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Técnicas de Purificação

Maria Alice Zarur Coelho

Priscilla Filomena Fonseca Amaral

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

Introdução• Meios de fermentação:

- produtos extracelulares (solúveis e insolúveis),- produtos intracelulares,- fragmentos de células,- microrganismos intactos- substratos ou demais componentes não convertidos em produto.

• Diversidade: métodos de separação passíveis de utilização é muito vasto.

• Quatro etapas similares, que ocorrem seqüencialmente:- remoção de material insolúvel- separação dos produtos- purificação- polimento (geralmente associado a cristalização)


suspensão diluídaprocesso de separação e/ou purificação composto altamente

purificado

Separação

Purificação

Etapas de Recuperação

• Operações Unitárias:

- centrifugação- filtração- adsorção,- extração com solvente

• Duas etapas vêm sendo combinadas em um único estágio;

• Nota-se um grande aumento da concentração do produto nesta fase


Separação

Remoção de material insolúvel

Separação de produtos


• Enzimas extracelulares:- Resfria-se o meio fermentado a 5°C (estabilidade e evitar contaminação)- pH ajustado

• Fungos filamentosos: - centrifugação- ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)

• Leveduras e Bactérias: - prévia floculação (sulfato de alumínio, CaCl2)- centrifugação - ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)


Separação


• Enzimas hidrolíticas: centrifugação

- bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da protease subtisilina)- bactérias gram-negativas como Klebsiella pneumoniae (produtora da pululanase): presença de membrana externa – complicações: liberação apenas parcial da enzima no meio.


Separação


• Obtenção de enzimas intracelulares:

Técnicas de lise celular: - métodos físicos,- métodos químicos,- métodos enzimáticos


Extração

Enzima localizada na parte externa da membrana celular

(mas não é extracelular)

liberação da enzima: destruição parcial ou total da célula

(exemplo: autólise das células a 50oC durante 14 horas).


• Métodos enzimáticos:

- Utilização de enzimas que catalisam a digestão de parede celular: Lisozima – bactériasGlucanase, tripsina e protease – leveduras

- Pouco usado industrialmente: alto custo


Extração




Extração

Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicasbeta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico(Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num pepitídeoglicano

Tratamento prévio com EDTA




Extração

Glucanase, tripsina e protease – leveduras


• Métodos químicos:

- tratamentos com bases (NaOH) – enzima tolerante a alto pH

- choque osmótico (variação da concentração de soluto presente no tampão):

Extrato resultante com pouca contaminaçãoBactérias Gram-positivas: alta pressão osmótica interna

- tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sódio, triton)Agem sob condições de baixa força iônica, combinando as

lipoproteínas da membrana para formar micélios

- tratamento com solventes orgânicos (álcool isopropílico, etanol).


Extração


• Métodos físicos:

- Congelamento / descongelamento: formação de cristais degelo intracelulares

DemoradoPode inativar enzima

- Moagem com abrasivos: moinhos vibratórios com esferas de vidro

largamente empregadaOpera em batelada ou contínuoNecessita de sistema de resfriamento

- Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais


Extração


• Métodos físicos:

- Cisalhamento líquido: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão

- Sonicação: aparelhos de ultrassomaltíssimas frequênciasruptura das células por cavitaçãoNão muito aplicada em escala industrial

O extrato enzimático contém muitos componentes celulares. Em particular, as células bacterianas lisadas liberam elevadas quantidades de ácidos nucleicos.


Extração


• Extração a partir de Tecidos Animais e Vegetais

- Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em leveduras

Homogeneização do tecido selecionado em uma solução tampão adequada é a técnica mais amplamente empregada.

Segundo passo: se utiliza a centrifugação diferencial para selecionar a subfração celular apropriada.

- Tecidos vegetais: Forças necessárias são elevadasPresença de compostos fenólicos facilmente oxidados


Extração

Etapas de Purificação

• As características das etapas de um processo de purificação são, em grande parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicação

• Existe necessidade para a purificação completa de uma enzima?

• Maioria das aplicações: suficiente um menor grau de purificação ainda que existam algumas atividades contaminantes desde que não afetem substrato(s), produto(s) ou enzima(s) envolvido(s) em um processo específico.

• Existem algumas aplicações (na medicina clínica, área farmacêutica, análises específicas, projeto de biosensores, engenharia genética) onde é essencial que a proteínas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas.



• Cuidados devem ser tomados para que ao passar de uma etapa a outra mínimas alterações nas condições de estabilidade, pH, temperatura, etc. sejam promovidas.

• As enzimas são moléculas de elevado peso molecular, cujas funções dependem de uma estrutura altamente ordenada.


• Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biológica são as principais características proteicas utilizadas na etapa de purificação das proteínas


Precipitação

- A solubilidade de uma proteína é o resultado de:interações polares com o solvente aquoso,interações iônicas com os sais presentes,forças eletrostáticas de atração e repulsão.

