção de estrógeno e

o segundo pico de progesterona, enquanto na fase estro são visualizadas basicamente

células epiteliais queratinizadas da camada córnea e o nível de estrógeno retorna aos

valores basais (Marcondes et al., 2002).

Durante o processo de sacrifício dos animais, foi possível avaliar, também, o

efeito da ovariectomia, por meio do exame macroscópico dos cornos uterinos. Para a

realização desta análise foi necessário, antes do sacrifício dos animais, incisionar a

região abdominal para localização das respectivas estruturas. Nos animais

ovariectomizados (com deficiência de hormônio) os cornos uterinos deveriam

Trabalho de conclusão de curso

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apresentar-se finos, atróficos e anêmicos. Estes experimentos foram realizados em

triplicata.

3.3. Grupo Controle - Sham

Os animais do grupo controle (SHAM) foram submetidos apenas ao procedimento

cirúrgico, com exposição dos ovários e seu reposicionamento dentro da cavidade

abdominal. Estes animais também receberam, via intramuscular, uma única dose de

24.000UI/Kg de peso de penicilina (Pentabiotic Veterinário Pequeno Porte - Fort

Dodge®, Campinas, SP, Brasil).

3.4. Administração in vivo da cafeína

Utilizamos a cafeína adquirida da empresa Sigma-Aldrich. Após sua solubilização

em água destilada, a cafeína foi administrada por meio de sonda gástrica, na dosagem de

50 mg/kg de peso corporal (adaptado de Reis et al, 2016) por um período de 60 dias um

mês após o procedimento de ovariectomia para os grupos OVX/CAF. Os grupos

Controle (C) e OVX receberam somente água destilada.

3.5. Sacrifício Dos Animais e Coleta de Material

As ratas foram sacrificadas após noventa dias da cirurgia por meio de anestesia

seguida de decapitação. Os anestésicos utilizados foram cloridrato de cetamina (40-80

mg/Kg) e xilazina (10 mg/kg), por via intraperitoneal. Em seguida, foi realizada a coleta

dos fêmures para a realização da avaliação histológica e cultura celular como descrito a

seguir.

3.6. Ensaios in vitro de cultura celular

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3.6.1. Cultura De Células Mesenquimais da Medula Óssea De Ratas

Os experimentos com cultura de células foram realizados no Laboratório de Cultura de

Células do Departamento de Morfologia, Fisiologia e Patologia Básica da Faculdade de

Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A cultura de células

mesenquimais (CTM) obtidas da medula óssea de fêmures das ratas (n=3 para cada grupo)

foi realizada como descrito por Maniatopoulos et al., (1988). As ratas foram sacrificadas

com overdose de anestésico Ketamina (Agener União, Embu-Guaçu, São Paulo, Brasil) e

Xylazina (Dopaser – Calier, Juatuba, Minas Gerais, Brasil). Os fêmures foram retirados e

transportados até o laboratório em meio de transporte (α-MEM (Gibco) suplementado com

500 µg/mL de gentamicina (Gibco) e 3 µg/mL de fungizona (Gibco). No fluxo laminar, os

fêmures foram submetidos à anti-sepsia (clorexidina a 2,5% e álcool a 70% por 1 minuto

cada). Posteriormente, foi realizada a remoção de tecidos moles restantes nos fêmures por

meio de lâmina de bisturi intercalada com a permanência dos mesmos em meio de

transporte/lavagem por 15 minutos (três vezes). As epífises foram cortadas e a medula óssea

extraída do fêmur por meio de irrigação das diáfises com meio de cultura.

As células foram mantidas em frascos de 75 cm2 (Corning) com MTS(meio total

suplementado) contendo α-MEM (Gibco), 10% de soro fetal bovino (Gibco), dexametasona

10-7 M (Sigma), 5 g/mL ácido ascórbico (Gibco), 7mM de -glicerofosfato , 0,3 µg/mL de

fungizona (Gibco) e 50 µg/mL de gentamicina (Gibco) .

