expressÃo, purificaÇÃo e caracterizaÇÃo …
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA DE SOBRAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
ANTÔNIA SÂMIA FERNANDES DO NASCIMENTO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL
DA BDH-2 RECOMBINANTE, UMA ESPERMADESINA PRESENTE
NO PLASMA SEMINAL DE BODE (Capra hircus)
SOBRAL / CE
FEVEREIRO - 2010
ANTÔNIA SÂMIA FERNANDES DO NASCIMENTO
DEFESA DE DISSERTAÇÃO:
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL
DA BDH-2 RECOMBINANTE, UMA ESPERMADESINA PRESENTE
NO PLASMA SEMINAL DE BODE (Capra hircus)
Dissertação desenvolvida no
Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular da Universidade
Federal do Ceará, durante o curso de
Pós-Graduação em Biotecnologia e
apresentada como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada
Co-Orientadora: Profa. Dr
a. Kyria Santiago do
Nascimento
SOBRAL / CE
FEVEREIRO – 2010
N193e Nascimento, Antônia Sâmia Fernandes do
Expressão, purificação e caracterização estrutural da BDH-2
recombinante, uma espermadesina presente no plasma seminal do bode
(Capra hircus) / Antônia Sâmia Fernandes do Nascimento, 2010.
84 f. ;il. color. enc.
Orientador: Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada
Co-orientadora: Profa. Dra. Kyria Santiago do Nascimento
Área de concentração: Biotecnologia
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Campus de
Sobral, Sobral-Ce, 2010.
1. Caprino-criação 2. Lectinas I. Cavada, Benildo Sousa (orient.) II.
Nascimento, Kyria Santiago (co-orient.) III. Universidade Federal do Ceará
– Pós-Graduação em Biotecnologia IV. Título
CDD 660.6
CDD 639.2
ANTÔNIA SÂMIA FERNANDES DO NASCIMENTO
DEFESA DE DISSERTAÇÃO:
EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA BDH-2
RECOMBINANTE, UMA ESPERMADESINA PRESENTE NO PLASMA SEMINAL
DE BODE (Capra hircus)
Dissertação desenvolvida no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Ceará durante o curso de Pós-Graduação em Biotecnologia e
apresentada como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Biotecnologia
Dissertação aprovada em: 02/02/2010
_________________________________
Antônia Sâmia Fernandes do Nascimento
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Professor Dr. Benildo Sousa Cavada (Orientador)
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará-UFC
___________________________________________
Dr. João Batista Cajazeiras
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará-UFC
___________________________________________
Professor Dr. Jorge Luiz Martins
Departamento de Química e Geociência de Pelotas
Universidade Federal de Pelotas-UFPe
A Deus,
À minha família,
A meus amigos,
Dedico
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Benildo Sousa Cavada, pela acolhida em seu laboratório, pela
orientação, incentivo e por todas as oportunidades ofertadas. Agradeço pelos ensinamentos e
acima de tudo pelo exemplo de pesquisador, prova de que conhecimento não é obstáculo à
humildade.
À Profa. Dr
a. Kyria Santiago do Nascimento, querida Mme Kyrie, antes de tudo
pela amizade ilimitada, pelo empenho em ver meu crescimento e me ajudar nessa caminhada.
Obrigada pela paciência, alegria do dia-a-dia e por tornar o ambiente de trabalho um local
prazeroso de se conviver.
Ao Dr. João Batista Cajazeiras (Bapte), pela amizade, conselhos e incentivos, cuja
ajuda foi indispensável na execução de todas as etapas deste trabalho.
Ao Prof. Rodrigo Maranguape pelos ensinamentos em Biologia Molecular, cuja
orientação me forneceu bases sólidas para meu amadurecimento profissional.
Ao Prof. Dr. André Luis Coelho da Silva, pela ajuda na execução dos
experimentos de dicroísmo circular e pelos conselhos e discussões compartilhadas.
A todos os professores que compõem o curso de Biotecnologia pelos valiosos
ensinamentos durante meu Mestrado, em especial ao nosso coordenador Prof. Dr. Edson
Holanda Teixeira, pela enorme dedicação ao curso ainda tão recente, mas com grande
potencial.
A toda a equipe do BIOMOL-LAB (Helton, Ito, Raniere, Rafael, Camilinha,
Julinha, Eduárdico, Júnior, Kássia, Alfa, Fernando, Sukita, Talitos, Guilherme, Arthur,
Rômulo e Luciana) pelas boas risadas que demos juntos, pelo aprendizado e principalmente
pela amizade, em especial, aos companheiros de laboratório Bruninho e Sarita, indispensáveis
na realização deste trabalho, obrigada pela força, apoio e incentivo.
Aos meus inestimáveis companheiros da primeira turma de mestrado em
Biotecnologia: Mayron, Cynara, Ticiana, Fábio, Fabiano, Isana, Edmundo, Togashi e Niedja,
com os quais compartilhei bons momentos de aprendizagem.
Aos integrantes do Núcleo de Biotecnologia de Sobral (NUBIS) em especial a
Dôra, Daniel, João, Jackson e Antônio pela “calorosa” receptividade no NUBIS, pelo
companheirismo e incentivo.
Às minhas queridas amigas Bébé, Melzinha e Manélica sempre tão presentes e
incentivadoras, muito obrigada por compartilharem comigo este momento e por tudo de bom
que acrescentam em minha vida.
A minha grandiosa família e de forma mais que especial a minha querida irmã
Pauliana, sem a qual não imagino minha caminhada, sempre tão presente e incentivadora,
muito obrigada por proporcionar este momento tão feliz em minha vida.
A Deus, por estar sempre ao meu lado e conceder-me a graça de viver esta vitória.
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho, faço de minha conquista uma forma de gratidão e de reconhecimento por tudo
quanto recebi de vocês.......muito obrigada!
“Se não houver frutos, valeu a beleza das flores, se não houver flores, valeu a sombra das
folhas, se não houver folhas, valeu a intenção da semente.”
Henfil.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS--------------------------------------------------------------------------------------------------------10
LISTA DE TABELAS--------------------------------------------------------------------------------------------------------13
LISTA DE ABREVIATURAS----------------------------------------------------------------------------------------------14
RESUMO-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------16
ABSTRACT--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------17
1. INTRODUÇÃO-------------------------------------------------------------------------------------------------------------18
1.1 CAPRINOCULTURA---------------------------------------------------------------------------------------------------- -18
1.2 PLASMA SEMINAL---------------------------------------------------------------------------------------------------- -19
1.3 LECTINAS----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -20
1.3.1 HISTÓRICO E DEFINIÇÃO------------------------------------------------------------------------------------------20
1.3.2 OCORRÊNCIA E FUNÇÕES-------------------------------------------------------------------------------------- ---21
1.3.3 CLASSIFICAÇÃO DAS LECTINAS VEGETAIS-----------------------------------------------------------------24
1.3.4 LECTINAS ANIMAIS------------------------------------------------------------------------------------------------- -26
1. Lectina do Tipo C------------------------------------------------------------------------------------------------------------26
1.1 Colectinas----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---27
1.2 Selectinas--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------29
1.3 Lectinas endocíticas---------------------------------------------------------------------------------------------------- ----30
2. Galectinas------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --30
3. Siglecs ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- -----32
1.4 ESPERMADESINAS--------------------------------------------------------------------------------------------------- ---33
1.4.1 ESPERMADESINAS SUÍNAS ---------------------------------------------------------------------------------------34
1. AWN, AQN-1 e AQN-3----------------------------------------------------------------------------------------------------34
2. PSP-I e PSP-II------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ---36
1.4.2 ESPERMADESINAS BOVINAS-------------------------------------------------------------------------------------38
1.4.3 ESPERMADESINA EQÜINA-----------------------------------------------------------------------------------------39
1.4.4ESPERMADESINA OVINA-------------------------------------------------------------------------------------------40
1.4.5.ESPERMADESINAS CAPRINAS------------------------------------------------------------------------------------41
2. JUSTIFICATIVA----------------------------------------------------------------------------------------------------------43
3. OBJETIVOS----------------------------------------------------------------------------------------------------------------45
3.1 OBJETIVO GERAL-------------------------------------------------------------------------------------------------------45
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ----------------------------------------------------------------------------------------- ---45
4. MATERIAIS E MÉTODO-----------------------------------------------------------------------------------------------46
4.1 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO PROCARIÓTICO----------------------------------------------46
4.2 PCR COLONY PARA SELEÇÃO DOS CLONES POSITIVOS--------------------------------------------------47
4.3 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA rBdh-2---------------------------------------------------------------------------48
4.3.1 INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DA rBdh-2 POR IPTG---------------------------------------------------------48
4.3.2 INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DA rBdh-2 POR TEMPERATURA-----------------------------------------49
4.4 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DA E. coli TOP 10 RECOMBINANTE-----------------------------49
4.5 PURIFICAÇÃO DA r-Bdh2 POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM COLUNA HIS-TRAP-----50
4.6 PURIFICAÇÃO DA BODESINA RECOMBINANTE rBdh-2 POR CROMATOGRAFIA DE TROCA
IÔNICA EM COLUNA DEAE-SEPHACEL-------------------------------------------------------------------------51
4.7 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA-------------------------------------------------------------52
4.8 IMUNOBLOTTING----------------------------------------------------------------------------------------------- -------52
4.9 DICROÍSMO CIRCULAR (CD)-------------------------------------------------------------------------------------- --53
4.10 ENSAIO DE TERMOESTABILIDADE DA rBdh-2 UTILIZANDO DICROÍSMO CIRCULAR------------55
5. RESULTADOS-------------------------------------------------------------------------------------------------------------56
5.1 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO PROCARIÓTICO----------------------------------------------56
5.2 PCR COLONY PARA SELEÇÃO DOS CLONES POSITIVOS---------------------------------------------------57
5.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE r-Bdh2 POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
EM COLUNA HIS-TRAP - INDUÇÃO POR TEMPERATURA-------------------------------------------------------58
5.4 PURIFICAÇÃO DA r-Bdh2 POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM COLUNA HIS-TRAP COM
METAL IMOBILIZADO (IMAC) – INDUÇÃO POR IPTG------------------------------------------------------------59
5.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA rBdh-2 SEMI PURIFICADA - ANÁLISE
ELETROFORÉTICA E IMUNOBLOTTING------------------------------------------------------------------------------60
5.6 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE rBdh-2 POR CROMATOGRAFIA DE TROCA
IÔNICA EM COLUNA DEAE-SEPHACEL-------------------------------------------------------------------------------61
5.7 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA rBdh-2 PURIFICADA - ANÁLISE ELETROFORÉTICA E
IMUNOBLOTTING------------------------------------------------------------------------------------------------------------62
5.8 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA rBdh-2 POR DICROÍSMO CIRCULAR (CD)-------------------62
5.9 ENSAIO DE TERMOESTABILIDADE DA rBdh-2 POR DICROÍSMO CIRCULAR-------------------------64
6. DISCUSSÃO--------------------------------------------------------------------------------------------------------------- --66
7. CONCLUSÃO---------------------------------------------------------------------------------------------------------------72
8. PERSPECTIVAS-----------------------------------------------------------------------------------------------------------73
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS---------------------------------------------------------------------------------74
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática da interação lectina-carboidrato na superfície celular
(SHARON & LIZ, 2004). p.22.
Figura 2: Representação esquemática de Merolectinas, Hololectinas, Quimerolectinas e
Superlectinas (VAN DAMME et al., 1998). p.24.
Figura 3: Representação esquemática mostrando a organização molecular das lectinas do
tipo-C. p. 27.
Figura 4: Representação esquemática mostrando a organização molecular das colectinas
(KAWASAKI, 1998). p. 28.
Figura 5: Representação esquemática das galectinas baseado na arquitetura estrutural de suas
subunidades (HIRABAYASHI E KASAI, 1993) . p.31.
Figura 6: Representação esquemática montrando a capacitação do espermatozóide e
fecundação no oviduto de mamíferos. Adaptado de TOPFER-PETERSEN et al., (2008). p.
35.
Figura 7: Comparação da seqüência de aminoácidos do N-terminal das espermadesinas de
suínos (AQN-1, AWN), eqüino (AWN) e bovino (aSFP) e caprino (BSFP). A: Alinhamento
feito através do CLUSTAL W. Asteriscos representam resíduos de aminoácidos idênticos em
todas as sequências; Dois pontos representa substituições conservadas; ponto representa
substituições semi-conservadas. B: Cladograma obtido por alinhamento através do CLUSTAL
W. (Adaptado de TEIXEIRA et al., 2006). p.41.
Figura 8: Representação esquemática do vetor de expressão procariótico pTrcHis-Bdh-2.
pBR322 ori: origem de replicação; Amp: gene de resistência a ampicilina; Lac1q: gene
repressor lac; LacO: operador lac; ATG: códon de iniciação; 6XHis: sequência que codifica
para a cauda de histidina; EK: sítio de clivagem para a enteroquinase; Bdh-2: fragmento do
cDNA da Bdh-2; rrnB: seqüência de terminação da transcrição. p. 47.
Figura 9: Representação esquemática da Interação entre resíduos vizinhos da cauda de
histidina (His-tag) e a matriz contendo níquel imobilizado. Os sítios livres na esfera de
interação do níquel interagem com os anéis de imidazol da proteína recombinante (azul). p.
50.
Figura 10: A: Espectropolarímetro J-815 da JASCO utilizado para a realização das medidas
de CD da bodesina rBdh-2; B: Cubeta de quartzo com 1 mm de caminho ótico. p. 54.
Figura 11: Representação esquemática da sequência nucleotídica do sistema de
expressãopTrcHis-Bdh-2 e da sequencia de aminoácidos traduzida. O vetor plasmidial é
mostrado em letras sublinhadas. O códon de iniciação (ATG) e os dois códons de parada estão
dentro das caixas cinzas. O sítio de ligação do ribossomo está representado em letras itálica. A
6xHis tag e a sequencia de reconhecimento da enteroquinase são mostrados em negrito . p. 56.
Figura 12: Amplificação da ORF codificadora da bodesina Bdh-2. A primeira coluna indica o
padrão de massa molecular de 250 pb DNA Ladder da Invitrogen. A seta corresponde a ORF
da Bdh-2 amplificada. p. 57.
Figura 13: Perfil cromatográfico da purificação da proteína rBdh-2 utilizando cromatografia
de afinidade em coluna His-Trap contendo metal imobilizado. O tampão de eluição da fração
protéica não ligante foi fosfato de sódio com imidazol 10mM. O tampão de eluição da fração
protéica retida na coluna foi fosfato de sódio com gradiente de imidazol de 0-500mM. O fluxo
da cromatografia foi de 1,0 mL/min e as frações protéicas foram monitoradas a 216 nm (rosa)
e 280 nm (azul). p. 58.
Figura 14: Perfil cromatográfico da purificação da proteína recombinante rBdh-2 através de
cromatografia de afinidade em coluna HisTrap no sistema Äkta Purifier (GE Healthcare). O
tampão de eluição da fração protéica não retida utilizado foi fosfato de sódio com uréia 8 M e
imidazol 10mM. O tampão de eluição da fração retida nos metais da coluna de afinidade foi
fosfato de sódio com uréia 8 M e gradiente de imidazol de 0-500mM. O fluxo da
cromatografia foi de 1,0 mL/min e as frações protéicas foram monitoradas a 280 nm (azul). p.
59.
Figura 15: A: Perfil da detecção da bodesina recombinante r-Bdh2 fusionada com cauda de
histidina. 1: T0 ( Extrato total antes da indução por IPTG); 2: T2 (Extrato total após indução
por IPTG 1,5mM por 2 horas); 3: Fração insolúvel da indução por IPTG ; 4: Fração solúvel da
indução por IPTG; 5: Fração retida em coluna de HisTrap; 6: Fração não retida em coluna de
HisTrap. p. 60.
Figura 16: Perfil cromatográfico da purificação da proteína rBdh-2 em coluna de troca iônica
DEAE-Sephacel no sistema Äkta Purifier. O tampão de eluição da fração protéica não retida
na matriz cromatográfica foi Tris 20mM pH 7,4. O tampão de eluição de fração protéica
retida na matriz cromatográfica foi Tris 20mM pH 7,4 com NaCl 1,0M. O fluxo da
cromatografia foi de 1,0 mL/min e as frações protéicas foram monitoradas a 280 nm (azul). p.
61.
Figura 17: A: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS corado
com prata. 1- Fração retida em coluna de DEAE-Sephacel; 2- Fração não retida em coluna de
DEAE-Sephacel. B: Análise por imunoblotting. p. 62.
Figura 18: Espectro de dicroísmo circular da rBdh-2. As medidas foram realizadas no
espectropolarímetro da Jasco J-815 utilizando 100 L da rBdh-2 (DO = 0,300) em tampão
Tris 20 mM pH 7.0. Os espectros foram obtidos variando o comprimento de onda entre 190 a
250 nm e registrados como uma média de 8 varreduras a 25 oC, utilizando uma cubeta de
quartzo com caminho óptico de 1 mm. p. 63.
Figura 19: Espectros de dicroísmo circular da rBdh-2 obtidos sob diferentes temperaturas. As
medidas foram realizadas utilizando uma alíquota de 100 L da rBdh-2 (DO = 0,300) em
tampão Tris 20 mM pH 7.0. Os espectros foram obtidos variando o comprimento de onda
entre 200 a 250 nm e registrados como uma média de 8 varreduras, com a temperatura
variando de 5 a 55 oC (em intervalos de 5
oC), utilizando uma cubeta de quartzo com caminho
óptico de 1 mm. p. 64.
Figura 20: Curva de termoestabilidade da estrutura secundária rBdh-2 obtida através da
análise de dicroísmo circular (CD). p. 65.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composição da estrutura secundária da rBdh-2 obtida da desconvolução do
espectro de CD. p.63
LISTA DE ABREVIATURAS
µm: micrometro
aSFP: (acidic seminal fluid protein) Proteína ácida do plasma seminal
Atms: Atmosferas
AWN, AQN-1, AQN-3: Espermadesinas suínas
Bdhs: Bodesinas
BSFP: (Buck Seminal Fluid Protein) Proteína do plasma seminal de bode
Ca2+
: Íon cálcio
CD: (Circular Dichoism) Dicroísmo circular
cDNA: DNA complementar ao RNA mensageiro
CL-P1: Colectina de placenta
ConA: Concanavalina A, lectina de Canavalia ensiformes
CRD: Domínio de reconhecimento de carboidratos
CRISP: (Cystein Rich Secretory Protein) Proteína secretória rica em cisteína
CUB: C de subcomponentes do complemento (Clr, Cls), U de proteína do
embrião do ouriço-do-mar (Uegf) e B de proteína 1 morfogenética do osso (Bmp1).
