isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de folhas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO

DEIZE RAQUEL DOS REIS CRUZ

ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO

PARCIAL DA LECTINA DE FOLHAS DE Bauhinia cheilantha

(BONGARD) STEUDEL, NATIVA DO BIOMA CAATINGA

Petrolina-PE

2015





Dissertação apresentada à Universidade Federal do

Vale do São Francisco – UNIVASF, campus

Petrolina, como requisito para a obtenção do título

de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.

Área de concentração: Química e atividade

biológica.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Pereira Felix

Petrolina-PE

2015

Cruz, Deize Raquel dos Reis. C957i Isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de

folhas de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do bioma caatinga / Deize Raquel dos Reis Cruz—Petrolina, 2015.

89p. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2015.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Pereira Felix

1. Bauhinia cheilantha – Purificação. Caracterização parcial. 2. Lectina - Propriedades. 3. Caatinga – Recursos naturais. 4. I. Universidade Federal do Vale do São Francisco. II. Felix, Wagner Pereira. III. Título. CDD 581.5

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da UNIVASF. Bibliotecária: Maria Betânia de S. da Silva – CRB4-1747.





Dissertação apresentada como requisito parcial para

obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais

do Semiárido, pela Universidade Federal do Vale do

São Francisco.

Aprovado em ______/_______/______

__________________________________

Prof. Dr. Wagner Pereira Felix

Orientador (UNIVASF)

_______________________________

Prof. Dr. Dráulio Costa da Silva

Examinador externo (UNIVASF)

___________________________________

Prof. Dr. Renato de Azevedo Moreira

Examinador externo (UNIFOR)

“Não te mandei eu? Esforça-te e tem

bom ânimo; Não te atemorizes, nem te

espantes; porque o Senhor teu Deus está

contigo, por onde quer que andares”.

(Bíblia Sagrada, Josué 1:9).

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente a Deus, minha força, meu rochedo e minha fortaleza, por

me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as

dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e suprir todas as minhas

necessidades.

À minha mãe, que sempre esteve ao meu lado orando para que os planos de Deus

se cumprissem em minha vida.

Ao meu pai (vivo em minhas lembranças), pelo seu amor incondicional, proteção e

incentivo, por ser uma pessoa de coração puro e simples que ajudou a construir meu

caráter. Obrigada pelos momentos maravilhosos que Deus nos permitiu, mesmo

com todas as dificuldades enfrentadas. Amo-te mais que tudo nessa vida!

Aos meus irmãos, especialmente Benita e Renato, pelo amor, carinho e incentivo.

À minha cunhada Jeane e ao meu irmão Nairo, pelo amor e orações.

À minha cunhada e amiga Eliana, por estar sempre presente em todos os momentos

da minha vida.

Ao meu querido Humberto Marçal, por seu amor, carinho, compreensão, e pelas

palavras de incentivo e conforto nos momentos de tribulação.

Ao meu amigo, orientador e colega de trabalho, professor Dr. Wagner Pereira Felix,

a quem serei grata eternamente pelos ensinamentos, confiança, amizade, apoio e

orientação. Pelos valiosos conselhos e tempo dedicado a mim. Todos os seus

ensinamentos foram de grande valia para meu crescimento pessoal e profissional.

À professora Dra. Ana Cristina de Oliveira Monteiro Moreira, por ter me recebido tão

bem em seu laboratório na UNIFOR e, com tanta gentileza, ter me orientado com

relação às minhas dúvidas. Seus ensinamentos e colaboração foram importantes

para a finalização deste trabalho.

Ao Professor Dr. Renato de Azevedo Moreira pelo apoio e ensinamentos no período

que estive em Fortaleza e pela disponibilidade em participar da banca examinadora

desta dissertação.

Ao professor Dr. Dráulio Costa da Silva, por aceitar o convite para participar da

banca examinadora.

Ao Prof. Dr. José Alves de Siqueira Filho, pela identificação botânica da espécie.

Ao Dr. Frederico Moreno (Pepeu), pela contribuição nas análises de espectrometria

de massas. Agradeço também a Marina Lobo, pela ajuda e disponibilidade nessa

parte da pesquisa.

À equipe do Laboratório de Bioquímica- CCA, Cárita, Isabel, Láyla, Laís, Thaís,

Vitor, Wiliam e João, que sempre se colocaram disponíveis para auxiliar na

execução desse projeto.

Aos meus queridos, Yasmin e Adijailson pela amizade, carinho, palavras de conforto

e participação na correção do texto deste trabalho.

Aos professores do colegiado de Pós-graduação em Recursos Naturais do

Semiárido, por terem proporcionado momentos gloriosos na aprendizagem.

À UNIVASF, por ter disponibilizado o curso e me proporcionado esse titulo de

Mestre.

Ao pessoal do Laboratório de Genética da UNIVASF- CCA, pela disponibilização de

materiais e equipamentos que foram importantes na realização dos experimentos.

Ao professor Aldrin Silva e aos veterinários Alane, Felipe e Wasley, pelas coletas de

sangue dos animais.

Às minhas amigas de longa data, Elisangela Cordeiro e Eliatania Costa, pela

amizade, carinho, força, incentivo, momentos de descontração e pela participação

direta nas correções do texto deste trabalho.

À Rosangela, Erivando, Levi e Lucas, família maravilhosa que me acolheu tão bem

em Fortaleza a quem eu vou agradecer eternamente.

À Maria Forte e Edu pelo apoio e momentos de alegria nos dias que estive em

Fortaleza.

Às amigas, Scheila, Poliana, Geórgia, Jaqueline, Keyte, Bethy, Adriana, Eliane,

Bruna, Thaíse, Ana Paula, Amanda e Sandra pela amizade verdadeira e pelos

momentos de descontração, os que passaram e os que ainda virão!

Às minhas colegas de mestrado, pela solidariedade nos momentos de incerteza e

ansiedade e pela alegria compartilhada nos nossos encontros.

Aos meus novos amigos de Fortaleza, Rogênio, Hyldecia, Rossueti, Fernanda,

Camilo, Taís, Márcio, Vinícius e, especialmente a Felipe Sousa, que, com

ensinamentos, ajuda e amizade, contribuiu bastante para a finalização deste

trabalho.

RESUMO

Lectinas estão amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em seres unicelulares, animais e vegetais. Em vegetais, as lectinas são frequentemente isoladas de sementes, principalmente das leguminosas. Elas também podem ser encontradas em outras partes da planta, como por exemplo, em folhas, mas a extração proveniente destas ainda é pouco explorada. Desta forma, estudos foram realizados em extratos foliares com a Bauhinia cheilantha, para avaliar as propriedades físico-químicas e biológicas da sua lectina, denominada BcL. Das extrações obtidas em diferentes valores de pH, observou-se que a melhor solução tampão de extração proteica foi o Tris- HCl 0,1M pH 7,8, pois o Extrato Bruto preparado com esse tampão apresentou uma maior atividade hemaglutinante. Lectina de B. cheilantha foi purificada por cromatografia de afinidade numa matriz de galactomanana reticulada de cadeia principal constituída de D-manose com ramificações de D-galactose. A homogeneidade da lectina foi demonstrada por SDS-PAGE na presença e ausência de β-mercaptoetanol, apenas uma banda de proteína com uma massa molecular aparente de 32 kDa foi observada. A amostra foi analisada por espectrometria de massa usando MALDI-TOF e o espectro de peptídeos foi analisado por bases de dados do programa MASCOTE. O perfil dos peptídeos trípticos revelou homologia com a cadeia A da lectina I-B4 de Griffonia simplicifolia de massa molecular 28,351 kDa. A BcL mostrou especificidade por D-galactose e D-lactulose. Nos ensaios de hemaglutinação, observou-se que essa proteína aglutina fortemente eritrócitos de coelho e é termoestável mantendo sua atividade hemaglutinante mesmo após incubação a 60°C durante 30min. Ela também foi resistente a uma ampla faixa de pH, e não necessita de íons metálicos Ca2+ e Mn2+ para exercer sua atividade hemaglutinante. Na atividade antimicrobiana, verificou-se que a lectina de B. cheilantha não apresentou atividade

inibitória frente às cepas Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli. Palavras-chave: Bauhinia cheilantha. Lectina. Purificação. Caracterização parcial.

ABSTRACT

Lectins are widely distributed in the nature being found in unicellular beings, animal and vegetable. In plants, lectins are often isolated from seeds, particularly legumes. They can also be found in other plant parts, such as leaves, but the extraction from these still little bit explored. Therefore, studies were performed on leaf extracts with the Bauhinia cheilantha to evaluate the physicochemical and biological properties of a lectin, known BcL. From the extractions obtained in different values of pH observed that the best buffer of proteic extraction was the Tris-HCl 0.1M pH 7.8 because the Crude Extract prepared with that buffer showed a great hemagglutinating activity. The lectin from B. cheilantha was purified for affinity chromatography on cross-linked galactomannan matrix, which containing terminal D-galactose, with main chain compound of D-mannose. The homogeneity of the lectin was demonstrated by SDS-PAGE in the presence and absence of β-mercaptoethanol, so only one proteic band with an apparent molecular mass of 32 kDa was observed. The sample was analyzed by mass spectrometry using MALDI-TOF and the spectrum of peptides was analyzed by MASCOT program databases. The tryptic peptides profile revealed homology with the chain A of lectin IB4 from Griffonia simplicifolia, molecular mass of 28,351 kDa. The BcL demonstrated specificity for D-galactose and D-lactulose. In the hemagglutination assays, it could observe this protein agglutinates strongly rabbit erythrocytes and it is thermostable maintaining its hemagglutinating activity even after incubation to 60°C during 30 min. it was also resistant to a wide pH variation and does not need of metallic ions Ca2+ and Mn2+ to execute its hemagglutinating activity. In the antibacterial activity, it verified that the lectin from B. cheilantha did not show inhibitory activity on the strains of Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli.

Key-words: Bauhinia cheilantha. Lectin. Purification. Partial characterization

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Interações da lectina com carboidrato na superfície celular

mediam interações célula-célula e/ ou célula-matriz

extracelular através do reconhecimento específico de

glicoconjugados.......................................................................

23

Figura 2 - Foto da espécie Bauhinia cheilantha (Bongard)

Steudel.....................................................................................

31

Figura 3 - Distribuição geográfica de B. cheilantha no Brasil................... 31

Figura 4 - Purificação da lectina de B. cheilantha por cromatografia de

afinidade em galactomanana...................................................

45

Figura 5 - Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida- SDS da lectina

purificada de B. cheilantha (32kDa)........................................

48

Figura 6 - Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da

lectina de folhas de B. cheilantha (BcL)...................................

50

Figura 7 - Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da lectina de

folhas de B. cheilantha (BcL)...................................................

51

Figura 8 - Sequência de aminoácidos de Griffonia simplicifolia. Em

vermelho está o peptídeo homólogo a lectina de BcL (p <

0,05).........................................................................................

,,,,,,,,,

53

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Atividade Hemaglutinante (AH) dos Extratos Brutos (EB)

preparados com tampões de diferentes valores de

pH......................................................................................

42

Tabela 2 - Atividade Hemaglutinante (AH) do EB com diferentes

eritrócitos..................................................................................

43

Tabela 3 - Inibição da Atividade Hemaglutinante da F0-90% de B.

cheilantha por carboidratos .....................................................