Após atingirem subconfluência, as células foram liberadas enzimaticamente dos

frascos de cultura pela adição de solução de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 1

mM (Gibco), 1,3 mg/mL de colagenase tipo II (Gibco) e tripsina a 0,25% (Gibco) e

colocadas em presença de quantidade suficiente de meio de cultura para interromper a ação

enzimática. Posterior à centrifugação a 2000 rpm por 5 min para obtenção do precipitado

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celular, as células foram homogeneizadas em meio de cultura MTS e uma alíquota de 100

µL desta solução, adicionada à porção igual de corante azul de tripan 0,1% (Acros

Organics), foi utilizada para contagem celular por meio de um contador de células

automático (Countess automated cell counter tm, Invitrogen, USA). A primeira passagem

celular foi utilizada para realização dos experimentos.

As células foram cultivadas no mesmo meio de cultura descrito acima, na

concentração de 2 x 104 células por poço, em placas de cultura celular de 24 poços (n=5). As

culturas foram incubadas a 37 ºC, em atmosfera umidificada contendo 5% de dióxido de

carbono (CO2) e 95% de ar atmosférico. Durante o tempo de cultivo de até 21 dias, as

células foram acompanhadas por meio de observação em microscópio de luz invertido

(Axiovert 25 Zeiss) sendo os meios de cultura trocados duas vezes por semana.

As culturas celulares foram divididas em quatro grupos experimentais: : 1) controle/C (sem

indução da osteoporose e sem adição da cafeína no meio); 2) controle/Cc (sem indução da

osteoporose e com adição de 1mM de cafeína no meio); 3) ovariectomizado/Ovx (sem adição

de cafeína no meio); 4) ovariectomizado/Ovxc (com adição de 1mM cafeína no meio).

3.6.2. Proliferação celular

Aos 3, 7 e 10 dias de cultura, a proliferação e viabilidade celular foram avaliadas

pelo ensaio colorimétrico MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolio]} (Sigma). Após remoção do meio de cultura, as células foram

incubadas com solução de MTT + MTS por 4 horas a 37ºC, em atmosfera umidificada

contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico. Passado esse período, o meio de cultura

foi removido dos poços e, em seguida, adicionado 1mL de solução de isopropanol ácido

(Merck, Darmstadt, Alemanha) em cada poço sob agitação por 5 minutos, para a

solubilização completa do precipitado formado. Alíquotas de 150µL foram removidas

Trabalho de conclusão de curso

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dos poços e transferidas para uma placa de 96 poços para leitura em espectrofotômetro

(µQuant, Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT, EUA) em comprimento de onda de

570nm.

3.6.3. Conteúdo de proteína total e atividade de fosfatase alcalina (ALP)

Após 3, 7, 10 dias de cultura celular, o meio de cultura foi removido das placas e

os poços foram lavados três vezes com PBS (Gibco) aquecido a 37°C para remoção das

células não aderidas e do meio de cultura sobressalente. Em seguida, os poços foram

preenchidos com 1mL de solução de lauril sulfato de sódio 0,1% (Sigma) e deixados à

temperatura ambiente (TA) por 30 minutos antes de iniciar os ensaios:

a) Proteína total: a dosagem de proteína foi realizada seguindo o método de

Lowry (Lowry et al., 1951). Para isso, 500µL da amostra contida em cada poço da placa

de cultura foram transferidos ao respectivo tubo de ensaio, ao qual foi adicionado

500µL do reagente de Lowry (Sigma). Os tubos foram agitados vigorosamente e

deixados em T.A. por 20 minutos. Após este período, 250µL da solução de Folin &

Ciocaulteau’s phenol reagent (Sigma) foram adicionados aos tubos, que após agitação,

ficarão em TA por 30 minutos para desenvolvimento da coloração azul. Passado o

tempo, a absorbância de cada tubo foi determinada em um espectrofotômetro (Bio-Tek),

em comprimento de onda de 680nm. O conteúdo de proteína total de cada poço foi

calculado com base na construção de uma curva padrão a partir de albumina bovina

(Sigma). Os resultados foram utilizados para normalização da atividade de fosfatase

alcalina.

