CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI

ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA

PURIFICAO DE PRODUTOS BIOTECNOLGICOS

PROF. Dsc. ALEX FERNADO DE ALMEIDA

PRODUO E PURIFICAO DE LIPASE

ADRIA CARNEIRO BORGES

DANILO JOS MACHADO DE ABREU2

DOUGLAS BORDIGNON3

PATRCIA VERDUGO PASCOAL4

VICTORIA MENEZES IEMBO5

WANESSA ROCHA6

GURUPI-TO

OUTUBRO/2014

_______________________________

1Nmero de matricula: 2010213626

2Nmero de matricula: 2010213603

3Nmero de matricula: 2010213609

4Nmero de matricula: 2010111682

5 Nmero de matricula: 2011110780

6Nmero de matricula: 2011 110803

SUMRIO

LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... 3

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... 4

1 INTRODUO ............................................................................................................. 5

2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 7

2.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 7

2.2 Objetivos especficos .............................................................................................. 7

3 METODOLOGIA ..................................................................................................... 7

3.1 Obteno de extrato proteico .................................................................................. 7

3.1.1 Preparo do cultivo da fermentao em estado slido ....................................... 7

3.1.2 Preparo do cultivo da fermentao em estado submerso ............................ 8

3.1.3 Obteno de extrato proteico em fermentao slida ................................. 8

3.1.4 Obteno de extrato proteico em fermentao submersa ........................... 8

3.2 Determinao da atividade enzimtica .............................................................. 9

3.2.1 Curva de Calibrao de p-Nitrofenol ............................................................... 9

3.2.2 Atividade Enzimtica da Lipase ................................................................. 9

3.3 Determinao de protenas Totais .................................................................... 10

3.3.1 Curva de Calibrao para Protenas (Mtodo de Bradford) ........................... 10

3.3.2 Determinao das protenas totais ............................................................ 11

3.4 Precipitao de protenas ................................................................................. 11

3.5 Dilise .............................................................................................................. 11

3.6 Cromatografia de interao hidrofbica .......................................................... 12

3.7 Rendimento da purificao .............................................................................. 12

3.8 Atividade especfica .............................................................................................. 13

3.9 Fator de purificao .............................................................................................. 13

4 RESULTADO E DISCUSSO .............................................................................. 13

4.1 Obteno do extrato proteico ........................................................................... 13

4.2 Curva de calibrao do -nitrofenol palmitato ( -NPP) ...................................... 14

4.2.1 Atividade enzimtica ...................................................................................... 16

4.3 Quantificao de protena pelo Mtodo de Bradford ............................................ 16

4.3.1 Determinao das protenas totais .................................................................. 18

4.4 Cromatografia de interao hidrofbica (CIH) ..................................................... 18

5 CONCLUSO ........................................................................................................ 21

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................................ 22

3

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Volume do -NPP em mol e mdias das absorbncias lidas em

espectrofotmetro em comprimento de onda de 405 m.

Tabela 2 Concentraes de soroalbumina bovina utilizadas e valores das respectivas

leituras de absorbncia.

Tabela 3 Atividade enzimtica das fraes parciais aps a CIH

Tabela 4 Atividade enzimtica, rendimento e concentrao final de protenas da

fermentao slida.

Tabela 5 - Atividade enzimtica, rendimento e concentrao final de protenas da

fermentao submersa.

4

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Curva de calibrao do pnitrofenol palmitato a partir dos valores obtidos pela

leitura de densidade ptica, com comprimento de onda de 405 m.

Figura 2- Curva de calibrao obtida pela relao entre as concentraes de

soroalbumina bovina e os valores de absorbncia lidos.

Figura 3 Cromatograma de interao hidrofbica, Absorbncia 280 nm(), Atividade

enzimtica (U/ml) (-), gradiente Triton X-100 (%)(-)

5

1 INTRODUO

A utilizao de enzimas um mtodo antigo, onde o homem explora de forma

natural a mesma tendo como objetivo produzir diversos produtos base de fermentados,

onde suas aplicaes eram consideradas rsticas sem qualquer conhecimento sobre

reaes enzimticas envolvidas ao decorrer do processo. Com o passar dos anos foram

se descobrindo os mecanismos dessas reaes qumicas, bem como seus benefcios nos

diversos ramos de atuao da atividade humana. Essas reaes enzimticas so contidas

de vantagens como apresentar elevada especificidade dos substratos utilizados e

produtos gerados. As enzimas so destinadas para industrias farmacutica, saponcea,

lctea, e outras, sendo uma matria prima para a produo de produtos (WANDERLEY;

NEVES; ANDRADE, 2011).

