met poa slav 39 02 proteina bruta

7/26/2019 MET POA SLAV 39 02 Proteina Bruta

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MAPA/SDA/CGALLaboratrio Nacional Agropecurio - LANAGRO/RSLaboratrio de Produtos de Origem Animal/SLAVMtodo de Ensaio - MET

Cdigo: MET POA/SLAV/39/02/01Pgina 1 de 12Emisso: 24/07/2014

Determinao de protena bruta em produtos de origem animal por acidimetria

1 Escopo

Este mtodo tem por objetivo determinar o teor de protena bruta de produtos de origem animal.

Aplica-se a amostras nitrogenadas de origem orgnica e inorgnica, com exceo de nitratos e

nitritos.

2 Fundamentos

O mtodo se baseia na digesto das protenas e outros compostos nitrogenados com cidosulfrico concentrado a quente, em presena de catalisador, liberando o carbono como gs

carbnico, o hidrognio como gua e transformando o nitrognio em amnia (NH3), que fixado

na forma de sulfato de amnio. O sulfato de amnio resultante, na presena da soluo

concentrada de hidrxido de sdio, libera amnia, que recebida na soluo de cido brico e

titulada com cido sulfrico de ttulo conhecido. Os resultados so expressos como protena bruta,

multiplicando-se a porcentagem do nitrognio total por fatores especficos.

3 Reagentes, padres e materiais

Todos os reagentes so de grau analtico (p.a.), exceto quando especificado. Toda a gua

utilizada nos procedimentos destilada/deionizada, exceto quando especificada.

3.1 Reagentes

cido brico (H3BO3);

cido clordrico (HCl);

cido sulfrico (H2SO4);

Etanol (CH3CH2OH);

Hidrxido de sdio (NaOH);

Sulfato de amnio ((NH4)2SO4);

Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O);

Sulfato de sdio anidro (Na2SO4) ou sulfato de potssio anidro (K2SO4);

Verde de bromocresol (C21H14Br4O5S);

Vermelho de metila (C15H15N3O2).


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3.2 Padres

Carbonato de sdio (Na2CO3), material de referncia.

3.3 Materiais

Bales volumtricos (1000 mL);

Bureta graduada ou titulador automtico;

Erlenmeyers de 125 ou 250 mL;

Gral de porcelana com pistilo;

Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrognio);

Provetas de 50, 100 e 250 mL;

Tubos de vidro compatveis com sistemas micro e macro-Kjeldahl.

4 Equipamentos Balana analtica, com preciso mnima de quatro casas decimais;

Bloco digestor;

Destilador micro ou macro-Kjeldahl;

Forno-mufla.

5 Precaues analticas

Este mtodo emprega substncias qumicas nocivas e procedimentos que podem representarrisco ao operador. Todos os procedimentos devem ser realizados com uso de equipamentos de

proteo individual e uniforme apropriado. O preparo das solues reagentes deve ser feito em

capela de exausto.

Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biolgico, evitando-se o

contato direto com pele e mucosas.

6 Procedimentos


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As operaes devero ser registradas no formulrio Dados brutos, Anexo A do POP

POA/SLAV/15 Procedimentos de rotina na anlise fsico-qumica de produtos de origem animal.

Realizar o ensaio em duplicata.

6.1 Preparo de solues e reagentes

6.1.1 Mtodo micro-Kjeldahl

6.1.1.1 Mistura cataltica

Juntar dez partes de sulfato de sdio (ou potssio) anidro e uma parte de sulfato de cobre

pentahidratado. Triturar em gral, homogeneizar e armazenar em frasco identificado.

6.1.1.2 Soluo de hidrxido de sdio 50% (m/v)

Em um bquer, sobre banho de gelo, dissolver lenta e cuidadosamente 500 g de hidrxido de

sdio em aproximadamente 800 mL de gua. Esperar esfriar. Transferir para balo volumtrico

de 1 L e completar volume com gua.

6.1.1.3 Indicador misto

Pesar 0,132 g de vermelho de metila e 0,06 g de verde de bromocresol. Dissolver em 200 mL de

lcool etlico 70% (v/v). Filtrar se necessrio e guardar em frasco mbar.

6.1.1.4 Soluo de cido brico 4% (m/v)

Dissolver 40,00 g de cido brico em 800 mL de gua quente. Homogeneizar. Deixar esfriar,transferir para um balo de 1000 mL, adicionar 8 mL de indicador misto e avolumar.

6.1.1.5 Soluo de cido sulfrico 0,05 M (mol/L)

Na capela de exausto, transferir cuidadosamente 2,70 mL de cido sulfrico para balo

volumtrico de 1000 mL, contendo aproximadamente 400 mL de gua. Deixar esfriar e completar

o volume.

6.1.1.6 Soluo hidro-alcolica de vermelho de metila 0,1% (m/v)


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Em um balo volumtrico de 100 mL, dissolver 0,1 g de vermelho de metila em 40 mL de etanol.

Completar o volume com gua. Homogeneizar e armazenar em frasco mbar identificado.

6.1.1.7 Soluo de cido clordrico (HCl) 0,1 M (mol/L)

Na capela de exausto, adicionar com cuidado e lentamente pelas paredes de um balo de 1000

mL contendo 10 mL de gua deionizada, 8,35 mL de cido clordrico, com auxlio de uma pipeta.

Completar o volume com gua deionizada e transferir a soluo preparada para frasco de vidro e

rotular. Essa soluo poder ser armazenada temperatura ambiente.

6.1.2 Mtodo macro-Kjeldahl

6.1.2.1 Mistura cataltica

Conforme item 6.1.1.1.