b) Atividade de ALP: foi determinada através da liberação de timolftaleína pela

hidrólise do substrato timolftaleína monofosfato, utilizando o kit comercial (Labtest

Trabalho de conclusão de curso

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Diagnostica SA, Lagoa Santa, MG, Brasil) e seguindo as instruções do fabricante.

Foram utilizados tubos de ensaio para os grupos testes, padrão e branco. Em todos os

tubos foram adicionados 50µL de substrato e 500µL de solução tampão; somente no

tubo padrão foram acrescentados 50µL da solução padrão. Posteriormente, todos os

tubos foram colocados em banho-maria a 37ºC, para a realização do experimento.

Foram acrescentados 50µL das amostras aos respectivos tubos testes em uma etapa

realizada em intervalo máximo de 10 minutos. Decorrido o tempo, 2mL do reagente de

cor foram adicionados a todos os tubos de ensaio e, em seguida, determinar-se-á a

absorbância em espectrofotômetro (Bio-Tek), no comprimento de onda de 590 nm. Os

dados da atividade de ALP foram normalizados pelo conteúdo de proteína total.

3.6.4. Análise de fosfatase alcalina in situ por meio de Fast Red

A análise da enzima fosfatase alcalina in situ foi realizada aos 3, 7 e 10 dias. Após

a remoção do meio de cultura, os poços foram lavados duas vezes com PBS aquecido a

37°C. Trezentos e vinte miligramas do reagente Triz (Sigma) foram dissolvidos em

20mL de água deionizada e, adicionado, 7mg do reagente Fast Red (Sigma). Foram

desprezados 2mL desta solução e acrescidos 8mg de naftol (Sigma) diluídos em 2mL

de dimetil formamida (Merck) formando a solução de trabalho. Um mililitro dessa

solução foi adicionado em cada poço. A placa foi levada à incubadora em uma

atmosfera umidificada a 37°C com 5% de CO2 por 30 minutos. Decorrido esse tempo, a

solução foi retirada dos poços e a placa foi seca à temperatura ambiente para posterior

análise qualitativa.

3.6.5. Detecção e quantificação de matriz mineralizada

Trabalho de conclusão de curso

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A detecção de matriz mineralizada foi avaliada ao final dos 14 e 17 dias de

experimento. Após remoção do meio de cultura, os poços foram lavados três vezes com

PBS (Gibco) aquecido a 37ºC e adicionados 2mL de formalina 10% para fixação e

mantidos a 4°C por 24 horas. A formalina foi removida e os poços desidratados à T.A.

em séries crescentes de álcoois (30°, 50°, 70° e 100°) por um período de 1 hora para

cada graduação alcoólica. Após secagem, os poços foram corados com vermelho de

alizarina a 2% pH 4,2 (Sigma) por 10 minutos e as áreas de mineralização ricas em

cálcio evidenciadas pela coloração vermelha. Para quantificação da coloração segundo

método de Gregory et al. (2004), 280µL de ácido acético a 10% (Labsynth, Lab Ltda,

Diadema, SP, Brasil) foram acrescentados a cada poço e as placas deixadas sob agitação

suave por 30 minutos. A camada de células foi raspada com o auxílio de uma ponteira e

a solução transferida para tubos eppendorf de 1,5mL, aquecida a 85ºC por 10 minutos e

transferida para o gelo por 5 minutos. Os tubos foram centrifugados a 13.000rpm por 20

minutos. Um volume de 150µL do sobrenadante foi transferido para uma placa de 96

poços (Corning) e 40µL de hidróxido de amônia a 10% (Quimibras, Rio de Janeiro, RJ,

Brasil) foram adicionados. A leitura foi realizada em espectrofotômetro (Bio-Tek) em

um comprimento de onda de 405nm.