- O desempenho do processo de precipitação depende também da composição da solução, incluindo as propriedades das demais proteínas presentes (co-precipitação).

- Outros fatores determinantes na solubilidade das proteínas: pH, temperatura e força iônica.


Concentração


• Precipitação Isoelétrica:

- Ponto isoelétrico: pH no qual as proteínas apresentam a carga líquida igual a zero.não ocorre migração das molécula se submetidas a um campo elétrico. Abaixo do PI: forma catiônicaAcima do PI: forma aniônica.

- Quanto maior o caráter iônico:maior a tendência à solvatação.


Concentração


• Precipitação com sais inorgânicos:

- Sais inorgânicos neutros (NaCl, (NH4)2SO4) que promovam a precipitação seletiva das proteínas.

- Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das proteínas.

- Distribuição de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula de proteína: afeta enormemente sua solubilidade frente a vários solventes.

Grupos hidrofóbicos: papel importante no comportamento das moléculas proteicas, devido à carga e aos grupos polares que apresentam;


Concentração



- A força iônica mede a concentração das cargas em solução. Variação da força iônica (concentração do sal) no meio.Solubilidade aumenta exponencialmente com a concentração do sal,

passa por um máximo e depois decresce.


Concentração



- Salting-in: forças de atração entre os íons da proteína e os íons do sal;íons do sal: muito hidratados - contribuem para o aumento da camada de

hidratação da molécula, favorecendo o aumento da solubilidade.

- Salting-out:

O fenômeno da salting out é bastante apreciável no ponto isoelétrico, onde a repulsividade eletrostática passa por um mínimo.


Concentração

Ptn´s mais susceptíveis àaglomeração

redução das interações entre a água e os

grupos polares das proteínas

decréscimo na atividade

da água

Aumento da concentração

iônica


Sulfato de amônio:- barato e de fácil obtenção;

- não é tóxico;

- alta solubilidade mesmo em baixas temperaturas;

- efeito estabilizante em algumas proteínas, sendo normalmente utilizado no processo de armazenagem de enzimas comerciais;

- alta concentração deste sal previne ação proteolítica e bateriana, o que reduz as perdas de atividade enzimática.


Concentração

OBS: a adição do sal deve ser lenta e sob agitação para favorecer a homogeneização


• Precipitação com solventes orgânicos:

- A adição de solventes orgânicos (acetona e álcool): diminui a sua solubilidade. abaixamento da constante dielétrica da solução, ou seja, diminuição da atividade da água.

- Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade que ele apresenta de se colocar entre dois íons de cargas opostas e separá-los, solvatando-os.

Constante dielétrica da água: muito elevadaA água separa os íons de carga oposta, solvatando-os, e mantendo a

proteína em solução.O solvente já o faz com mais dificuldade, permitindo maior atração

entre as moléculas proteicas.


Concentração


• Precipitação com solventes orgânicos:

- Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC);

- O uso de solventes tem diminuído nos últimos anos;

- Mais usados: metanol, etanol e acetona – inflamáveis;

- Vantagem: recuperação do solvente para reutilização.


Concentração


• Precipitação com polímeros:

- Polietilenimidas e polietilenoglicóis de diferentes pesos moleculares.

- Mecanismo de precipitação: é similar ao existente com solventes orgânicos e resulta da mudança na solvatação das moléculas proteicas pela água.

- Acredita-se que as moléculas de polímero ocupem o lugar das moléculas proteicas na solvatação.

- Muitas enzimas precipitam com concentrações de polímero variando entre 15 e 20%.


Concentração


• Ultrafiltração:

- Princípio: Uma membrana semi-permeável permite a separação das moléculas de solvente das moléculas enzimáticas grandes porque apenas as moléculas pequenas podem penetrar na membrana quando a pressão osmótica éexcedida.

- O processo de ultrafiltração éempregado para concentração, dessalinização e fracionamento.

- A força motriz é a diferença de pressão entre os lados da membrana.


Concentração



Vantagens do processo:- utiliza baixas pressões hidrostáticas;- não ocorre mudança de fase;- não utiliza reagentes químicos;- mantém força iônica e pH da solução concentrada;- evita desnaturação e inativação das enzimas.

Desvantagens:- Concentração por polarização (acúmulo de moléculas grandes perto da

superfície da membrana),- Formação de camadas de géis na membrana (reduz-se através da

manutenção de escoamento turbulento ou laminar com alta vazão)- fouling (deposição) na membrana (especialmente agentes anti-espumantes

usados nas fermentações ocasionam depósitos).


Concentração



- Materiais: Acetato de celulose e polímeros orgânicos (polisulfonas e polipropileno)

- Fluxo inversamente proporcional a resistência. Como minimizar a resistência?