Em meados de 1926, provou-se pela primeira vez que as enzimas eram

protenas, depois de passar por processos de isolar urase de extratos de feijo. Em

seguida varias protenas foram isoladas passando por processos de classificao,

purificao e isolamento. No entanto, s em 1950 ocorreram os grandes avanos na

tecnologia das enzimas, com a juno do progresso e com uma maior compreenso da

bioqumica, o que relacionou uma grande variedade de enzimas presentes nas clulas

vivas e tambm seu modo de ao. A partir da dcada de 80 as empresas produtoras de

enzimas empregam mtodos de modificao gentica para se ter maiores retornos

quanto a qualidade, eficincia, bem como o desenvolvimento de novos produtos A

demanda de enzimas industriais para os prximos anos dever crescer gradualmente,

atingindo a marca dos US$ 3,74 bilhes at o ano de 2015. Esse crescimento se deve ao

aumento da demanda dessas enzimas, como as proteases e carboidrases, onde essas so

responsveis pelos maiores segmentos de produtos no mercado mundial de enzimas

industriais (WANDERLEY; NEVES; ANDRADE, 2011; ALMEIDA, 2012).

A produo de lipases tem sido desenvolvida principalmente por fermentao

submersa (FSM) devido aos aspectos de engenharia dominados e desenvolvidos. Est

associada ao crescimento microbiano e consequentemente, s variaes da composio

e condies do cultivo (MESSIAS, 2011). Na fermentao em estado slido (FES), os

fungos so considerados os micro-organismos mais propcios, devido variedade de

produtos de seu metabolismo e tambm ao desenvolvimento das hifas que permite aos

mesmos maior penetrao no substrato e nas regies porosas entre partculas da matria-

prima, a exemplo tem-se a espcie Aspergillus nger (SANTANA, 2012).

6

A purificao de produtos destinada para remover contaminantes at que se

obtenha um produto de elevado grau de pureza, ou seja, livre de qualquer dano que

possa prejudicar a qualidade do mesmo. Para isso feito uma serie de processos no que

remete ao produto biotecnolgico, mantendo a estabilidade da molcula e evitando a

degradao da protena. Relacionado a qualidade final do produto, este deve conter as

caractersticas necessrias para seu uso, tanto em humanos, para diagnstico, quanto

para uso veterinrio (JUNIOR, 2001; ALMEIDA e KURTENBACH, 2002).

O processo de separao e purificao de bioprodutos considerado um

segmento de grande importante na indstria, pois o mesmo representa cerca de 80 a

90% do custo de produo. Ento, tem-se que o desenvolvimento de um processo

eficiente e que se tenha um baixo custo de execuo, de extrema relevncia. A

extrao lquido-lquido vem despertando interesse a fim de ser utilizada como etapa

intermediria de separao, que substitui mtodos de separao mais caros ou diminui o

nmero de etapas de separao necessrias ao processo. Este processo de separao

baseado na distribuio do soluto entre as fases e a miscibilidade parcial dos lquidos

(FERREIRA et al, 2011).

Os mtodos para purificao das enzimas esto baseados nas suas propriedades,

consistindo na solubilidade, grau de hidratao, tamanho, densidade e distribuio de

carga, forma, grupo reativo especfico e estabilidade relativa. O processo de purificao

de uma protena composta por varias etapas, no existindo um mtodo nico ou um

conjunto de mtodos aplicveis, contudo, para qualquer protena, possvel escolher

uma sequncia de etapas de separao que, dependendo da pureza desejada, podem

resultar em aumento do custo e reduo da produo (BIAZUS, 2010).

O nmero de etapas necessrias deve ser mnimo, refletindo em menores custos,

e deve assegurar alto rendimento. A combinao das tcnicas cromatogrficas como a

filtrao em gel, cromatografia de troca inica, de interao hidrofbica e afinidade

recomendada na purificao de protenas, no existindo um protocolo definido para

purificao. Ento, faz-se necessrio desenvolver um protocolo especfico, utilizando-se

os diversos mtodos de purificao existentes de uma forma coerente e que acarrete em

um menor custo possvel (FURIGO JUNIOR, 2001).

7

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Produzir e purificar a enzima lipase atravs de mtodos tradicionais de

purificao de protenas.

2.2 Objetivos especficos

Obter o extrato protico da cultura de Candida viswanathii a partir da

fermentao em meio slido (farelo de trigo, bagao de cevada, azeite de oliva e meio

de Vogel) e liquido.