3.6.6. Extração de RNA e Transcrição Reversa

Após 10 e 14 dias, foi realizada a extração do RNA total através do kit SV Total

RNA Isolation System (Promega, EUA) de acordo com as especificações do fabricante.

Em seguida, o RNA total foi quantificado em diferentes comprimentos de onda (260;

280; 230; 320 ηm) no aparelho GeneQuant 1300 (GE Healthcare, Reino Unido). A

integridade do RNA foi avaliada através de eletroforese microfluídica RNA 6000 nano

chips fornecidos pela Agilent Technologies® (Santa Clara, CA, EUA) utilizando o

Trabalho de conclusão de curso

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aparelho Agilent 2100 Bioanalyser. Antes de iniciar o preparo do gel para a

eletroforese, todos os reagentes, que até o momento estavam armazenados em freezer,

foram mantidos por 30 minutos a temperatura ambiente. Decorrido o tempo, iniciou-se

o preparo do gel pipetando 550 µl do RNA 600 Nano Gel em uma coluna com filtro e

centrifugou-se por 10 minutos a 1.500 x g a temperatura ambiente. Uma alíquota de 65

µl foi colocada num tubo eppendorf de 0,5 ml e adicionou-se 1 µl de RNA 6000 Nano

Dye e após agitação por 10 segundos, centrifugou-se por 10 minutos a 13.000 x g a

temperatura ambiente. Em seguida, iniciou-se o preparo do RNA 6000 Nano Chip o

qual foi colocado no priming station com os ajustes corretos. Primeiramente pipetou-se

9 µl da mistura gel/dye na região G indicada no chip e com o auxílio de uma seringa

acoplada ao priming station distribuiu-se o gel por todo o chip. Em seguida, pipetou-se

9 µl das misturas nos demais pontos indicados com a letra G. Pipetou-se 1 µl do

marcador na posição indicada e 5 µl do RNA 6000 Nano Marker em cada posição

relacionada as amostras assim como na posição do marcador. Por último, 1 µl de cada

amostra (100-150 ng de RNA total) foi adicionado nos respectivos poços marcados de 1

a 12 e com a ajuda de um aparelho tipo vórtex IKA MS 3 (Manca, Hong Kong, China)

agitou-se o chip horizontalmente por 1 minuto a 2200 rpm antes da leitura. Com a ajuda

do Agilent 2100 Expert Software obteve-se o resultado (eletroferograma e densitometria

dos géis). A caracterização de um RNA mensageiro (RNAm) de boa qualidade foi

verificada pela visualização de duas subunidades ribossômicas características nos

eucariotos (18S e 28S). Após extração do RNA total, o cDNA foi sintetizado a partir de

1µg de RNA por reação de transcrição reversa utilizando o Kit High Capacity cDNA

Reverse Transcription (Applied Biosystems, EUA), de acordo com as instruções do

fabricante. Brevemente, foram adicionados ao RNA: 2 μL de (10X) RT buffer, 0,8 μL

de (25X) dNTP mix (100mM), 2 μL (10X) RT Random Primers, 1 μL de MultiScribe

Trabalho de conclusão de curso

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Reverse Transcriptase, 1 μL de RNase Inhibitor e 3,2 μL de água DEPC, para um

volume final de 20 μL/ reação. Em seguida, a amostra foi incubada a 25 ºC por 10

minutos, 37 ºC por 120 minutos, 85 ºC por 5 segundos, seguido pelo resfriamento a 4

ºC. Ao final da reação a amostra foi mantida em gelo e o cDNA estocado em freezer

−20°C.