CV: volumes de coluna
E. coli: Bactéria Escherichia coli
HPLC: (High Performance Liquid Chromatography) Cromatografia Líquida de
alta performance
Ig C2-set: Região constante do anticorpo
Ig V-set: Região variável do anticorpo
IPTG: Isopropyl-D-thiogalactoside
kDa: KiloDaltons
LB-Broth: Meio de cultivo para bactéria Lauria Bertani-Broth
MASP-1, -2 ou -3: MBL associado à serina protease
IL: Interleucina 1
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
MBL: Lectina ligante de manana
CL-L1: Colectina do fígado 1
CL-L2: Colectina do fígado 2
MPB: Proteína ligante de manose
CL-43: Colectina-43 bovina
Fn-tipo II: Fibronectinas do tipo II
nm: nanometro
ORF: (Open Reading Frame) Janela aberta de leitura
pb: Pares de base
pB1: Proteína suína fibrinogênio tipo-II
PSP-I: (Porcine Seminal Plasma Protein) Proteína do plasma seminal de suíno I)
PSP-II: (Porcine Seminal Plasma Protein I I) Proteína do plasma seminal de suíno II)
r-Bdh2: Bodesina 2 recombinante
RIP: (Ribosome-Inactivating Protein) Proteína inativadora de ribossomos
RNA: Ácido ribonucléico
rpm: Rotações por minuto
RSP: (Ram Seminal Plasma Protein) Proteína do plasma seminal de carneiro
RT- PCR: (Reverse Transcriptase- Polymerase chain reaction) Reação em cadeia da
polimerase acoplada a transcrição reversa
SDS-PAGE: Dodecil sulfato de sódio-Poliacrylamida gel eletroforesys (eletroforese em gel
de poliacrilamida na presença de SDS
Siglecs: Lectinas da superfamília das imunoglobulinas com afinidade para ácido siálico
SP-A: Proteína pulmonar surfactante A
SPADH-1 e SPADH-2: Espermadesinas bovinas
SP-D: Proteína pulmonar surfactante D
S-S: Ponte dissulfeto
SSP-7: (Stallion Seminal Plasma Protein) Proteína do plasma seminal do garanhão
TxLC-1: (first Tulipa hybrid lectin with complex specificity) lectina de tulipa
RESUMO
O cDNA da bodesina Bdh-2 presente no plasma seminal de caprino (Capra hircus) foi
subclonado no vetor de expressão pTrcHis TOPO utilizado para transformar células E.coli
Top 10 One Shot. Os clones recombinantes foram selecionados através de crescimento em
meio LB-Broth contendo 50 µg/mL de ampicilina e amplificação do gene por PCR. A síntese
da proteína recombinante rBdh-2 fusionada com cauda de histidina foi monitorada através de
SDS-PAGE seguido por immunobloting usando anticorpo monoclonal anti histidina. A
produção da rBdh-2 através da indução a baixas temperaturas não se mostrou satisfatória. A
maior produção da rBdh-2 ocorreu com IPTG 1,5 mM após 2 horas de indução. O método
utilizado para a purificação da proteína recombinante rBdh-2 foi através de cromatografia de
afinidade em coluna His-Trap seguida por cromatografia de troca-iônica em coluna de DEAE-
Sephacel. A estrutura secundária da rBdh-2 foi avaliada através do perfil espectral de
dicroísmo circular (CD) que confirmou a predominância de estruturas secundárias do tipo
folhas-β, a presença de um baixo conteúdo de estruturas não-ordenadas e de hélices- . A
rBdh-2 manteve sua estrutura estável até 35 °C. No entanto, mudanças significativas foram
observadas a partir de 40 °C referentes à descaracterização do espectro de CD.
ABSTRACT
The Bdh-2 bodhesin cDNA present in seminal plasma of goat was subcloned in the
expression plasmid pTrcHis TOPO used to transform E. coli Top10 One shot cells. The
recombinant clones were selected by growth in 50 µg/mL ampicillin-containing LB-Broth
medium and PCR amplifications. The recombinant protein synthesis was monitored by SDS-
PAGE followed by immunoblotting using monoclonal anti-His antibody. The production of
the rBdh-2 through low temperature was not satisfactory. A greater production of the rBdh-2
occurred with IPTG 1.5 mM after 2 h of induction. The method utilized to the purification of
the rBdh-2 was realized in affinity chromatography on a His-Trap column following ion-
exchange chromatography on a DEAE-Sephacel column. The secondary structure of the
rBdh-2 was evaluated through spectral profile circular dichroism (CD) and confirmed the
prevalence of secondary structures like β-sheets, the presence of a low content of unfolded
structures and helices- . The rBdh-2 structure remained stable up to 35 °C. However,
significant changes were observed from 40 °C related to a distortion of the spectrum of CD.
19
1. INTRODUÇÃO
1.1 CAPRINOCULTURA
A região Nordeste concentra cerca de 93% do contingente populacional de
caprinos do Brasil, estimado em cerca de 9 milhões de cabeças, o que coloca nosso país como
o 11° produtor mundial (IBGE, 2005; FAO, 2005). O grande efetivo de caprinos da região
Nordeste leva a caprinocultura a ser uma importante alternativa para o desenvolvimento social
e econômico dessa região.
Os caprinos foram introduzidos no Nordeste do Brasil ainda no período colonial e
sua cultura (caprinocultura) é considerada mundialmente uma atividade milenar. Estes
animais trazidos para o Brasil, ao longo do tempo, passaram por processos adaptativos através
dos quais adquiriram características únicas como, por exemplo, a rusticidade, que permite que
estes animais se desenvolvam mesmo sob condições adversas, como as encontradas no
Nordeste brasileiro. Podem ainda ser uma alternativa para a produção de leite, carne e pele,
tornando-os importantes como fontes básicas de proteína animal para a população.
As raças de caprino naturalizadas do Nordeste brasileiro, como por exemplo, as
raças Moxotó e Canindé, apesar de bem adaptadas, apresentam algumas desvantagens, como
um baixo volume do plasma seminal (SIMPLICIO et al., 1999). Devido a este fato, associado
à necessidade de aumento da produtividade, na década de 20 foram feitas tentativas de
realizar um melhoramento genético do rebanho caprino nordestino, importando da Espanha e
de Portugal animais de raça pura e exótica como a Saanen e a Anglo-Nubiana.
Porém, foi nos últimos anos, que ocorreram mudanças significativas para a
consolidação da cadeia produtiva da caprinocultura no Brasil, com a introdução de
biotecnologias modernas como inseminação artificial e produção de embriões tanto in vitro
como in vivo que vêm aumentando o número de animais de alto valor genético e contribuindo
para a conservação e multiplicação de animais de alta linhagem.
A caprinocultura vem despertando a atenção de governantes, técnicos e produtores
e isso tem se refletido na intensificação de pesquisas voltadas para a produção animal. Essas
pesquisas demandam o conhecimento aprofundado do processo reprodutivo em diversos
aspectos. Dentro dessa vertente, o plasma seminal caprino tem recebido considerável atenção
pela sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozóides.
20
1.2 PLASMA SEMINAL
Em caprinos, a eficiência reprodutiva dos machos, é um fator essencial a ser
considerado para viabilizar, com sucesso, o processo de reprodução.
Para isso, Inúmeros parâmetros químicos e físicos têm sido utilizados como
indicadores confiáveis do potencial reprodutivo dos animais. Dentre estes indicadores, o
plasma seminal apresenta fatores que influenciam a funcionalidade dos espermatozóides e do
trato genital feminino durante o transporte espermático (YANAGIMACHI, 1994).
O plasma seminal ou sêmem é um fluido no qual estão suspensos os
espermatozóides de mamíferos, bem como uma variedade de componentes orgânicos
(lipídeos, proteínas e carboidratos) e inorgânicos (sais minerais e íons) e são secretados pelos
testículos, epidídimo e glândulas sexuais acessórias que providenciam não somente suporte
metabólico e fonte de energia para os espermatozóides, mas também influenciam sua
funcionalidade (CABALLERO et al., 2005).
Dentre os inúmeros componentes presentes no plasma seminal, destacamos as
proteínas. Esta classe de biomoléculas exerce um importante papel durante a maturação das
células espermáticas e no desenvolvimento do trato reprodutivo do macho. Além disso, as
proteínas presentes no plasma seminal controlam os mecanismos moleculares de transporte do
espermatozóide ao longo do trato reprodutivo da fêmea (CABALLERO et al., 2005).
As principais proteínas presentes no plasma seminal de espécies unguladas
pertencem a três diferentes classes de proteínas amplamente distribuídas: Fibronectinas do
tipo II (Fn-tipo II), proteínas secretórias ricas em cisteína (CRISPs) e espermadesinas
(TÖPFER-PETERSEN et al., 2005).
Fibronectinas do tipo II. Fibronectinas do tipo-II são caracterizadas pela presença
de dois (Fn-tipo II curta) ou quatro (Fn-tipo II longa) módulos conservados de fibronectinas
arranjados em seqüência (SCHÄFER et al., 2003).
As formas curtas são amplamente sintetizadas no trato genital masculino,
enquanto as formas longas são expressas exclusivamente no epidídimo (EKHLASI-
HUNDRIESER et al., 2005). As Fn-tipo II encontram-se fortemente associadas à superfície
do espermatozóide durante o trânsito epididimário e no momento da ejaculação, exercem
diversas ações na membrana plasmática, as quais podem iniciar o processo de capacitação
(MANJUNATH &THERIEN, 2002).
21
CRISPs ou Proteínas Secretórias Ricas em Cisteína. Esta classe de proteínas
compreende moléculas que são caracterizadas pela presença de 16 resíduos de cisteína
conservados nas estruturas protéicas. Estes resíduos estão envolvidos na formação de pontes
dissulfeto (YAMAZAKI & MORITA, 2004). Várias funções têm sido relatadas para CRISPs
no trato reprodutor masculino, dentre elas podemos citar a capacidade de agir no processo de
fecundação, maturação espermática e adesão de células espermatogênicas (MAEDA et al.,
1999).
Espermadesina. A terceira classe de proteínas que se encontra em maior número
no plasma seminal de espécies unguladas são as espermadesinas descritas como uma nova
classe de lectinas animais. Estas proteínas estão associadas principalmente a funções
reprodutivas, atuando em diversas etapas durante o processo de fecundação (CALVETE et
al.,1994).
1.3 LECTINAS
1.3.1 HISTÓRICO E DEFINIÇÃO
Lectina é uma classe de proteínas que foi inicialmente descoberta em 1860 por
Weir Mitchell, que durante seus estudos observou o fenômeno de hemaglutinação de
eritrócitos quando associados ao veneno de cascavel (Crotalus durissus). Em 1888, Hermman
Stillmark observou o mesmo fenômeno ao utilizar em seus experimentos extrato protéico de
sementes de mamoma (Ricinus communis).
O primeiro termo dado as proteínas hemaglutinantes foi proposto em 1898 por
Elfstrand referindo-se a proteínas citotóxicas hemaglutinantes vegetais. A idéia de que a
toxicidade era uma característica intrínseca das lectinas teve que ser abandonada, quando em
1907 Landsteiner e Raubitschek reportaram pela primeira vez a presença de lectinas não-
tóxicas em leguminosas como Phaseolus vulgaris, Pisium sativum, Lens culinaris e Vicia
sativa (LANDSTEINER & RAUBITSCHEK, 1907).
Em 1936, Sumner e Howell observaram que a hemaglutinação produzida pela
proteína presente em sementes de Canavalia ensiformis denominada Concanavalina A
(ConA) era inibida quando a mesma estava associada a sacarose presente na cana de açúcar
(SUMNER & HOWELL, 1936). Porém, somente em 1952, Watkins e Morgan demonstraram
22
que as propriedades hemaglutinantes das lectinas, até então estudadas, eram baseadas numa
atividade específica de ligação a açúcar.
No final da década 40, W. C. Boyd e Shapleigh descobriram que certas
hemaglutininas eram específicas para eritrócitos dos grupos sanguíneos humanos. A
descoberta dessa seletividade levou Boyd, em 1954, a propor um novo termo para nomear
esta classe de proteínas hemaglutinantes. Assim, foi proposto o termo lectina oriunda do latim
legere, cujo significado é escolher, selecionar (BOYD & SHAPLEIGH, 1954).
À medida que novas propriedades iam sendo descobertas, novas definições iam
sendo atribuídas às lectinas. Atualmente, o conceito mais aceito data de 1995 e foi proposto
por Peumans e Van Damme. Estes autores definem lectinas como um grupo de proteínas de
origem não imune que possuem pelo menos um sítio não-catalítico de ligação a carboidratos,
de forma específica e reversível, não alterando sua estrutura (PEUMANS & VAN DAMME,
1995a).
Desde Weir Mitchell e Stillmark até os dias atuais, inúmeras moléculas biológicas
foram identificadas e caracterizadas como lectinas. Mas, somente a partir da década de 70,
essas moléculas passaram a ser tema de investigação em vários grupos de pesquisa
distribuídos no mundo.
1.3.2 OCORRÊNCIA E FUNÇÕES
Lectinas podem ser encontradas nos mais diversos grupos de organismos como
algas, plantas, bactérias, vírus, fungos, animais invertebrados e vertebrados. Desses
organismos, diferentes proteínas já foram isoladas e caracterizadas mostrando o potencial de
interação a diferentes carboidratos. Sendo assim, as lectinas representam uma classe de
proteínas que podem ser utilizadas como ferramentas valiosas em diversos estudos.
A ubiquidade das lectinas reflete sua participação efetiva em atividades biológicas
muito diversas atuando tanto intra como intercelularmente, tanto em processos fisiológicos
como em processos patológicos.
As interações moleculares baseadas no reconhecimento específico entre lectinas e
glicanos desempenham um papel chave em inúmeros processos celulares. Isso se deve, em
parte, ao enorme potencial codificador da estrutura dos glicanos em comparação com outras
macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. Portanto, lectinas são também
23
consideradas moléculas capazes de decodificar glicocódigos presentes nos mais diversos tipos
celulares (PEUMANS & VAN DAMME, 1995).
Os processos de interação das lectinas a carboidratos ocorrem, por exemplo, por
meio de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas estabelecidas entre os carboidratos e
os resíduos aminoacídicos do sítio ativo da lectina (WEIS & DRICKAMER, 1996).
Devido a essa característica primordial de ligar-se a carboidratos, as lectinas
desempenham várias atividades biológicas como citotoxicidade em células e organismo,
adesão celular, interações célula-matriz, indução de apoptose e aglutinação de células e
bactérias (SALES et al., 2000; DANGUY et al., 2002) (Figura 1).
Figura 1 - Representação esquemática da interação lectina-carboidrato na superfície celular (SHARON & LIS,
2004).
As lectinas têm sido usadas também no estudo da arquitetura da superfície celular,
tipagem de grupos sanguíneos e isolamento e caracterização estrutural de oligossacarídeos.
Além disso, as lectinas apresentam efeitos biológicos de grande interesse como
24
imunossupressão e mitogenicidade, por isso são amplamente utilizadas em imunologia e
biologia celular (Revisado em SHARON & LIS, 2004).
Algumas lectinas discriminam diferentes tipos de células, incluindo conjuntos e
subconjuntos de células linfóides (MACIEL et al., 2004), e reconhecem células cancerosas
em diferentes estágios de desenvolvimento (SHARON & LIS, 2004). Essas considerações têm
induzido sua exploração como marcadores histoquímicos e como agentes para separação de
células.
Diversas lectinas podem ainda apresentar aplicações terapêuticas, podendo ser
utilizadas no combate de diferentes patógenos. A lectina isolada da alga vermelha Solieria
filiformis foi eficiente ao inibir o crescimento das bactérias gram-negativas Serratia
marcescens, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Proteus sp, e
Pseudomonas aeruginosa (HOLANDA et al., 2005). Lectinas específicas de manose obtidas
de monocotiledôneas apresentam ainda atividade antiretroviral, podendo ser utilizadas no
combate a síndrome da imunodeficiência adquirida em humanos (SIDA) (BALZARINI et al.,
1991). Isso se deve ao fato dessas lectinas ligarem-se a glicoproteína da cápsula viral
relacionada ao reconhecimento e adesão a linfócitos, gp120, impedindo a invasão dessas
células (BALZARINI et al., 1992).
Devido ao fato de algumas lectinas possuírem a habilidade para mediar
mucoadesão, citoadesão e a citoinvasão de drogas (GABOR et al., 2004), essas moléculas têm
sido exploradas quanto à sua utilização em sistemas de liberação de drogas. Lectina de folhas
de Bauhinia monandra e a lectina de Lens culinaris foram incorporadas e também adsorvidas
na superfície de nanopartículas, mostrando ser potenciais ferramentas para a utilização em
medicamentos de administração oral com liberação controlada (RODRIGUES et al., 2003).
A família das leguminosas é a mais bem estudada quanto ao isolamento e
caracterização de lectinas. Essa família apresenta lectinas com alto grau de homologia e
similaridade. São encontradas geralmente em cotilédones e endospermas, estando também
presentes em folhas, raízes, tubérculos e flores. A grande maioria das lectinas conhecidas é
proveniente de sementes (PEUMANS & VAN DAMME, 1995b).
Fisiologicamente, acredita-se que as lectinas vegetais atuam como: (i)
transportadores e armazenadores de carboidratos (NAKAMURA et al., 2004), (ii) ligação
entre bactérias fixadoras de nitrogênio à raiz das plantas, (iii) inibição do crescimento de
fungos, (iv) proteção das plantas contra ataque por insetos (WANG et al., 2000) e (v)
regulação hormonal do crescimento e desenvolvimento das plantas (SANZ-APARICIO et al.,
1997).
25
Em animais invertebrados as lectinas estão presentes principalmente na hemolinfa
e nos órgãos sexuais. Já nos animais vertebrados as lectinas encontram-se distribuídas em
todos os tecidos e órgãos desempenhando as mais diversas funções como reconhecimento
específico entre espermatozóide e óvulo na fecundação, interações entre células e célula-
matriz extracelular, durante a embriogênese e no desenvolvimento do organismo,
diferenciação e proliferação celular (GABIUS, 1997).
1.3.3 CLASSIFICAÇÃO DE LECTINAS VEGETAIS
Com base nas características estruturais de lectinas de plantas, Peumans e Van
Damme classificaram lectinas como merolectinas, hololectinas, quimerolectinas e
superlectinas (PEUMANS & VAN DAMME, 1998) Descritas a seguir (Figura 2).
Figura 2: Representação esquemática de Merolectinas, Hololectinas, Quimerolectinas e Superlectinas
(PEUMANS & VAN DAMME, 1998).
26
- Merolectinas: inclui lectinas que possuem apenas um sítio de ligação a
carboidrato e, consequentemente, não são capazes de aglutinar células ou precipitar
glicoconjugados. Como exemplo, podemos citar as proteínas manose-ligantes de orquídeas
(VAN DAMME et al., 1996) e a heveína, uma proteína quitina ligante encontrada no látex da
seringueira (VAN PARIJIS et al., 1996).
- Hololectinas: compreendem aquelas lectinas que têm dois ou mais sítios de
ligação a um mesmo carboidrato, sendo capazes de aglutinar células ou precipitar
glicoconjugados. Nesse grupo encontramos as lectinas mais estudadas. Como exemplo tem-se
a lectina de semente de Canavalia brasiliensis, ConBr (SANZ-APARICIO et al., 1997).
- Quimerolectinas: englobam as lectinas que possuem um ou mais sítios de
ligação a carboidratos, além de apresentarem atividade catalítica (ou outra atividade biológica
não carboidrato ligante) associada a um outro domínio molecular, portanto, diferente do sítio
de ligação a carboidrato. Como representantes dessa classe, podemos citar a PPL2, uma
lectina obtida a partir de sementes de Parkia platycephala, que apresenta de forma
independente um domínio ligante de quitina e outro com atividade endoquitinásica
(CAVADA et al., 2006).
- Superlectinas: possuem dois sítios de ligação a carboidratos, os quais são
estruturalmente diferentes e reconhecem açúcares não relacionados. Um exemplo desse grupo
é a lectina de tulipa TxLC-1 (first Tulipa hybrid lectin with complex specificity) que possui
subunidades com um sítio específico para manose e outro para N-acetil-galactosamina,
atuando de maneira totalmente independente (PEUMANS & VAN DAMME, 1998).
As lectinas vegetais podem ser classificadas em sete famílias, de acordo com
VAN DAMME et al. (1998):
Lectinas de leguminosas;
Lectinas de monocotiledôneas;
Lectinas ligantes a manose;
Lectinas ligantes a quitina;
RIPs tipo 2;
Lectinas relacionadas a jacalina;
Lectinas relacionadas a amarantina;
e Lectinas de floema de Curcubitacea.