Construir a curva padro de protenas totais a partir do mtodo de Bradford,

plotando absorbncia versus concentrao da soluo da soroalbumina bovina

(1mg/mL), e atravs da regresso linear, determinar a equao da curva e o coeficiente

de correlao.

Construir a curva padro de -nitrofenol, plotando absorbncia versus

concentrao da soluo de -nitrofenol (1mM) e atravs da regresso linear,

determinar a equao da reta, o coeficiente de correlao e o coeficiente de extino

molar.

Quantificar as protenas totais e a enzima lipase produzida por C. viswanathii em

meio slido e calcular a atividade enzimtica da mesma.

Precipitar as protenas da amostra utilizando a tcnica de fracionamento com

sulfato de amnio e analisar o teor de protenas totais e a enzima lipase precipitada

Purificar a protena enzimtica, lipase, a partir do uso da cromatografia de

interao hidrofbica e construir o cromatograma, calculando a atividade enzimtica e o

seu rendimento.

3 METODOLOGIA

3.1 Obteno de extrato proteico

3.1.1 Preparo do cultivo da fermentao em estado slido

Separou-se um frasco de Erlenmeyer de 250 ml, pesou-se 10 gramas de farelo de

trigo, depois pesou-se 6 gramas de bagao de cevada e em seguida 8 gramas de azeite

8

de oliva. Depois da pesagem adicionou-se 16 ml de mio de Vogel contendo 3% (1,5g)

de extrato de levedura. Misturou-se bem todos os componentes do meio de cultivo, e o

Erlenmeyer foi devidamente tampado com algodo e depois coberto com um pedao de

jornal. Depois o frasco foi para a autoclave por 20 minutos a 121C. Inoculou-se o meio

de cultivo com 5 ml do pr-inculo e em seguida foi incubado por 5 dias a 28C.

3.1.2 Preparo do cultivo da fermentao em estado submerso

Separou-se dois frascos de Erlenmeyer de 125 ml, preparou-se 50 ml do meio de

Vogel, diluindo-o 50 vezes (1 ml de Vogel + 49 ml de gua destilada). Acrescentou-se

0,2% de extrato de levedura (fonte de Nitrognio), depois ajustou-se o pH para 6,0.

Distribuiu-se 20 ml do meio de Vogel em frascos de Erlenmeyer. Depois acrescentou-se

1,5% de azeite de oliva. Em seguida tampou-se o frasco com algodo e depois com um

pedao de jornal. Depois foi o frasco foi para autoclave por 20 minutos a 121C. E

inoculou-se 1 ml do pr-inculo nos meios de cultivo. E por fim incubou-se sob

agitao a 210 rpm a 28C por 3 dias. A preservao foi feita em geladeira a

temperatura em torno de 4C.

3.1.3 Obteno de extrato proteico em fermentao slida

Adicionou-se 100 ml de gua destilada no frasco contendo a amostra e com um

basto de vidro, homogeneizou-se bem para desfazer o slido. Em seguida esse frasco

foi levado para agitao por 30 minutos. Colocou-se o papel filtro dentre do funil de

Bchner e encaixou-se o funil o funil do frasco de Kitassato e colocou-se a mangueira

da bomba de vcuo. Depois o papel filtro foi umedecido com gua destilada e ligou-se a

bomba. Cuidadosamente colocou-se a amostra sobre o papel filtro e esperou-se toda a

amostra ser filtrada. Em seguida, colocou-se em uma proveta para medir o volume (32

ml), e depois distribuiu-se a amostra em epperndorffs. Estes foram levados centrfuga

em uma rotao de 8000 g por 10 minutos a 4C, E por fim o sobrenadante foi recolhido

e colocado em frascos devidamente identificados, e levados para o congelador.

3.1.4 Obteno de extrato proteico em fermentao submersa

Colocou-se o papel filtro dentro do funil de Bchner e encaixou-se o funil do

frasco de Kitassato e colocou-se a mangueira da bomba de vcuo. Depois o papel filtro

foi umedecido com gua destilada e ligou-se a bomba. Cuidadosamente colocou-se a

amostra sobre o papel filtro e esperou-se toda a amostra ser filtrada. Em seguida,

9

colocou-se em uma proveta para medir o volume (21 ml), e depois distribuiu-se a

amostra em epperndorffs. Estes foram levados centrfuga em uma rotao de 8000 g

por 10 minutos a 4C, E por fim o sobrenadante foi recolhido e colocado em frascos

devidamente identificados, e levados para o congelador.