3.6.7. Reação de PCR em tempo real utilizando o sistema de sondas TaqMan

As reações de PCR em tempo real realizadas pelo sistema de sondas TaqMan

foram preparadas para um volume final de 10 µL por reação. Para cada reação, foi

adicionados 5 μL de TaqMan Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG (2X), 0,5

μL das sondas TaqMan para os genes de interesse (20X TaqMan Gene Expression

Assay Mix) e 11,25 ηg de cDNA. As reações consistiram em 2 minutos a 50 ºC, 10

minutos a 95 ºC, e quarenta ciclos de 15 segundos a 95 ºC e 1 minuto a 60 ºC.

Os resultados foram analisados com base no valor de Ct (cicle threshold – ou

ciclo limiar) e todas as amostras foram submetidas a reações para a detecção de RNA

mensageiro para o gene de expressão constitutiva beta-actina. Os níveis de expressão do

gene constitutivo foram utilizados para a normalização dos níveis de expressão do gene

alvo e uma amostra negativa (água) foi submetida à reação com cada sonda TaqMan

utilizada. A normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas

pelo método de 2-ΔΔCT (Livak et al., 2001). Usando o método de 2-ΔΔCT, os dados foram

representados como diferença (em vezes) na expressão gênica normalizada pelo gene

constitutivo. A significância estatística das mudanças de expressão gênica foi avaliada

pelo teste Análise de Variância (One Way ANOVA) entre os grupos experimentais.

Valores de p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Os resultados

Trabalho de conclusão de curso

16

representam os valores da média ± desvio padrão, da intensidade de expressão de

RNAm para o gene alvo, normalizado pela expressão de beta-actina.

3.7. Ensaios in vivo para avaliação histológica

Os fêmures coletados foram imersos em formaldeído a 4% tamponado, por 24

horas. Em seguida, os espécimes foram descalcificados em EDTA+TRIS a 0,5M, e as

soluções foram trocadas a cada dois dias. Após o período de descalcificação, que pode

variar de quinze a trinta dias, a ação do ácido foi neutralizada em uma solução de

sulfato de sódio a 5%, por vinte e quatro horas. Após esse período os fêmures foram

desidratados em séries crescentes de álcoois, diafanizados em xilol e incluídos em

parafina. Foram, então, realizados cortes longitudinais de 6 µm de espessura. Estes

cortes foram corados em hematoxilina-eosina, que permite a avaliação morfológica

qualitativa do tecido ósseo neoformado. A análise qualitativa das lâminas permitiu

avaliar o tecido ósseo nos grupos experimentais. Foi utilizado um microscópio de luz

Leica DM 4000B, acoplado a uma câmera digital de vídeo Leica EC3 para captura das

imagens as quais foram analisadas em aumentos de 20x e 40x. A análise quantitativa do

volume de tecido ósseo de cada animal foi analisada por meio do software Image J de

lâminas histológicas e os dados obtidos foram submetidos à análise estatística adequada

com significância para p<0.05.

3.8. Forma de análise dos resultados

Os dados obtidos das culturas células (n=5) foram analisados através de teste

estatístico apropriado após aplicação de testes de normalidade e homogeneidade e a

significância foi fixada em 5%.

Trabalho de conclusão de curso

17

4. Resultados

4.1. Ciclo estral das ratas

A Figura 1 mostra imagens de esfregaço vaginal 16 dias após a cirurgia. Nas ratas

controles podemos observar a predominância de leucócitos e células epiteliais nucleadas

e anucleadas, definindo a fase metaestro. Já o esfregaço de ratas ovariectomizadas

mostrou predominância de leucócitos, definindo a fase diestro, confirmando o sucesso

da ovariectomia.

Figura 1. Fotomicrografia de esfregaço vaginal, dezesseis dias após cirurgia. A e C)

Esfregaço de ratas controles em fase metaestro com leucócitos e células epiteliais

nucleadas e anucleadas. B e D) Esfregaço de ratas ovariectomizadas na fase diestro

com predominância de leucócitos.