43

Tabela 4 - Purificação da lectina de Bauhinia cheilantha ......................... 47

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Funções das lectinas............................................................... 24

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AH: Atividade Hemaglutinante

AHE: Atividade Hemaglutinante Específica

AHT: Atividade Hemaglutinante Total

ATCC: American Type Culture Collection

BcL: Lectina de Bauhinia cheilantha

BHI: Brain Heart Infusion

BSA: Albumina Sérica Bovina

BUL: Lectina de Bauhinia ungulata

Ca2+:Cátion divalente de Cálcio

CIM: Concentração Inibitória Mínima

Con A: Concanavalina A

CRD: Domínio de reconhecimento de carboidrato

EB: Extrato Bruto

EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético

ESI: Ionização por Electrospray

HCl: Ácido Clorídrico

HDL: Lipoproteínas de Alta Densidade

HVASF: Herbário Vale do São Francisco

kDa: Kilodalton

M: concentração Molar (Mol.L-1)

MaxEnt: Entropia máxima

Mn2+: Cátion divalente de Manganês

MS: Espectrometria de Massas

NaCl: Cloreto de sódio

NI: Não Inibidor

OH: grupo Hidroxila

pH: Potencial Hidrogeniônico

PHA: Lectina de Phaseolus vulgaris

PI: Primeiro Pico

PII: Segundo Pico

PVPP: Polivinilpolipirrolidona

SDS: Dodecil Sulfato de Sódio

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Tris: Tris-(hidroximetil)-aminometano

UH.mL-1: Unidade de Hemaglutinação por Mililitro

WGA: Lectina de Germe de Trigo

OBS: as abreviaturas e os símbolos utilizados neste trabalho e que não constam

nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas

universalmente.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 19

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 23

2.1 Lectinas 23

2.2 A interação lectina-carboidrato resulta em diferentes efeitos biológicos 25

2.2.1 Atividade antitumoral das lectinas de planta 25

2.2.2 Atividade antimicrobiana e antifúngica das lectinas de plantas 25

2.2.3 Atividade inseticida das lectinas de plantas 26

2.3 Classificação quanto ao sítio de ligação para carboidratos 26

2.4 Considerações sobre a família Fabaceae 27

2.5 Aspectos gerais do gênero Bauhinia 28

2.6 Considerações sobre a espécie Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud 30

3. OBJETIVOS 33

3.1 Geral 33

3.2 Específicos 33

4. MATERIAL E MÉTODOS 35

4.1 Coleta do material vegetal 35

4.2 Obtenção do Extrato Bruto (EB) 35

4.3 Precipitação com Sulfato de Amônio 35

4.4 Eritrócitos 36

4.5 Determinação da Atividade Hemaglutinante 36

4.6 Determinação da concentração de proteínas 36

4.7 Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares 37

4.8 Purificação da BcL 37

4.9 Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) 38

4.10 Efeito da temperatura 38

4.11 Efeito do pH 38

4.12 Efeito do EDTA e de Cátions Divalentes sobre a Atividade Hemaglutinante 38

4.13 Avaliação de presença de glicídios constituintes 39

4.14 Atividade Antimicrobiana 39

4.14.1 Determinação de concentração Inibitório Mínima (CIM) da BcL contra

Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus,

Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli.

39

4.15 Espectrometria de Massa 40

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 42

5.1 Determinação da atividade Hemaglutinante (AH) 42

5.2 Inibição da Atividade Hemaglutinante por açúcares 43

5.3 Purificação da BcL 45

5.3.1 Cromatografia de Afinidade 45

5.3.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) 48

5.4 Avaliação de presença de glicídios constituintes 49

5.5 Estabilidade da BcL frente a diferentes fatores 49

5.5.1 Efeito da temperatura 49

5.5.2 Efeito do pH na atividade hemaglutinante da lectina 50

5.5.3 Efeito de cátions divalentes na atividade hemaglutinante da lectina 51

5.6 Atividade antimicrobiana 52

5.6.1 Determinação de Concentração Inibitório Mínima (CIM) da BcL contra

Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus,

Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli.

52

5.7 Espectrometria de Massa 52

6 RESUMO DOS RESULTADOS 55

7 CONCLUSÕES 57

REFERÊNCIAS 59

APÊNDICE 71

1. INTRODUÇÃO

CRUZ, D. R. R. Isolamento, purificação e caracterização parcial da lectina de folhas de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do bioma Caatinga.

19

1. INTRODUÇÃO

Proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células. Elas ocorrem

em todas as células vivas e em todas as partes das mesmas relacionando-se

praticamente com todas as funções fisiológicas. Quimicamente, as proteínas são

polímeros de alta massa molecular, cujas unidades básicas são os aminoácidos,

ligados entre si por ligações peptídicas (LEHNINGER; NELSON; COX, 2000). Entre

os milhares tipos de diferentes proteínas encontram-se as lectinas, que são

proteínas ou glicoproteínas de origem não imune, com pelo menos um domínio não

catalítico, aglutinantes de células e glicoconjugados, com capacidade de ligar-se

reversivelmente a mono/oligossacarídeos específicos através de ligações de

hidrogênio e interações de Van der Waals sem alterar a estrutura covalente destes.

(LANNOO; VAN DAMME, 2010; LIS; SHARON, 1998; PEUMANS; VAN DAMME,

1995).

A primeira lectina de planta foi descoberta em 1888 pelo estudante de medicina

Hermann Stillmark quando estudava a mamona (Ricinus communis L.). Em seus

experimentos, constatou a presença de um fator proteico tóxico em extratos dessa

planta que também aglutinava eritrócitos de diferentes animais. Para indicar a fonte

dessa proteína, o nome ricina foi adotado (PEUMANS; VAN DAMME, 1998;

SHARON; LIS, 2004). Esse fato é considerado o verdadeiro ponto de partida da

investigação sobre lectinas de plantas. Sharon e Lis (2004) relataram que em 1889

Hellin descreveu em sua tese de doutorado na Universidade de Dorpat (atual Tartu,

Estônia) uma nova hemaglutinina tóxica, a abrina, encontrada nos extratos de

sementes de feijão jequiriti (Abrus precatorius) que também era capaz de aglutinar

hemácias. Poucos anos depois, Paul Ehrlich utilizando ricina e abrina em estudos

imunológicos estabeleceu os fundamentos da Imunologia básica (KENNEDY et al.,

1995).

Outro fato histórico marcante ocorreu em 1907 quando Landsteiner e

Raubitschek descobriram a presença de aglutininas não tóxicas em sementes de

Lens culinaris (lentilha), Phaseolus vulgaris (feijão comum), Vicia sativa e Pisum

sativum (ervilha). A partir daí, muitas outras hemaglutininas atóxicas foram

descobertas com o passar dos anos, tornando-se claro que as lectinas de plantas

são comuns no reino vegetal (SOL et al., 2006; TEIXEIRA et al., 2012).


20

Segundo Sharon e Lis (2004), James B. Sumner, em 1919, purificou pela

primeira vez uma proteína de Canavalia ensiformis e a nomeou de Concanavalina A

(Con A), e foi apenas em 1936, juntamente com Howell atestaram que essa proteína

era capaz de aglutinar hemácias e alguns fungos. A especificidade da lectina ao

carboidrato foi revelada pela primeira vez quando observaram em seus

experimentos que a hemaglutinação por Con A foi inibida por sacarose.

Em 1940, Boyd constatou que extratos de Phaseolus limensis e Vicia craca

aglutinavam seletivamente eritrócitos humanos do tipo A, mas não do tipo B ou O, já

os extratos de Lotus tetragonolobus, aglutinava especificamente eritrócitos do tipo O.

Essa descoberta pode ser considerada um marco na história das lectinas de plantas

(SHARON; LIS, 2004).

Em 1960, Peter Nowell descobriu que a lectina de Phaseolus vulgaris (PHA)

possui atividade mitogênica, esse fato causou um impacto revolucionário na

imunologia e fez com que novas pesquisas fossem realizadas nesse sentido, sendo

então possível utilizar as lectinas como ferramentas para o estudo da interação entre

células e análise de eventos bioquímicos que ocorrem durante a estimulação de

linfócitos in vitro (BRANDO-LIMA et al., 2006).

AUB e colaboradores (1963; 1965) relataram que a aglutinina de germe de trigo

(WGA) tem a habilidade de aglutinar preferencialmente células malignas e isso levou

a acreditar que as mudanças nos açúcares da superfície celular estão associadas ao

desenvolvimento de câncer e, consequentemente, a uma alta probabilidade dessas

células serem reconhecidas por lectinas.

A capacidade desta classe de proteína em distinguir entre eritrócitos de

diferentes tipos sanguíneos levou Boyd e Shapleigh (1954), a nomeá-las de lectinas,

termo derivado do latim lego que significa selecionar, escolher.

Como já relatado, as primeiras lectinas foram isoladas a partir de plantas, e até

hoje, esta classe de proteínas provenientes de vegetal ainda estão entre as mais

estudadas, destacando-se as pertencentes à Fabaceae, que compreendem um

amplo grupo de proteínas estruturalmente similares, que apesar do seu elevado grau

de homologia, apresentam distintas atividades biológicas. A maior parte dos

estudos, no entanto, se concentra na subfamília Papilionoideae, estando estes

escassos na subfamília Caesalpinoideae, da qual faz parte a espécie Bauhinia

cheilantha.


21

Diante da imensa riqueza vegetal presente nos solos brasileiros, principalmente

no bioma Caatinga, e dos poucos estudos químicos e biológicos das espécies

endêmicas desse bioma exclusivamente brasileiro, este trabalho relata o isolamento,

purificação e caracterização parcial da lectina de folhas de Bauhinia cheilantha

(Bongard) Steudel, espécie nativa do bioma Caatinga, no qual foi possível obter

informações relevantes a respeito das propriedades físico-químicas e atividade

biológica dessa proteína que ainda não possui estudos referenciados na literatura.

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA


23

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. Lectinas

Lectinas são consideradas um grupo heterogêneo de proteínas oligoméricas

que variam em suas estruturas, entre os sítios de ligação a carboidratos, tamanho e

organização molecular (CAMACHO, 2007). Estão amplamente distribuídas na

natureza, sendo encontradas em seres unicelulares (IMBERT et al., 2004), animais

(MOURA et al., 2006) e vegetais (LEITE et al., 2005) Em vegetais, as lectinas são

frequentemente isoladas de sementes, principalmente das leguminosas

(FERNANDES et al., 2011) como também de raízes ( SOUZA et al., 2011), folhas

(SILVA, et al, 2010), tubérculos (KAUR et al., 2006) e cerne (SÁ et al., 2008). Esta

ampla distribuição reflete uma multiplicidade de funções biológicas, algumas

mostradas no Quadro 1, que estão relacionadas à sua habilidade de reconhecer

carboidratos e glicoconjugados na superfície celular (Figura 1). O estudo de suas

propriedades biológicas tem sugerido importantes aplicações biotecnológicas, dentre

estas aplicações, destaca-se a identificação de receptores de membrana e a

detecção de estruturas características de neoplasias (LIS; SHARON, 1998).

Figura 1 - Interações da lectina com carboidrato na superfície celular mediam interações célula-célula e/ ou célula-matriz extracelular através do reconhecimento específico de glicoconjugados.

Fonte: Baseado no diagrama original de BioCarbAB (Adaptado de SHARON; LIS, 2004).