3.2 Determinao da atividade enzimtica

3.2.1 Curva de Calibrao de p-Nitrofenol

Foram separados 10 tubos de ensaio e pipetou-se 20 L de uma soluo padro

(pNP, p-nitrofenol em tampo) no tubo 2, 40 L no tubo 3 e assim sucessivamente

subindo 20 L a cada tubo. E o tubo 1 ficou sem pNP. Foi adicionado nos tubos

tambm gua destilada, comeando pelo tubo 1 com 1,000 L e no tubo 2, 0,980 L e

assim sucessivamente decrescendo 20 L a cada tubo.

Fez-se o clculo utilizando a formula C1.V1=C2.V2 para calcular o volume de

pNP em g/mL. E o valor obtido para tubo 1 foi zero, no tubo 1, foi 0,5, no tubo 3, foi

1,0 e assim sucessivamente subindo 0,5 em cada tubo. Em todos os tubos foi adicionado

1,000 mL de Tetraborato de Sdio. E realizou-se a leitura das absorbncias em

comprimento de onda em 405 m pelo espectrofotmetro, em duplicata.

Construiu-se a curva padro de p-nitrofenol, e realizou-se a plotagem do grfico

absorbncia x concentrao, atravs da regresso linear, determinou-se a equao da

curva e o coeficiente de correlao e posteriormente calculou-se o coeficiente de

extino molar.

3.2.2 Atividade Enzimtica da Lipase

A determinao da atividade da lipase foi com p-nitrofenilpalmitato (pNPP)

como substrato. Dissolveu-se o pNPP em 500L de dimetil sulfxido (DMSO),

posteriormente com 60mL de tampo MCllvaine de pH 4,0. Os tubos de ensaio foram

organizados na estante em sequncia e numerados devidamente, sendo o tubo T1 e T2

em duplicata e o tubo B para controle. Adicionou-se em todos os 5 tubos 900L do

tampo com o substrato da enzima e foram colocados em banho-maria por 5 minutos a

temperatura, em torno de 40C. A reao foi iniciada com os 5 tubos em banho-maria,

no tubo T1 adicionou-se 100L da amostra e permaneceu por mais 1 minuto em banho-

maria a temperatura de 40C, posteriormente a reao foi interrompida com choque

trmico de temperatura de 80C por perodo de 1 minuto, seguido pela adio de 1mL

10

Tetraborato de Sdio saturado para cessar a reao. Analogamente aos outros tubos

foram analisados com a adio de 100L das amostras de cada tubo. No tubo B no

houve a adio da enzima. Realizou-se leitura da absorbncia a 410nm e espectrmetro.

Assim foi possvel calcular o coeficiente de absorbncia molar do pNPP a partir de:

= a*b*c Eq. (1)

Dessa maneira foram usadas as ABS para calcular a atividade enzimtica a partir

da equao abaixo:

Eq. (2)

O clculo da atividade enzimtica das protenas totais foi realizado a partir da

construo das formulas, sendo que uma equao da reta foi encontrada sendo possvel

calcula-los pela formula y = ax +b, pela equao da reta, onde y a absorbncia, a o

coeficiente angular, b o coeficiente linear e x a concentrao a ser determinada.

3.3 Determinao de protenas Totais

3.3.1 Curva de Calibrao para Protenas (Mtodo de Bradford)

Foram separados 7 tubos de ensaio e pipetou-se 0,010 mL de uma soluo de

soroalbumina bovina no tubo 2, e no tubo 3, pipetou-se 0,020 mL, e assim

sucessivamente subindo 0,010 mL a cada tubo, e no tubo 1 deixou-se sem SAB.

Adicionou-se no tubo 1, 0,750 mL de gua, e no tubo 2, adicionou-se 0,740 mL,

completando o valor de 0,750, e assim sucessivamente diminuiu-se o valor de gua de

0,010 a cada tubo, sempre completando 0,750. O reagente foi adicionado um valor de

0,750 mL de reagente.

Fez-se o clculo utilizando a formula C1.V1=C2.V2 para calcular o volume de

protena, sendo que o tubo 1 ficou com zero, no tubo 2 foi 1,67 g/mL, no tubo 3, foi

3,33 g/mL, no tubo 4, foi 5 g/mL, no tubo 5, foi 6,67 g/mL, no tubo 6, foi 8,33

g/mL, no tubo 7, foi 10 g/mL. E realizou-se a leitura das absorbncias em

comprimento de onda em 595 m pelo espectrofotmetro, em duplicata.