- Aumentando o tamanho dos poros (até o máximo)

- Aumentando a quantidade de poros;

- mínima expessura da membrana;

- Máxima hidratação da membrana;

- Mínima viscosidade da solução;


Concentração


• Liofilização:

- Concentração dos sais presentes na solução inicial

- Pode provocar perda na atividade enzimática

- Uma vez ativa em forma de pó: mais estável do que em solução aquosa

- Cuidado: não descongelar durante o processo


Concentração


• A cromatografia pode ser considerada como uma separação diferencial dos componentes de uma amostra entre uma fase móvel e uma fase estacionária.

• Fase estacionária: partículas esféricas de um material insolúvel empacotado em uma coluna;

• A mistura de enzimas é introduzida na coluna pela fase móvel e forçada a migrar através da coluna;

• As enzimas que possuem maior atração pela fase estacionaria irão migrar de forma diferenciada das que tem maior afinidade pela fase estacionária.


Cromatografia



• Cromatografia de gel-filtração (permeação em gel, exclusão por tamanho ou peneira molecular)

- Para o fracionamento e purificação de proteínas e aplicável à determinação de seus pesos moleculares.

- Moléculas são separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em solução, utilizando matrizes (ou géis) com porosidade definida.Estabilidade, rigidez, tamanho de partícula, distribuição de poros e inércia química são fatores que podem afetar o tamanho da coluna, a vazão a ser adotada e a eficiência de separação.

- Definição: partição difusional das moléculas de soluto entre a fase móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros do gel.


Cromatografia


• Cromatografia de gel-filtração

- Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligações cruzadas, contendo poros de diferentes tamanhos que permitem o acesso de apenas algumas moléculas.


Cromatografia

Ex.: matrizes formadas por ligações cruzadas de dextranas(Sephadex):

Moléculas maiores: eluídas mais rapidamente;

Moléculas menores: movem-se mais lentamente por terem um maior caminho a percorrer.



-Escolha do gel: depende da finalidade- Separação de moléculas maiores (enzima) de menores (sais): geis com

poros pequenos - Separação de moléculas de tamanho próximo: géis que fracionam várias

faixas de peso molecular

- Parâmetros críticos para a otimização do processo de gel-filtração:- volume da amostra;- concentração da amostra;- vazão adotada;- altura do leito da coluna.


Cromatografia



- Vantagens:- não utilização de energia,- forças cisalhantes desprezíveis,- sistemas simples de automação- altas recuperação aliadas a máxima resolução.

- Desvantagens: - quantidade de amostra aplicada: máx 1-2% do volume total da coluna; - géis, Sephadex e Sepharose (agarose), tendem a empacotar;- problemas de diluição no processo de eluição da coluna.


Cromatografia



- Equipamento: coluna,detector de UVcoletor de fraçõesControle de fluxo (bomba peristáltica)

- Utilizada para etapas finais de purificação, mas pode ser usada na dessalinização e na determinação de pesos moleculares.


Cromatografia


• Cromatografia de Troca-iônica

- Fracionamento de substâncias biológicas que apresentem semelhanças em suas propriedades químicas e fisico-químicas,

- Método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a um suporte que contém uma carga oposta.

A separação ocorre porque as interações eletrostáticas entre os grupos são reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador.

Esta afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força iônica, do tampão, etc.


Cromatografia



- Suportes: trocadores iônicos ou resinas, sendo normalmente empregados em colunas.As resinas são obtidas pela introdução de grupamentos polares em matrizes insolúveis em água. Ex.: Celulose, poliacrilamida, géis de dextrana e copolímeros de estireno e divinilbenzeno.

- Classificação:Permutadores de cátions:

grupamentos ácidos (ativos em pH > pK)Permutadores de ânions:

grupamentos básicos (ativos em pH < pK)


Cromatografia



- Ativação do trocador catiônico:

Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma sódica, ou seja:


Cromatografia

tratamento com tampão cujo pH deve ser superior ao pK do grupa-mento trocador

trata-se com uma base forte (NaOH)

lava-se com água deionizada

Trata-se a resina com um ácido

forte (HCl)


R-COOH NaOH R-COO- Na+

Forma Inativa Forma Ativa



- Ativação do trocador aniônico:

Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma cloreto, ou seja:


Cromatografia

tratamento com tampão cujo pH

deve ser inferior ao pK do grupamento

trocador

trata-se com uma base forte (NaOH)


Trata-se a resina com um ácido

forte (HCl)


R-COOH HCl R-CO+ Cl-

Forma Inativa Forma Ativa



- Caso uma solução contendo um cátion X+ for colocada em contato com um trocador catiônico ativo, este deslocará o cátion presente no trocador e será

fixado:

- Capacidade total de troca: função do tipo de trocador. Importância deste parâmetro: se excedido, os íons não serão totalmente retidos. “capacidade disponível ou real de troca”: capacidade de cada trocador em

uma determinada condição experimental (pH, natureza do tampão, força iônica, etc.).