27
1.3.4 LECTINAS ANIMAIS
Lectinas animais apresentam similaridades em suas seqüências primárias exibindo
características estruturais comuns. No entanto, é com base nas características dos domínios de
reconhecimento a carboidratos (CRDs) que foi feita a classificação das lectinas animais
(DRICKAMER, 2001).
Pelo menos 12 famílias estruturais de lectinas animais são descritas, entre elas as
lectinas Tipo-S, Tipo-I, Tipo-P, Tipo-L, Eglectinas, Calreticulinas/Calnexinas, Anexinas,
Discoidinas, Eel Aglutininas, Tipo-Fibrinogênio e Pentraxinas. No entanto, a família das
lectinas animais mais bem estudadas são as galectinas, lectinas tipo C e as siglecs, que
compreendem as três maiores famílias de lectinas animais (KILPATRICK, 2002).
Porém nem todas as lectinas animais conhecidas se agrupam em alguma dessas
famílias, devido as suas singularidades, e mesmo dentro de uma mesma família, suas funções
biológicas podem variar muito (KILPATRICK, 2002).
1. Lectinas Tipo C
Lectinas Tipo C são assim denominadas devido à necessidade de requererem o íon
cálcio (Ca2+
) para se ligarem a açúcares. Esse metal é de extrema importância, pois viabiliza a
ligação da lectina ao seu açúcar específico e, consequentemente, sua atividade biológica. Esta
é uma família de lectinas altamente diversa, tanto em relação a estrutura quanto a
especificidade a carboidratos. Algumas são solúveis, enquanto outras estão ligadas a
membrana e possuem um domínio CRD extracelular conservado, designado C-CRD de 115 a
150 aminoácidos (DRICKAMER, 1988).
O íon Cálcio presente no CRD está diretamente envolvido no reconhecimento a
carboidrato, ligando-se a uma de suas hidroxilas. Este envolvimento contribui para a
manutenção da estrutura funcional da lectina, interagindo com dois resíduos de glutamato
presentes no CRD (BERG et al., 2002). Os CRDs das lectinas tipo-C encontram-se
incorporados em variados contextos de organização molecular (Figura 3), o que permite
classificá-las em duas categorias: a) Lectinas do tipo-C solúveis, e b) Lectinas do tipo-C
transmembrana.
28
Lectinas do Tipo-C solúveis
Lectinas do Tipo-C transm em brana
Lecticanas
Colectinas
Selectinas Receptores
Lectinas transm em brana com DRC em tandem
DCR
Tipo-C
Dom ínio
Tipo- EGF
Dom ínio
regulatório do
com plem ento
Dom íno
Tipo-Ig
Dom ínio
de ligação
Tipo-Proteína
Dom ínio Tipo-
F ibronectina
Dom ínio
Transm em brana
Figura 3: Representação esquemática mostrando a organização molecular das lectinas do tipo-C.
É possível classificar estas lectinas em subgrupos a partir de sua seqüência
nucleotídica e a partir de domínios de natureza não lectínica, pelo fato da família de lectinas
do tipo-C apresentar proteínas com estruturas primárias muito variáveis (KILPATRICK,
2002). Os membros de cada subgrupo dividem características comuns quanto à natureza e
arquitetura de seus CRDs.
Dentre os subgrupos das lectinas tipo C, destacam-se as colectinas, selectinas e
lectinas endocíticas, descritas a seguir.
1.1 Colectinas
As colectinas são assim chamadas devido a seu domínio colagenoso, estão
presentes predominantemente em mamíferos e são as únicas da família das lectinas tipo C que
são solúveis e não ligadas à membrana.
Elas são proteínas de estruturas tridimensionais únicas, agrupadas conforme sua
estrutura primária, com um CRD do tipo-C combinado a um domínio do tipo colágeno, na
presença de uma pequena região rica em cisteínas na posição N-terminal. As cadeias básicas
de polipeptídeos das colectinas (30-45kDa) organizam-se em tripla hélice por enovelamento
das regiões tipo colágeno. Essas subunidades em tripla hélice podem se agrupar assumindo
novas estruturas em forma de cruz (conglutininas) ou em formato de um “buquê de flores”
(KAWASAKI, 1998) (Figura 4).
29
Subunidade
polipepetídeo
U nidade estrutural
3 polipeptídeos
Lectina
O psonização
de
Previne infecções
de H IV e Influenza
D C R Tipo-CR egião de
enovelam ento
Tripla hélice
Tipo-C olágeno
N -term inal rico
em C isteínas
Figure 4: Representação esquemática mostrando a organização molecular das colectinas (KAWASAKI, 1998).
As colectinas incluem três grupos de proteínas séricas: as proteínas ligantes de
manose (MBP)1 ou lectina ligante de manana (MBL)
2, conglutinina bovina e colectina-43
bovina (CL-43). Além disso, englobam também duas proteínas pulmonares surfactantes (SP-
A e SP-D). Há também um grupo de colectinas não secretadas: colectina do fígado-1 e -2
(CL-L1 e CL-L2)3 e a colectina de placenta (CL-P1). Os CRDs das colectinas atuam
estabelecendo ligações com um íon de Ca2+
, sendo também capazes de se ligarem a
grupamentos hidroxilas 3- e 4- (extremidade não redutora) dos açúcares: N-acetil-
glicosamina, manose, N-acetil-manosamina, fucose e glicose (TURNER, 2003). Isso permite
às colectinas interagirem com os domínios glicídicos dispostos sobre a superfície de vírus,
bactérias, fungos e protozoários.
As colectinas do tipo MBL, quando ligadas à superfície de alguns parasitas, são
capazes de ativar o sistema imune, através do sistema complemento. Essa ativação é mediada
pelo complexo MBL associado às proteases serínicas -1, -2 ou -3 (MASP-1, -2 ou -3). As
MBLs podem ainda, interagir diretamente com receptores das células fagocitárias agindo
como opsoninas, apresentando a capacidade de reconhecer e fagocitar microorganismos.
1 Mannose-binding protein
2 Mannan binding Lectin
3 Collectin liver-1 and 2 (CL-L1, CL-L2)
30
1.2 Selectinas
As selectinas são lectinas de membrana que apresentam especificidades por
carboidratos fucosilados, especialmente sialyl-lewis X e mucinas.
As selectinas podem ser agrupadas em tipo E, L e P de acordo com sua
ocorrência. As selectina tipo E estão confinadas às células endoteliais, as do tipo L estão
presentes em leucócitos e as selectinas do tipo P são mais abundantes em células plaquetárias.
As selectinas são moléculas cruciais para a interação leucócito-endotélio, estando
primariamente envolvidas na comunicação intercelular e nos processo de reconhecimento e
fagocitose dos microorganismos. Vários dados indicam que as selectinas mediam o contato
inicial ou rolamento dos leucócitos sobre o endotélio, durante a passagem destas células do
interior dos vasos sanguíneos para o tecido nos processos inflamatórios agudos e crônicos.
As selectinas estão intimamente envolvidas no processo de adesão de leucócitos à
parede do endotélio. Essa adesão é iniciada por fracas interações, que permitem o rolamento
do leucócito na superfície do endotélio. Mediando esse processo inicial estão envolvidas a P-
selectina e a L-selectina e depois, interações mais fortes são estabelecidas pela E-selectina, o
que proporciona a diapedese dos leucócitos para o tecido linfóide e sítios inflamatórios
subjacentes.
As selectinas P, E e L são glicoproteínas de membrana, cujos domínios lectínicos
interagem de forma dependente de Ca2+
, a porções de oligossacarídeos que estão presentes em
glicoproteínas da superfície de leucócitos (VARKI, 2004). A selectina P aparece nas
membranas das células endoteliais quando estas são ativadas por trombina e histamina, ao
passo que selectina E é expressa após a indução de sua síntese por citocinas inflamatórias,
como IL-1 ou TNF-α. A selectina L, que expressa-se constitutivamente na superfície dos
leucócitos, media o rolamento dos neutrófilos na superfície das células endoteliais.
Estruturalmente estas moléculas apresentam um domínio semelhante ao fator de
crescimento epidérmico, um domínio lectínico e uma série de domínios semelhantes às
proteínas do complemento (KILPATRICK, 2002). O domínio lectínico é o responsável pela
propriedade adesiva das selectinas, uma vez que a adesividade de leucócitos ao endotélio
pode ser inibida por açúcares específicos a esse domínio. Consequentemente, a presença do
açúcar pode levar a inibição da migração de leucócitos.
31
1.3 Lectinas Endocíticas
As lectinas endocíticas são uma classe de lectinas do tipo C que funcionam como
receptores de membrana com diferentes especificidades como N-acetilgalactosamina,
galactose e manose. As lectinas endocíticas do tipo II são proteínas transmembranais,
constituídas de um domínio citoplasmático N-terminal, uma região hidrofóbica, um domínio
transmembrana e uma região C-terminal composta pelo domínio CRD (LIS & SHARON,
1998).
2. Galectinas
As galectinas originalmente eram conhecidas como lectinas do tipo S ou tiol
dependentes. Hoje são assim chamadas devido a sua capacidade de se ligarem
especificamente a resíduos de β-galactose (CUMMINGS, 2004).
Estas proteínas não apresentam pontes dissulfeto e glicosilações e sua ligação a
carboidratos independe de íons metálicos. Elas são caracterizadas por apresentarem baixo e
médio peso molecular (14-35KDa), afinidade a galactosídeos e um domínio de
reconhecimento a carboidrato altamente homólogo denominado S-CRD. Este domínio possui
em média 135 resíduos de aminoácidos e sua integridade parece ser requerida para a atividade
das galectinas (CUMMINGS, 2004).
Este grupo é constituído de lectinas solúveis, porém durante seu processamento
seus genes podem sofrer splicing e formas alteradas da proteína podem ser expressas de modo
que elas fiquem ancoradas a membrana celular. Após sua síntese, as galectinas residem no
citosol, onde podem atuar na organização do citoesqueleto, e no núcleo, onde participam do
transporte e splicing de RNAs. Alternativamente, elas podem também ser secretadas das
células.
As galectinas ocorrem em quase todos os tipos celulares devido a uma
preservação evolucionária em seus CRDs. Nos tecidos conectivos as galectinas geralmente
estão ligadas a carboidratos contendo unidades de N-acetillactosamina. Isso foi evidenciado
não apenas por estudos de análise filogenética, mas também por estudos estruturais
(SHARON & LIS, 2003).
Atualmente, 14 galectinas de mamíferos já foram identificadas e numeradas
sequencialmente, de acordo com a ordem de depósito das sequencias publicadas no Genome
32
Data Base. Os membros da família das galectinas também já foram identificados em várias
outras espécies, incluindo aves, anfíbios, peixes, esponjas e fungos (BUCK et al., 1998;
AHAMED et al.,1996), sendo adotado o mesmo critério de nomenclatura (numeração
seqüencial) para lectinas isoladas de outros organismos.
Baseado na arquitetura estrutural das subunidades das galectinas, estas proteínas
podem ser classificadas em (i) proto, (ii) repetições em tandem e (iii) tipo-quimera. Galectinas
do tipo proto apresentam domínios simples de ligação a carboidratos, as galectinas do tipo
repetições em tandem apresentam dois domínios homólogos e as do tipo quimera apresentam
um domínio galectínico com outro domínio não lectínico. Estes três tipos de galectinas podem
ser representados pelas galectinas 1, 9 e 3, respectivamente (Figura 5) (HIRABAYASHI E
KASAI,1993).
Figure 5: Representação esquemática das galectinas baseado na arquitetura estrutural de suas subunidades
(HIRABAYASHI E KASAI, 1993).
As galectina 1, 2, 5, 7 e 10 (representantes do tipo-proto), usualmente formam um
dímero não covalente com dois CRDs idênticos, em condições não desnaturantes. Desta
forma devem ter dois sítios equivalentes (idênticos) de ligação a carboidratos.
Em contrapartida, a galectina-3, único representante do tipo-quimera até o
momento, possui dois domínios distintos. Um domínio tipo-colágeno N-terminal (não CRD) e
um domínio com CRD característico de uma galectina que permite formar uma ligação
cruzada entre um motivo de natureza glicídica e outro de natureza não glicídica.
Os membros do grupo de repetições em tandem, representadas pelas galectinas 4,
6, 8 e 9, possuem em um único polipeptídeo dois CRDs com elevada homologia estrutural,
mas com especificidades a carboidratos diferentes, sendo que assim, reconhecem carboidratos
distintos.
33
As galectinas geralmente são proteínas abundantes em alguns tipos celulares. As
galectinas 4 e 6 estão mais abundantes em células epiteliais do trato gastrointestinal, as
galectinas 5 são bastante expressas nos eritrócitos e as galectinas tipo 7 expressas nos
queratinócitos.
Quanto ao seu papel fisiológico, acredita-se que as galectinas ajam como
moduladoras da interação célula-substrato e sejam essenciais para a diferenciação celular
normal e crescimento dos animais multicelulares (LEFFLE, 2004).
Nos últimos anos, inúmeros dados experimentais têm demonstrado a participação
das galectinas em diversos processos fisiopatológicos in vitro como em processos de adesão
celular modulando as interações célula-célula e célula-matriz extracelular, na regulação do
crescimento celular, em processos inflamatórios imunomodulados, durante os processos de
apoptose, dos processos de embriogênese, durante a reprodução e também durante os
processos de metástase (LEFFLE, 2004).
3. Lectinas Siglecs
Os membros desta família de proteínas são todos específicos para ácido siálico,
um monossacarídeo encontrado em abundância na superfície das células. Sua nomenclatura é
derivada do termo em inglês (Sialic acid-binding, Ig-like- lectins).
Siglecs, também conhecidas como lectinas da superfamília de imunoglobulinas
com afinidade ao ácido siálico, formam uma subclasse distinta de lectinas do tipo-I. As
Siglecs são proteínas transmembranares, com um único segmento inserido na membrana,
apresentando um domínio extracelular com alto grau de homologia. Todos os membros desse
grupo apresentam, na região extracelular (N-terminal), um domínio Ig V-set (região variável
do anticorpo) com um sítio de ligação para ácido siálico, seguido de um número variável de
domínios Ig C2-set (região constante do anticorpo). Na sua maioria, as Siglecs possuem um
motivo tipo imuno-receptor tirosina em seu domínio intracelular, sugerindo sua participação
em eventos de sinalização celular (ANGATA & BRINKMAN-VAN DER LINDEN, 2002;
VARKI, 2004).
Nem todas as lectinas animais conhecidas se agrupam em alguma das famílias
acima descritas, devido as suas singularidades, sendo o caso, por exemplo, das
espermadesinas, um grupo de lectinas animais presentes no plasma seminal de algumas
espécies domésticas.
34
1.4 ESPERMADESINAS
As espermadesinas são lectinas que geralmente apresentam massas moleculares
em torno de 12 a 16 kDa. Elas são encontradas no plasma seminal e/ou perifericamente
associadas à superfície dos espermatozóides de animais domésticos como suínos, bovinos,
equinos, ovinos e caprinos (TÖPFER-PETERSEN et al., 2008). Funcionalmente, elas são
capazes de interagir com alguns receptores de açúcar que se encontram na superfície celular.
A capacidade de se ligar a moléculas de açúcar é também uma característica da atividade
biológica das proteínas pertencentes à família das lectinas.
Todas as lectinas animais contêm um domínio de reconhecimento a carboidrato
(CRD) em sua sequência de aminoácidos. Entretanto, as espermadesinas diferem
estruturalmente da maioria das lectinas, pois elas são caracterizadas por apresentarem um
domínio denominado CUB (ROMERO et al., 1996). Esta sigla é devido às proteínas onde
estes domínios foram primeiramente identificados: C de subcomponentes do complemento
(Clr, Cls), U de proteína do embrião do ouriço-do-mar (Uegf) e B de proteína morfogenética
óssea-1 (Bmp1) (BORK & BERCKMANN, 1993).
O domínio CUB é encontrado em todas as espermadesinas já descritas. Sua
estabilização se dá através de duas pontes dissulfeto conservadas entre resíduos de cisteínas
vizinhos. Os domínios CUBs apresentam cerca de 40 a 60% de similaridade em suas
estruturas primárias (CALVETE et al., 1995). A estrutura tridimensional de dois membros da
família das espermadesinas suínas (PSP-I e PSP-II) revelou pela primeira vez conhecimentos
sobre a estrutura do domínio CUB (ROMERO et al., 1996).
Essa estrutura consiste de subunidades formando um β sanduíche feito de duas
folhas β. Cada folha β contém quatro fitas antiparalelas e a outra fita paralela (ROMERO et
al., 1997; ROMÃO et al., 1997; VARELA et al., 1997).
A função biológica das espermadesinas ainda está sendo estudada, no entanto, elas
são consideradas proteínas com uma vasta variedade de interações bioquímicas. Dentre elas, a
capacidade de se ligar a carboidratos e fosfolipídeos e atuar como inibidores de proteinases
(TOPFER-PETERSEN et al., 1998; CALVETE & SANZ, 2007). Além disso, elas atuam
como lectinas ligadoras de glicoproteínas presentes na zona pelúcida durante etapas do
processo de fecundação (DOSTÀLOVÀ et al., 1994a; CALVETE et al., 1994).
Até o presente momento, já foram encontradas espermadesinas em espécies
domésticas de suínos (HAASE et al., 2005), bovinos (EINSPANIER et al., 1991), equinos
35
(REINERT et al., 1996), ovinos (BERGERON et al,. 2005) e caprinos (TEIXEIRA et al.,
2002; MELO et al., 2008).
Nenhuma espermadesina foi encontrada até o presente momento no plasma
seminal de humanos, cães ou ratos. Parece claro que os genes das espermadesinas foi
funcionalmente inativado em humanos por mutações que silenciaram esses genes. Cópias
inativas dos genes das espermadesinas também já foram encontradas no genoma de cães e
chimpanzés enquanto a região inteira contendo um ancestral hipotético dos genes das
espermadesinas parece ter sido deletado do genoma de ratos e camundongos (LEEB, 2005).
1.4.1 ESPERMADESINAS SUÍNAS
Em suínos, a família das espermadesinas exibe a maior diversidade de membros
perfazendo cinco diferentes genes que codificam para cinco polipeptídeos denominados
AQN-1, AQN-3, AWN, PSP-I, PSP-II e suas isoformas glicosiladas (SANZ et al., 1991;
KWOK et al., 1993a).
Estas moléculas foram originalmente definidas como proteínas ligadoras de
polissulfatos. Esta definição baseou-se no fato de que polímeros sulfatados como fucoidan,
heparina, condroitin sulfato e polivinil sulfato, podem inibir a ligação de proteínas de baixo
peso molecular a glicoproteínas da zona pelúcida, presentes no fluido seminal (PARRY et al.,
1992).
Estudos têm indicado a vesícula seminal como principal fonte produtora das
espermadesinas, embora as proteínas suínas sejam sintetizadas também pelo epidídimo e
glândulas do trato genital masculino como cabeça e cauda do epidídimo, testículo e próstata, o
que foi evidenciado por abordagens investigativas através de RT-PCR, Western blot e
imunohistoquímica (EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2002; HOSHIBA & SINOWATZ,
1998).
1. AWN, AQN-1 E AQN-3
A nomenclatura adotada para as espermadesinas suínas é baseada nos três
primeiros resíduos de aminoácidos presentes na região N-terminal da estrutura primária de
cada uma delas. A espermadesina AWN apresenta alanina (A), triptofano (W) e asparagina
(N), AQN-1 e AQN-3 apresentam alanina (A), glutamina (Q) e asparagina (N), onde os
36
números 1 e 3 indicam a posição de eluição destes peptídeos durante a cromatografia
realizada em coluna de fase reversa acoplada a HPLC (JONÁKOVÁ et al., 1991) .