24

Quadro 1- Funções das lectinas

Lectinas Papel biológico

MICRORGANISMOS

Ameba Infecção

Bactéria Infecção

Vírus da Influenza Infecção

PLANTAS

Várias Defesa

Leguminosas Simbiose com bactérias fixadora de Nitrogênio

ANIMAL

Calnexina, Calreticulina, ERGIC-

53 Controle de biossíntese de glicoproteínas

Colectinas Imunidade

Dectinas- 1 Imunidade

Galectinas

Regulação das células de crescimento e

apoptose; regulação dos ciclos celulares,

modulação célula-célula e interação substrato

célula.

Selectina-L Direcionamento de linfócitos

E-selectina e P-selectina Carregamento de linfócitos para o local de

inflamação

Siglec Interação célula-célula no sistema imunológico

e nervoso

Espermadesinas Interação espermatozoide/oócito

Fonte: SHARON; LIS, 2004.


25

2.2. A interação lectina-carboidrato resulta em diferentes efeitos biológicos

2.2.1. Atividade antitumoral das lectinas de planta

Lectinas de planta são amplamente utilizadas como sondas na histoquímica

para caracterizar vários tipos de células em vários estágios de diferenciação e

maturação de câncer (CAMPBELL; SAMPATHKUMAR; YAREMA, 2007; JIM´ENEZ-

CASTELLS et al., 2006; RÊGO et al., 2013; SOBRAL et al., 2010). Foi confirmado

que elas contribuem para o reconhecimento de células tumorais (marcadores de

superfície), para a estimulação mitogênica, localização e adesão celular, apoptose

(“morte celular programada‖), transdução de sinal através das membranas e

citotoxicidade (HAMID et al., 2013). Estudos recentes comprovam cada vez mais os

importantes papéis desempenhados por essas proteínas. Uma lectina isolada a

partir de sementes de Lotus corniculatus apresentou atividade anticarcinogênica

(RAFIQ et al., 2013). Vega e Pérez (2006) estudaram a lectina de sementes de

Salvia bogotensis que mostrou alta afinidade por antígenos de células tumorais e

pode ser usada como ferramenta para estudos imunohistoquímicos e celulares,

enquanto Maciel e colaboradores (2012) purificaram a lectina da casca do caju

(Anacardium occidentale) e concluíram que a mesma pode ser utilizada como matriz

para obtenção de glicoconjugados de interesse biotecnológico.

Estas funções biológicas estão relacionadas à diversidade estrutural das

lectinas e dos carboidratos presentes em células opostas, as quais podem ser do

mesmo tipo ou não.

2.2.2. Atividade antimicrobiana e antifúngica das lectinas de plantas

Lectinas de distintas especialidades podem impedir o crescimento de

microrganismos e/ou serem agentes bactericidas e/ou fungicidas. Estas proteínas

são dotadas de uma grande habilidade em reconhecer seletivamente

microrganismos que causam doenças em plantas e no homem, por isso são muito

utilizadas como agente antimicrobiano (SILVA et. al., 2013).

A maioria das lectinas desempenham funções no próprio vegetal que a produz,

tais como função de defesa e interação com glicoconjugados de outros organismos.

Sá e colaboradores (2009) mostraram esse evento quando isolaram uma lectina do


26

cerne de Myracrodruon urundeuva, conhecida como aroeira. Eles avaliaram sua

atividade contra bactérias e fungos que atacam plantas e constataram que essa

lectina tem um papel importante na resistência do cerne de M. urundeuva contra

deterioradores biológicos.

A atividade antifúngica também foi observada na lectina de sementes de Talisia

esculenta (pitombeira) na qual a interação da lectina com as estruturas dos fungos

Fusarium oxysporum, Colletotrichum lindemuthianum e Saccharomyces cerevisiae

inibiu o crescimento dos mesmos (FREIRE et al., 2002). Já Brustein e colaboradores

(2012) avaliaram o efeito antibacteriano da lectina de Eugenia malaccensis no

tratamento da cicatrização de feridas cutâneas em ratos.

2.2.3. Atividade inseticida das lectinas de plantas

Lectinas são as únicas proteínas de plantas que reconhecem e se ligam

especifica e reversivelmente a glicoconjugados presentes na superfície de

microrganismos ou expostos no trato intestinal de insetos, mamíferos e herbívoros.

Esse evento leva a acreditar que elas podem desempenhar importante papel de

defesa na planta. As lectinas ligantes de quitina são as principais responsáveis pelo

mecanismo de defesa das plantas contra o ataque de insetos; interagindo com esse

carboidrato que é um elemento estrutural importante do trato digestivo dos insetos

(LERNER; RAIKHEL, 1992; PEUMANS; VAN DAMME, 1995).

Muitos estudos comprovam essa propriedade, por exemplo, a lectina da folha

de Bauhinia monandra causou mortalidade significativa a Zabrotes subfaciatus e a

Callosobruchus maculatus, quando incorporados em uma dieta artificial (MACEDO et

al., 2007). Isso acontece porque as lectinas interagem com as glicoproteínas e

formam um complexo que provoca no local um efeito deletério (PEUMANS; VAN

DAMME, 1995). Araújo e colaboradores (2012) isolaram a lectina da casca de

Crataeva tapia e mostram que a mesma possui atividades adsorventes e inseticidas.

2.3. Classificação quanto ao sítio de ligação para carboidratos

Lectinas de plantas apresentam semelhanças em sua estrutura, porém

diferenças em sua especificidade de ligação a carboidratos; sendo assim, elas estão


27

subdivididas em cinco grupos de acordo com o monossacarídeo pelo qual elas

apresentam maior afinidade, são eles: D-manose/D-glucose, D-galactose/N-

acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, L-fucose, e ácido siálico (GOLDSTEIN;

WINTER; PORETZ, 1997). Portanto, dependendo da especificidade, a lectina irá

ligar-se seletivamente a um destes açúcares acima que são componentes típicos de

superfícies de células eucarióticas (LIS; SHARON, 1998).

Lectinas ligantes de manose geralmente reagem com glucose e vice-versa,

mas também podem interagir em menor quantidade com N-acetil-glucosamina, esse

evento acontece porque algumas lectinas toleram variações na posição do C2 do

anel piranosídico. Em relação ao C3, poucas variações são toleradas, mas a

configuração do C4, no que se refere à posição do grupo OH é considerada crítica já

que lectinas específicas para glucose/manose não reagem com a galactose e vice-

versa (ZANETTI, 2007).

As lectinas de plantas podem ser classificadas em sete famílias de proteínas

relacionadas evolutivamente, são elas: as famílias das lectinas de leguminosas,

lectinas com domínio pra heveína, monocotiledôneas ligantes de manose, proteínas

inativadoras de ribossomo tipo 2, lectinas relacionadas à jacalina, amarantinas e

lectinas de floema de Curcubitáceas (VAN DAMME et al., 2004).

2.4. Considerações sobre a família Fabaceae

Fabaceae é uma das principais famílias de angiospermas com mais de

19.000 espécies. No Brasil, é uma das mais diversas e abundantes famílias de

plantas superiores, presente praticamente em todos os seus maiores biomas

(LEWIS et al., 2005). Está representada por três subfamílias muito distintas

(Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae), 36 tribos e aproximadamente

727 gêneros. Tem grande importância econômica, especialmente no setor

farmacológico, medicinal, industrial, madeireiro, ornamental e na produção

alimentícia, além de contribuir bastante para a melhoria de solos agrícolas

(MOURÃO; KARAM; SILVA, 2011).

Lectinas de Fabaceae constituem o grupo mais investigado de lectinas de

plantas, sendo que uma grande parte destas já possuem suas estruturas

tridimensionais bem descritas (SHARON; LIS, 1990; PEUMANS; VAN DAMME,


28

1998). É bem documentado que essas proteínas diferem bastante no que diz

respeito à sua especificidade de ligação a carboidratos e em suas funções

biológicas, mas apresentam elevada semelhança estrutural, sendo compostas por

duas ou quatro subunidades, idênticas ou ligeiramente diferentes, com massas

moleculares de 25 a 30 kDa e são normalmente constituídas por uma única cadeia

polipeptídica com aproximadamente 250 aminoácidos. Cada subunidade das

lectinas de leguminosas apresenta os íons Ca2+ e Mn2+ que são essenciais para a

atividade de ligação ao carboidrato. Além disso, uma grande parte das lectinas de

leguminosas são glicoproteínas. (SHARON; LIS, 1990; SHARON; LIS, 2002; WEIS;

DRICKAMER, 1996).

2.5. Aspectos gerais do gênero Bauhinia

O gênero Bauhinia está inserido na família Fabaceae. A subfamília

Caesalpinioideae tem se mostrado parafilética nas principais filogenias abordando

Fabaceae (DOYLE et al., 2000) e por tal razão muitos taxa estão em mudança como

é o caso da tribo Cercideae no qual se encerra o gênero Bauhinia L. Tal gênero é o

maior da tribo sendo composto por árvores e arbustos de distribuição pantropical,

apresenta cerca de 310 espécies organizadas em 22 seções e 30 séries (VAZ;

TOZZI, 2005). No Brasil, existem aproximadamente 98 espécies nativas desse táxon

e por causa do formato de suas folhas, é conhecido popularmente como ―Pata-de-

vaca‖ (CECHINEL FILHO, 2009; VAZ 2001).

As folhas, caules e raízes das plantas desse gênero, são bastante utilizados

em forma de chás e outras preparações fitoterápicas para o tratamento de várias

patologias devido às suas propriedades antibacterianas, antifúngicas, anti-

inflamatórias e principalmente antidiabéticas (CECHINEL FILHO, 2000; SILVA;

CECHINEL FILHO, 2002).

No Brasil, cresce cada vez mais o interesse pelas espécies do gênero

Bauhinia, uma vez que estudos experimentais têm confirmado as suas propriedades

terapêuticas relatadas. As espécies mais estudadas fitoquimicamente são: B.

manca, B. candicans, B. uruguayensis, B. purpurea, B. forficata e B. splendens, nas

quais vários compostos de interesse medicinal como lactonas, flavonoides,


29

terpenóides, esteroides, triterpenos, taninos e quinonas já foram isolados e

identificados (SILVA; CECHINEL FILHO, 2002).

A B. forficata é utilizada desde muito tempo nas comunidades rurais porque é

capaz de reduzir o índice de glicose no sangue. Esse potencial terapêutico foi

confirmado em estudos clínicos pela primeira vez por Juliane em 1929 (MARQUES

et al., 2013) e continua atraindo cada vez mais a atenção dos pesquisadores. Nesse

sentido, os estudos farmacológicos foram realizados nos extratos de folhas (aquosos

e alcoólicos) dessa espécie, a fim de verificar a atividade antidiabética em diferentes

modelos in vivo (CUNHA et al., 2010; MENEZES et al., 2007; PEPATO et al., 2010).

Outros estudos mostraram que o extrato de B. forficata é útil no tratamento de

diabetes mellitus tipo II após reduzir a taxa de glucose, triglicérides, colesterol total e

HDL em modelo in vivo (LINO et al., 2004).

Da mesma forma, Menezes e colaboradores (2004) relataram que os extratos

aquosos obtidos a partir das folhas de B. monandra e B. forficata apresentaram

atividade hipoglicemiante quando avaliados em camundongos, sugerindo que esta

ação pode estar relacionada com a presença de flavonoides glicosilados. Esta

hipótese é confirmada por estudos recentes que mostram que vários flavonoides

naturais exibem um potencial antidiabético (MORIKAWA, 2007).