Construiu-se a curva de calibrao de protenas totais, pelo mtodo de Bradford

(1976), usando soluo padro de soroalbumina bovina 0,5 mg/ml.

11

3.3.2 Determinao das protenas totais

Os tubos de ensaio foram organizados e marcados em sequncia na estante, o

qual os tubos foram denominados de 1x e 2x, pois foram testadas duas concentraes.

Adicionou-se as amostras de extrato proteico com as concentraes distintas, o qual o

tubo 1x continha: 750 L de extrato solido e o tubo 2x, tinha 375 L de gua e 375 L

de extrato solido. No tubo B era o branco, com 750L de gua destilada, funcionado

como controle. Posteriormente adicionou-se 750L de reagente de Bradford em todos

os tubos e os mesmos foram deixados em repouso por 05 minutos. Ocorreu a leitura em

espectrofotmetro a 595nm. Viu-se que a leitura estourou o valor da absorbncia, ento

dilui-se o extrato proteico em 50 x, o qual foram usados 20 L de amostra e 980 L de

gua destilada.

3.4 Precipitao de protenas

Pulverizou-se o sulfato de amnio com o auxlio do almofariz e do pistilo.

Posteriormente a amostra de 20mL do cultivo em meio lquido da levedura Candida

viswanathii, foi descongelada gradativamente dentro de um recipiente com gelo, de

maneira no houvesse variao de temperatura na amostra, prejudicando o seu

metabolismo. Colocou-se a pulga magntica e foi mantida uma rotao baixa, para que

no houvesse a lise celular. Com o auxlio da tabela de precipitao de protenas,

calculou-se o primeiro fracionamento, porm utilizou-se a frao de 80% para os dois

extratos correlacionando os volumes obtidos, para a precipitao. Adicionou-se

lentamente o sulfato de amnio, de modo que no ocorresse a formao de precipitado

ao fundo do frasco. Agitou-se a amostra por 30 minutos, logo depois a amostra foi

transferida epperdorffs para centrifugar e ocorreu um repouso de 30 minutos.

Posteriormente a amostra foi centrifugada a 10.000g, a temperatura de 4C por 30

minutos. Assim anotou-se o valor do volume do precipitado.

3.5 Dilise

Realizou-se a dilise aps a precipitao das protenas, ocorrendo a hidratao da

membrana de dilise fervendo-a em soluo de carbonato de sdio de 20g/L e de EDTA

de 0,1g/L, posteriormente lavou-se a membrana com gua destilada. Preparou-se uma

12

soluo de citrato de sdio 0,5 M e pH 5,5 e foi colocada em um Becker de 1000 mL.

As amostras devidamente numeradas com suas fraes especficas foram colocadas

dentro da membrana de dilise e logo aps foram mantida em um Becker contendo a

soluo tampo. Agitou-se lentamente por um determinado perodo, ocorrendo trocas da

soluo tampo a cada 3 horas. As membranas foram abertas de maneira extremamente

cuidadosa e o material dialisado foi coletado e seus devidos volumes registrados. O

material foi conservado em geladeira a temperatura em torno de 4C, at a determinao

da atividade enzimtica e quantificao de protenas.

3.6 Cromatografia de interao hidrofbica

Escolheu-se uma cromatografia de interao hidrofbica, o qual foi utilizado uma

coluna com capacidade de 10 mL e de dimenses de (16x1cm). Dessa maneira, seguiu-

se o procedimento adicionando a resina para que a coluna fosse empacotada, sendo que

a resina utilizada foi GE Helathcare octyl sepharose, assim para que fosse utilizada

colocou-se em uma soluo de lcool 20%, evitando assim a formao de bolhas e

prejudicando o procedimento de purificao.Quando empacotado, adicionou-se a

coluna um volume de tampo a pH 5,5 para estabilizar a coluna e assim comear o

procedimento de purificao propriamente dito.

Para o processo de purificao, foi utilizado apenas o extrato proteico slido

obtido aps a dilise, sendo que o seu volume foi adicionado ao longo do tempo, o qual

foram retiradas fraes de 2 mL para analise de atividade enzimtica da quantificao

do rendimento de protena enzimtica total. Sabendo disso, foram recolhidas 48 fraes,

o qual a primeira frao foi utilizada para zerar a leitura do espectrofotmetro 280 nm.