4.2. Proliferação Celular (MTT)

O ensaio bioquímico colorimétrico que estima a proliferação celular (MTT)

apresentou resultados significantes no período de sete e dez dias. No período de 7 dias, o

grupos Cc mostrou proliferação celular significativamente maior quando comparado aos

outros grupos experimentais e o grupo OVX mostrou proliferação significativamente

Trabalho de conclusão de curso

18

maior em relação ao grupo controle. Já no período de 10 dias, podemos observar um

aumento significativo da proliferação de células no grupo OVXc quando comparado ao

controle. No período de 14 dias, todos os grupos mostraram resultados similares (Figura

3).

Figura 2. Proliferação celular de células osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas após cultura

de 7, 10 e 14 dias, divididas em grupos C - Controle; Cc –Controle Cafeína; OVX - Tratado e OVXc –

Tratado Cafeína. Análise de variância (ANOVA) para 7 e 10 dias e Kruskal-Wallis para 14 dias, com

significância para p<0.05.

4.3. Quantidade de proteína total

A quantidade de proteína total aos 7 dias de cultura foi significativamente maior

no grupo OVXc quando comparado aos grupos C e Cc, assim como foi maior no grupo

Trabalho de conclusão de curso

19

OVX quando comparado ao grupo C. Já aos 10 dias, também foi observado um

aumento no grupo OVXc quando comparado ao grupo C.

Figura 3. Quantidade de proteína total de células osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas após

cultura de 7, 10 e 14 dias, divididas em grupos C - Controle; Cc –Controle Cafeína; OVX - Tratado e

OVXc– Tratado Cafeína. Análise de variância (ANOVA) para 7 e 10 dias e Kruskal-Wallis para 14 dias,

com significância para p<0.05.

4.4.Detecção in situ de Fosfatase Alcalina (ALP)

A técnica de Fast Red pode ser usada como um cromogênio para coloração

imuno-histoquímica. Na presença de enzima fosfatase alcalina, o líquido produz um

produto de reação vermelho que pode ser visto usando um microscópio ou

macroscopicamente, facilitando a quantificação de nódulos formados. O procedimento

foi aplicado nas placas com os períodos de 7, 10 e 14 dias. Na Figura, pode ser

Trabalho de conclusão de curso

20

observado que a detecção in situ da ALP no grupo OVX foi maior que nos grupos C e

Cc aos 7 e 10 e 14 dias, assim como no grupo OVXc aos 7 e 10 dias. Já aos 14 dias, a

presença de ALP nos poços foi menor no grupo OVXc quando compactado ao grupo

OVX, mas maior quando comparado aos grupos C e Cc neste período.

Figura 4. Detecção in situ da atividade de fosfatase alcalina aos 7 dias, 10 e 14 dias em células

osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas divididas em grupos controle (C), controle com

cafeína (Cc), tratado(OVX), tratado com cafeína(OVXc).

4.5. Detecção e quantificação de nódulos mineralizados

Este experimento mostrou que aos 17 dias, a quantidade de nódulos mineralizados

diminui no grupo de ratas ovariectomizadas, ao passo que a administração da cafeína

aumentou a quantidade de nódulos no grupo Ovx caf, com valores similares para o

grupo controle e controle com cafeína.

Trabalho de conclusão de curso

21

Figura 5. Quantificação dos nódulos mineralizados por coloração com vermelho de alizarina aos 17 dias

em células osteoblásticas de ratas controle e ovariectomizadas divididas em grupos controle (C), controle

com cafeína (Ccaf), tratado(OVX), tratado com cafeína(OVXcaf).

4.6. Expressão gênica quantitativa

A expressão gênica quantitativa mostrou que aos 10 dias e 14 dias, a presença da

cafeína promoveu a indução dos genes OC, Runx2 e BMP4 quando comparado aos

grupos ovariectomizados que não receberam a substância. Já o gene ALP sofreu uma

repressão significativa aos 10 dias, assim como SP7 e o iBSP na presença da cafeína.