AWN é uma das principais espermadesinas encontradas na zona pelúcida quando
o espermatozóide encontra-se presente e é sintetizada na “reti testis” e principalmente no
epitélio da vesícula seminal de suínos (DOSTÀLOVÀ et al, 1995a). Dados demonstram que
essa proteína é o único membro desta família presente no espermatozóide epididimário, tendo
sido quantificado em 6 a 7x106 móleculas/célula (DOSTÀLOVÀ et al., 1994b). Tem sido
relatado que elas desempenham um papel importante na maturação dos espermatozóides
(CALVETE et al., 1994). A espermadesina AWN é classificada como uma proteína de
superfície do espermatozóide (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 1998). AWN permanece
vinculada à região peri-acrossomal da membrana plasmática espermática após o transporte
através do trato genital feminino, da capacitação in vivo e pode estar associada ao
reconhecimento de gametas (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 1998) (Figura 6).
Figura 6: Representação esquemática montrando a capacitação do espermatozóide e fecundação no oviduto de
mamíferos (Adaptado de TOPFER-PETERSEN, 2008).
Estudos imunohistoquímicos têm demonstrado que após a síntese de AWN na
“reti testis”, esta espermadesina é transportada para o epidídimo. Curiosamente, AWN não é
expressa somente no epidídimo e vesícula seminal, mas também no útero e na tuba uterina do
trato genital da fêmea suína (EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2002). Tal achado desfaz
37
considerações prévias de que as espermadesinas seriam moléculas exclusivas do trato
reprodutor masculino.
AWN, AQN-1 e AQN-3 são proteínas que se ligam ao espermatozóide e parecem
estar envolvidas na interação com carboidratos presentes em ovócitos secundários para a
fecundação. As proteínas AQN-1 e AQN-3 estão ligadas predominantemente na superfície da
cabeça espermática e sua contribuição tem sido demonstrada para a formação do reservatório
espermático ovidutal através da interação com glicoconjugados do epitélio do oviduto.
(WAGNER et al., 2002; EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2005).
No que diz respeito às interações bioquímicas, apenas AWN e AQN-3 são capazes
de interagir com a matriz fosforil-etanolamina, sugerindo que estas espermadesinas podem
ligar-se diretamente aos lipídios da membrana espermática (DOSTÀLOVÀ et al., 1995b).
Vale ressaltar que fosforil-etanolamina é o principal substituinte de fosfolipídios de
membrana do esperma de suínos. Agregados de espermadesinas poderiam então tornar-se
revestidos no topo desta primeira camada, servindo como fatores de estabilização que
protegem a membrana acrossômica de uma possível reação acrossômica prematura. Estas
espermadesinas são cogitadas para estabilizar a membrana plasmática durante a reação
acrossômica e são liberadas a partir da superfície espermática principalmente durante a
capacitação (DOSTÀLOVÀ et al., 1994).
AQN-1 liga-se a membrana lipídica do espermatozóide através de mecanismo
indireto. Esta ligação forma um heterodímero com a proteína suína tipo Fn-2, pB1, que pode
se associar ao espermatozóide através da membrana ligando-se a fosforilcolina por meio do
sítio da pB1(EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2007).
2. PSP- I E PSP- II
As espermadesinas PSP-I e PSP-II são denominadas Porcine Seminal Plasma
Protein e correspondem as mais abundantes proteínas presentes no plasma seminal de suíno
(NIMTZ et al., 1999). Vale ressaltar que elas representam mais de 50% da fração composta
pelas espermadesinas (KWOK et al., 1993b).
PSP-I é uma glicoproteína composta por 109 resíduos de aminoácidos, com massa
molecular da ordem de 11 kDa (forma-não glicosilada). Esta espermadesina, apesar de ter
uma seqüência única de aminoácidos, apresenta duas glicoformas, oriundas de diferentes
modificações pós-traducionais (CALVETE et al., 1995a).
38
Uma glicoforma pode ser encontrada na fração ligante a heparina do plasma
seminal (AQN-2) e contém resíduos de fucose, N-acetilglicosamina e manose. A outra
glicoforma contém resíduos de galactosamina, galactose e ácido siálico e é preferencialmente
recrutada por PSP-II para formar heterodímeros. Assim o padrão de glicosilação pode
determinar a capacidade de ligação da espermadesina e, consequentemente, sua função
biológica (CALVETE et al., 1995a).
A espermadesina PSP-II, principal componente protéico do plasma seminal de
suínos, é composta por 116 resíduos de aminoácidos e apresenta uma massa molecular (forma
não glicosilada) de aproximadamente 12 kDa (CALVETE et al., 1995a). Apresenta a
capacidade de ligar-se a polissacarídeos polissulfatados, tais como heparina e fucoidan, de
forma específica e dose-dependente e a oligossacarídeos contendo grupos manose-6-fosfato.
No entanto, apesar disso, o complexo PSP-I/PSP-II não apresenta essa afinidade, indicando
que a dimerização bloqueia estericamente ou modifica os sítios envolvidos na interação
proteína-carboidrato (SOLIS et al., 1998). Adicionalmente o monômero PSP-II apresenta um
sítio putativo de ligação para glicoproteínas da zona pelúcida (CALVETE et al., 1995b),
conferindo essa capacidade a PSP-I/PSP-II. Tal fato poderia sugerir um papel destas
espermadesinas na interação de gametas. Entretanto, o heterodímero liga-se apenas à
superfície do espermatozóide, sendo facilmente removido durante o processo de capacitação
dos espermatozóides in vitro (DOSTÀLOVÀ et al., 1994).
A PSP-I e PSP-II isoladas têm a capacidade de se ligar a heparina, embora, na
forma heterodimérica glicosilada esta interação a heparina não ocorra. Além disso, o
heterodímero e a subunidade PSP-II, mas não a PSP-I, apresentam afinidade por inibidor de
tripsina e glicoproteínas da zona pelúcida (CALVETE et al., 1995a).
PSP-I e PSP-II, na forma heterodimérica, foram as primeiras espermadesinas a
serem cristalizadas (ROMERO et al., 1996) e terem a estrutura tridimensional determinada
na qual foi revelada a arquitetura do domínio CUB das espermadesinas.
Funcionalmente, recentes estudos evidenciam uma atividade imunosupressiva para
a glicoforma PSP-I e PSP-II. Elas são imuno-estimulatórias para atividades de linfócitos in
vitro (NIMTZ et al., 1999), enquanto o heterodímero PSP-I/PSP-II induz o recrutamento de
neutrófilos na cavidade peritoneal de ratos (ASSREUY et al., 2002; ASSREUY et al., 2003) e
de suínos (RODRÍGUEZ- MARTINEZ et al., 2005) o que pode evitar uma possível infecção
do trato reprodutor baixo e fornecer uma estratégia para prover um ambiente uterino livre de
células para os embriões gerados (ASSREUY et al., 2003). Além disso, essas espermadesinas
têm mostrado exercer influências na qualidade de espermatozóides altamente diluídos para
39
fins biotecnológicos (CENTURÍON et al., 2003; CABALLERO et al., 2004; GARCIA et al.,
2006).
Tais descobertas apontam essas proteínas para uma potencial utilização como
aditivo ao meio diluidor de sêmen, podendo incrementar os parâmetros espermáticos. Além
disso, não parece haver influência desta espermadesina sobre a capacidade de fecundação in
vitro dos espermatozóides previamente incubados com a proteína (CABALLERO et al.,
2004). No entanto, quando PSP-I/PSP-II é acrescentada ao meio de maturação dos oócitos ou
ao meio de fecundação, ocorre acentuada diminuição na taxa de fecundação, bem como no
número de espermatozóides circundando os oócitos. Não se sabe se esses efeitos inibitórios
são exercidos diretamente sobre os espermatozóides ou bloqueando os receptores na zona
pelúcida (glicoproteínas) do oócito (CABALLERO et al., 2005).
1.4.2 ESPERMADESINAS BOVINAS
Em bovinos somente duas espermadesinas foram identificadas, a SPADH-1
(aSFP) e a SPADH-2 (Z13) (WEMPE et al., 1992; TEDESCHI et al., 2000).
A espermadesina aSFP (acidic seminal fluid protein) é um peptídeo não
glicosilado de 12,9 kDa purificado a partir do plasma seminal bovino e que não apresenta a
capacidade de se ligar a heparina. Esta proteína é principalmente expressa na vesícula seminal
e em menor proporção no epidídimo, não tendo sido detectada em nenhum outro tecido
bovino (EINSPAINER et al., 1991). No animal adulto, a aSFP é o principal componente do
fluido seminal, sendo sua concentração na faixa de 2 a 7 mg/mL (DOSTÀLOVÀ et al.,
1994b; EINSPANIER et al., 1993).
A estrutura primária de aSFP demonstra que esta proteína é composta por 114
resíduos de aminoácidos e apresenta duas pontes dissulfeto (EINSPANIER et al., 1994).
A aSFP liga-se mais fracamente à superfície do espermatozóide bovino no
ejaculado, sendo quantitativamente liberada durante a capacitação in vitro (DOSTÀLOVÀ et
al., 1994b). A aSFP, além de apresentar fraca ligação à membrana do espermatozóide, não
apresenta capacidade de ligação à zona pelúcida, indicando que a mesma não está envolvida
na interação de gametas.
Por outro lado, em concentrações fisiológicas, a aSFP parece proteger o
espermatozóide contra lesões oxidativas por reduzir a peroxidação lipídica (SCHONECK et
al., 1993). Além disso, a aSFP parece estimular de forma dose-dependente a divisão celular
40
de linfócitos estimulando a secreção de progesterona pelo endométrio bovino e pelas células
ovarianas (EINSPANIER et al., 1991).
Após a cristalização, a estrutura tridimensional de aSFP foi determinada
apresentando similaridade às espermadesinas suínas PSP-I e PSP-II. No entanto, algumas
características exclusivas para esta proteína foram demonstradas, o que pode explicar as
diferentes propriedades biológicas dos diferentes membros da família das espermadesinas
(ROMÃO et al., 1997).
Recentemente uma nova proteína da família das espermadesinas do plasma
seminal bovino foi purificada, sendo denominada SPADH-2 ou Z13. Os dados indicam que a
proteína é um dímero de 26 kDa, quando a amostra é preparada em condições nativas, e um
monômero de 13 kDa na presença de agentes redutores (TEDESCHI et al., 2000).
Z13 é um polipeptídeo que apresenta 116 resíduos de aminoácidos, os quais
apresentam 53% de similaridade com a aSFP, 49% de similaridade com PSP-I e 38% com
PSP-II. A PSP-II se liga a heparina somente no estado monomérico e ao formar dímero com
PSP-I perde essa capacidade. Uma explicação similar não pode ser dada para a Z13, que não
apresentou capacidade de se ligar a heparina nem na forma monomérica nem na forma
dimérica.
A mais significativa diferença entre Z13 e as outras espermadesinas é a existência
de um quinto resíduo de cisteína na posição 89 (C89) dessa molécula. Este aminoácido pode
estar envolvido na formação de uma ponte dissulfeto intercadeia responsável pela dimerização
da proteína Z13. Assim, quando em solução aquosa, Z13 provavelmente apresenta-se como
um homodímero com uma ponte dissulfeto intercadeia envolvendo os resíduos C89 de cada
molécula (TEDESCHI et al., 2000).
1.4.3 ESPERMADESINA EQUINA
HSP-7 ou SSP-7 (Stallion Seminal Plasma Protein) foi isolada do plasma seminal
de cavalos (REINERT et al.,1996) e apresenta sequência de aminoácidos similar à
espermadesina suína AWN, com diferença apenas em três aminoácidos (REINERT et al.,
1996; EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2002.
Em contraste com a AWN suína, a HSP-7 foi primeiramente detectada em
espermatogônias e, posteriormente, na “reti testis”, no epidídimo e na vesícula seminal. Em
41
acordo com sua ampla distribuição celular, HSP-7 já foi detectada em alguns espermatozóides
isolados dos tecidos. Durante a passagem através dos ductos epididimários, quantidades
adicionais de HSP-7 associam-se ao segmento equatorial do espermatozóide (HOSHIBA &
SINOWATZ, 1998).
Tanto a AWN suína como a HSP-7 apresentam a capacidade comum de ligar-se a
carboidratos da zona pelúcida. Em função disso, essas espermadesinas podem desempenhar
um importante papel como moléculas de adesão primária nas etapas iniciais do processo de
fecundação (TOPFER-PETERSEN & CALVETE, 1996; TOPFER-PETERSEN et al., 2005).
1.4.4 ESPERMADESINA OVINA
RSP (Ram Seminal Plasma Protein) foi isolada do plasma seminal de ovinos. O
isolamento de proteínas do plasma seminal ocorreu através de cromatografia de afinidade em
coluna com gel de agarose. Este procedimento identificou a presença de uma proteína
denominada RSP com 15,5 kDa, sendo a principal proteína do plasma seminal ovino,
representando 45% do peso total de proteínas. Esta conclusão foi possível através do cálculo
de sua massa.
A sequência N-terminal desta proteína foi suficiente para identificá-la como uma
espermadesina. Os 25 primeiros resíduos de aminoácidos identificados na RSP indicaram
sequência idêntica com a espermadesina AQN-1, purificada do plasma seminal de suíno
(BERGERON et al., 2005).
Além disso, como descrito para a espermadesina AQN-1, a espermadesina de
ovino (RSP) mostrou especificidade a heparina. Isto sugere que esta proteína apresenta um
papel similar na capacitação espermática ou ligação do espermatozóide no epitélio ovidutal ou
na zona pelúcida (BERGERON et al., 2005).
42
1.4.5 ESPERMADESINAS CAPRINAS
Em 2002 foi isolada a primeira espermadesina caprina denominada BSFP (Buck
Seminal Fluid Protein) presente no plasma seminal caprino (TEIXEIRA et al., 2002). A
BSFP, através de sua sequência N-terminal, mostrou homologia com as espermadesinas
suínas (AQN-1 e AWN), equina (HSP-7) e bovina (aSFP) (Figura 7). BSFP não apresentou
capacidade de se ligar a heparina (TEIXEIRA et al., 2006), uma propriedade biológica de
alguns membros da família das espermadesinas.
Figura 7: Comparação da seqüência de aminoácidos do N-terminal das espermadesinas de suínos (AQN-1,
AWN), equino (AWN), bovino (aSFP) e caprino (BSFP). A: Alinhamento feito através do CLUSTAL W.
Asteriscos representam resíduos de aminoácidos idênticos em todas as sequências; dois pontos representa
substituições conservadas; ponto representa substituições semi-conservadas. B: Cladograma obtido por
alinhamento através do CLUSTAL W (Adaptado de Teixeira et al., 2006).
A BSFP apresentou massa molecular de 12,591 kDa determinada por
espectometria de massa (MALDI-TOF) (TEIXEIRA et al., 2006).
Por métodos cromatográficos clássicos, somente uma espemadesina foi isolada e
caracterizada do plasma seminal de bode. Após essa análise, estudos genômicos revelaram a
presença de quatro cDNAs codificando as principais formas das espermadesinas de caprinos
coletivamente designadas de bodesinas 1, 2, 3 e 4 ou Bdhs (MELO et al., 2008; MELO et al.,
2009).
43
Todas as sequências de aminoácidos deduzidas continham a assinatura do
domínio CUB da família das espermadesinas e foram 49 a 52% similares a AWN suína. Entre
as quarto Bdhs, a Bdh-2 foi a mais similar ao fragmento N-teminal da BSFP previamente
isolada por Teixeira et al (MELO et al., 2008).
Os genes da BSFP identificados e isolados foram clonados, caracterizados e sua
expressão ao longo do trato genital foi investigada, utilizando os cDNAs da vesícula seminal,
testículos, epidídimos, glândulas bulboretais e ductos deferentes de caprino (MELO et al.,
2008).
O perfil de expressão das Bdhs foi avaliado por qRT-PCR e revelou que na
vesícula seminal Bdh-2 é a isoforma predominantemente expressa. Os transcritos de
bodesinas foram detectados em todos os tecidos examinados, exceto no ducto deferente. O
perfil de expressão dos genes das bodesinas se mostrou diferenciado nos diferentes tecidos
examinados, o que pode indicar que cada isoforma pode ter uma função biológica específica
no trato genital do bode.
Cajazeiras et al clonaram e expressaram o cDNA da Bdh-2 em Escherichia coli a
fim de produzir Bdh-2 recombinante. A expressão desta recombinante foi realizada em
função da dificuldade de se obter quantidades de Bdh-2 suficiente por métodos
cromatográficos clássicos que possibilitasse a realização de estudos funcionais e estruturais.
Dessa forma, a produção de Bdh-2 recombinante seria uma alternativa promissora
para a realização de diversos estudos.
Futuros experimentos são necessários para caracterizar a função particular de cada
espermadesina caprina e para aumentar o conhecimento dos mecanismos reprodutivos nessa
espécie, bem como para se estabelecer o padrão estrutural de cada uma dessas proteínas. Fica
claro, entretanto, que devido ao baixo rendimento das proteínas nativas obtidas diretamente a
partir do líquido seminal, uma estratégia viável de se obter quantidades significativas de cada
uma das espermadesinas caprinas é através da clonagem e expressão de cada um dos seus
genes em sistemas heterólogos.
44
2. JUSTIFICATIVA
Com a biotecnologia é possível usar conhecimentos sobre os processos biológicos
e sobre os organismos vivos, para gerar novos insumos que tragam benefícios a sociedade
como um todo.
Atualmente, no Brasil muitos pecuaristas utilizam da técnica de fertilização in
vitro para obter linhagens animais com parâmetros que tornam os animais mais atraentes pelo
mercado nacional e internacional. De acordo com a Associação Brasileira das Indústrias
Exportadoras de Carnes (ABIEC), em 2008 o Brasil liderou o ranking dos maiores
exportadores de carne bovina no mundo, somando o volume de 2,2 milhões de toneladas
equivalente carcaça e receita cambial de US$ 5,3 bilhões. Estes valores representaram uma
participação de 28% do comércio internacional, exportando para mais de 170 países. Com
tantas vantagens competitivas, o Brasil segue na disputa e conquista de novos mercados de
modo que a carne bovina brasileira continue sendo apreciada por consumidores no mundo
todo. Transformar a carne brasileira em produto destacado, com alto valor agregado, e não
em mais uma commodity, é um dos grandes desafios que a cadeia do agronegócio tem que
enfrentar.
O Brasil além de grande produtor de carne bovina, alternativamente tem grande
potencial pecuário para criar outras espécies como suína, ovina e caprina. Estas espécies
também conferem grande valor econômico de produtividade ao país. De acordo com a
Associação Brasileira da Indústria Produtora e Exportadora de Carne Suína, o Brasil exportou
607,49 mil toneladas de janeiro a dezembro de 2009, um crescimento de 14,75% em volume
em relação ao mesmo período de 2008, obtendo uma receita anual em torno de US$ 1,2
bilhão.
No entanto, dentre as espécies ruminantes, no Nordeste brasileiro destaca-se os
caprinos, especialmente os das raças Moxotó e Canindé, cuja rusticidade lhes conferem
resistência ao calor. Diferentemente das espécies bovinas e suínas, a carne caprina é pouco
consumida mundialmente. No entanto, o aumento da produtividade desta espécie ruminante
será uma importante fonte de renda principalmente para os pecuaristas nordestinos.
Sabe-se que o sucesso do aumento da produtividade bovina e suína envolve
tecnologias como a fertilização in vitro. Muito provavelmente, as espermadesinas atuam
fisiologicamente como um fator importante na fertilização in vitro por mostrar exercer
45
influências na qualidade de espermatozóides altamente diluídos para fins biotecnológicos
(CABALLERO et al., 2004; GARCIA et al., 2006).
No entanto, o possível papel fisiológico reprodutivo das espermadesinas ainda
está sendo estudado. Especula-se que elas possam participar do processo de capacitação,
reconhecimento e ligação entre os gametas masculinos e femininos (CALVETE et al., 1994).