3.7 Rendimento da purificao

O rendimento foi determinado pela razo entre a atividade enzimtica obtida aps

o mtodo de purificao e a atividade enzimtica da protena hipottica no extrato puro

ou da etapa anterior de purificao, a depender da quantidade de etapas que foram

realizadas.

Eq. (3)

13

Em que: = atividade enzimtica do extrato bruto.

= atividade enzimtica aps a ltima etapa de purificao realizada.

3.8 Atividade especfica

A atividade especfica foi determinada pela razo entre a atividade enzimtica (U)

e a protena total (mg) em cada uma das etapas de purificao.

Eq. (4)

3.9 Fator de purificao

O fator de purificao foi definido pela razo entre a atividade especfica obtida

aps a etapa de purificao e a atividade especfica do extrato bruto (etapa inicial).

Eq. (5)

4 RESULTADO E DISCUSSO

4.1 Obteno do extrato proteico

Na inoculao do meio liquido, observou-se que no houve fase lag, pois o

micro-organismo j se encontrava adaptado, isso devido a realizao de um pr-inoculo,

o qual foi conduzido por 24 horas para que o crescimento se encontrasse em sua maior

atividade metablica, gerando maior crescimento, diminuindo a taxa de morte celular.

J para o meio solido a fermentao ocorre desde a fase inicial.

Aps o perodo de crescimento em ambos os processos de fermentao, slido e

submerso, observou-se que o meio se encontrava na colorao branco devido

caractersticas incorporadas pelo micro-organismo.

14

De acordo com Roveda e colaboradores (2010) a utilizao do azeite de oliva

5% devido a necessidade do micro-organismos ter um fontes de carbono/indutor

disponvel para a produo de lipase, sem a presena de metablitos interferentes.

Em relao a extrao do extrato proteico, no foi necessrio utilizar mtodos de

baixa resoluo como o rompimento celular, devido a lipase ser um metablito

extracelular. Porm, existe uma vantagem da fermentao submersa sobre a

fermentao solida, o qual o produto da fermentao submersa j se encontro pronto

para a fermentao, eliminando algumas etapas de purificao, que venham a aumentar

o custo de produo. J na fermentao slida existe a desvantagem, pela necessidade

de mais etapas para ocorrer a extrao, um dos fatores e a necessidade ser solubilizado

para assim, liberar as protenas solveis. Com relao as vantagens desse processo que

o mesmo tem um custo menos elevado, pela utilizao de resduos agroindstrias,

apesar de necessitar de mais estudos, como fonte nutricional ao micro-organismo.

importante salientar que ambas as extraes devem ser realizadas abaixas temperaturas

para no afetar a atividade enzimtica da lipase e posterior desnaturao.

4.2 Curva de calibrao do -nitrofenol palmitato ( -NPP)

Pela Equao (6),

Eq. (6)

foi calculada a concentrao C2 de -NPP aps a adio de 0,05 mM de -NPP (C1).

Tem-se que V1 o volume de -NPP, o qual varia em cada tubo de ensaio e V2 o

volume final da soluo (2000 L). Logo, pela frmula dada anteriormente, obtm-se os

valores das concentraes de -NPP apresentados na Tabela 1, assim como o os valores

das absorbncias e suas respectivas mdias, medidas em espectrofotmetro, com

comprimento de onda de 405 m.

15

Tabela 1 Volume do -NPP em mol e mdias das absorbncias lidas em espectrofotmetro em comprimento de onda de 405 m.

Tubo

s

nitrofenol

(mL)

Tampo

(mL)

Tetraborato de sdio

(mL)

p nitrofenol

(mg/mL)

Absorbncia

(405 m)

1 0,000 1,000 1,000 0,001 0,181

2 0,020 0,980 1,000 0,0025 0,415

3 0,040 0,960 1,000 0,004 0,677

4 0,060 0,940 1,000 0,005 0,863

5 0,080 0,920 1,000 0,0065 1,118

6 0,100 0,900 1,000 0,008 1,365

7 0,120 0,880 1,000 0,010 1,692

8 0,140 0,860 1,000 0,0115 1,95

9 0,160 0,840 1,000 0,013 2,116

10 0,180 0,820 1,000 0,015 2,386

Atravs do clculo da regresso linear entre os volumes de p-nitrofenol e a

mdia das absorbncias, encontram-se os seguintes valores:

a = 160,77 b = 0,0464 R2 = 0,9973

Para a da curva de calibrao do p-nitrofenol, obteve-se o grfico representado

na Figura 1:

Figura 1- Curva de calibrao do pnitrofenol palmitato a partir dos valores obtidos pela leitura de densidade ptica, com comprimento de onda de 405 m.

y = 160,77x + 0,0464 R = 0,9973

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,005 0,01 0,015 0,02

Ab

s (4

05

nm

)

pNP (mg/ml)

16

A partir da equao da reta obtida da curva de calibrao do pnitrofenol

palmitato foi possvel calcular o coeficiente de absortividade molar ( ), que necessrio

para se calcular a atividade enzimtica enzima total.