Aos 10 dias, o ALP não sofreu modificações, enquanto que no grupo OVX c o gene

SP7 foi induzido em relação ao grupo Ovx neste mesmo período.

Trabalho de conclusão de curso

22

Figura 6. Expressão gênica quantitativa de genes associados ao metabolismo ósseo em células

osteoblásticas após 10 e 14 dias de cultura de ratas ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas + cafeína

(OVX caf).

Trabalho de conclusão de curso

23

4.7. Análise histológica qualitativa e quantitativa

As lâminas histológicas do fêmur obtidas por meio de coloração com

hematoxilina-eosina e foram analisadas qualitativamente. Como podemos observar na

figura 9, as lâminas dos grupos controles apresentam o campo histológico preenchido

por trabéculas ósseas densas e bem conectadas; Já no grupo ovariectomizado nota-se um

menor volume trabecular com perda da conectividade, muito característico em situações

de osteoporose. Após a administração da cafeína, o volume trabecular parece maior e

mais conectado, similar aos grupos controles.

Figura 7. Análise histológica do fêmur das ratas do grupo controle (A), controle +cafeína (B),

ovariectomizado (C), ovariectomizado + cafeína.

A análise quantitativa foi feita com ajuda do programa Image J, onde foi possível

contar a quantidade de trabécula óssea que tínhamos em relação a quantia de osso

A B

C D

Trabalho de conclusão de curso

24

medular (Figura 10). Depois de passar pelo programa encontrou-se a porcentagem de

trabécula óssea de cada fotografia da lâmina.

Figura 8. A figura mostra a contagem de pontos de trabécula óssea na intersecção da grade colocada

sobre as lâminas no programa Image J .

Trabalho de conclusão de curso

25

Figura 9. Percentual de volume de tecido ósseo no fêmur de ratas controles (C), controle + cafeína (Cc),

ovariectomizadas (OVX) e ovariectomizadas mais cafeína (OVXc).

A análise quantitativa mostrou que o grupo de ratas ovariectomizadas apresentou

uma diminuição significativa do percentual de volume ósseo no fêmur quando

comparado aos grupos controles. Entretanto, a administração de cafeína não diminuiu

significativamente o volume ósseo em uma situação de osteoporose (Figura 11).

5.Discussão

Muitos fatores como genética, etnia, nutrição e outros fatores relativos ao estilo de

vida, além da queda nos níveis de estrógeno, estão relacionados com a densidade

mineral no período pós menopausa das mulheres (Huitrón-Bravo et al., 2017). Em

conjunto, eles são capazes de regular a produção de citocinas que influenciam a

atividade dos osteoclastos e osteoblastos interferindo na formação óssea. A osteoporose

é uma doença óssea sistêmica que por si só não causa sintomas, caracterizada por uma

Trabalho de conclusão de curso

26

densidade mineral óssea diminuída e alterações da microarquitetura e da resistência

óssea que causam aumento da fragilidade óssea e, consequentemente, aumento do risco

de fraturas. Estima-se que esse problema atinge 25% das mulheres na menopausa e,

após os 65 anos, esse número sobe para 33,33%. Essas mulheres chegam a perder de 40

a 50% da massa óssea até o final da vida (Amadei et al., 2006).

A cafeína tem grande importância no cotidiano da população mundial estando

presente em diversas bebidas como café, chá, energéticos e alguns medicamentos

vendidos sem prescrição médica (Conlisk e Galuska, 2000; Bastos et al., 2014). Este

psicoestimulante tem uma variedade de respostas celulares e farmacológicas,

produzindo efeitos biológicos antioxidantes, angiogênicos, antibióticos, anti-

hipertensivos e anti-inflamatórios (Sakamoto et al., 2001; Macedo, Brentegani e

Lacerda, 2015). Devido a relevância dessa doença e desta substância se percebe uma

necessidade de maiores estudos sobre a relação entre eles. Uma vez que os resultados já

existentes na literatura mostram-se discordantes.