Muitas outras espécies de Bauhinia destacam-se pelas suas propriedades

biológicas, entre elas estão a B. purpurea com atividade citotóxica (PETTIT et al.,

2006), B. racemosa com atividades antioxidante, antitumoral, antiúlcera (AKTHAR;

AHMAD, 1995; GUPTA et al., 2004; KUMAR et al., 2005) e a B. variegata com

atividade antitumoral (RAJKAPOOR; JAYAKAR; MURUGESH, 2003).

O estudo fitoquímico recente das folhas e flores de B. purpurea demonstrou

que esta espécie contêm diversos componentes químicos (carboidratos, alcaloide,

esteroides, esteróis, glicosídeos, saponinas, flavonoides, taninos, compostos

fenólicos, proteínas, aminoácidos e óleo fixo) que podem ser aplicados no

tratamento de doenças (MARIMUTHU; DHANALAKSHMI, 2014).

Em relação às lectinas, um grande número já foi isolado e caraterizado a partir

da família Fabaceae. Contudo, as lectinas de espécies da subfamília

Caesalpinioideae ainda estão entre as menos estudadas. O gênero Bauhinia,

pertencente à tribo Cercideae é o principal táxon com o maior número de lectinas

que já foram caracterizadas bioquimicamente. Recentemente, algumas espécies têm

demonstrado atividades biológicas importantes, por exemplo, a lectina das sementes


30

de B. ungulata (BUL) possui atividade antifúngica contra espécies fitopatogênicas e

uma atividade antiproliferativa in vitro contra linhagens tumorais, HT29 (carcinoma

de cólon humano). Estas propriedades são favoráveis para potenciais aplicações

terapêuticas e biotecnológicas dessa proteína (SILVA et al., 2014). A lectina de B.

forficata é atualmente a única lectina de Bauhinia que apresenta propriedades

anticoagulantes e inibe a agregação de plaquetas (SILVA et al., 2012). Já a lectina

extraída das raízes secundárias de B. monandra (BmoRoL) possui potencial

termiticida e fungicida, podendo ser aplicada no controle de pragas agrícolas

(SOUZA et al., 2011).

2.6. Considerações sobre a espécie Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud.

O Brasil possui a maior diversidade biológica do mundo, contando com uma

rica flora, sendo o país com maior potencial para pesquisas com espécies vegetais.

Sua rica biodiversidade está distribuída em seis biomas diferentes (SOUZA;

FELFILI, 2006). O bioma Caatinga é o principal ecossistema do Nordeste brasileiro,

este, possui muitas espécies de plantas que apresentam interesse fitoterápico

(AGRA et al., 2008). Dentre elas, encontra-se a Bauhinia cheilantha (Bongard)

Steudel, espécie alvo deste estudo, típica desse bioma e conhecida popularmente

como mororó.

Essa espécie pertence à série Cansenia que é claramente um grupo definido

por apresentar inflorescência terminal áfila, chamada pseudo-racemo com brácteas

foliáceas, (bráctea floral e respectivas bractéolas), além de grãos de pólen do tipo 3-

(4-) colpados, ângulo-aperturados. Bauhinia cheilantha, por sua vez, é um complexo

de espécies que pode ser definido por apresentarem estípulas semilunares,

inflorescências parciais muitas vezes com três flores ou vestígios destas; pétalas

obovadas a lanceoladas com margens fimbriadas e glandulosas no dorso (Figura 2

A); coluna estaminal internamente com apêndice laciniados nos bordos, hirsuta

interna e externamente; anteras loceladas (VAZ; TOZZI, 2003).

São árvores silvestres que possuem de 3 a 5m de altura, de caule duro e

casca fibrosa (Figura 2 B). Suas folhas são bilobadas e lembra o rastro da pata de

bovinos (Figura 2 C). Ocorre, de preferência, em solos férteis e argilosos e em

comunidades arbóreo-arbustivas (CAMPANHA; ARAÚJO, 2010). Essa espécie


31

encontra-se distribuída em vários Estados do Nordeste, Minas Gerais, Mato Grosso

e Mato Grosso do Sul conforme mostra a Figura 3.

Bauhinia cheilantha tem importância econômica diversificada, sendo

exploradas pelo valor madeireiro e ornamental; as folhas e ramos novos são

forrageiros, excelentes para a alimentação dos rebanhos (CAMPANHA; ARAÚJO,

2010) É uma espécie bastante utilizada na produção de remédios tradicionais para o

tratamento de diabetes (AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007).

Figura 2 – Foto da espécie Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel

FONTE: Autora

Figura 3 - Distribuição geográfica de B. cheilantha ( ) no Brasil.

Fonte: Adaptado de VAZ; TOZZI, 2003.

3. OBJETIVOS

3. OBJETIVOS


33

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Isolar, purificar e caracterizar parcialmente a lectina de folhas de Bauhinia

cheilantha (Bongard) Steudel, nativa do bioma Caatinga, de modo a obter

informações relevantes a respeito das propriedades físico-químicas e atividade

biológica.

3.2. Específicos

3.2.1 Determinar a sua especificidade aos carboidratos;

3.2.2 Determinar as características físico-químicas em função dos parâmetros como

pH, temperatura e dependência de cátions divalentes;

3.2.3 Estimar a massa molecular aparente da lectina por SDS-PAGE;

3.2.4. Determinar a massa molecular da lectina por MS;

3.2.5 Avaliar sua atividade antimicrobiana.

4. MATERIAIS E MÉTODOS


35

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Coleta do Material Vegetal

O material vegetal (folhas) foi coletado no município de Petrolina (9°23'53,1"S

40°29'13,9"W), no Estado de Pernambuco em outubro de 2014. A identificação

botânica foi realizada pelo Prof. Dr. José Alves de Siqueira Filho, sendo a exsicata

depositada no Herbário da UNIVASF (HVASF) da cidade de Petrolina com número

de tombo #2241.

4.2. Obtenção do Extrato Bruto (EB)

As folhas coletadas foram lavadas em água corrente e mantidas em

temperatura ambiente durante 48h. Após a retirada da umidade, as extrações foram

realizadas triturando-se as folhas em triturador com laminas com os tampões glicina

0,1 M pH 2,6, acetato de sódio 0,1M pH 5,0, fosfato de sódio 0,1M pH 6,5, Tris-HCl

0,1M pH 7,8 e borato de sódio 0,1M pH 10,0 na proporção de 1:10 (m/v) a fim de

identificar o meio extrator de melhor eficiência. Após trituração, as suspensões foram

colocadas sob agitação lenta por 1h à temperatura ambiente e em seguida foram

filtradas em gaze dupla. Aos filtrados foram adicionados PVPP 2% (m/v) e β-

mercaptoetanol 0,1% (v/v) sob agitação por 30min, posteriormente centrifugados a

10.000 g, 30 min, 4°C e filtrados em papel de filtro qualitativo. Os Extratos Brutos

(EB) obtidos foram utilizados para atividade hemaglutinante.

4.3. Precipitação com Sulfato de Amônio

A lectina da folha de Bauhinia cheilantha (BcL) foi extraída a partir de 100 g de

folhas frescas maceradas em 500 mL de tampão Tris- HCl 0,1M pH 7,8, utilizando o

mesmo procedimento descrito acima. O extrato bruto obtido foi fracionado com

sulfato de amônio a 90% de saturação. Após 12h à temperatura ambiente o

precipitado foi separado por centrifugação (10.000 g, 30 min), solubilizado em Tris-

HCl 50mM pH 7,8 e dialisado contra água, resultando na fração 0/90% (F0/90).


36

4.4. Eritrócitos

Para os ensaios de atividade hemaglutinante foram empregadas amostras de

sangue de coelho, caprino, bovino, equino e ovino coletadas no Setor de Produção

do Campus de Ciências Agrárias da UNIVASF.

Este estudo recebeu aprovação do Comitê de Ética e Deontologia em

Estudos e Pesquisas da Universidade Federal do Vale do São Francisco, sob o

Protocolo nº 0002/210114.

Os sangues foram coletados através da veia jugular, exceto no coelho, que foi

na marginal da orelha. Em seguida, esses sangues foram transferidos para um tubo

contendo anticoagulante heparina 1µL.mL-1 de sangue coletado e lavados com NaCl

0,15 M por cinco vezes (3.000 rpm, 4ºC, 5 min.). O sobrenadante foi descartado e o

precipitado (papa de hemácias) foi utilizado para preparar uma suspensão de

hemácias a 2%.

4.5. Determinação da Atividade Hemaglutinante

Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados através de diluições

seriadas em tubos de ensaio segundo o método de Moreira e Perrone (1977). Em

cada tubo foram adicionados 100 µL de solução de NaCl 0,15 M e 100 µL do extrato

bruto apenas no primeiro tubo, após a diluição seriada, adicionou-se o mesmo

volume de suspensão de hemácias 2%. O controle negativo continha volumes iguais

de NaCl 0,15 M e solução de hemácias 2%. Após 30 min de incubação a 37ºC e

repouso por mais 30 min a temperatura ambiente, a atividade hemaglutinante foi

observada visualmente, sendo o título expresso em unidade de hemaglutinação

(UH.mL-1), que corresponde ao inverso da maior diluição da amostra que apresente

nítida aglutinação.

4.6. Determinação da concentração de proteínas


37

A concentração de proteínas solúveis no extrato e fração proteica foi realizada

segundo o método de BRADFORD (1976) e como padrão foi utilizado albumina

sérica bovina (BSA).

4.7. Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares.

A especificidade de ligação da lectina a carboidrato foi determinada pelo ensaio

de inibição utilizando as seguintes soluções de açúcares (concentração inicial de

500 mM): D-galactose, D-lactose, D-manose, D-glucose, D-frutose, D-sacarose, D-

lactulose, D-trealose e D-maltose. Inicialmente foi realizada uma diluição da BcL e

depois as soluções de açúcares foram preparadas em NaCl 0,15 M em diferentes

concentrações, por diluições seriadas. Volumes iguais (100 µL) da amostra e

soluções de açúcares foram previamente incubados por 30 min a 37ºC, em seguida,

acrescentado 100 µL de suspensão de eritrócitos de coelho a 2%. A inibição de

hemaglutinação foi avaliada visualmente após 1h à temperatura ambiente e a

concentração mínima necessária do açúcar para inibir a atividade hemaglutinante foi

determinada.

4.8. Purificação da BcL

A lectina de Bauhinia cheilantha (BcL) foi facilmente purificada em uma única

etapa. A F 0-90% foi submetida à cromatografia de afinidade em uma coluna de

galactomanana de Adenanthera pavonina L. reticulada com epicloridrina, preparada

no Laboratório de Desenvolvimento de Fármacos da Universidade de Fortaleza,

conforme metodologia de APPUKUTTAN (1977), e equilibrada com Tris- HCl 50mM

pH 7,8. A fração não retida (pico I) foi eluída com a solução de equilíbrio. Para a

eluição da fração retida (pico II) o tampão glicina 0,1M pH 2,6 em NaCl 0,15M foi

utilizado. A concentração de proteínas eluídas foi estimada por medida da

absorbância em 280 nm utilizando espectrofotômetro modelo UVmini-1240 . As

frações retidas que apresentavam leituras mais altas a 280nm foram reunidas e

dialisadas exaustivamente contra água destilada em temperatura ambiente.

Posteriormente, a amostra dialisada foi liofilizada (liofilizador modelo LS 3000).