A espermadesina suína na forma heterodimérica PSP-I/PSP-II contribui para a
manutenção ou melhoramento da viabilidade e da motilidade dos espermatozóides
(CABALLERO et al., 2005). Além disso, quando a espermadesina suína encontra-se em
solução com espermatozóides de suíno, verifica-se o aumento significativo do percentual de
espermatozóides viáveis.
Já a espermadesina bovina SPADH-1 (aSFP) parece proteger o espermatozóide
contra lesões oxidativas, reduzindo a peroxidação lipídica (SCHONECK et al., 1993).
A espemadesina equina HSP-7 tem a capacidade de ligar-se a carboidratos da
zona pelúcida, podendo assim, desempenhar um importante papel como molécula de adesão
primária nas etapas iniciais do processo de fecundação (TOPFER-PETERSEN et al., 2005).
Na espécie caprina o baixo volume do plasma seminal, característico desta
espécie, tornou-se um obstáculo como fonte de espermadesinas para estudos na área de
reprodução, bioquímica e aplicações biotecnológicas. Para isso torna-se necessário a produção
desta proteína na sua forma recombinante. Assim, esta dissertação visa obter uma
espermadesina caprina recombinante para caracterizá-la físico-quimica e estruturalmente. Este
estudo é de suma importância para abrir um novo caminho na pecuária brasileira, auxiliando
no conhecimento de fertilização in vitro desta espécie ruminante e assim, contribuindo para o
aumento da produtividade de caprinos. Alternativamente, o domínio desta técnica para
caprinos contribuirá para o crescimento da economia local e nacional, ao exemplo existente
da produtividade da carne bovina e suína brasileira que dominam o mercado mundial.
46
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Expressar, purificar e caracterizar estruturalmente a Bdh-2 recombinante, uma
espermadesina presente no plasma seminal de bode (Capra hircus).
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a expressão da bodesina Bdh-2 recombinante produzida em sistema
bacteriano (E. coli TOP 10);
Estabelecer o método mais adequado de purificação da proteína rBdh-2;
Caracterizar a estrutura secundária da rBdh-2 através do perfil espectral de
dicroísmo circular (CD) bem como estimar as frações destas estruturas na conformação global
da proteína;
Avaliar as mudanças conformacionais na estrutura secundária da rBdh-2
promovidas por alterações na temperatura.
47
4. MATERIAIS E MÉTODO
4.1 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO PROCARIÓTICO
O cDNA que codifica a espermadesina Bdh-2 foi isolado de acordo com o método
descrito por MELO et al., (2008). A região que codifica a Bdh-2 foi amplificada por PCR e os
fragmentos amplificados foram subclonados no vetor de expressão pTrcHis TOPO utilizando
o kit de expressão pTrcHis TOPO TA (Invitrogen). Os plasmídeos recombinantes foram
utilizados para transformar células Top 10 One Shot fornecidas pelo Kit, segundo
metodologia de CAJAZEIRAS et al ., (2009).
O plasmídeo pTrcHis utilizado como vetor de expressão neste estudo foi
desenhado para facilitar a expressão de proteínas de origem eucariótica em sistema
procariótico utilizando como hospedeiro a bactéria E.coli. O vetor possui um forte promotor
transcricional denominado trc que confere altos níveis de expressão protéica em E.coli. O
vetor possui ainda uma seqüência denominada operador lacO para ligação do repressor Lac
codificado pelo gene LacIq. Na falta de IPTG, o repressor lac se liga a sequência lacO,
reprimindo a transcrição. Com a adição de IPTG a expressão é induzida.
O pTrcHis possui uma seqüência de terminação rrnB que reduz a terminação
prematura da transcrição, possui ainda um gene que confere resistência a ampicilina e
apresenta uma seqüência nucleotídica na região N-terminal do sítio múltiplo de clonagem que
codifica seis histidinas denominada His-tag, seguido pelo sítio de clivagem para a
enteroquinase. Dessa forma, o cDNA da Bdh-2 foi subclonado em fusão com esta sequência a
fim de facilitar a purificação da proteína recombinante através de cromatografia de afinidade
em metal imobilizado (IMAC) (Figura 8)
48
Figura 8: Representação esquemática do vetor de expressão procariótico pTrcHis-Bdh-2. pBR322 ori: origem
de replicação; Amp: gene de resistência a ampicilina; Lac1q: gene repressor lac; LacO: operador lac; ATG:
códon de iniciação; 6XHis: sequência que codifica para a cauda de histidina; EK: sítio de clivagem para a
enteroquinase; Bdh-2: fragmento do cDNA da Bdh-2; rrnB: seqüência de terminação da transcrição (Adaptado
de CAJAZEIRAS et al., 2009).
4.2 PCR COLONY PARA SELEÇÃO DOS CLONES POSITIVOS
Um clone positivo, selecionado por crescimento em meio LB-Broh contendo 50
µg/mL de ampicilina, foi confirmado por PCR utilizando primers flaqueadores de inserto
pTrcHis Forward e pTrcHis Reverse adquiridos na Invitrogen.
A reação de PCR foi realizada no termociclador Mastercycler Gradient S
(Eppendorf, Hamburg, Germany). As condições da reação de PCR envolveram uma
desnaturação inicial a 94 °C por dois minutos, seguidos por 30 ciclos de desnaturação a 94 °C
por 50s, anelamento a 55 °C por 50s e extensão a 72 °C por 50s, seguida por extensão final a
72 °C por 8 minutos. Os amplicons foram avaliados em gel de agarose 1%, corados com
brometo de etídeo a 5 mg/mL e visualizados sob iluminação ultravioleta.
49
4.3 EXPRESSÃO HETERÓLOGA DA rBdh-2
Para a expressão heteróloga da proteína rBdh-2 fusionada com cauda de histidina
partiu-se de um clone positivo detectado por PCR. Foram utilizadas duas diferentes
metodologias, uma proposta por CAJAZEIRAS et al., (2009) que induz a expressão da
bodesina recombinante através de isopropyl-D-thiogalactoside, IPTG (USB Corporation,
Cleveland, OH, USA) e outra proposta neste trabalho que utiliza temperatura como um
indutor da expressão da proteína recombinante rBdh-2 na forma solúvel.
4.3.1 INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DA rBdh-2 POR IPTG
Para indução por IPTG foram feitos 5 pré-inóculos da bactéria em 5 mL de meio
LB-Broth, onde 4 pré-inóculos foram denominados experimentais e 1 pré-inóculo foi
denominado controle. Todos os pré-inóculos continham 50 µg/mL de ampicilina e foram
cultivados a 37 °C overnight.
Cada pré-inóculo foi reinoculado em um meio contendo 500 mL de meio de
cultura com a mesma concentração de ampicilina, totalizando 2 L de cultura. As bactérias
foram deixadas sob agitação aproximadamente 3 horas em agitador até atingirem crescimento
na fase log cujo valor de DO600nm
(Densidade Ótica) alcançasse 0,6-0,8. Posteriormente, uma
alíquota de 1 mL foi retirada (amostra experimental e amostra controle) para ser utilizada
como controle negativo da indução de expressão da proteína recombinante, sendo
denominado T0 (tempo zero) imediatamente antes da indução por IPTG. As proteínas
expressas nestas amostras foram analisadas em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15%.
Todo o restante da cultura bacteriana foi submetida à indução da expressão da
rBdh-2 utilizando IPTG na concentração de 1,5 mM por duas horas segundo metodologia
proposta por CAJAZEIRAS et al., (2009). Uma alíquota de 1 mL foi retirada após indução
para verificar a eficiência da expressão da proteína. A proteína expressa foi analisada em gel
de poliacrilamida SDS-PAGE 15% e este período de indução foi denominado T2 (tempo
dois), ou seja, tempo após as duas horas de indução. O mesmo foi feito para a amostra
controle.
50
4.3.2 INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DA rBdh-2 POR TEMPERATURA
Para indução por temperatura foi utilizada a mesma metodologia descrita
anteriormente, porém, ao invés de se utilizar IPTG como indutor utilizou-se baixa
temperatura. As culturas bacterianas, após atingirem crescimento em uma DO600
entre 0,6-0,8,
foram mantidas a 14 °C por 24h, a fim de se obter a maior quantidade de proteína na fração
solúvel. Uma alíquota de 1 mL foi retirada antes (T0) e após (T24) a indução para se verificar
a eficiência da expressão da proteína. Esta análise foi realizada em gel de poliacrilamida SDS-
PAGE 15%.
4.4 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS DA E. coli TOP 10 RECOMBINANTE
A extração da proteína recombinante de ambas as induções (IPTG e temperatura)
envolveu a lise das bactérias. As células da cultura bacteriana após 2 horas de indução com
IPTG 1,5 mM ou de crescimento a 14 °C overnight foram centrifugadas a 7.000 rpm (rotações
por minuto) por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante correspondendo ao meio de cultura foi
descartado e o precipitado (pellet) de bactérias foi mantido no gelo a fim de minimizar a ação
de proteases.
Em seguida, usando uma pipeta sorológica de 10 mL, as células foram
ressuspensas completamente adicionando-se 25 mL de solução de lise (Tampão fosfato de
sódio contendo imidazol 10 mM em pH 7,4) para cada 500 mL de pellet de cultura bacteriana.
Em seguida, esse volume foi mantido em gelo e sonicado em pulsos de 20 segundos 15 vezes
com potência de 30 W a intervalos de 15s. Após essa etapa, procedeu-se a centrifugação a
7.000 rpm por 20 minutos a 4 °C.
O sobrenadante da indução por IPTG e da indução por temperatura foi transferido
cuidadosamente e separadamente para um tubo de microcentrífuga de 15 mL estéril. Em
seguida, a amostra foi filtrada em filtro de 0,45 µm (MILLIPORE) e submetida à análise por
SDS-PAGE 15%.
O sobrenadante da indução por temperatura foi submetido à cromatografia de
afinidade em coluna com metal imobilizado (IMAC).
O pellet da cultura induzida por temperatura foi descartado e o pellet da cultura
induzida por IPTG foi ressuspendido completamente em solução de lise contendo uréia 8 M
para solubilizar as proteínas expressas em corpos de inclusão. Em seguida, a amostra foi
51
centrifugada a 7.000 rpm por 20 minutos à 4 °C, sendo o sobrenadante submetido a
eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15% para avaliar a expressão da proteína
recombinante. O pellet contendo os debris celulares foi descartado.
As proteínas solúveis totais foram quantificadas pelo método de Bradford e em
seguida passadas no filtro de 0,45 μm (MILLIPORE) imediatamente antes da purificação por
cromatografia de afinidade em metal imobilizado (IMAC) no sistema ÄKTA Purifier (GE
Healthcare).
4.5 PURIFICAÇÃO DA rBdh-2 POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM
COLUNA HIS-TRAP
A estratégia empregada para a purificação da bodesina recombinante rBdh-2
contendo cauda de histidina utilizou as vantagens da cromatografia de afinidade em metal. Os
íons metálicos são imobilizados através do uso de um agente quelante presente na matriz
cromatográfica capaz de possibilitar a ligação da proteína ao metal. Alguns aminoácidos
como a histidina apresentam alta especificidade de ligação por metal imobilizado (Figura 9).
Figura 9: Representação esquemática da interação entre resíduos vizinhos da cauda de histidina (His-tag) e a
matriz contendo níquel imobilizado. Os sítios livres na esfera de interação do níquel interagem com os anéis de
imidazol da proteína recombinante (azul).
Dessa maneira, proteínas ricas em histidina podem ser especificamente eluídas da
resina cromatográfica carregada com íons metálicos, e então isoladas por este método.
52
A coluna utilizada na cromatografia de afinidade contendo metal imobilizado para
a purificação da bodesina recombinante rBdh-2 foi a His-Trap HP de 5 mL (GE Healthcare).
As condições cromatográficas consistiram em equilibrar His-Trap HP, com 5 CV (volumes de
coluna), com tampão de equilíbrio (Tampão fosfato de sódio e Imidazol 10 mM em pH 7,4)
para aplicar extrato protéico advindo da indução por temperatura. O mesmo tampão
acrescidos de uréia 8 M foi utilizado para equilibrar His-Trap HP para aplicar extrato protéico
advindo da indução por IPTG.
O extrato total protéico das induções (por temperatura e IPTG) foi separadamente
aplicado à coluna HisTrap HP em um fluxo de 1 mL/min, a fim de possibilitar uma maior
interação das proteínas expressas, contendo cauda de histidina presentes no extrato total, com
os metais imobilizados da coluna. As proteínas que não interagiram com o metal da coluna
foram eluídas com 5 CV de tampão de equilíbrio e a fração ligante a matriz cromatográfica
foi eluída em tampão de equilíbrio em gradiente de 0-500 mM de imidazol. Nestas
cromatografias as amostras foram coletadas e o conteúdo protéico foi avaliado a 216 e 280
nm. As amostras, tanto da fração ligante como da fração não ligante, foram coletadas para
análise em gel de eletroforese em poliacrilamida a 15% e por immunoblotting.
4.6 PURIFICAÇÃO DA BODESINA RECOMBINANTE rBdh-2 POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM COLUNA DEAE-SEPHACEL
A fração protéica retida na cromatografia de afinidade foi dializada contra tampão
Tris 20 mM pH 7,4 e o conteúdo protéico foi concentrado em filtros amicon de 10KDa
(MILLIPORE). Posteriormente, este concentrado protéico foi submetido à cromatografia de
troca iônica em coluna (1 mL de volume) de DEAE-Sephacel Hi-Trap (GE Healthcare).
As condições cromatográficas consistiram em equilibrar a coluna com 5 CV do
mesmo tampão em que a amostra estava solubilizada (Tris 20 mM em pH 7,4). Em seguida, 1
mL de amostra foi aplicada na coluna em fluxo de 1,0 mL/min e com este mesmo fluxo a
fração não ligante à matriz cromatográfica foi eluída com 5 CV no tampão de equilíbrio. A
fração ligante a matriz foi eluída com 10 CV em gradiente de NaCl de 0-1M no mesmo
tampão de equilíbrio. As amostras foram coletadas em coletor de fluxo em volumes de 1 mL e
o conteúdo protéico foi avaliado a 216 e 280 nm.
53
As frações ligante e não-ligante foram submetidas à análise por eletroforese em
gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15% e imunoblotting.
4.7 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
Alíquotas das frações citadas anteriormente foram ressuspensas em tampão de
amostra (azul de bromofenol 5%, SDS 20% e glicina 10%). Para os testes em condições
redutoras, as mesmas foram acondicionadas em tampão contendo β-mercaptoetanol a
concentração final de 10%. Antes da aplicação da amostra no gel de poliacrilamida, a mesma
foi aquecida a 100 °C por 5 minutos.
A metodologia desenvolvida por LAEMMLI (1970) foi utilizada para caracterizar
o perfil eletroforético das proteínas obtidas nas várias etapas de purificação. O gel de
separação foi preparado com 1,25 mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 1,25 mL de tampão
Tris-HCl 1,5M pH 8,8; 2,425 mL de água destilada; 50 μL de SDS 10%; 5 μL de TEMED
concentrado e 25 μl de persulfato de amônio 10%. O gel de concentração continha 0,33 mL
de acrilamida-bisacrilamida 30%; 625 μL de tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 1,5 mL de água
destilada; 25 μL de SDS 10%; 5 μL de TEMED e 12,5 μL de persulfato de amônio. O tampão
de corrida continha 25 mM de trisma-base; 192 mM de glicina e SDS 1%.
A eletroforese foi processada em uma amperagem constante de 20 mA durante 2
horas. Os géis foram mergulhados em solução corante contendo Coomasie Blue R250 0,1%
em água, metanol e ácido acético glacial (5: 5: 2 v/v) por 1 hora a temperatura ambiente,
sendo, em seguida, descolorados com solução descorante constituída de etanol 30% e ácido
acético 10%.
4.8 IMMUNOBLOTTING
Para a detecção da bodesina recombinante rBdh-2 fusionada com cauda de
histidina, as amostras após terem sido separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida
SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose (GE Healthcare). Como
tampão de transferência foi utilizado Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM e metanol 20%
(v/v). Para isto, foi utilizada uma voltagem constante de 25 V, amperagem de 25 mA,
54
temperatura ambiente no período de 2 horas usando o sistema de eletroforese Mini VE Blot
Module Apparatus (GE Healthcare).
Os sítios inespecíficos foram bloqueados com incubação do gel overnight a 4 °C
ao tampão de bloqueio TTBS constituído de Tris-HCl 100 mM pH 7,5, NaCl 150 mM e
Tween 20 1% adicionados a de leite desnatado (Molico/Nestle) a concentração de 5% (p/v).
Em seguida, a membrana foi incubada com anticorpo monoclonal anti-
polihistidina na diluição de 1:1.500 (v/v) adquiridos na Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA e
diluído no tampão de bloqueio, seguido de incubação por 3 horas a temperatura ambiente.
Após três lavagens da membrana, foi adicionado o anticorpo conjugado (anti-rabbit alkaline
phosphatase conjugate) diluído no tampão de bloqueio na proporção de 1:5000 seguido de
incubação por 1 hora a temperatura ambiente.
Após lavagem da membrana com TTBS, a mesma foi incubada por 60 minutos
com fosfatase alcalina anti IgG de rato (Sigma-Aldrich) diluída na proporção de 1:100 (v/v).
Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com TTBS e uma vez com TBS (100 mM Tris-
HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl). A bodesina recombinante rBdh-2 foi visualizada adicionando o
substrato NBT/BCIP para fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich), sendo a reação parada com água
destilada.
4.9 DICROISMO CIRCULAR (CD)
De acordo com a conformação estrutural que as proteínas adquirem (hélices- ,
folhas-β ou estruturas desordenadas), é possível caracterizar a estrutura secundária destas
moléculas devido ao perfil espectral de CD particular destes arranjos, bem como estimar as
frações destas estruturas na conformação global da proteína.
As medidas de CD foram realizadas em um espectropolarímetro J-815 da JASCO
(Figura 10A). Utilizou-se uma alíquota de 100 L da rBdh-2 (OD = 0,3) em tampão Tris 20
mM pH 7,0. As medidas foram feitas numa cubeta de quartzo com 1 mm de caminho ótico
(Figura 10B) a temperatura controlada de 25 °C.
55
A B
Figura 10: A: Espectropolarímetro J-815 da JASCO utilizado para a realização das medidas de CD da bodesina
rBdh-2; B: Cubeta de quartzo com 1 mm de caminho ótico.
Primeiramente foi obtido um espectro do branco, ou seja, apenas da solução
tampão Tris 20 mM pH 7,0 (no qual a amostra foi diluída) para que não houvesse
interferência. As contribuições do tampão obtidas sob condições idênticas foram subtraídas e
todos os espectros de CD foram corrigidos a fim de eliminar quaisquer efeitos de ruído. Foi
feita então, uma varredura de 190 a 250 nm aplicando a velocidade de 50 nm/mim,
registrando 8 acumulações. Utilizou-se como fonte de luz uma lâmpada de xenônio com 16
atmosferas de pressão.
Os programas utilizados para processar os dados foram Spectra ManagerTM
II,
Origin® e Protein Secondary Structure Estimation Program Jasc for windows (que faz parte
do pacote de softwares adquiridos junto com o equipamento).
As contribuições de estrutura secundária obtidas pelo espectro de CD da rBh-2
foram realizadas utilizando o programa Convex Constraint Analysis (CCA) – Selcon3. Este
programa é um método de deconvolução que extrai as componentes comuns de um grupo
qualquer de espectros, calculando assim, suas curvas básicas.