Os dados obtidos na proliferação celular (MTT) se mostram bem significativos.

Aos 7 dias o grupo controle cafeína apresentou maior volume. Aos 10 dias o grupo Ovx

cafeína mostrou resultados um pouco melhores que os demais. Pode-se notar com isso

que a cafeína apresentou influencia significativa no resultados de ambos os grupos.

Em relação a fosfatase alcalina, sua atividade não teve resultados expressivos aos

7 e 10 dias, apenas aos 14 dias que o grupo Ovx mostrou resultados um pouco maiores

em relação aos demais grupos. Já na detecção in situ da fosfatase alcalina tanto aos 7,

como 10 e 14 dias pode-se observar uma expressão maior dos grupos controle e

controle cafeína e aos 7 e 10 dias é notável a predominância do grupo ovariectomizado

com administração de cafeína. Com isso, se observa o efeito do psicoestimulante sobre

ao enzima e consequentemente a produção de matriz óssea. A cafeína também mostrou-

Trabalho de conclusão de curso

27

se ativa nos resultados da quantificação de proteína total em que nos períodos de 7 e 10

dias o grupo ovariectomizado com administração de cafeína apresentou números

maiores que os demais grupos.

A expressão gênica mostrou resultados interessantes no que diz respeito à

modulação dos genes associados ao metabolismo ósseo. A administração de cafeína

promoveu a indução de alguns genes como OC, Runx2 e BMP4, todos essenciais na

formação da matriz óssea e sua mineralização. Por outro lado, genes como ALP, SP7 e

iBSP sofreram repressão nas células osteoblásticas na presença desta substância. Esses

dados sugerem que a dose administrada pode interferir com a modulação gênica e que

os genes fazem parte de cascatas de sinalização onde outros genes possam estar

envolvidos e culminando com determinada característica funcional.

A análise qualitativa das laminas histológicas obtidas dos fêmures dos animais

mostrou nos dois grupos controles uma grande quantidade de trabéculas ósseas bem

conectadas e rodeadas por osteoblastos ativos e medula óssea celular. Já o grupo

ovariectomizado apresentou uma quantidade reduzida de trabéculas, que se mostraram

desconectadas. O grupo Ovx com administração de cafeína mostrou maior volume

trabecular, similar aos grupos controles. Apesar disso, na análise quantitativa das

lâminas histológicas, observamos que este aumento do trabeculado ósseo não foi

significativo quando comparado ao grupo Ovx.

6. Conclusão

Diante desses resultados e dos anteriormente obtidos nos estudos in vitro e in vivo

do efeito da cafeína, é possível notar que a substância apresenta influência sobre a

atividade celular refletindo na qualidade de tecido ósseo femoral. Apesar da influência

na atividade funcional de células osteoblásticas na indução de genes relacionados ao

Trabalho de conclusão de curso

28

metabolismo ósseo, sugere-se que a concentração de cafeína administrada não prejudica

(visto pela análise qualitativa histológica) a formação e manutenção do tecido ósseo em

uma situação de osteoporose. Mais estudos com outras concentrações são necessários

para que mais informações sejam coletadas sobre o efeito da cafeína na osteoporose.

7. Agradecimentos

Devo agradecimentos à minha orientadora, Karina Fittipaldi, por confiar em mim

mesmo sendo tão nova e sem experiência em pesquisa; ao Roger, técnico responsável

pelo laboratório, que mesmo diante de meus tropeços não desistiu de me ajudar. Aos

meus pais, que sempre me apoiaram nesta empreitada. Este trabalho foi realizado com o

apoio de FAPESP, sendo a aluna agraciada com uma bolsa de Iniciação Científica e

posterior renovação por mais 12 meses (processo 2014/19679-6).

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