38

4.9. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

A pureza da proteína foi confirmada por eletroforese em SDS-PAGE seguindo

o método de LAEMMLI (1970). Para isso, utilizou-se 20 µg do pico retido (PII)

liofilizado oriundo da cromatografia de afinidade. A amostra foi dissolvida em 20 µL

do tampão de amostra com e sem β-mercaptoetanol, submetida à fervura por 5min e

em seguida aplicada a um gel com malha 15%, contendo marcador molecular

padrão (LMW Calibration Kit For SDS Electrophoresis).

4.10. Efeito da temperatura

O efeito do calor sobre a atividade hemaglutinante foi determinado através da

incubação da BcL em banho-maria por 30min no intervalo de 20 a 100 °C, com

incremento de 10 ºC. Após incubação, as amostras foram resfriadas em banho de

gelo e usadas para ensaios de hemaglutinação.

4.11. Efeito do pH

O efeito do pH na atividade hemaglutinante da proteína foi avaliado incubando

100 µL da BcL (1mg.mL-1) com 100 µL dos seguintes tampões: acetato de sódio 100

mM (pH 5,0), citrato de sódio 100 mM (pH 6,5), fosfato de sódio 100 mM (pH 7,5),

Tris-HCl 100 mM (pH 8,0) e borato de sódio 100 mM (pH 10,0) por 30 min a 37 ºC,,

em seguida adicionou-se a mesma quantidade de suspensão de eritrócitos 2%(v/v),

incubou-se novamente e os resultados foram observados macroscopicamente.

4.12. Efeito do EDTA e de Cátions divalentes sobre a Atividade Hemaglutinante

A dependência de cátions divalentes (Ca2+ e Mn2+) para a atividade

hemaglutinante da BcL foi determinada pelo método da dupla diluição seriada

usando EDTA como agente quelante, conforme PAJIC et al. (2002).


39

4.13. Avaliação de presença de glicídios constituintes

A presença de carboidratos neutros na lectina isolada foi determinada pelo

método de Dubois et al. (1956). Utilizou-se como padrão solução de D-glucose

(1µg.mL-1) e 100 µL da BcL (1mg.mL-1), com leitura em espectrofotômetro a 490 nm

modelo v-1100.

4.14. Atividade Antimicrobiana

4.14.1. Determinação de Concentração Inibitória Mínima (CIM) da BcL contra

microrganismos patógenos.

A CIM foi determinada pelo método de microdiluição em caldo de cultura

Brain Heart Infusion (BHI) de acordo com a metodologia descrita pelo CLSI, 2009.

Para isso, utilizou-se microplacas com 96 poços de fundo redondo, estéreis e com

tampas apropriadas.

Culturas microbianas puras mantidas em ágar sob refrigeração, foram

repicadas para caldo infusão (caldo BHI) e incubadas a 37ºC até atingirem fase

exponencial de crescimento (4-6h). Após esse período, as culturas tiveram sua

densidade celular ajustada em meio BHI estéril, de modo a se obter uma turbidez

equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 × 108

UFC.mL-1 ). A suspensão obtida foi diluída 100 vezes, em solução salina 0,15M

estéril, resultando em uma cultura com aproximadamente 106 UFC.mL-1. Aos poços

da microplaca foram adicionados 100 μL de caldo BHI, 50 μL de BcL em diferentes

concentrações e por fim, 50 μL da suspensão microbiana. As microplacas foram

incubadas durante 24h em estufa bacteriológica a 37°C. Após esse período foi

realizada a inspeção visual do crescimento microbiano e a leitura das absorbâncias

em leitora de Elisa Bio-Tek a 620 nm.

A CIM é considerada a menor concentração da BcL capaz de inibir o

crescimento das cepas testadas, constatado pela ausência de turvação visível do

crescimento microbiano ou pelas leituras de absorbância quando a amostra por si só

gera turvação quando em contato com o meio.


40

4.15. Espectrometria de Massa

A lectina de folhas de Bauhinia cheilantha (BcL) foi analisada por

espectrometria de massas com o objetivo de verificar sua pureza e também

determinar sua massa molecular. Para esse fim, BcL oriunda do pico retido na

cromatografia de afinidade descrita anteriormente foi diluída em água contendo 0,1%

de ácido fórmico até uma concentração final de 1 mg.mL-1 e aquecida a 80oC por

15 min. Alíquota dessa diluição foi reduzida com 10 mM de Ditiotreitol, seguida de

uma reação de alquilação com 30 mM de iodoacetamida protegendo-se da luz.

Também foram utilizadas alíquotas de 5 µL da solução de BcL nativa.

Cinco microlitros da amostra de BcL reduzida e não reduzida foi inicialmente

aplicada em uma

–

USA) usando um gradiente de 5 a 80% de acetonitrila em 0,1% de ácido fórmico

(v/v), com fluxo de 600 nL.min-1. Em todas as análises, o espectrômetro de massa

foi operado no modo ―V‖ com resolução de pelo menos 20.000, utilizando

nanoeletrospray como fonte de ionização operando no modo de íon positivo ESI (+).

A digitalização dos dados foi realizada em espectrômetro de massa Synapt

HDMS (Waters, Manchester – UK) acoplado ao sistema NanoUPLC-ESI programado

para alternar automaticamente entre MS de energia baixa (3 eV) e de energia de

colisão MAS (12 – 55 eV).

Esta tecnologia é utilizada para caracterizar tanto a porção N-terminal como a

C-terminal com igual probabilidade. Nesta metodologia, obtém-se um espectro de

massa de uma mistura de peptídeos digeridos na presença de tripsina. A mistura de

peptídeos obtidos foi analisada por espectrômetro de massa e as massas

monoisotópicas de cada peptídeo oriundo do MALDI-TOF foram submetidas à busca

na base de dados MASCOT (versão 2.1.03) (http://www.matrixscience.com),

software livre que permite a identificação por mapa de peptídeos (PMF).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO


42

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Determinação da atividade Hemaglutinante (AH)

É bem documentado que a maior parte das lectinas isoladas é extraída de

sementes de leguminosas, sendo a extração proveniente de folhas ainda pouco

explorada. Desta forma, estudos foram realizados em extratos foliares com a

Bauhinia cheilantha para avaliar as propriedades físico-químicas e biológicas da sua

lectina.

Na tentativa de identificar a presença de lectina nas folhas de Bauhinia

cheilantha, observou-se que a melhor solução tampão de extração proteica foi o

Tris- HCl 0,1M pH 7,8, pois o EB preparado com esse tampão apresentou uma maior

atividade hemaglutinante (Tabela 1). Sendo, portanto utilizado nos demais

processos de purificação e caracterização da lectina. Esse resultado foi semelhante

àqueles obtidos para lectinas de B. pentandra (SILVA; HORTA; MOREIRA, 2001), B.

ungulata (SILVA et al., 2014) e B. variegata (PINTO et al., 2008).

Tabela 1- Atividade Hemaglutinante (AH) dos Extratos Brutos (EB) preparados com tampões de diferentes valores de pH

EB/ Solução tampão de extração

proteica *Título AH (U.H. mL-1)

Glicina 0,1 M pH 2,6 _

Acetato de sódio 0,1M pH 5,0 8

Fosfato de sódio 0,1M pH 6,5 32

Tris-HCl 0,1M pH 7,8 256

Borato de sódio 0,1M pH 10,0 _

*Título: definido como a última diluição da lectina capaz de aglutinar eritrócitos a 2%

O EB preparado com Tris-HCl 0,1M pH 7,8 foi testado em relação à

especificidade a diferentes eritrócitos. A atividade hemaglutinante mostrou que este

extrato aglutinou pobremente eritrócito bovino e foi incapaz de aglutinar hemácias de

caprino, equino e ovino, entretanto, aglutinou fortemente eritrócitos de coelho,

conforme mostra a Tabela 2.


43

Tabela 2 - Atividade Hemaglutinante (AH) do EB com diferentes eritrócitos.

Eritrócitos 2% *Título AH (U.H. mL-1)

Coelho 256

Bovino 16

Caprino _

Equino _

Ovino _

*Título: definido como a última diluição da lectina capaz de aglutinar eritrócitos a 2%

A Atividade hemaglutinante (AH) está relacionada à especificidade e afinidade

dos sítios de ligação das lectinas a carboidratos presentes na superfície de

eritrócitos determinadas, principalmente, por ligações de hidrogênio e interações

hidrofóbicas (SHARON; LIS, 2002).

5.2. Inibição da Atividade Hemaglutinante por Açúcares

Através da atividade hemaglutinante observou-se que BcL foi inibida por D-

galactose e D-lactulose, mas não pelos demais açúcares testados (Tabela 3).

Tabela 3- Inibição da Atividade Hemaglutinante da F0-90% de B. cheilantha por carboidratos

Carboidrato Concentração (mM)*

D-Galactose 0,976

Lactulose 1,953

D-Glucose NI**

D-Lactose NI

D-Maltose NI

D-Manose NI

D-Sacarose NI


44

D-Trealose NI

D-Frutose NI

*Concentração mínima requerida para inibição da atividade hemaglutinante **NI: Açúcar não inibidor a 500m M de concentração.

Esta especificidade de ligação a galactose é também uma característica das

lectinas isoladas a partir de B. variegata (PINTO et al., 2008), B. ungulata (SILVA et

al., 2014), B. bauhinioides (SILVA et al., 2011) e B. monandra (MACEDO et al.,

2007), já que a maioria das lectinas isoladas desse gênero são ligantes de galactose

e seus derivados. Lectinas que possuem especificidade para galactose não são

capazes de se ligar à manose ou glicose, nem manose/glicose ligam-se à galactose.

Esse dado corrobora com a discussão elaborada por Ambrosi e colaboradores

(2005).

Assim como as lectinas, alguns compostos como taninos, substâncias

catiônicas, alguns lipídios, carboidratos cognatos e cátions divalentes em altas

concentrações, também são capazes de aglutinar ou precipitar células (TRINDADE,

2005). Sendo assim, apenas a capacidade de promover aglutinação em células não

pode ser considerada um teste conclusivo de que há lectina em um determinado

vegetal, por isso é importante realizar o teste de Inibição da atividade

hemaglutinante por açúcares para confirmar se de fato é a lectina a responsável

pela aglutinação.

Peumans e Van Damme (1995), afirmaram que alguns critérios devem ser

levados em consideração para que uma proteína seja considerada uma lectina, um

desses critérios é ser uma proteína ou glicoproteína que são capazes de se ligar

especifica e reversivelmente a carboidratos sem alterar a estrutura dos mesmos.

Essa interação ocorre através de ligações de hidrogênio e interações de Van der

Waals entre os grupos hidroxilas e os resíduos de aminoácidos do sítio ativo da

lectina. Esse evento foi evidenciado através do ensaio de inibição no qual foram

utilizadas soluções de açúcares de concentração inicial 500 mM e uma suspensão

de eritrócitos de coelho 2% (v/v).

O teste de inibição por carboidratos foi considerado uma etapa muito

importante no processo de purificação e caracterização parcial da BcL, pois, esse

resultado conduziu todo o resto do processo.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ambrosi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15858635


45

5. 3. Purificação da BcL

5.3.1 Cromatografia de Afinidade

A cromatografia de afinidade é um método muito utilizado na purificação de

lectinas por ser técnica baseada na interação reversível entre a proteína e um

ligando específico acoplado a uma matriz cromatográfica pela mudança de pH ou

por eluição competitiva de uma solução de carboidrato.