Teoricamente, a partir da combinação destas curvas básicas, pode-se obter
qualquer curva contida no grupo de espectros. A este grupo de espectros dá-se o nome de
espectros de referência. O Selcon3 utiliza o algarítimo simplex que extrai dos espectros de
referência suas cinco componentes puras, isto é, as curvas associadas à conformação
secundária de proteínas ( -hélice, folha- , volta- , estrutura não ordenada e contribuições
aromáticas).
56
4.10 ENSAIO DE TERMOESTABILIDADE DA rBdh-2 UTILIZANDO DICROÍSMO
CIRCULAR
Com o objetivo de avaliar as mudanças conformacionais na estrutura secundária
da rBdh-2 promovidas por alterações na temperatura, uma alíquota de 100 L da bodesina
recombinante (OD = 0,300 diluída em tampão Tris 20 mM pH 7,0) foi submetida a diferentes
medidas de CD variando-se a faixa de temperatura de 5 a 55 °C. Os espectros de CD foram
determinados em intervalos de 5 °C.
57
5. RESULTADOS
5.1 CONSTRUÇÃO DO VETOR DE EXPRESSÃO PROCARIÓTICO
Neste trabalho foi utilizado como template para PCR, os clones produzidos por
Melo et al (2008) que continham insertos de cDNA de 607 pares de bases. Em particular, o
fragmento clonado da Bdh-2 compreende uma ORF (Open Reading Frame) de 318 pb
incluindo o códon de parada com 278 pb na região 3’ não traduzida (Figura 11).
Figura 11: Representação esquemática da seqüência nucleotídica do sistema de expressão pTrcHis-Bdh-2 e da
sequência de aminoácidos traduzida. O vetor plasmidial é mostrado em letras sublinhadas. O códon de iniciação
(ATG) e os dois códons de parada estão dentro das caixas cinzas. O sítio de ligação do ribossomo está
representado em letras itálica. A 6xHis tag e a sequencia de reconhecimento da enteroquinase são mostrados em
negrito. Adaptado de CAJAZEIRAS et al., 2009.
58
Os insertos de cDNA estavam em frame com o códon de iniciação ATG do vetor
pTrcHis TOPO. Este fato assegurou uma correta tradução da sequência de aminoácidos da
rBdh-2. O vetor pTrcHis-bdh-2 produzido codificou uma cadeia polipeptídica de 140
aminoácidos, dos quais 105 resíduos correspondiam a rBdh-2. Os 35 resíduos de aminoácidos
extra codificados são referentes ao plasmídeo que correspondem a seis histidina (6xHis) na
região N-terminal e ao sítio de clivagem para enteroquinase.
5.2 PCR COLONY PARA SELEÇÃO DOS CLONES POSITIVOS
A figura 12 representa um clone positivo selecionado por crescimento em meio
LB-Broth contendo 50 µg/mL de ampicilina confirmado por PCR, analisado em gel de
agarose 1%, corado com brometo de etídeo e visualizado sob iluminação ultravioleta.
O tamanho do produto de PCR foi de aproximadamente 350 pb, o que é
compatível com o tamanho da ORF da bodesina Bdh-2 utilizada neste estudo. Uma vez
confirmada à presença do inserto no clone selecionado foi dada sequência aos experimentos
de expressão heteróloga da proteína.
Figura 12: Amplificação da ORF codificadora da bodesina Bdh-2. A primeira coluna indica o padrão de massa
molecular de 250 pb DNA Ladder da Invitrogen. A seta corresponde a ORF da Bdh-2 amplificada.
59
5.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE r-Bdh2 POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM COLUNA HIS-TRAP - INDUÇÃO POR
TEMPERATURA
A purificação da proteína recombinante expressa através da indução por
temperatura envolveu primeiramente a lise das bactérias através de sonicação. O sobrenadante
obtido da cultura bacteriana, após sonicação seguida de centrifugação, foi passado em filtro de
0,45 µm (MILLIPORE) e submetido à cromatografia de afinidade em coluna His-Trap
contendo metal imobilizado (IMAC) utilizando o sistema cromatográfico ÄKTA Purifier (GE
Healthcare).
A figura 13 mostra o perfil cromatográfico obtido a partir do extrato total
bacteriano submetido à indução de expressão protéica por temperatura.
Figura 13: Perfil cromatográfico da purificação da proteína rBdh-2 utilizando cromatografia de afinidade em
coluna His-Trap contendo metal imobilizado. O tampão de eluição da fração protéica não ligante foi fosfato de
sódio com imidazol 10mM. O tampão de eluição da fração protéica retida na coluna foi fosfato de sódio com
gradiente de imidazol de 0-500mM. O volume de amostra aplicado na coluna foi de 70 mL e o fluxo da
cromatografia foi de 1,0 mL/min. As frações protéicas foram monitoradas a 216 nm (rosa) e 280 nm (azul).
60
5.4 PURIFICAÇÃO DA rBdh-2 POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM
COLUNA HIS-TRAP COM METAL IMOBILIZADO (IMAC) – INDUÇÃO POR
IPTG
A purificação da proteína recombinante expressa através da indução por IPTG
também envolveu primeiramente a lise das bactérias através de sonicação. A fração insolúvel
da cultura induzida por IPTG foi passada em filtro de 0,45 μm (MILLIPORE) imediatamente
antes de ser submetida à cromatografia de afinidade utilizando uma coluna contendo níquel
imobilizado. A figura 14 mostra o perfil cromatográfico obtido do extrato total bacteriano
cuja expressão protéica foi induzida por IPTG 1,5mM.
Figura 14: Perfil cromatográfico da purificação da proteína recombinante rBdh-2 através de cromatografia de
afinidade em coluna His-Trap no sistema Äkta Purifier (GE Healthcare). O tampão de eluição da fração protéica
não retida utilizado foi fosfato de sódio com uréia 8 M e imidazol 10mM. O tampão de eluição da fração retida
nos metais da coluna de afinidade foi fosfato de sódio com uréia 8 M e gradiente de imidazol de 0-500mM. O
volume de amostra aplicado na coluna foi de 100 mL e o fluxo da cromatografia foi de 1,0 mL/min. As frações
protéicas foram monitoradas a 280 nm (azul).
61
5.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA rBdh-2 SEMI PURIFICADA -
ANÁLISE ELETROFORÉTICA E IMMUNOBLOTTING
Alíquotas referentes a cada passo da indução da expressão da proteína
recombinante rBdh-2 foram utilizadas para análise eletroforética seguidas por
immunoblotting.
Após a expressão da bodesina rBdh-2 na forma recombinante através da indução
por IPTG, o extrato total foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna His-Trap
com metal imobilizado utilizando o sistema Äkta Purifier (GE Healtcare). As frações eluídas
durante o processo cromatográfico foram submetidas à análise por SDS-PAGE seguidas por
immunoblotting.
A figura 15 mostra a detecção da bodesina recombinante rBdh-2 fusionada com
cauda de histidina, as amostras após terem sido separadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida SDS-PAGE 15% foram transferidas para membrana de nitrocelulose (GE
Healthcare).
Figura 15: Perfil da detecção da bodesina recombinante rBdh-2 fusionada com cauda de histidina. 1: T0 (
Extrato total antes da indução por IPTG); 2: T2 (Extrato total após indução por IPTG 1,5 mM por 2 horas); 3:
Fração insolúvel da indução por IPTG ; 4: Fração solúvel da indução por IPTG; 5: Fração retida em coluna de
HisTrap; 6:Fração não retida em coluna de HisTrap.
62
5.6 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE rBdh-2 POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM COLUNA DEAE-SEPHACEL
A fim de otimizar o processo de purificação da rBdh-2 e, conseqüentemente,
eliminar a presença de proteínas contaminantes, foi realizada cromatografia de troca iônica
em coluna de DEAE-Sephacel (GE Healtcare) no sistema Äkta Purifier (GE Healtcare).
A figura 16 representa o perfil cromatográfico da purificação da proteína
recombinante semi purificada em cromatografia de afinidade em coluna de His-Trap (GE
Healtcare). O método complementar para a purificação da proteína recombinante rBdh-2 foi a
cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel (GE Healtcare).
Figura 16: Perfil cromatográfico da purificação da proteína rBdh-2 em coluna de troca iônica DEAE- Sephacel
no sistema Äkta Purifier. O tampão de eluição da fração protéica não retida na matriz cromatográfica foi Tris 20
mM pH 7,4. O tampão de eluição de fração protéica retida na matriz cromatográfica foi Tris 20mM pH 7,4 com
NaCl 1,0 M. O fluxo da cromatografia foi de 1,0 mL/min e as frações protéicas foram monitoradas a 280 nm
(azul).
63
5.7 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA rBdh-2 PURIFICADA - ANÁLISE
ELETROFORÉTICA E IMMUNOBLOTTING
Alíquotas referentes à fração protéica não-ligante e ligante à coluna de troca
iônica (DEAE-Sephacel) foram utilizadas para análise eletroforética seguidas por
immunoblotting.
Figura 17: A- Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida 15% na presença de SDS corado com prata.1A-
Fração retida em coluna de DEAE-Sephacel; 2A- Fração não retida em coluna de DEAE-Sephacel. B- Análise
por immunoblotting. 1B- Fração retida em coluna de DEAE-Sephacel; 2B- Fração não retida em coluna de
DEAE-Sephacel
5.8 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA rBdh-2 POR DICROÍSMO CIRCULAR
(CD)
O espectro de CD obtido para a proteína recombinante rBdh-2 apresentou uma
banda positiva em 202 nm e uma banda negativa em 216 nm (Figuras 18). Isso caracteriza a
predominância de estruturas secundárias do tipo folhas-β sendo confirmado através do uso do
programa Convex Constraint Analysis (CCA) – Selcon3. Este programa confirmou também a
presença de um baixo conteúdo de estruturas não-ordenadas e de hélices- (Tabela 1).
64
Figura 18 - Espectro de dicroísmo circular da rBdh-2. As medidas foram realizadas no espectropolarímetro da
Jasco J-815 utilizando 100 L da rBdh-2 (DO = 0,300) em tampão Tris 20 mM pH 7,0. Os espectros foram
obtidos variando o comprimento de onda entre 190 a 250 nm e registrados como uma média de 8 varreduras a 25
°C, utilizando uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 1 mm.
Tabela 1 – Composição da estrutura secundária da rBdh-2 obtida da deconvolução do espectro de CD.
Componente Composição da rBdh-2 (%)
Hélice- 3
Não-ordenada 20
Volta-β (β-turn) 31
Folha- β 46
65
5.9 ENSAIO DE TERMOESTABILIDADE DA rBdh-2 UTILIZANDO DICROÍSMO
CIRCULAR
A figura 19 mostra os espectros de CD da rBdh-2 sob as diferentes condições de
temperaturas testadas.
Figura 19- Espectros de dicroísmo circular da rBdh-2 obtidos sob diferentes temperaturas. As medidas foram realizadas
utilizando uma alíquota de 100 L da rBdh-2 (DO = 0,300) em tampão Tris 20 mM pH 7,0. Os espectros foram
obtidos variando o comprimento de onda entre 200 a 250 nm e registrados como uma média de 8 varreduras,
com a temperatura variando de 5 a 55 oC (em intervalos de 5
oC), utilizando uma cubeta de quartzo com caminho
óptico de 1 mm.
A curva de transição foi determinada em função da temperatura, monitorando-se o
ponto em 216 nm (Figura 20).
66
Figura 20 - Curva de termoestabilidade da estrutura secundária rBdh-2 obtida através da análise de dicroísmo circular
(CD).
Como resultado, observou-se que a rBdh-2 manteve sua estrutura estável até 35
oC. No entanto, mudanças significativas foram observadas a partir de 40°C referentes à
descaracterização do espectro de CD.
67
6. DISCUSSÃO
Os plasmídeos de expressão recombinante requerem, entre outros, um forte
promotor transcricional para controlar os altos níveis de expressão dos genes e um repressor
adequado para minimizar a transcrição basal na falta do indutor. O mais comum indutor é a
molécula de açúcar IPTG.
O pTrcHis TOPO utilizado neste trabalho é um vetor plasmidial baseado no
pBR322, contendo um promotor trc, o operador Lac (LacO) e o gene LacIq. O operador lac é
o sítio de ligação do repressor lac, que é codificado pelo gene lacIq, para providenciar uma
expressão regulável pelo promotor trc. Assim na falta de IPTG, o repressor lac se liga a
seqüência do operador lac reprimindo a transcrição. Para induzir a expressão da rBdh-2, foi
adicionado IPTG na concentração final de 1,5 mM como proposto por CAJAZEIRAS et al
(2009).
De maneira ideal, quando se pensa em expressão de proteínas recombinantes,
espera-se que o sistema expresse uma proteína em grande quantidade, estável, não tóxica para
a bactéria, solúvel e que possa ser facilmente purificada.
O sistema mais amplamente utilizado para expressão de proteínas heterólogas é o
que utiliza E. coli como célula hospedeira. Este sistema é bastante difundido devido à
facilidade de manuseio, reprodutibilidade, baixo custo de se cultivar esta bactéria e
abundância de proteínas expressas (CHOI & LEE, 2004). Entretanto, algumas proteínas,
simplesmente não são expressas em E.coli, pois muitas vezes para serem funcionais
necessitam sofrer processamentos pós-traducionais (glicolisações, fosforilações,
processamento de cadeias polipeptídicas, etc) que não são realizados por bactérias. Outras
vezes são expressas, porém, na forma insolúvel como corpos de inclusão (SØRENSEN &
MORTENSEN, 2005). Neste trabalho foi utilizada E.coli TOP 10 como célula hospedeira
para a produção da proteína de interesse rBdh-2, uma vez que a mesma não apresenta
modificações pós-traducionais.
Os corpos de inclusão são agregados estruturalmente complexos que
frequentemente ocorrem como uma resposta a um estresse, quando uma proteína
recombinante é expressa em altos níveis (VAN DEN BERG et al., 1999).
As proteínas recombinantes insolúveis normalmente enriquecem os corpos de
inclusão em 50 a 95% do material protéico (CARBONNELL & VILLAVERDE, 2002). A
68
exposição de resíduos hidrofóbicos na superfície das proteínas favorece a formação desses
agregados.
Pouco é conhecido sobre os mecanismos de formação dos corpos de inclusão
(VILLAVERDE & CARRIO, 2003). Entretanto, se sabe que sua formação em sistema de
expressão recombinante é o resultado de um desequilíbrio entre a agregação das proteínas in
vivo e sua solubilização, específico para cada proteína em relação a uma dada bactéria. A
formação de corpos de inclusão não é um agregado inerte, mas age como um reservatório
transiente para intermediários protéicos fracamente enovelados in vivo (CARRIO AND
VILLAVERDE, 2001).
Um problema que pode surgir na formação de corpos de inclusão tem relação com
a estrutura nativa da proteína e, consequentemente, com sua atividade biológica. De fato, o
procedimento realizado para purificação de uma proteína recombinante a partir dos corpos de
inclusão é, primeiramente, a sua solubilização em condições desnaturantes. Isso pode
comprometer a re-solubilização da proteína após purificação e dessa maneira torná-la inativa.
A indução da expressão de proteínas recombinantes em sistema procariótico a
baixas temperaturas pode ser utilizada como uma alternativa para a redução da formação de
corpos de inclusão uma vez que a exposição de resíduos hidrofóbicos na superfície das
proteínas pode levar, eventualmente, a agregações protéicas.
Vale ressaltar que a indução de superexpressão induz também a expressão de
proteases indesejadas que, entretanto, ao se reduzir a temperatura, têm suas atividades
reduzidas. Além disso, a atividade e a expressão de chaperonas são aumentadas em
temperaturas mais amenas o que favorece um aumento da estabilidade e um aumento
potencial para se adquirir um correto enovelamento da proteína.
Diante das dificuldades apresentadas quanto a utilização de proteínas
recombinantes a partir de corpos de inclusão e as vantagens apresentadas pela utilização de
baixas temperaturas na indução de proteínas exógenas em sistema bacteriano, tentou-se, neste
trabalho, produzir a proteína recombinante rBdh-2 na fração solúvel através da indução da
expressão a baixas temperaturas, como sugerido por vários trabalhos.
IMAC (Cromatografia de afinidade em metal imobilizado) é frequentemente
utilizada para purificação de proteínas recombinantes contendo grupos sulfidrilas, em
particular contendo o aminoácido histidina (HIS). Íons metálicos agem como quelantes destes
aminoácidos possibilitando a ligação da proteína contendo cauda de histidina ao metal
imobilizado. Alguns aminoácidos, principalmente a histidina, apresentam alta especificidade
de ligação por metal imobilizado. Dessa maneira, proteínas ricas em histidina podem ser
69
especificamente eluídas da resina carregada com íons metálicos (Ni2+
) e então isoladas por
este método.
IMAC foi a estratégia utilizada para a purificação da proteína recombinante rBdh-
2. Como pode-se observar através do perfil cromatográfico da figura 13, não houve fração
retida na coluna de His-Trap contendo níquel a partir do extrato bacteriano induzido por
temperatura. Provavelmente a proteína de interesse rBdh-2 foi expressa em baixa quantidade
ou até mesmo não foi expressa com este tipo de indução de expressão. Isto indica que este
método não é o mais adequado para expressar a proteína recombinante rBdh-2, necessitando
utilizar um método mais eficiente.
Alternativamente, para a expressão heteróloga da proteína rBdh-2 fusionada com
cauda de histidina foi utilizada a metodologia proposta por CAJAZEIRAS et al., (2009) que
induz a expressão da bodesina recombinante através de isopropyl-D-thiogalactoside, IPTG.
Análises investigativas através de immunoblotting (figura 15) mostraram a
presença de uma banda diferenciada na fração induzida do extrato total da indução da
produção da rBdh-2 por IPTG o que denota o sucesso no protocolo de expressão utilizado.
Em adição, houve a presença de uma segunda banda na mesma fração de indução com massa
molecular aparente acima do esperado para a rBdh-2, este banda provavelmente se deve a
ligações inespecíficas do anticorpo utilizado para análise por immunoblotting, uma vez que
não podemos atribuir essa banda a uma possível oligomerização da proteína em questão, visto
termos utilizado as amostras na presença de SDS que, teoricamente, agiria como agente
redutor desfazendo possíveis oligomerizações.
Após a lise celular também foi evidenciado que a proteína recombinante rBdh-2
esteve presente em grande quantidade na fração insolúvel ou expressa na forma de corpos de
inclusão no sistema de expressão utilizado. Por outro lado, não foi constatada a presença da
proteína de interesse na fração solúvel induzida por IPTG.
Nesta dissertação, a expressão da proteína recombinante rBdh-2 foi observada
duas horas após indução com IPTG 1,5 mM na fração insolúvel do citoplasma, ou seja, houve
formação de corpos de inclusão, o que pode significar que a proteína foi produzida em grande
quantidade. Porém, apesar dessa bodesina ter sido expressa na forma de corpos de inclusão,
não encontramos dificuldades nos procedimentos de re-solubilização, uma vez que a mesma
apresentou-se totalmente solúvel até mesmo após a remoção do agente caotrópico uréia.
Como se pode observar, o perfil cromatográfico da Figura 14 (indução da
expressão de proteínas por IPTG) apresentou-se bastante diferente da cromatografia mostrada
na Figura 13 (indução da expressão de proteínas por Temperatura).
70
O IPTG neste caso atuou de forma eficiente induzindo a expressão da proteína
recombinante rBdh-2 com cauda de histidina em grande quantidade no sistema procariótico
utilizado E.coli TOP 10. Isso possibilitou sua purificação em coluna His-Trap como mostrado
no resultado da cromatografia de afinidade. Uma fração protéica eluída em tampão fosfato
com uréia 8 M e gradiente de imidazol de 0-500 mM monitorada a 280 nm foi obtida
indicando a presença de proteínas, muito provavelmente a rBdh-2.
