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Espectofotometria, purificação e caracterização de proteínas

2014

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Absorção de luz por moléculas: a Lei de Lamber t-Beer

• Ampla variedade de biomoléculas absorve luz em comprimentos de onda característicos;

• A medida de espectrofotômetro é utilizada para detectar e identificar moléculas e para medir suas concentrações em solução;

• Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm;

• A medição da luz absorvida por uma biomolécula através do espectrofotômetro é usada para detectar, identificar e quantificar moléculas num determinado material biológico;

• Para tanto deve-se levar em consideração a Lei de Lambert-Beer.

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Espectrometria de absorção atômica

Definição: Consiste na medida da absorção da energia luminosa por átomos no estado fundamental nas regiões do visível a ultravioleta.

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Espectrometria de absorção atômica

Relação entre radiação e concentração

Lei de Beer

A= a.b.c = Log Io/I

A: absorbância ; a: absortividade; b: percurso ótico; c: concentração molar

5Lei de Lambert-Beer

• Quanto maior a concentração (c) ou maior o caminho óptico (b) maior será a absorbância da amostra, por isso geralmente o b é padronizado em 1 cm.

• Exemplo:

– com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbância de uma solução com concentração 0,002 mol L-1 de uma substância com absortividade molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma célula com 2,00 cm de caminho óptico.

A = a.b.c

A= 313 L mol-1 . 2,00 cm . 0,002 mol L-1

A= 1,252

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Pico máximo de absorção de luz

• Toda biomolécula apresenta um comprimento de onda específico onde a absorção de luz é máxima.

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Trabalhando com proteínas

Para se estudar uma proteína detalhadamente deve-se separá-la de outras proteínas em sua forma pura;

Proteínas devem ser purificadas para ser caracterizada quanto as suas propriedades e atividades.

Hemoglobina

8Purificação de proteínas

Necessário fonte de proteínas (tecido ou células);

Romper estas células, liberando suas proteínas em uma solução (extrato bruto);

Centrifugar se necessário para preparar frações subcelulares;

Uma vez com o extrato pronto, diversos métodos estão disponíveis para a purificação. Exemplos: Diálise, Fracionamento (cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de afinidade e cromatografia líquida de alta eficiência -HPLC).

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Purificação de proteínas

Método de Diálise: É um processo que separa proteínas de pequenos solutos

se aproveitando do maior tamanho das proteínas;

O extrato parcialmente purificado é colocado em um saco ou tubo feito de uma membrana semi-permeável;

Ele é suspenso em um volume muito maior de solução tampão de força iônica apropriada, a membrana permite a troca de sal e tampão, mas não de proteínas.

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Purificação de proteínas

Método de Fracionamento: É utilizado diferenças na solubilidade proteica, onde a

mesma é reduzida em elevadas concentrações salinas, um efeito denominado salting out de proteínas;

As proteínas que então precipitam são removidas daquelas que permanecem em solução por centrifugação em baixa velocidade.

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Purificação de proteínas

Cromatografia em coluna: Tem como base diferenças no tamanho,carga, afinidade

de ligação e outras propriedades;

Um material sólido poroso com propriedades químicas apropriadas é mantido em uma coluna, pela qual é percolada uma solução tampão;

A solução contendo a proteína depositada no topo da coluna percola o material sólido poroso dentro da solução tampão.

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13Purificação de proteínas

Cromatografia de troca iônica: Explora as diferenças no sinal e na magnitude da carga

elétrica líquida de proteínas em um dado pH.

A matriz da coluna é polímero sintético (resina) contendo grupos carregados ligados (trocadores de cátions ou trocadoras de ânions);

A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na coluna é afetada pelo pH e pela concentração de íons de sais livres.

Enquanto a solução contendo proteínas permanece na coluna, frações deste efluente são coletadas em tubos teste (cada fração pode ser testada para a presença de proteína de interesse)

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15Purificação de proteínas

Cromatografia de afinidade: Tem como base a afinidade de ligação;

Os grânulos da coluna possuem um grupo químico covalentemente ligado (ligante);

Quando uma mistura de proteinas é adicionada a coluna, qualquer proteína com afinidade por este ligante se liga aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada;

As proteínas que não se ligam são lavadas na coluna, e a proteína ligada é eluida com a solução contendo uma concentração elevada de sal quanto do ligante livre.

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Purificação de proteínas

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high perfomance liquid chromatography):

Utiliza bombas de alta pressão que aceleram o movimento das moléculas de proteína através da coluna;

Ao reduzir o tempo de trânsito na coluna, a HPLC pode limitar o espalhamento difusional das bandas de proteína e assim aumentar significativamente a resolução (Ver cromatografia em coluna).

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Caracterização de proteínas

Caracterização por eletroforese: Baseado em migração de proteínas carregadas em um

campo elétrico;

A eletrofoese permite a determinação de propriedades críticas (ponto isoelétrico e massa molecular estimada);

Para eletroforese de proteínas é utilizado géis de poliacrilamida (peneira molecular), retardando a migração de proteínas na proporção de sua relação carga-massa;

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Caracterização de proteínas - eletroforese

Um método eletroforético utilizado faz uso do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS, sodium dodecyl sulfate);

O SDS se liga a grande maioria das proteínas onde contribui com uma grande carga negativa e conferindo para cada proteína uma carga-massa semelhante;

Na eletroforese o SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na massa molecular;

As proteínas são visualizadas pela adição de corantes (azul de Coomassie) que liga-se as proteínas e não ao gel.

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Na maioria dos casos vários métodos precisam ser utilizados sequencialmente para purificar uma proteína por completo pois cada método separa as proteínas com base em diferentes propriedades;

Diversas estratégias podem ser tentadas até que seja encontrada a mais eficiente;

Protocolos de purificação publicados estão disponíveis para muitos milhares de proteínas;

Métodos de baixo custo devem ser utilizados primeiro ( volume e número de contaminantes e maior);

Métodos cromatográficos são impraticáveis nos estágios iniciais já que a quantidade de meio cromatográfico cresce com o tamanho da amostra;

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Conforme casa passo de purificação é completado, o tamanho da amostra se torna menor, tornando acessível o uso de procedimentos cromatográficos.

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Referência

NELSON, D. L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. - 5. ed. -Porto Alegre: Artmed, 2011.