Lectina de B. cheilantha foi facilmente purificada num único passo por

cromatografia de afinidade numa matriz de galactomanana de cadeia linear principal

constituída de D-manose com ramificações de galactose.

A amostra de lectina (F0-90%), quando submetida à cromatografia de

afinidade em coluna de galactomanana (Figura 4), apresentou dois picos

cromatográficos. O primeiro pico (PI), não adsorvido ao polímero, mostrou-se

destituído de atividade hemaglutinante, enquanto o segundo pico (PII), eluído com

glicina 0,1M pH 2,6 com NaCl 0,15M, apresentou a máxima atividade

hemaglutinante.

Figura 4. Purificação da lectina de B. cheilantha por cromatografia de afinidade em galactomanana. A amostra foi aplicada a uma coluna de 10 mL, e as frações 4 mL (PI) e 2 mL (PII) foram recolhidas com fluxo constante de 0,5 mL.min-1.

A cromatografia de afinidade em coluna de galactomanana foi um método

bastante eficaz na purificação da BcL, pois esse processo permitiu a remoção de


46

outros compostos do material aplicado e a lectina foi eluída com alto grau de pureza.

O fator de purificação obtido foi 16, 92 conforme mostra a Tabela 4.

A formação do pico retido (PII) mostrou que a proteína interagiu de forma

reversível com as ramificações de galactose da matriz, confirmando ainda mais a

especificidade desta proteína por esse açúcar.

Essa matriz também foi utilizada para purificar lectinas ligantes de D-

galactose de sementes de Artocarpus incisa (CONSTANCIO, 2005; MONTEIRO,

1998; MOREIRA et al., 1998).


47

Tabela 4. Purificação da lectina de Bauhinia cheilantha

Etapas Volume (mL) Proteína (mg.mL-1) Proteína total (mg) AHa AHTb AHEc Fator de

Purificação

Extrato Bruto

500

0,55

275,00

256

128.000

465,45

1

F 0-90 58 0,57 33,06 512 29.696 898,24 1,93

PII

(Galactomanana) 25 0,52 13,00 4.096 102.400 7.876,92 16,92

a Hemaglutinação foi realizada com uma suspensão de eritrócito de coelho 2% (v/v). b Atividade hemaglutinante total = AH × volume (mL). c Atividade hemaglutinante específica = AH. Proteína-1 (mg.mL-1).


48

5.3.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Essa técnica tem por base a mobilidade determinada por fatores de carga e

estrutura da biomolécula. O SDS é um detergente aniônico forte, que se liga aos

resíduos positivamente carregados das proteínas, conferindo às mesmas uma carga

final negativa e ocasionando a desnaturação.

BcL mostrou uma única banda em SDS-PAGE com uma massa molecular

aparente de aproximadamente 32,0 kDa (Figura 5), sob condições não redutoras

(Poço 2) e redutoras (Poço 3), indicando que a proteína nativa não é composta de

subunidades ligadas por pontes dissulfeto. A maioria das lectinas isoladas do gênero

Bauhinia exibem um perfil eletroforético com uma banda única de aproximadamente

30 kDa (SILVA; HORTA; MOREIRA, 2001; SILVA, et al., 2014; SOUZA et al., 2011).

Figura 5. Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida- SDS da lectina purificada de B. cheilantha (32kDa). Poço 1: marcador molecular: Fosforilase b (97,0 kDa), albumina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa) inibidor de tripsina (20,1 kDa) α-lactoalbumina (14,4 kDa). Poços 2 e 3 representam BcL (20 µg) aquecida a 100°C durante 10min minutos na ausência e na presença de β-mercaptoetanol, respectivamente.


49

5.4. Avaliação de presença de glicídios constituintes

Lectinas de leguminosas podem ser glicosiladas, exibindo uma ou duas

cadeias de carboidratos covalentemente ligado à cadeia lectínica (VAN DAMME

LANNOO; PEUMANS, 2008). Sendo assim, a BcL foi investigada quanto à presença

de carboidratos neutros em sua composição molecular.

Para uma solução de lectina purificada encerrando 1mg. mL-1 de proteína

(determinada por absorbância em 280 nm) foi encontrado 0,128 mg. mL-1 de

carboidrato, correspondendo a um teor de 12,8% de açúcar neutro. Diante disto, a

lectina foi considerada uma glicoproteína. Da mesma forma, lectinas de outras

espécies do gênero Bauhinia, como B. purpurea (IRIMURA; OSAWA, 1972), B.

monandra (COELHO; SILVA, 2000), B. ungulata (SILVA et al., 2014) e B. forficata

(SILVA et al., 2012), são também glicoproteínas. Em contraste, lectina da B.

bauhinioides não foi reativa para o ensaio do fenol-sulfúrico (SILVA et al., 2011).

5.5. Estabilidade da BcL frente a diferentes fatores

Muitos são os fatores que influenciam a atividade das lectinas, tais como,

tratamentos térmicos, pH e íons, e, por isso o controle da estabilidade de uma

proteína representa uma importante estratégia para manutenção de sua atividade

biológica. Diante disto, foi importante compreender quais condições estabiliza ou

desnaturam a BcL .

5.5.1. Efeito da temperatura

Através dos ensaios, verificou-se que a lectina da folha de B. cheilantha é

uma proteína termoestável (Figura 6) mantendo sua atividade hemaglutinante

mesmo após incubação por 30min a 60°C e completamente desnaturada em

temperaturas entre 65 e 100ºC durante 30 min. Isso acontece porque o aumento da

temperatura provoca um aumento na velocidade de vibração molecular e

consequentemente, as ligações que estabilizam a estrutura tridimensional da

proteína são rompidas, promovendo a sua desnaturação (LEHNINGER; NELSON;

COX, 2000).


50

Resultado semelhante foi observado na lectina de B. bauhinioides (SILVA et

al., 2011) e na lectina obtida a partir da raízes secundárias de B. monandra

(BmoRoL) (SOUZA et al., 2011). As lectinas de Bauhinia pentandra (SILVA; HORTA;

MOREIRA, 2001) e Bauhinia forficata (SILVA et al., 2012) mostraram-se mais

estáveis e mantiveram a sua atividade hemaglutinante após incubação, por 30 min.,

a 70 e 100°C, respectivamente.

Kawasgishi e Mori (1991) afirmaram que lectinas isoladas de diferentes fontes

apresentam estabilidade térmica variável, mas muitas delas perdem sua atividade

biológica quando são submetidas a temperaturas acima de 60°C. O efeito

hidrofóbico e a conformação entrópica são os possíveis fatores responsáveis pela

estabilidade das proteínas a uma determinada temperatura (PACE et al., 2004). Os

resultados dos estudos termodinâmicos de desnaturação de proteínas estão

fundamentados por interações das forças de Van der Walls e ligações de hidrogênio,

pois estas contribuem bastante para alteração na entalpia que atua diretamente no

comportamento das proteínas (LOLADZE; ERMOLENKO; MAKHATADZE, 2002).

Figura 6- Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da lectina de folhas de B. cheilantha (BcL).

5.5.2. Efeito do pH na atividade hemaglutinante da lectina

Cada proteína possui um pH ideal para exercer sua atividade. Variações de

pH modificam a carga liquida das proteínas provocando repulsão eletrostática e

0

200

400

600

800

1000

1200

0 20 40 60 80 100 120

UH

. mL-1

Temperatura °C


51

rompimento de ligações de hidrogênio que estabilizam a estrutura proteica, levando

assim à desnaturação e perda da atividade biológica (LEHNINGER; NELSON; COX,

2000).

Com o intuito de verificar a estabilidade da lectina de B. cheilantha, sua

atividade hemaglutinante foi testada frente a variações do pH. Através desse ensaio,

constatou-se que esta proteína é resistente a uma ampla faixa de pH, sendo que na

faixa entre 6,5 e 8,0 observou-se maiores títulos de hemaglutinação (Figura 7).

Portanto, essa faixa é considerada ótima para a atividade dessa lectina.

Experiências semelhantes mostraram que a atividade hemaglutinante das lectinas

de B. ungulata e B. bauhinioides teve seus maiores valores em pH 6,0-8,0 e pH 8,0-

9,0, respectivamente (SILVA, et al., 2014.; SILVA et al., 2011).

Figura 7 - Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da lectina de folhas de B. cheilantha (BcL)

5.5.3. Efeito de cátions divalentes na atividade hemaglutinante da lectina

Segundo Silva e colaboradores (2014), a maioria das lectinas de leguminosas

depende de íons metálicos (Ca2+ e Mn2+) para exercer sua atividade hemaglutinante.

Estes íons são os responsáveis por estabilizar a ligação ao domínio de

reconhecimento de carboidrato (CRD) e fixar as posições dos resíduos de

aminoácidos que interagem com o carboidrato ligante.

Através dos ensaios observou-se que, a adição dos íons metálicos Ca2+ e

Mn2+ não afetaram a atividade hemaglutinante da lectina de B. cheilantha, mostrando

0

100

200

300

400

500

600

0 2 4 6 8 10 12 14 16

UH

. m

L-1

pH


52

que, diferente da maioria da lectinas de leguminosas, não necessita de íons

metálicos para exercer sua atividade ou esses íons, se presentes na estrutura da

proteína, estão fortemente ligados à molécula. Esse resultado é semelhante aos

obtidos em outras espécies do mesmo gênero, como B. variegata candida (SILVA et

al., 2007) e B. bauhinioides (SILVA et al., 2011) que também não tiveram suas

atividades afetadas pelo EDTA.

5.6. Atividade Antimicrobiana

5.6.1. Determinação de Concentração Inibitório Mínima (CIM) da BcL contra

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231,

Staphylococcus aureus ATCC 6538, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

e Escherichia coli ATCC 8739.

Através da determinação da CIM, observou-se que a BcL não inibiu o

crescimento das cepas P.aeruginosa, C.albicans, S.aureus, K.pneumoniae e E.coli,

possivelmente, os açúcares presentes na estrutura desses microrganismos não

estão expostos para o sítio ativo da lectina, ou até mesmo a ausência de atividade

pode ser devida à concentração adotada, a fatores ambientais ou somente ser

determinada em outras espécies de microrganismos que nesse estudo não foram

testados.

Apesar da BcL não ter apresentado atividade antimicrobiana, não significa

que ela é desprovida de outras atividades biológicas, pois a lectina de B. variegata

também não apresentou atividade antifúngica, mas possui atividade antiproliferativa

e atividade mitogênica (LIN; NG, 2008). Nascimento Neto e colaboradores (2011)

avaliaram o potencial de cura da lectina de B. variegata (nBVL) e sua isoforma

recombinante (rBVL-1) e concluíram que essa lectina pode ser utilizada no

tratamento de feridas cutâneas agudas. Já lectinas isoladas a partir das folhas de B.

monandra possuem atividade inseticida (MACEDO et al., 2007) e potencial

antioxidante (SISENANDO et al., 2009).

5.7. Espectrometria de Massa


53

Os resultados obtidos não foram conclusivos, pois não foi possível obter o

sequenciamento integral para todos os peptídeos. Todos os fragmentos,

provenientes da digestão foram introduzidos na base de dados MASCOT (versão

2.1.03), para comparação com sequências já descritas, e revelaram homologia, em

primeiro lugar, com a cadeia A da lectina I-B4 de Griffonia simplicifolia (LESCAR et

al., 2002), de massa molecular 28351 Da, e também com uma hipotética proteína de

Phaseolus vulgaris (. A analise do MASCOT revelou homologia dos peptídeos

trípticos da BcL obtendo uma cobertura de sequência proteica de 5% (Figura 8).