Porém, a presença de vários picos congruentes no topo na fração retida pode
indicar a presença de proteínas contaminantes.
Picos congruentes podem ser um resultado da exposição de resíduos hidrofóbicos
na superfície da proteína ligada à cauda de histidina o que pode possibilitar a ligação de
outros peptídeos à proteína de interesse. No momento da eluição durante etapas
cromatográficas, além da proteína de interesse ser eluída, peptídios e/ou proteínas
contaminantes também podem ser carreadas. Para isso, torna-se necessário então, a utilização
de um processo cromatográfico alternativo para a purificação da proteína de interesse.
Nesta dissertação, a cromatografia de afinidade em His-Trap eluiu a bodesina
recombinante com alguns contaminantes, que foram removidos através da cromatografia de
troca iônica em matriz de DEAE-Sephacel. Como observado pelo perfil cromatográfico da
rBdh-2 em cromatografia de troca iônica DEAE-Sephacel, este método foi eficiente para
purificar a rBdh-2 das proteínas contaminantes. Vale ressaltar que esta matriz cromatográfica
apresenta cargas positivas em seus ligantes o que permite a separação de proteínas baseadas
em suas cargas líquidas.
A primeira fração protéica, representada na figura 16, mostra um pico simétrico e
representa a proteína recombinante rBdh-2 purificada o que foi observado por análise através
de immunoblotting (Figura 17). Nesta análise, a proteína recombinante mostrou-se livre das
proteínas contaminantes com massa molecular aparente em torno de 16 kDa, sendo o método
de purificação da rBdh-2 por cromatografia de troca iônica bastante satisfatório.
Esta proteína em pH 7,4 apresenta carga líquida positiva e por isso não ficou
retida na matriz cromatográfica. Os contaminantes representados pelo segundo pico não
simétrico, neste valor de pH, apresentaram carga líquida negativa e, portanto, ficaram retidos
na matriz de DEAE-Sephacel. Os contaminantes só foram eluídos na presença de NaCl, que
em solução se dissociam em Na+ (altamente eletropositivo) e Cl
- (altamente eletronegativo),
ocupando os espaços antes tomados pelas proteínas contaminantes, eluindo-as da matriz
carregada. Neste método de cromatografia de troca iônica, o valor de pH do tampão foi
extremamente importante para o sucesso da purificação da proteína recombinante rBdh-2.
71
Considerando que a expressão de proteínas heterólogas provenientes da
manipulação de genes alvos representa uma das etapas da tecnologia do DNA recombinante,
o subsequente estudo desta proteína pode fornecer evidências sobre o seu papel no mecanismo
reprodutivo da espécie caprina.
A produção de proteínas recombinantes possibilita a obtenção de proteínas de
interesse em escala preparativa suficiente para diversos estudos estruturais e funcionais. O
baixo volume do plasma seminal na espécie caprina apresentou-se como uma forte barreira
para a obtenção da bodesina Bdh-2 e, consequentemente, para o aprofundamento dos estudos
funcionais envolvendo essa biomolécula. Portanto, a expressão de proteína recombinante em
sistema heterólogo foi uma alternativa promissora para a produção em larga escala dessa
espermadesina recombinante.
Porém, é importante ressaltar que o objetivo principal na produção de proteínas
recombinantes é que as mesmas sejam funcionais. Recentemente, duas espermadesinas foram
produzidas com sucesso em sistema procariótico, a AQN-1 suína e a aSFP bovina
(EKHLASI-HUNDRIESER et al., 2008). Os autores demonstraram que a recombinante tipo
selvagem bem como alguns mutantes exibiram características semelhantes quanto à
capacidade de ligação a manose, quando comparadas com as proteínas nativas advindas do
plasma seminal.
No trabalho desenvolvido nesta dissertação, o sistema de expressão foi construído
para produzir a espermadesina Bdh-2 fusionada com cauda de histidina, em células de E.coli
TOP 10. Dessa forma, foi proposto que, depois de solubilizada, a rBdh-2 mesmo com cauda
de histidina mantém a mesma atividade biológica putativa que a proteína nativa, BSFP,
isolada do plasma seminal. Tendo em vista que a etiqueta de 6 histidinas é pequena, sendo
pouco imunogênica e parece não influenciar na conformação da molécula como verificado em
outros trabalhos.
Corroborando com a proposta desta dissertação, os dados de dicroísmo circular
indicam que a proteína recombinante rBdh-2 provavelmente mantém sua conformação
estrutural similar a estrutura da proteína nativa BSFP.
A técnica de dicroísmo circular (Circular Dichroism, CD) refere-se à absorção
diferenciada da luz circularmente polarizada à direita e à esquerda. A luz circularmente
polarizada é gerada quando a fonte de luz oscila em duas direções perpendiculares entre si
(horizontal e vertical), com amplitudes iguais, mas com uma diferença de fase /2. Quando
isto acontece, a trajetória do vetor resultante de propagação da luz é helicoidal. Assim, a
72
onda resultante será circularmente polarizada à direita ou à esquerda conforme a diferença de
fase for + /2 ou - /2 (CAMPBELL & DWEK, 1984; CANTOR, 1980).
Peptídeos e proteínas são amplamente estudados por CD, pois estão repletos de
centros quirais (carbonos α, C ) distribuídos ao longo da cadeia principal em hélices alfa,
folhas beta, estruturas desordenadas e voltas denominadas estruturas secundárias. Portanto, é
possível caracterizar a estrutura secundária dessas macromoléculas e quantificá-las por seus
espectros de CD.
A região do UV-distante nos espectros de CD, entre 180 e 260 nm, fornece
informações capazes de caracterizar e discriminar as estruturas presentes nestas moléculas
(SREERAMA et al., 2001).
A estimativa do conteúdo de estrutura secundária de uma proteína é feita com
base num grupo de proteínas de referência que possuem estrutura secundária e espectros de
CD conhecidos. Com o auxílio de programas computacionais, que utilizam diferentes
métodos de deconvolução, são extraídas as componentes comuns dos espectros de CD da
proteína analisada e a porcentagem que as mesmas representam no espectro (SREERAMA et
al., 2000).
O espectro de CD obtido para a rBdh-2 apresentou uma banda positiva em 202 nm
e uma banda negativa em 216 nm (Figura 18 ). Este espectro indica que a rBdh-2 apresenta
um padrão de enovelamento protéico característico de proteínas da família das
espermadesinas, que possuem uma predominância de estruturas do tipo folhas-β
(MENÉNDEZ et al., 1995). A predominância do conteúdo de folhas-β foi confirmado usando
o programa Convex Constraint Analysis (CCA) – Selcon3 que confirmou também, um baixo
conteúdo de estruturas não-ordenadas e de hélices- (Tabela 1). Esse resultado é compatível
com o modelo estrutural proposto para o domínio CUB (BORK & BECKMAN, 1993).
Os dados de CD obtidos da variação térmica foram analisados assumindo-se que
este é um processo irreversível de dois estados da molécula (nativo e desnaturado). Como
resultado, observou-se que a rBdh-2 manteve sua estrutura estável até 35 °C. No entanto,
mudanças significativas foram observadas a partir de 40 °C referentes à descaracterização do
espectro de CD, sugerindo a perda da estrutura secundária e consequentemente, a
desnaturação da proteína. Esses resultados apontam que, por ser uma proteína recombinante e
não glicosilada, a rBdh-2 apresenta uma estabilidade térmica menor que de outras
espermadesinas nativas, como a aSFP e a PSP-I/PSPII (MENÉNDEZ et al., 1995).
73
7. CONCLUSÃO
A bodesina Bdh-2 recombinante foi produzida de forma satisfatória em sistema
bacteriano (E. coli TOP 10)
O método mais adequado de purificação da proteína recombinante rBdh-2 foi
através de cromatografia de afinidade em coluna His-Trap seguida por cromatografia de
troca-iônica em coluna de DEAE-Sephacel;
A estrutura secundária da rBdh-2 avaliada através do perfil espectral de
dicroísmo circular (CD) confirmou a predominância de estruturas secundárias do tipo folhas-
β, a presença de um baixo conteúdo de estruturas não-ordenadas e de hélices- .
A rBdh-2 manteve sua estrutura estável até 35 °C. No entanto, mudanças
significativas foram observadas a partir de 40 °C referentes à descaracterização do espectro de
CD.
74
9. PERSPECTIVAS
A rBdh-2 viabilizará a produção de anticorpos específicos que servirão como
ferramentas para verificar o nível de expressão e as funções da bodesina nativa a partir do
plasma seminal.
A espermadesina recombinante rBdh-2 viabilizará estudos na área de fecundação
in vitro. O domínio desta técnica poderá resultar em aumento da produtividade caprina,
potencializando a economia local e também nacional. Entretanto, o real efeito fisiológico da
rBdh-2 no papel da fecundação in vitro ainda está por ser determinado.
A produção da Bdh-2 na sua forma recombinante possibilitará ainda a sua
caracterização físico-quimica e estrutural.
75
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AHMED, H.; POHL, J.; FINK, N. E.; STROBELI, F. E VASTA, G. R. The Primary Structure
and Carbohydrate Specificity of a b-Galactosyl-binding Lectin from Toad (Bufo arenarum
Hensel) Ovary Reveal Closer Similarities to the Mammalian Galectin-1 than to the Galectin
from the Clawed Frog Xenopus laevisthe. Journal of Biological Chemistry, v. 271, (51) p.
33083–33094, 1996.
ANGATA, T. E.; BRINKMAN-VAN DER LINDEN, E. C. M. I-type lectins. Biochimica et
Biophysica Acta, v. 1572 (2-3) p. 294-316. 2002.
ASSERUY, A.M.; CALVETE, J.J.; ALENCAR, N.M.N.; CAVADA, B.S.; ROCHA-FILHO,
D.R.; MELO, S.C.; CUNHA, F.Q.; RIBEIRO, R.A. Spermadhesin PSP-I/PSP-II heterodimer
and its isolated subunits induced neutrophil migration into peritoneal cavity of rats. Biology
of Reproduction. v.67, p.1796-1803, 2002.
Associação Brasileira da Indústria Produtora e Exportadora de carne Suína, Disponível em:
<http://www.abiec.com.br>. Acesso em janeiro 2010.
ASSREUY, A.M.; ALENCAR, N.M.N.; CAVADA, B.S.; ROCHA-FILHO, D.R.; FEITOSA,
R.F.G.; CUNHA, F.Q.; CALVETE, J.J.; RIBEIRO, R.A. Porcine spermadhesin PSP-I/PSP-II
stimulates macrophage to release a neutrophil chemotactic substance: modulation by mast
cell. Biology of Reproduction. v.68, p.1836-1841, 2003.
BALZARINI J.; NEYTS J.; SCHOLS D.; HOSOYA M.; VAN DAMME E.J.; PEUMANS
W.J.; DE CLERCQ E. The mannose specific plant lectins from Cymbidium hybrid and
Epipactis helleborine and the (N-acetylglucosamine) n-specific plant lectin from Urtica dioica
are and selective inhibitors of human immunodeficiency virus and cytomegalovitus
replication in vitro. Antiviral Research. 18(2): 191-207. 1992.
BALZARINI J.; SCHOLS D.; NEYTS J.; VAN DAMME E.J.; PEUMANS W.J.; DE
CLERQ E. Alpha-(1-3)- and alpha-(1-6)-D-mannose-specific plant lectins are markedly
inhibitory to human immunodeciency virus and cytomegalovirus infections in vitro.
Antimicrob Angents Chemother. 35(3): 410-416. 1991.
BERG, J. M.; TYMOCZKO, J. L.; STRYER, L. In: Biochemistry. New York: W. H. Freeman
and co, 2002. Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=Search&DB=books.
BERGERON A.; VILLEMURE M.; LAZURE C.; MANJUNATH P. Isolation and
characterization of the major proteins of ram seminal plasma. Molecular Reproduction and
Development. 71: 461-470. 2005.
76
BORK, P., BECKMAN, G. The CUB domain. A widespread module in developmentally
regulated proteins. Journal of Molecular Biology. 232, 539-545, 1993.
BOYD, W.C.; SHAPLEIGH, E. Specific precipitating activity of plant agglutinins (lectins),
Science 119, 419, 1954.
BUCK, F.; SCHULZE, C.; BRELOER, M.; STRUPAT, K.; BRETTING. H. Amino acid
sequence of the D-galactose binding lectin II from the sponge Axinella polypoides (Schmidt)
and identification of the carbohydrate binding site in lectin II and related lectin I. Comparative
Biochemistry and Physiology- Part B: Biochemistry & Molecular Biology. v. 121 (2) p.153-
60, 1998.
CABALLERO, I.; VAZQUEZ, J.M.; GIL, M.A.; CALVETE, J.J.; ROCA, J.; SANZ, L.;
PARRILA, I.; GARCIA, E.M.; RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H.; MARTÍNEZ, E. A. Does
seminal plasma PSP-I/PSP-II spermadhesin modulate the ability of boar spermatozoa to
penetrate homologous oocytes in vitro? Journal of Andrology, v.25, p.1004-1012, 2004.
CABALLERO, I.; VÁZQUEZ, J.M.; RODRIGUEZ-MARTINEZ, H.; GIL, M.A.;
CALVETE, J.J.; SANZ, L.; GARCIA, E.M.; ROCA, J., MARTINEZ; E.A. Influence of
seminal plasma PSPI/PSPII spermadhesin on pig gamete interaction . Zygote, v.13 p.11-16,
2005.
CAJAZEIRAS, J.B.; MELO, L.M.; ALBUQUERQUE, E.S.; RÁDIS-BAPTISTA, G.;
CAVADA, B.S.; FREITAS, V.J.F. Analysis of protein expression and construction of
prokaryotic expression system for buck (Capra hircus) spermadhesin Bdh-2 cDNA. Genetics
and Molecular Research, 2009.
CALVETE J.J.; MANN, K.; SCHAFER, W.; RAIDA, M., et al. Boar spermadhesin PSP-II:
Location of posttranslational modifications, heterodimer formation with PSP-I glycoforms
and effect of dimerization on the ligand-binding capabilities of the subunits. FEBS Letters.
v.365: 179-182, 1995a.
CALVETE, J.J.; SANZ, L.; DOSTALOVA, Z.; TOPFER-PETERSEN, E. Spermadhesin:
sperm-coating proteins involved in capacitation and zona pellucid biding. Fetility. v.11, p.35-
40, 1995b.
CALVETE, J.J.; SANZ, L. Insights into structure-function correlations of ungulate seminal
plasma potein. Society for Reproduction and Fertility. v.65, p.201-216, 2007.
CALVETE, J.J.; SOLÍS, D.; SANZ, L.; DIAZ-MAURINO, T.; TOPFER-PETERSEN, E.
Glycosilated boar spermadhesin AWN-1 isoforms: biological origin, structural
characterization by lectin mapping, localization of O-glycosylation sites and effect of
glycosilation on biding. The journal of Biology and Chemistry. Hoppe-Seyler, v.375, p.667-
673, 1994.
77
CANTOR, C.R.; SCHIMMEL, P. R. Biophysical Chemistry, part II: techniques for the study
of biological structure and function, New York: W.H. Freeman, p.350, 1980.
CARBONELL, X.; VILLAVERDE, A. Protein aggregated into bacterial inclusion bodies
does not result in protection from proteolytic digestion. Biotechnology Letters. V.24, p.1939-
1944, 2002.
CUMMINGS, R. D. Essentials of glycobiology “galectins” lecture 21, 2004
http://grtc.ucsd.edu/lecture21.pdf
CARRIO, M.M.; VILLAVERDE, A. Protein aggregation as bacterial inclusion bodies is
reversible. FEBS Letters. V. 489, p.29-33, 2001.
CAVADA, B. S.; MORENO, F. B. B.; ROCHA, B. A. M. DA; AZEVEDO JR, W. F.;
CASTELLÓN, R. E. R.; GOERSCH, G. V.; NAGANO, C. S.; SOUZA, E. P. ;
NASCIMENTO, K. S.; RADIS-BAPTISTA, G.; DELATORRE, P.; LEROY, Y.; TOYAMA,
M. H.; PINTO, V. P. T.; SAMPAIO, A. H.; BARETTINO, D.; DEBRAY, H.; CALVETE, J.
J. & SANZ, L. cDNA cloning and 1.75 A ° crystal structure determination of PPL2, an
endochitinase and Nacetylglucosaminebinding hemagglutinin from Parkia platycephala
seeds. FEBS Journal. 273: 3962–3974, 2006.
CENTURIÓN, F.; VÁZQUEZ, J.M.; CALVETE, J.J.; ROCA, J.; SANZ, L.; PARRILLA, L.;
GARCÍA, E.M.; MRTÍNEZ, E.A. Influence of porcine spermadhesins on the susceptibility of
boar spermatozoa to high dilution. Biology of Reproduction. v.69, p.640-646, 2003.
CHOI, J. H.; LEE, S. Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins
using Escherichia coli. Applied Microbiology Biotechnology . v.64, p. 625–635, 2004.
DANGUY, A.; CAMBY, I.; KISS, R. Galectins and cancer. Biochimica et Biophysica Acta,
v.1572 (2-3) p. 285-293, 2002.
DELEAGE, G.; GEOURJON C., An interactive graphic for calculation the secondary
structure content proteíns from circular dicroism spectrum. Computer Applications in the
Biosciences. n. 2, p. 197-199, 1993.
DOSTÀLOVÀ, Z.; CALVETE, J.J.; SANZ, L.; TOPFER-PETERSEN, E. Quantitation of
boar spermadhesin in accessory sex gland fluids and on surface of epididymal, ejaculated and
capacitated spermatozoa. Biochimica et Biophysica Acta. v.1200, p.48-54, 1994a
DOSTÀLOVÀ, Z.; CALVETE, J.J.; SANZ, L.; HETTEL, C.; RIEDEL, D.; SCHONECK, C.;
EINSPANIER, R.; TOPFER-PETERSEN, E. Immunolocalization and quantitation of acidic
seminal fluid protein (aSFP) in ejaculated, swim-up, and capacitated Bull spermatozoa. The
Journal of Biologycal Chemistry. Hoppe Seyler, v.375, p.457-461, 1994b.
78
DOSTÀLOVÁ, Z.; CALVETE, J.J.; SANZ, L.; TOPFER-PETERSEN, E. Boar spermadhesin
AWN-1: Oligosacharide and zona pellucida binding characteristic. European Journal of
Biochemistry. v. 230, p.329-336, 1995a..
DOSTÀLOVÀ, Z.; CALVETE, J.J.; TOPFER-PETERSEN, E. Interaction of non-aggregated
boar AWN-1 and AQN-3 with phospholipid matrices. A model for coating o spermadhesins
to the sperm surface. The Jpurnal of Biology of Chemistry. Hoppe seyler. v.376, p.237-242,
1995b.
DRICKAMER, K. Two distinct classes of carbohydrate-recognition domains in animal lectins
Journal of Biology of Chemistry., v. 263 p. 9557-9560, 1988.
DRICKAMER, K.; DODD, R. B. E. Lectin-like proteins in model organisms: implications for
evolution of carbohydrate-binding activity. Glycobiology, v. 11 (5) p. 71-79, 2001.
EINSPANIER, R.; AMSELGRUBER, W.; SINOWATZ, F.; HENLE, T.; ROPKE, R.;
SCHAMS, D. Localization and concentration of a new bioactive acetic seminal fluid protein
(aSFP) in bulls (Bos taurus). Journal for Reproduction and Fertility. v.98, p.241-244, 1993.
EINSPANIER, R.; EINSPANIER, A.; WENPE, F.; SCHEIT, K-H. Characterization of a new
bioactive protein from bovine seminal fluid. Biochemical and Biophysical Research
Communications. v.179, p.1006-1010, 1991.