Cromatografia

R-COO-Na+ + X+ R-COO- X+ + Na+



- Escolha do tipo de resinaProteínas com cargas positivas e negativas:

Carga é função do pH do meio,Fator principal: estabilidade da

molécula nos diferentes pH’s. Proteínas labéis: trocadores fracos

- Trocador catiônico (p.ex. CM-celulose), uma força iônica baixa e um pH = 5 são condições ideais para fixar as proteínas.


Cromatografia

(pK típico dos grupos carboximetílicos = 4) e a maioria das proteínas se encontrariam positivamente carregadas (abaixo do seu ponto isoelétrico).

• Cromatoenfoque:

- As proteínas são eluídas de uma coluna de troca iônica utilizando-se um enfraquecedor

- Efeito de enfoque: concentra a enzima de interesse

- A coluna é equilibrada com um tampão e, depois da aplicação da amostra, se utiliza um segundo tampão, enfraquecedor de pH (para a eluição).

- Geração de um gradiente linear de pH “in situ” como conseqüência da capacidade enfraquecedora da resina.

- Este gradiente de pH tem efeito de enfoque e as moléculas com o ponto isoelétrico específico se concentram conjuntamente.



Cromatografia

• Cromatografia de adsorção:

- Os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase estacionária por forças do tipo van der Waals, ligações hidrogênio ou interações eletrostáticas.

- O deslocamento das partículas adsorvidas será função da maior ou menor interação destas com a fase estacionária.



Cromatografia

• Cromatografia de afinidade:

- Cromatografia de adsorção onde o suporte apresenta afinidade específica com a substância a ser isolada.

- É capaz de fornecer um alto grau de purificação.

- Acopla-se covalentemente uma molécula ligante apropriada a uma matriz insolúvel.

- A molécula ligante adsorve da solução a substância a ser isolada, sendo eliminadas as que não apresentam nenhuma afinidade com o suporte.

- Dessorção: mudanças nas condições experimentais ([substrato] , coenzimas).

- Isolamento de substâncias de acordo com sua função biológica



Cromatografia

• Interação hidrofóbica:

- Observou-se: proteínas são retidas nos géis de afinidade contendo “braços” de hidrocarbonetos (C2 a C10).

- As interações hidrofóbicas são mais fortes em alta força iônica sendo, portanto, convenientemente utilizadas após a precipitação com sais ou cromatografia de troca iônica.

- A eluição pode ser efetuada alterando o pH do solvente, a força iônica ou usando um modificador orgânico (como etilenoglicol).



Cromatografia

• Eletroforese:

- Existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas

- Quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas.

- A taxa de migração destas partículas, quando submetidas a um campo elétrico, é proporcional a força do campo e a carga efetiva das partículas e inversamente proporcional ao atrito, dependo da sua forma e tamanho.



Cromatografia

• Eletroforese:

- Papel: simples e mais usado Em alguns casos, não se obtém uma

boa separação.

- Em gel:amido, agarose e poliacrilamidaUtilização de outros fatores como a

difusão e a separação por peneiramento molecular, além do campo elétrico.

Mais conhecida: SDS-poliacrilamida usada na determinação de peso molecular e dapureza da amostra.



Cromatografia

• Eletroforese:

- Sódio dodecilsulfato (SDS): detergente aniônico que se liga fortemente as proteínas causando sua desnaturação e fornecendo uma carga negativa constante por unidade de massa.

- Os complexos SDS-proteína: movem-se para o anodo durante a eletroforese.

- Propriedades de peneira molecular do gel: mobilidades são inversamente proporcionais ao logaritmo de seus pesos moleculares.

- Proteínas padrão de peso molecular conhecido são aplicadas: o peso molecular das amostras proteicas pode ser determinado.

- Relevação do gel: Comassie Brilliant Blue, Bromofenol – ZnSO4 – ácido acético ou Nitrato de prata.



Cromatografia

• Géis bidimensionais:

- Amostras são parcialmente separadas por diferenças entre pontos isoelétricos, usando uma coluna cilíndrica.

- O anodo possui um pH menor que o catodo e um gradiente estável de pH émantido.



Cromatografia

- Proteínas abaixo do seu pI: carregadas negativamente e migrarão para o catodo, até uma região onde o pH corresponda a seu pI, cessando o movimento de migração. Oposto: proteínas acima do seu pI.

- Esta técnica é conhecida como enfoque isoelétrico.

• Géis bidimensionais:

- Após separação parcial: eletroforese em SDS no sentido perpendicular àprimeira separação - separação baseada nas diferenças de peso molecular.



Cromatografia

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