Apesar de não ter conseguido uma alta homologia entre os peptídeos analisados,

esse estudo deve ser continuado já que se trata de uma proteína ligante de

carboidrato.

Figura 8- Sequência de aminoácidos de Griffonia simplicifolia. Em vermelho está o

peptídeo homólogo a lectina de BcL (p < 0,05).

6. RESUMO DOS RESULTADOS


55

6. RESUMO DOS RESULTADOS

Através do estudo realizado, foi possível isolar, purificar e caracterizar

parcialmente a lectina proveniente de folhas de Bauhinia cheilantha através de

cromatografia em coluna de galactomanana. Tal lectina não mostrou especificidade

para eritrócitos de caprino, equino e ovino, porém aglutinou pobremente eritrócitos

bovino e fortemente hemácias de coelho. Sua atividade hemaglutinante foi inibida

por D-galactose e D-lactulose.

A lectina purificada é uma glicoproteína que não depende de cátions

divalentes para exercer sua atividade hemaglutinante; é resistente a uma ampla

faixa de pH e termoestável mantendo sua atividade mesmo após 30min de

incubação a 60°C. Apresentou um perfil eletroforético com uma banda de

aproximadamente 32 kDa semelhante às lectinas de outras espécies do gênero

Bauhinia. O perfil dos peptídeos trípticos, obtidos na espectrometria de massa,

revelou homologia com a cadeia A da lectina I-B4 de Griffonia simplicifolia de massa

molecular 28,351 kDa.

BcL não apresentou atividade antimicrobiana contra as cepas P.aeruginosa,

C.albicans, S.aureus, K.pneumoniae e E.coli. Apesar deste resultado, surge o

desafio de identificar se ela possui outro tipo de atividade biológica, já que a maioria

das espécies de bauhinia é dotada de potenciais atividades.


56

7. CONCLUSÃO


57

7. CONCLUSÃO

Esse estudo é de grade importância para espécies típicas do bioma Caatinga,

principalmente as do gênero Bauhinia, pois através dele foi possível isolar pela

primeira vez a lectina D-galactose ligante com massa molecular aparente de 32 KDa

das folhas de Bauhinia cheilantha, como também obter informações a respeito das

propriedades físico-químicas dessa proteína.

Outras perspectivas são realizar o seu sequenciamento e estudar a sua

estrutura tridimensional para que a partir daí seja possível entender o seu

mecanismo de ação. Sendo assim, este trabalho é fundamental para estudos futuros

desta espécie.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE


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72


73

10.034 - ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA LECTINA DA BAUHINIA CHEILANTHA (Bong.) Steud. NATIVA DO BIOMA CAATINGA.

Cruz, D. R. R. , Moraes, L. M. A. , Bezerra, G. S. , Felix, W. P. ,

Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido – UNIVASF

Introdução:

Lectinas são proteínas que se ligam especificamente e reversivelmente a mono ou

oligossacarídeos, mas são destituídas de atividade catalítica e, em contraste, com

anticorpos, não são produtos de uma resposta imune. O gênero Bauhinia é muito

utilizado com fins medicinais e, para algumas espécies, são atribuídas propriedades

antifúngicas, antibacterianas, antiinflamatórias e antidiabética.

Objetivos:

Isolar, purificar e caracterizar parcialmente lectina da Bauhinia cheilantha (Bong.)

Steud., espécie nativa do Bioma Caatinga ainda não plenamente estudada na região

do Vale do Rio São Francisco.

Métodos:

protocolo nº 0002/210114 O material vegetal (folhas) de Bauhinia cheilantha foi

coletado na cidade de Petrolina-PE. O extrato bruto foi obtido após a maceração

mecânica de 48 g de folhas frescas em 200 mL de tampão Tris- HCl pH 8,0 com

PVP 2% (v/v). Deixou-se sob agitação por 30 min e filtrou- se em gaze dupla. A

seguir, centrifugou-se a 2.500 × g por 20 min a 4° C e descartou-se o resíduo,

obtendo assim o Extrato bruto, que foi usado nos ensaios de hemaglutinação. Para

os ensaios de atividade hemaglutinante (U.H.) foram empregadas amostras de

eritrócitos de coelho (Oryctolagus cuniculus), da raça Nova Zelândia, cor branca,

sexo masculino com 4 kg e 4 meses de idade. Para determinação da U.H. no extrato

bruto foram utilizadas soluções a 2% (v/v) de eritrócitos de coelho tratados e não

tratados enzimaticamente (pepsina e tripsina). Os ensaios foram realizados com

volumes iguais do extrato bruto, diluídos seriadamente com solução salina (NaCl

0,15M) com e sem a adição de Mn++ e Ca++), incubando-os por 30 min a 38°C e


74

deixado-os em repouso por mais 30 min a temperatura ambiente e a determinação

da U.H. foi observada macroscopicamente.

Resultados:

A ligação da lectina oriunda do extrato bruto das folhas de Bauhinia cheilantha aos

carboidratos da superfície dos eritrócitos de coelho, tratados e não tratados,

promoveu a formação de uma rede que foi visível a olho nu. Os resultados foram

positivos na presença e na ausência de íons Ca2+ e Mn2+.

Conclusão:

A capacidade de hemaglutinação verificada no extrato bruto aponta para a presença

de lectina nas folhas de Bauhinia cheilantha e que essa lectina é independente de

Ca2+ e Mn2+, e também do tratamento enzimático.

Apoio Financeiro:

FACEPE/CNPq/FABESB/CAPES/UNIVASF


75

XII Reunião Regional Nordeste da SBBq Natal, RN, 01 a 03 de Dezembro de 2014

ISOLATION, PURIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL LECTIN

FROM Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud LEAVES IN THE CITY OF PETROLINA –

PERNAMBUCO – BRAZIL.

Cruz, D. R. R.1; Felix, W. P.1; Negreiros, C. R. P.1; Bezerra, G. S.1; Jurema, I. C. F.1; Sousa,

F. D.2; Moreira, R. A.2; Moreira, A. C. O. M.2;

1 Laboratory of Biochemistry (CCA) – UNIVASF, Petrolina, PE. Center for Experimental

Biology (Nubex) – UNIFOR, Fortaleza, CE. E.mail: [email protected]

Lectins, proteins or glycoproteins that reversible bind carbohydrates with distinct degrees of

selectivity, they are found in a variety of organisms (microorganisms, plants and animals)

being involved in numerous cellular processes. The Bauhinia genus is widely used for

medicinal purposes, and for some species, are attributeed antifungal, antibacterial, anti-

inflammatory and antidiabetic properties. In this study evaluated the presence of lectin from

Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud leaves, plant popular know with ―pata-de-vaca‖, native

species of the Caatinga.

Crude extract (1:10, w/v) in Tris-HCl 0.1M pH 7.8 buffer of leaves was obtained. The extract

was submitted to ammonium sulphate fractionation (F 0-90%), dialyse and hemaglutinating

assays (HA) with different types of erythrocytes (rabbit, bovine, sheep, goat and horse). The

selected fraction with leaves B. cheilatha lectin (BCL) was obtained in 50 mM Tris-HCl pH

7.8 buffer. Inhibition of hemagglutination: The following sugars were used to determine its

effect on the hemagglutination reaction: D-galactose, D-mannose, D-lactulose, D-glucose, D-

maltose, D-fructose and D- trehalose. The F 0-90% (NH4)2SO4 was then subjected to affinity

chromatography on Adenanthera pavonina cross-linked galactomannan, a matrix containing

terminal D-galactose. The purity degree was evaluated through polyacrylamide gel

electrophoresis (PAGE) to and native proteins or denatured.

BCL showed hemagglutinating high activity with rabbit and bovine erythrocytes and with

lower intensity sheep, goat and horse erythrocytes. Of the various sugars tested, the

hemagglutinating activity was partial inhibited by D-galactose, D-mannose and D-lactulose.

BCL was easily purified in a single step by affinity chromatography on A. pavonina cross-

linked galactomannan column. The bound protein eluted with 0.1 M glycine pH 2.6 buffer.

The purity and the profile molecular weight of the lectin was determined by PAGE after

heating either in the presence or absence of the reducing agent -mercaptoethanol. BCL

appears to be composed of single polypeptide chain weighing approximately 32 kDa.

Keywords: lectin; affinity chromatography; Bauhinia cheilantha

Supported by: CAPES/CNPq, FACEPE; UNIFOR, UNIVASF.


77

Journal of the Brazilian Chemical Society

ISOLATION, PURIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF A LECTIN FROM BAUHINIA

CHEILANTHA (BONGARD) STEUDEL LEAVES, NATIVE OF BIOME CAATINGA.

Journal: Journal of the Brazilian Chemical Society

Manuscript ID: Draft

Manuscript Type: Article

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Complete List of Authors: Felix, Wagner; Universidade Federal do Vale do São Francisco, Laboratório de Bioquímica

Keyword: Biological and Pharmacological Activities, OTHERS, Polymers Please, specify if the

submission is for a Regular Regular Issue Issue or Special Issue:

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ISOLATION, PURIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION

OF A LECTIN FROM Bauhinia cheilantha (BONGARD) STEUDEL LEAVES,

NATIVE OF BIOME CAATINGA.

CRUZ, D. R. R.

1; FELIX, W. P.

1*; BEZERRA, G. S.

1; SOUSA, F. D.

2; MORENO, F. B. M. B.

2;

LOBO, M. D. P.

2 ; MOREIRA, R. A.

2; MOREIRA, A. C. O. M.

2

1 Laboratory of Biochemistry (CCA) – UNIVASF, Petrolina, PE.

2 Center for Experimental Biology (Nubex) – UNIFOR, Fortaleza, CE.

*[email protected]



ABSTRACT

Lectins, proteins that reversible bind carbohydrates with distinct degrees of selectivity, they

are found in a variety of organisms being involved in cellular processes. In this work evaluated the

presence of lectin from Bauhinia cheilantha leaves. Extract in Tris-HCl 0.1M pH 7.8 buffer of

leaves were obtained and submitted to fractionation and hemaglutinating assays. The following

sugars were used to determine its effect on the hemagglutination reaction. The F 0-90% was then

subjected to affinity chromatography. The purity degree was evaluated through SDS-PAGE to and

native proteins or denatured. Of the various sugars tested, the hemagglutinating activity was partial

inhibited by D-galactose and D-lactulose. BcL was purified in a single step by affinity

chromatography. The bound protein eluted with 0.1 M glycine pH 2.6 buffer. The purity and the

profile molecular weight of the lectin were determined by PAGE to be composed of single

polypeptide chain weighing approximately 32 kDa.

Keywords: lectin; affinity chromatography; Bauhinia cheilantha.




INTRODUCTION

Lectins are proteins or glycoproteins of non-immune origin derived from plants, animals or

microorganisms that have specificity for terminal or subterminal carbohydrate residues. The main

characteristic of this class of proteins is their ability to interact with carbohydrates and thus combine

with glycocomponents of the cell surface, as well as with cytoplasmatic and nuclear structures and

the extracellular matrix of cells and tissues from throughout the animal and plant kingdoms, down

to bacteria and viruses1.