Temos que a absortividade molar dada pela Equao (1):

Eq. (1)

Em que: = coeficiente de absortividade molar;

coeficiente angular da equao da reta;

caminho ptico = 1cm;

massa molar do p-NP = 139,10 M.

Desta maneira, atravs dos clculos necessrios foi obtido o coeficiente de

absortividade molar M-1 cm-1.

4.2.1 Atividade enzimtica

Para determinao da atividade enzimtica da lipase foi necessrio a leitura de

absorbncia aps a precipitao com fracionamento de 80% e do sobrenadante. A

atividade enzimtica do extrato bruto da lipase foi determinada como sendo a somatria

das atividades enzimticas obtidas em cada uma das etapas de precipitao.

Desta forma, temos que as absorbncias obtidas aps um minuto de reao da

amostra do extrato da enzima com o substrato p-NPP esto apresentadas na Tabela 1.

As atividades enzimticas dos extratos, ao longo da purificao e da enzima,

propriamente dita, esto apresentados na Tabela 4 e 5, bem como, seu rendimento e o

fator de purificao.

4.3 Quantificao de protena pelo Mtodo de Bradford

Foram realizadas as leituras de absorbncia das solues para quantificao da

protena soro albumina pelo Mtodo de Bradford, obtiveram-se os seguintes resultados

(Tabela 1) para a leitura em espectrofotmetro com comprimento de onda de 595 m.

17

Tabela 2 Concentraes de soroalbumina bovina utilizadas e valores das respectivas leituras de absorbncia.

Tubos Soroalbumina

bovina (mL)

gua

(mL)

Reagente

de

Bradford

(mL)

[Protena]

( g/mL)

Absorbncia

(595 m)

1 0,000 0,750 0,750 0 0,000

2 0,010 0,740 0,750 1,67 0,130

3 0,020 0,730 0,750 3,33 0,202

4 0,030 0,720 0,750 5,00 0,293

5 0,040 0,710 0,750 6,67 0,395

6 0,050 0,700 0,750 8,33 0,449

7 0,060 0,690 0,750 10,00 0,535

Plotando-se os valores de Absorbncia (595 m) versus [Protena] ( g/mL) foi

obtido grfico, apresentado na Figura 1, que representa a curva de calibrao para

determinao da protena lipase e fazendo a regresso linear, os seguintes valores foram

encontrados:

a = 0,0555 b = 0 R2

= 0,9842

Foi ainda, medida as absorbncias das amostras de extrato proteico em cada

uma das etapas de purificao que sero utilizados na determinao da concentrao de

protena mais adiante.

Figura 2- Curva de calibrao obtida pela relao entre as concentraes de soroalbumina bovina e os

valores de absorbncia lidos.

y = 0,0555x R = 0,9842

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12

Ab

s 5

95

nm

SAB (ug/mL)

18

4.3.1 Determinao das protenas totais

As protenas totais foram calculadas com base na Equao (7). De forma que:

Eq. (7)

Em que x = concentrao da protena total.

y = absorbncias (595 m).

Assim, os valores das absorbncias obtidas no extrato bruto foram definidos

como sendo a somatria das protenas totais obtidas nas etapas de precipitao e do

sobrenadante atravs de amostras de 10 L de extrato protico, onde suas absorbncias

(595 m) esto apresentados na Tabela 2. Dessa maneira a quantificao de proteinas

totais e de enzimas, podem ser observadas na Tabela 4 e 5.