EINSPANIER, R.; KRAUSE, L.; CALVETE, J.J.; TOPFER-PETERSEN, E.;
KLOSTERMEYERB, H.; KARG, H. Bovine seminal plasma aSFP: localization of disulfide
bridges and detection of three different isoelectric forms. FEBBS Letters. v.344, p.61-64,
1994.
EKHLASI-HUNDRIESER, M.; CALVETE, J.J.; VON RAD, B.; HETTEL, C.; NIMTZ, M.;
TÖPFER-PETERSEN, E. Point mutations abolishing the mannose-binding capability of boar
spermadhesin AQN-1. Biochimica et Biophysica Acta. 1784: 856-862, 2008.
EKHLASI-HUNDRIESER, M.; GOHR, K.; WAGNER, A.; TSOLOVA, M.;
PETRUNKINA, A.; TOPFER-PETERSEN, E. Spermadhesin AQN-1 is a candidate receptor
molecule involved in the formation of the oviductal sperm reservoir in the pig. Biology of
Reproduction. v.73, p.536-545, 2005.
EKHLASI-HUNDRIESER, M.; SCHAFER, B.; PHILIPP, U.; KUIPER, H.; LEEB, T.;
MEHTA, M.; KIRCHHOFF, C.; TOPFER-PETERSEN E. Sperm-binding fibronectin type tt-
module proteins are genetically linked and functionally related. Gene, v.392, p.253-265, 2007.
79
EKHLASI-HUNDRIESER, M.; SINOWATZ, F.; GREISER DE WILKE, I.; WABERSKI,
D.; TOPFER-PETERSEN, E. Expression of spermadhesin genes in porcine male and female
reproductive tracts. Molecular Reproduction and Development. v.61, p.32-41, 2002.
FAO - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS.
Statistical database – 2005. Disponível em : <http://www.fao.org>. Acesso em dezembro
2009.
GABIUS, H.J.; GABIUS, S. (Eds.): Glycosciences - Status and Perspectives. Weinheim:
Chapman & Hall. ISBN 3-8261-0073-5. 1997.
GABOR, F.; BOGNER, E.; WEISSENBOECK, A.; WIRTH, M. The lectin-cell interaction
and its implications to intestinal lectin-mediated drug delivery. Advanced Drug Delivery
Reviews 56: 459-480, 2004.
GARCIA, E.M.; VAZQUEZ, J.M.; CALVETE, J.J.; SANZ, L.; CABALLERO, I.O.;
PARRILA, I.; GIL, M.A.; ROCA, J.; MARTINEZ, E.A. Dissecting the protective effect of
the seminal plasma spermadhesin PSP-I/PSP-II on boar sperm functionally. Journal of
Andrology, v.27, p.434-443, 2006.
HAASE B.; SCHLÖTTERER C.; HUNDRIESER M.E.; KUIPER H. Evolution of the
spermadhesin gene family. Gene 352: 20-29. 2005.
HIRABAYASHI, J. & KASAI, K. The family of metazoan metal-independent -galactoside-
binding lectins: structure, function and molecular evolution. Glycobiology, v.3 p. 297–304,
1993.
HOLANDA, M.L.; MELO, V.M.M.; SILVA, L.M.C.M.; AMORIM, R.C.N.; PEREIRA,
M.G. ; BENEVIDES, N.M.B. Differential activity of a lectin from Solieria filiformis against
human pathogenic bactéria. Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2005).
HOSHIBA, H.; SINOWAATZ, F. Immunohistochemical localization of the spermadhesin
AWN-1 in the equine male genital tract. Anatomia Histologia Embryologia. v.27, p.351-353,
1998.
IBGE- INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Produção da
Pecuária Municipal-2004. Rio de Janeiro: IBGE, dez. 2009.
JONÁKOVÁ, V.; SANZ, L.; CALVETE J.J.; HENSCHEN, A.; CECHOVÁ, D.; TÖPFER-
PETERSEN, E. Isolation and biochemical characterization of a zona pellucid-binding
glycoprotein of boar spermatozoa. FESB Letters. v.280, p.183-186, 1991.
80
KAWASAKI, N. Collectins and their roles in host defense.
http://www.glycoforum.gr.jp/science/word/lectin/LE_E.html. 1998.
KILPATRICK, D.C. Animal lectins: a historical introduction and overview Biochimica et
Biophysica Acta, v. 1572 (2-3) p. 187-197, 2002.
KWOK, S.C.; YANG, D.; DAÍ, G.; SOARES, M.J.; CHEN, S.; MCMURTRY, J.P.
Molecular cloning and sequence analysis of two porcine seminal proteins, PSP-I and PSP-II:
new members of the spermadhesin family. DNA and Cell Biology. v.12, p.605-610, 1993a.
KWOK, S.C.; YANG, D.; DAI, G.; SOARES, M.J.; CHEN, S.; McMURTRY, J.P. Binding
characteristics and immunolocalization of porcine seminal protein, PSP-I. Molecular
Reproduction and Development. v.35, p.244-250, 1993b.
LANDSTEINER, K.; RAUBITSCHEK, H. Beobachtungen über Hämolyse und
Hämagglutination. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr. Hyg. Abt. 1: Orig. 45: 660–
667, 1907.
LEEB, T.; SIEME, H.; TOPFER-PETERSEN, E. Genetic markers for stallion fertility –
lessons from humans and mice. Animal Reproduction Science. v.89, p.21-29, 2005.
LEFFLER, H.; CARLSSON, S.; HEDLUND, M.; QIAN, Y.; POIRIER, F.Introduction to
galectins. Glycobiology Journal. v.19, p.433-440, 2004.
MACIEL, E. V. M. ; ARAUJO-FILHO, V. S. ; NAKAZAWA, M. ; GOMES, Y. M. ;
COELHO, L. C. B. B. ; CORREIA, M. T. S. Mitogenic activity of Cratylia mollis lectin on
human lymphocytes. Biologicals 32: 57-60, 2004.
MAEDA, T.; NISHIDA, J.; NAKANISHI, Y. Expression pattern, subcellular localization and
structure-function relationship of rat Tpx-1, a spermatogenic cell adhesion molecule
responsible for association with sertoli cells. Developement Growth different. v.41, p715-722,
1999.
MANJUNATH, P.;THERIEN, I. Role of seminal plasma phospholipid-binding proteins in
sperm membrane lipid modification that occurs during capacitation. Journal Reproduction
Immunology., v. 53, p.109-119, 2002.
MELO, L.M.; NASCIMENTO, A.S.F.; SILVEIRA, F.G.; CUNHA, R.M.S; TAVARES,
N.A.C.; TEIXEIRA, D.I.A.; LIMA-FILHO, J.L.; FREITAS, V.J.F.; CAVADA, B.S.; RÁDIS-
BAPTISTA, G. Quantitative expression analysis of Bodhesin genes in the Buck (Capra
hircus) reproductive tract by real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Animal
Reproduction Science. v.110, p.245-255, 2009.
81
MELO, L.M.; TEIXEIRA, D.I.A.; HAVET, A.; CUNHA, R.M.S; MARTINS, D.B.G.;
CASTELLETTI, C.H.M; SOUZA, P.R.E.; LIMA-FILHO, J.L.; FREITAS, V.J.F.; CAVADA,
B.S.; RÁDIS-BAPTISTA, G. Buck (Capra hircus) genes encode new members of the
spermadhesin family. Molecular Reproduction And Development. v.75, p.08-16, 2008.
MENÉNDEZ, M.; GASSET, M.; LAYNEZ, J.; LÓPEZ-ZUMEL, C.; USOBIAGA, P.;
TOPFER-PETERSEN, E.; CALVETE, J.J. Analysis of the structural organization and thermal
stability of two spermadhesins. Calorimetric, circular dichroic and Fourier-transform infrared
spectroscopic studies. European Journal Biochemistry. 234, 887-896, 1995.
NAKAMURA, S., IKEGAMI, A., MIZUNO, M., YAGI, F. & NOMURA, K. The expression
profile of lectin differs from that of seed storage proteins in Castanea crenata trees.
Bioscience, biotechnology and biochemistry, 68: 1698-1705, 2004.
NIMTZ, M.; GRABENHORST, E.; CONRADT, H.S.; SANZ, L.; CALVETE, J.J. Structural
characterization of the oligosaccharide chains of native and crystallized boar seminal plasma
spermadhesin PSP-I and PSP-II glycoforms. European Journal Biochemistry. v.265, p. 703-
718, 1999.
PACE, K. E., BAUM, L. G.Induction of T Lymphocyte Apoptosis: A Novel Function for
Galectin-1 Trends in Glycoscience and Glycotechnology, v. 9 (45) p.21–29, 1997.
PARRY, R.V.; BARKER, P.J.; JONES, R. Characterization of low mr zona pellucid binding
proteins from boar spermatozoa and seminal plasma. Molecular Reproduction and
Development. v. 33, p.108-115, 1992.
PEUMANS, W.J.; VAN DAMME, E.J.M. Lectins as plant defense proteins. Plant
Physiology. 109, 347–352. 1995a.
PEUMANS, W.J.; VAN DAMME, E.J.M. Proposal For a novel sistem of nomenclature of
plant lectins. Lectin, v.10, p. 105-117, 1995b
PEUMANS, W.J.; VAN DAMME, E.J.M. Plant lectins: specific tools for the identificacion,
isolation, and characterization of O-linked glycans. Critical Reviews in Biochemistry and
Molecular biology. v.33, p.209-258, 1998.
REINERT, M.; CALVETE, J.J.; SANZ, L.; MANN, K.; TOPFER-PETERSEN, E. Primary
structure of stallion seminal plasma protein HSP-7, a zona-pellucida-binding protein of the
spermadhesin family. European Journal of Biochemistry. v.242, p.636-640, 1996.
RODRIGUES, J. S.; SANTOS-MAGALHÃES, N. S.; COELHO, L. C. B. B.; COUVREUR,
P.; PONCHEL, G.; GREF, R. Novel core (polyester)-shell(polysaccharide) nanoparticles:
82
protein loading and surface modification with lectins. Journal of Controlled Release 92: 103-
112, 2003.
RODRIGUEZ-MARTINEZ, H.; IBORRA, A.; MARTINEZ, P.; CALVETE, J.J.
Immunoeletronmicroscopic imaging of spermadhesin AWN epitopes on boar spermatozoa
bound in vivo to the zona pellucida. Reproduction, Fertility and Development. v.10, p.491-
497, 1998.
ROMÃO, M.J.; KOLLN, I.; DIAS, J.M.; CARVALHO, A.L.; ROMERO, A.; VARELA,
P.F.; SANZ, L.; TOPFER-PETERSEN, E.; CALVETE J.J. Crystal structure of acid seminal
fluid protein (aSFP) at 1.9A resolution: a bovine polypeptide of the spermadhesin family.
Journal of Molecular Biology. v.274, p.650-660, 1997.
ROMERO, A.; ROMÃO, M.J.; VARELA, P.F.; KOLLN, I.; DIAS, J.M.; CARVALHO,
A.L.; SANZ, L.; TOPFER-PETERSEN, E.; CALVETE, J.J. The crystal structure of two
spermadhesins reveal the CUB domain fold. Nature Structural & Molecular Biology. v.04,
p.783-788, 1997.
ROMERO, A.; VARELA, P.; SANZ, L.; TÖPFER-PETERSEN, E., CALVETTE, J.J.
Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of boar seminal plasma
spermadhesin PSP-I/PSP-II, a heterodimer of two CUB domains. FEBS LETTERS., v.382,
p.15-17, 1996.
SALES, M.P.; GERHARDT, I.R.; GROSSI-DE-SÁ, M.F; XAVIER-FILHO, J. Do legume
storage proteins play a role in defending seeds against bruchids?. Plant Physiology, v. 124 p.
515-522, 2000.
SANZ, L.; CALVETE, J.J.; MANN, K.; SCHAFER, W.; SCHMID, E.R.; TOPFER-
PETERSEN, E. The amino acid sequence of AQN-3, a carbohydrate-binding 93 protein
isolated from boar sperm. Location of disulphide bridges. FEBS Letters. v.01, p.33-36, 1991.
SANZ-APARICIO, J.; HERMOSO, J.; GRANGEIRO, T. B.; CALVETE, J. J. & CAVADA,
B. S. The cristal structure of Canavalia brasilienses lectin suggests a 111 correlation between
its quaternary conformation and its distinct biological propeties for an Concanavalin A, FEBS
Letters., 405: 114-118, 1997.
SCHÄFER, B.; VON HORSTEN, H.H.; DACHEUX, J.L.; HOLTZ, W.; KIRCHHF, C.
Cloning and characterization of boar epididymal secretory proteins by homology to the
human. Reproduction Domestical Animals. V.38, p.111-118, 2003.
SCHONECK, C.; EINSPANIER, R.; SCHALLENRGER, E.; SCHAMS, D. Effects of the
bovine seminal protein aSFP: protection of spermatozoa and rapid uptake by the female
mucosa. J. Reproduction Fertility and Development. v.12, p. 21-31, 1993.
83
SHARON, N.; LIS, H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition
molecules. Glycobiology 14: 53-62, 2004.
SHARON, N.; LIS, H. Lectins. 2nd
ed. Kluwer Academic Publishers, 2003.
SIMPLÍCIO, A.A.; BRACKETT, B.G.; KESKINTEPE, L. Produção de embriões in vitro em
meios quimicamente definidos. Arq Fac Vet UFRGS, v.25, n.1, p.302, 1999.
SOLIS, D.; ROMERO, A.; JIMÉNEZ, M.; DÍAZ-MAURINO, T.; CALVETE, J.J. Binding of
mannose-6-phosphate and heparin by boar seminal plasma PSP-I, a member of the
spermadhesin protein family. FEBS Letters. v.431, p.273-278, 1998.
SØRENSEN, H. P., MORTENSEN, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the
cytoplasm of Escherichia coli. Microbial Cell Factories, 4:1. 2005.
SREERAMA, N.; WOODY, R.W. Estimation of protein secondary structure from circular
dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with and
expanded reference set. Anayticall Biochemistry., n. 287, p.252-260. 2000;
SUMNER, J.; HOWELL, S.F. The identification of the hemagglutinin of the Jack bean with
concanavalin A, J Bacteriol 32, 227–37.1936.
TEDESCHI, G.; OUNGRE, E.; MORTARINO, M.; NEGRIA, A.; MAFFEO, G.; RONCHI,
S.Purification and primary structure of a new bovine spermadhesin. European Journal of
Biochemistry. v.267, p.6175-6179, 2000.
TEIXEIRA, D.I.A.; CAVADA, B.S.; SAMPAIO, A.H.; HAVT, A.; BLOCH, C. Jr.;
PRATES, M.V.; MORENO, F.B.; SANTOS, E.A.; GADELHA, C.A.; GADELHA, T.S.;
CRISÓSTOMO, F.S.; FREITAS, V.J.F. Isolation and partial characterization of a protein
from buck seminal plasma (Capra hircus) homologus to spermadhesins. Protein & Peptide
Letters. v.09, p.331-335, 2002.
TEIXEIRA, D.I.A.; MELO, L.M.; GADELHA, C.A.A.; CUNHA, R.M.S.; BLOCH JR, C.;
RÁDIS-BAPTISTA, G.; CAVADA, B.S.; FREITAS, V.J.F. Ion-exchange chromatography
used to isolated a spermadhesin-related protein from domestic goat (Capra hircus) seminal
plasma. Genetics and Molecular Research. v.05, p.79-87, 2006.
TÖPFER-PETERSEN E.; EKHLASI-HUNDRIESER M AND TSOLOVA M. Glycobiology
of fertilization in the pig. International Journal of Developmental Biology. 52: 717-736. 2008.
84
TÖPFER-PETERSEN, E.; CALVETE, J.J. Sperm-associated protein candidates for primary
zona pellucid-binding molecules: structure-function correlation of boar spermadhesin. Journal
of Reproduction and Fertility. v.50, p.55-61, 1996.
TÖPFER-PETERSEN, E.; EKHLASI-HUNDRIESER, M.; KIRCHHOFF, C.; LEEB, T.;
SIEME, H. The role of stallion seminal protein in fertilization. Animal Reproduction science.
v.89, p.159-170, 2005.
TÖPFER-PETERSEN, E.; ROMERO, A.; VARELA, P.F.; EKHLASI-HUNDRIESER, M.
Spermadhesins: a new protein family. Facts, hypotheses and perspectives. Andrologia 30:
217-224. 1998.
TURNER, M.W. The role of mannose-binding lectin health and disease Molecular
Immunology, v.40 (7) p. 423-429, 2003.
VAN DAMME, E.J.M.; BRIKÉ, F.; WIBTER, H.C.; VAB, LEUVEN, F.; GOLDSTEIN, I.J.,
PEUMANS, W.J. Molecular cloning of two different manose-binding lectins from tulip bulbs.
European Journal of Biochemistry. 236: 419-427, 1996.
VAN DAMME, E.J.M.; PEUMANS, W.J.; BARRE, A. & ROUGÉ, P. Plant lectins: a
composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with
diverse biological roles. Critical Reviews in Plant Science, 17(6): 575-692, 1998.
VAN DEN BERG, B.; ELLIS, R.J.; DOBSON, C.M. Effects of macromolecular crowding on
protein folding and aggregation. EMBO. v.18, p.6927-6933, 1999.
VAN PARIJIS, J.; BROEKAERT, W.F.; GOLDSTEIN, I. J., & PEUMANS, W. J. Havein: an
antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex. Planta. 183: 258-262,1996.
VARKI, A. Discovery and Classification of Glycan VARELA, P.F.; ROMERO, A.; SANZ,
L.; ROMÃO, M.J.; TOPFER-PETERSEN, E.; CALVETE, J.J. The 2.4 A resolution crystal
structure of boar seminal plasma PSP-I/PSP-II: a zona pellucida-binding glycoprotein
heterodimer of the spermadhesin family bulit by a CUB domain architecture. Journal of
Molecular Biology. v.274, p.635-649, 1997.
-Recognizing Proteins Lecture 17, http://grtc.ucsd.edu/lecture17.pdf. 2004.
VARKI, A. Essentials of Glycobiology The “I-type” Lectins and the Siglecs Lecture 23,
http://grtc.ucsd.edu/lecture23.pdf. 2004.
VILLAVERDE, A.; CARRIO, M.M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological
role of inclusion bodies. Biotechnology Letters. V.25, p.1385-1395, 2003.
85
WANG, H.; NG, T.B.; OOI, V.E.C.& LIU, W.K. Effects of lectins with different
carbohydrate-binding specifities on hepatoma, choriocarcinoma, melanona and osteosarcoma
cell lines. International journal of biochemistry & cell biology. 32: 365-372, 2000.
WAGNER, A.; EKHLASI-HUNDRIESER, M.; HETTEL, C.; PETRUNKINA, A.;
WABERSKI, D.; NIMTZ, M.; TOPFER-PETERSEN, E. Crabohadrate-based interactions of
ovicuctal sperm reservoir formation-studies in the pig. Molecular Reproduction and
Development. v.61, p.249-257, 2002.
WEIS, W. I.; DRICKAMER, K. Structural basis of recognition lectin-carbohydrate. Annual
Review of Biochemistry., v.65 p. 441-473, 1996.
WENPE, F.; EINSPANIER, R.; SCHEIT, K.H. Characterization by cDNA cloning of the
messenger-RNA of a new growth-factor from bovine seminal plasma – acidic seminal fluid
protein. Biochemical and Biophysical Researche Communication. v.183, p.232-237, 1992.
YAMAZAKI, Y.; MORITA, T. Structure and function of snake venom cysteine-rich
secretory proteins. Toxicon, v.44, p.227-231, 2004.
YANAGIMACHI, R., KNOBIL, E., NEILL, J. D. The Phisiology of Reproduction. 2nd
ed.
New York, Raven press, p.189-371, 1994.