The lectins represent a large group of plant proteins. They have been found in less than 500

species, which indicates that only a limited number of higher plants contain detectable levels of

lectins2. The concentration of lectins in seeds varies considerably (from 1 to 10% of the total seed

protein). In some species, values to 50% have been reported, whereas in others lectins are barely

detectable with techniques currently used3.

The use of metabolically active proteins in plant taxonomy is well established. The presence

of seed lectins in tribes, genera and species of the same family has been reported and high

homology has been found between lectins from taxonomically diverse sources, which makes these

proteins a suitable molecular tool for chemotaxonomy studies4.

Plants of the genus Bauhinia are widely distributed in the tropics and are important for

animal nutrition because of their high protein content. Some species also have been used in folk

medicine for the treatment of diabetes and as a diuretic.

Previous studies have reported the isolation and characterization of a lectin from Bauhinia

purpurea (BPA) and their seeds contain a typical legume lectin that is purified by affinity

chromatography on immobilized N-acetyl-D-galactosamine5. BPA is useful for detecting galactose-

containing glycoconjugates and mucin-type sugar chains, and can also be used as a marker for

Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease6. Lectins have also been reported from leaves of

Bauhinia monandra7.

The isolation and characterization of novel lectins reveal properties which are of practical

importance for different areas of biological research. Therefore, the objective of this work was to

isolate and characterize a lectin from Bauhinia cheilantha leaves.



EXPERIMENTAL

Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel leaves were collected from plants growing in the city

of Petrolina-PE (Brazil). Taxonomic identification was carried out at the herbarium Federal

University of San Francisco Valley (Univasf).

Red blood cells from rabbit, bovine, sheep, goat and horse were obtained from animals

reared at the Animal Production Section, Univasf.

The agglutination of red blood cells by fractions obtained during purification was estimated

as described before8. Serial two-fold dilutions of lectin were carried out in small glass tubes using

0.15 M NaCl and 0.25 mL of erythrocyte suspension was then added. The degree of agglutination

was monitored visually after incubation at 37 ºC for 30 min and a further 30 min at room

temperature. One hemagglutination unit (H.U.) was defined as the reciprocal of the highest dilution

still causing a visible agglutination. The specific activity was expressed as hemagglutination units

(HU. mg-1

) and the minimum dose as the minimum amount of protein still promoting a visible

agglutination.

The protein concentration of the different fractions was measured according to Bradford9,

using bovine serum albumine (BSA) as standard. The absorbance at 280 nm was used to estimate

the protein concentration in column eluates. The carbohydrate concentration of the different

fractions was measured according to Dubois10

, using glucose as standard. The absorbance at 485 nm

was used to estimate the carbohydrate concentration.

Bauhinia cheilantha leaves were stirred with 0.1 M glycine-HCl pH 2.6, 0.1 M NaOAc pH

4.0, 0.1 M Fosfate pH 6.5, 0.1 M Tris-HCl pH 7.8 and 0.1M Na-borate buffer pH 10.0, all

containing 0.15 M NaCl. The suspensions were left at room temperature for 1 h then centrifuged at

13.400 g for 30 min at 4 ºC. The clear supernatants were used for determining the protein and

carbohydrate content and hemagglutinating activity.

Bauhinia cheilantha lectin was extracted by treating the leaves (500 g) with 0.1 M Tris-HCl

pH 7.8 containing PVPP at 2% (m/v) and β-mercaptoethanol 0,1% (v/v) at room temperature for 1 h

after centrifuging at 13.400 g for 30 min at 4 ºC. The clear supernatant was then precipitated by

addition of ammonium sulfate in the saturation levels 90% at room temperature overnight. The

precipitate was collected by centrifuging at 13.400 g for 30 min at 4 ºC and then dissolved in 0.1

M Tris-HCl pH 7.8.



The saline crude extracts were precipitated by (NH4)2SO4 (0-90% of saturation) and applied

to Adenanthera pavonina L. cross-linked galactomannans column equilibrated with Tris-HCl 50

mM pH 7,8 buffer. After elution of the non-retained fraction, the lectin was eluted with pH 2.6, 0.1

M Glycine-HCl buffer, containing 0.15 M NaCl. The clear supernatants were dialysed against water

and lyophilized.

The polyacrylamide gel electrophoresis was performed in 2 mm thick vertical slab gels,

according to the method of Laemmli11

, using 3.95% and 12.5% stacking and running gels,

respectively. Samples were dissolved in 0.0625 M Tris-HCl pH 6.8, containing 2% SDS buffer and

1% β-mercaptoethanol then incubated at 100 ºC for 10 min. A few crystals of sucrose were

dissolved in the samples which were then applied to the gel. Electrophoresis was carried out at a

constant current of 20 mA for 3 h. The protein bands were visualized by staining the gel with

Coomassie Brilliant Blue-R 250. Estimations of the Mr of the lectin and fragments were based on

comparisons using LMW Calibration kit for SDS Electrophosis as a standard.

The carbohydrate-binding specificity of the lectin was estimated by the ability of a series of

single sugars to inhibit the hemagglutination of rabbit erythrocytes. Two-fold dilutions of sugars in

0.15 M NaCl were mixed with 0.25 mL of lectin solution at a concentration such that a two-fold

dilution would give the end point agglutination in the absence of inhibitor. The lowest concentration

of the sugar giving full inhibition was determined.

The purified lectin (1 mg) was dissolved and dialyzed dialysed exhaustively (48 h) against

0.2 M EDTA, followed by dialysis against 0.15 M NaCl. Hemagglutinating activity was recovered

by adding CaCl2 and MnCl2.

The heat stability of the hemagglutinating activity was determined by incubating the lectin at

different temperatures during different times and the residual activity determined.

Antibacterial activity of Bauhinia cheilantha lectin (BcL) was assayed against Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Escherichia

coli. All media were steam sterilized at 120°C for 20 min. To assay the inhibition of bacterial

growth, the tested bacteria were homogeneously seeded with a sterile hissope on to Petri dishes

containing 15 ml of the medium. Holes (7 mm in diameter) were aseptically bored into the agar

with a hollow punch and were filled up with 25 ml of each BcL at different concentrations (2

mg.mL-1

; 1 mg.mL-1

and 0.1 mg.mL-1

). The plates were examined after incubation at 37ºC for 24 h.



After this period visual inspection of bacterial growth and to read absorbance Bio-Tek ELISA

apparatus at 620 nm was performed. The determination of microorganisms in inoculum was

performed by colony counts on agar Plate-Count.

RESULTS AND DISCUSSION

Bauhinia cheilantha is a widespread plant, common in tropical and sub-tropical regions,

occurring in forests in northeastern Brazil. B. cheilantha belongs to the family Fabaceae, sub-family

Caesalpinioideae, tribe Cercidae, sub-tribe Cercidinae and genus Bauhinia. In Brazil, this species is

commonly called "mororó".

The influence of pH on the solubility of the proteins and hemagglutinating activity of B.

cheilantha was examined (Fig. 1). A maximum protein content was found at pH 6.0 until 8.0 and a

minimum content at pH 2.0, 4.0 and 10.0. The maximum hemagglutinating activity occurred at pH

7.8.

600

500

-1 400

ML

300

UH

.

200

100

0

1 3 5 7 9 11 13 PH

Figure 01 – Influnce of pH on the hemmagglutinating activity of Bauhinia cheilantha lectin (BcL). The purification of B. cheilantha lectin is summarized in Table 1. Table 1. Purification of the Bauhinia cheilantha lectin. Volume Protein Total Protein a b c Fold

Steps (mL) (mg.mL-1

) (mg) AH AHT AHE Purification

Crude 500 0.55 275 256 128,000 465.45 1

Extract

F 0-90 58 0.57 33.06 512 29,696 898.24 1.93



PII 25 0.52 13 4.096 102,400 7,876.92 16.92

a Hemagglutinating activity was performed with red blood cells from rabbit 2% v/v).

b

Total hemagglutinating activity = AH × volume (mL). c Specific hemagglutinating activity = AH. Protein

-1 (mg.mL

-1).

The purified B. cheilantha lectin strongly agglutinated rabbit erythrocytes and weakly

bovine erythrocytes. Erythrocytes from sheep, goat and horse were not agglutinated.

The hemagglutinating activity of the B. cheilantha lectin was inhibited by D-galactose

(0,976 mM) and lactulose (1,953 mM) but was not inhibited by D-glucose, lactose, maltose, D-

mannose, saccharose, D-fructose and trehalose a concentration of up to 500 mM. This

carbohydrate-binding specificity is also characteristic of the other lectin isolated from Bauhinia

genus5,7,12

.

The hemagglutinating activity was not affected by the presence of Ca2+

and Mn2+

(1, 3, 5, 7

and 10 mM). This result is similar to those obtained in other species of the same genus as B.

variegata ‘candida’13

and B. bauhinioides14

which also did not have their activities affected by

EDTA.

The B. pentandra lectin was thermostable: hemagglutinating activity was retained even after

incubation at 60 ºC for 30 min. However, the activity was completely lost at higher temperatures

(65-100 ºC) even after incubation for just 30 min (data not shown). Similar results were observed in

the lectin B. bauhinioides14

and lectin obtained from the secondary roots of B. monandra15

. Lectins

Bauhinia pentandra16

and Bauhinia forficata17

proved to be more stable and maintained their

hemagglutinating activity after incubation for 30 min at 70 to 100° C. respectively.

Polyacrylamide gel electrophoresis of the lectin, treated with SDS and β-mercaptoethanol

gave only one protein band with an apparent molecular mass of 32 kDa (Fig. 2). In the absence of β-

mercaptoethanol, the B. pentandra lectin also showed only one band.



Figure 2. Electrophoresis profile SDS polyacrylamide gel of the purified lectin B. cheilantha (32 kDa). Lane 1:

molecular markers: phosphorylase b (97.0 kDa), BSA (66 kDa), ovalbumin (45 kDa), carbonic anhydrase (30.0 kDa),

trypsin inhibitor (20.1 kDa), α-lactalbumin (14, 4 kDa). Wells 2 e 3 represent BcL (20 µg) heated at 100° C for 10min

minutes in the absence and presence of β-mercaptoethanol, respectively.

Through the determining the CIM, it was observed that BcL not inhibit the growth of P.

aeruginosa, C. albicans, S. aureus, E. coli and K. pneumoniae strains. Possibly these strains are not

present in their carbohydrate capsules, cell walls or even the flagella that are specific for this lectin

and therefore it was not able to bind to cells and these sugars are present in the structure of the

microorganisms, are not exposed to the active site lectin, or even no activity can be adopted due to

concentration or environmental factors. Despite the BcL not presented antimicrobial activity, does

not mean it is devoid of other biological activities because the lectin B. variegata also showed no

antifungal activity, but has antiproliferative and mitogenic activity (LIN; NG, 2008). It has been

reported the healing potential of lectin Bauhinia variegate (nBVL) and its recombinant isoform

(rBVL-1) and concluded that this lectin can be used for treating acute wounds18

. Already lectins

isolated from Bauhinia monandra leaves have insecticidal activity19

and antioxidant potential20

.

The results obtained in this study were of great importance for the unpublished isolation of

the lectin from Bauhinia cheilantha leaves in which it was possible to obtain relevant information

about the physico-chemical properties of this protein. This work is essential for future studies of this

species.



ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by grants from Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES), Universidade de Fortaleza (UNIFOR) and Fundação Universidade

Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF).

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