4.4 Cromatografia de interao hidrofbica (CIH)

A partir da leitura da absorbncia e a respectiva atividade enzimtica, foi

possvel construir o cromatograma:

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Ab

so

rb

ncia

(2

80

nm

)

Fraes (2 mL)

0

2

4

6

8

10

12

14

Ativid

ad

e lip

ase

(U

/mL

)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Gra

die

nte

Tri

tox X

-10

0 (

%)

Figura 3 Cromatograma de interao hidrofbica, Absorbncia 280 nm(), Atividade enzimtica (U/ml)

(-), gradiente Triton X-100 (%)(-)

19

Dessa forma observou-se que a enzima estava depositada na frao 23-27 e 29-

34, e para confirmar foram feitas os teste de atividade enzimtica, o qual foi calculado

pela Equao (2), podendo ser observado na Tabela 3:

Tabela 3 Atividade enzimtica das fraes parciais aps a CIH

Frao Absorbncia

(280nm) Diluio

Atividade

Enzimtica (U/ml)

23 0,106 50 4,818182

24 0,164 50 7,454545

25 0,164 50 7,454545

26 0,087 50 3,954545

27 0,052 50 2,363636

29 0,046 50 2,090909

30 0,118 50 5,363636

31 0,299 50 13,59091

32 0,122 50 5,545455

33 0,497 20 9,036364

34 0,19 20 3,454545

Dessa maneira, as fraes foram reunidas a fim de obter um rendimento maior,

assim reuniram-se as fraes 23-27 e 29-34 e efetuou-se a leitura da absorbncia

410 nm para calcular a atividade enzimtica, e o rendimento (pela equao 3), fator

de purificao (pela Equao 5) e atividade especifica (pela Equao 4) podendo ser

obsevado na Tabela 4:

Tabela 4 Atividade enzimtica, rendimento e concentrao final de protenas da fermentao slida.

Amostra

Atividade

total (U)

Protena

(mg)

Atividade

especfica (U/mg)

Fator de

purificao

Rendimento

(%)

Incio 355,932 6,184 57,559 1,00 100,0

Precipitado 113,222 4,211 26,888 0,47 31,8

Sobrenadante 39,215 5,095 7,696 0,13 11,0

Cromatografia

(24-27) 57,666 2,246 25,678 0,45 50,9

Cromatografia

(29-34) 64,839 2,807 23,097 0,40 57,3

20

Tendo em vista que rendimento final, demonstrado nessa Tabela 4 apenas da

enzima obtida a partir da fermentao com substrato slido. J a Tabela 5, mostra os

resultados da enzima obtida por uma fermentao submersa:

Tabela 5 - Atividade enzimtica, rendimento e concentrao final de protenas da fermentao submersa.

Amostra Atividade

total (U)

Protena

(mg)

Atividade

especfica (U/mg)

Fator de

purificao

Rendimento

(%)

Incio 200,486 0,228 878,459 1,000 100

Precipitado 68,416 0,042 1640,571 1,868 17,48

Sobrenadante 322,925 0,155 2089,701 2,379 82,52

Observou-se pela anlise dos rendimentos obtidos, que a fermentao solida teve

um bom rendimento, aps passar pelo processo cromatogrfico de interao

hidrofbica, sendo que a frao 24-27 teve um rendimento de 50,9% e a frao de 29-34

teve um rendimento de 57,3%. Com relao ao sobrenadante e o precipitado, tiverem

um baixo rendimento, cerca de 30 e 11%, respectivamente, o qual esses valores foram

obtidos antes da cromatografia. J o extrato lquido, precipitado e sobrenadante, obtido

pela fermentao submersa no passou pelo processo cromatogrfico e viu-se que o

rendimento foi muito alto, podendo afirmar que essa amostra ainda possui biomolculas

contaminantes.

21

5 CONCLUSO

Com base nos resultados obtidos e discutidos, pode-se concluir que os mesmos

se enquadram nos padres, em que a precipitao de lipase obtida a partir da

fermentao em estado slido e liquido alcana os melhores resultados de quantidade de

protena precipitada com fracionamento de 80% com atividade enzimtica de 57,666 U

para fraes 24-27, com rendimento de 50,9%, e de 64,839 U para as fraes de 29-34

com rendimento de 57,3%. Em geral, obteve-se essa baixa atividade e baixo

rendimento, devido erros experimentais e condies inadequadas de boas praticas de

produo de enzimas, a qual deve ser minuciosa, ter alto controle sobre os parmetros

de produo, como temperatura e pH, alm do baixo fluxo de tcnicos e pessoas

disponveis no recinto. O fator de purificao obtido reafirmam os problemas na

produo da enzima e a sua baixa atividade, sendo que eles ficaram em torno de 0,40.

Apesar desses resultados, obteve-se um alto aproveitamento com relao as

saberes das tcnicas de purificao, alm de se ter uma amplitude do funcionamento de

uma cromatografia e seus parmetros diante de sua utilizao em escala laboratorial e

posteriormente em escala industrial.

22

6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obteno do

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23

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