6.1.2.2 Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 32% (m/v)

Em um bquer, sobre banho de gelo, dissolver cuidadosamente 320 g de hidrxido de sdio em

cerca de 800 mL de gua. Esfriar. Transferir para balo volumtrico de 1 L e completar volume.

6.1.2.3 Soluo de cido brico (H3BO3) 2% (m/v)

Dissolver 20,00 g de cido brico em 700 mL de gua quente. Homogeneizar. Deixar esfriar,

transferir para um balo de 1000 mL e avolumar.

6.1.2.4 Soluo de cido sulfrico (H2SO4) 0,05 M


6.1.2.5 Soluo de cido clordrico (HCl) 0,1 M


6.2 Digesto



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Pesar, em balana analtica, cerca de 0,25 g de amostra em papel de pesagem e transferir para o

tubo. Adicionar aproximadamente 2,5 g de mistura cataltica e 7 mL de cido sulfrico. Aquecer

em bloco digestor, realizando uma rampa conforme tabela 1, at o lquido se tornar lmpido e

transparente, de tonalidade azul-esverdeada. Deixar esfriar. Adicionar um pouco de gua apenas

para limpar as paredes do tubo.

Tabela 1. Rampa de aquecimento para digesto de amostras para determinao de protena

bruta (mtodo micro-Kjeldahl).ETAPA TEMPERATURA TEMPO1 50C 30 minutos2 100C 20 minutos3 150C 20 minutos4 200C 20 minutos5 250C 20 minutos67

300C350/420C*

20 minutosAt clarear

* Para produtos lcteos manter a 350C; outros produtos: 420C.


Pesar aproximadamente entre 0,5 g e 1 g de amostra homogeneizada e transferir para tubo

macro-Kjeldahl identificado. Adicionar aproximadamente 5 g de mistura cataltica e 20 mL de

cido sulfrico concentrado. Se a amostra for muito gordurosa, adicionar 30 mL de cido

sulfrico. Aquecer a 420C at que o contedo dos tubos clareie por completo. Se necessrio,

fazer rampa de aquecimento (tabela 2). Se, aps digesto, as amostras no forem imediatamente

destiladas, adicionar 20 mL de gua.

Tabela 2. Exemplo de rampa de aquecimento para digesto de amostras de leite e derivados paradeterminao de protena bruta (mtodo macro-Kjeldahl).

ETAPA TEMPERATURA TEMPO1 150C 15 a 20 minutos2 300C 15 a 20 minutos3 400C 20 minutos4 420C At clarear

6.3 Destilao e titulao



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Levar ao destilador de nitrognio um erlenmeyer contendo 50 mL de soluo de cido brico 4%

com indicador misto. Acoplar o tubo de micro-Kjeldahl ao destilador.

Adicionar a soluo de hidrxido de sdio 50% (aproximadamente 20 mL) at obter uma soluo

de cor negra, que indicativa da neutralizao da reao.

Proceder destilao. Recolher o volume necessrio para a completa destilao da amnia.

Pode-se testar o ponto final da destilao com papel indicador de pH at que no ocorra mais

reao alcalina. A soluo coletora deve ser mantida fria durante a destilao.

A titulao poder ser realizada com soluo fatorada de cido sulfrico 0,05 M ou de cido

clordrico 0,1 M.

Digerir, destilar e titular uma prova em branco, com todos os reagentes exceto com a amostra.

Amostras com alto teor de gordura ou que formem espuma durante a digesto ou destilao

podem ser adicionadas de algumas gotas de anti-espumante.


Levar os tubos ao conjunto de destilao/titulao, operando-o conforme instruo de uso.

Recolher o destilado em cido brico 2% (m/v) e titular. A titulao poder ser realizada com

soluo fatorada de cido sulfrico 0,05 M ou de cido clordrico 0,1 M, at indicao da viragem

pelo equipamento.

Digerir, destilar e titular uma prova em branco, com todos os reagentes exceto com a amostra.

Amostras com alto teor de gordura ou que formem espuma durante a digesto ou destilaopodem ser adicionadas de algumas gotas de anti-espumante.

6.4 Padronizao da soluo titulante

A padronizao da soluo titulante dever ser registrada no formulrio Padronizao da soluo

titulante, Anexo D do POP POA/SLAV/09 Controle de reagentes, preparo de solues, curvas de

calibrao e padronizao de solues titulantes.

6.4.1 Soluo de cido sulfrico 0,05 M

Realizar a padronizao em triplicata.


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Colocar cerca de 5 g de Na2CO3em cadinho de porcelana de 50 mL.

Comprimir a substncia contra as paredes do cadinho, com uma esptula.

Aquecer a 300C, durante duas horas utilizando um forno mufla. Transferir o Na2CO3 para um

dessecador e deixar esfriar.

Pesar adequadamente (com ajuda de papis de seda), em um erlenmeyer de 250 mL, cerca de

0,130 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de gua deionizada e trs gotas de soluo de

vermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com soluo de cido sulfrico 0,05 M. Calcular o fator de

correo (f) utilizando a seguinte frmula:

Onde:

m = massa (g) de carbonato de sdio;

V = volume (mL) da soluo de cido sulfrico gasto na titulao;

M = concentrao (molaridade) da soluo de acido sulfrico utilizada.

6.4.2 Soluo de cido clordrico 0,1M

Realizar a padronizao em triplicata.

O procedimento de tratamento do sal (Na2CO3) e o clculo do fator de correo (f) devero ser

realizados conforme o item 6.4.1.

Pesar adequadamente (com ajuda de papis de seda), em um erlenmeyer de 250 mL, cerca de

0,132 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de gua deionizada e uma gota de soluo devermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com soluo de cido clordrico 0,1 M.

6.5 Teste de recuperao de nitrognio


Triturar o sulfato de amnio em gral e secar em estufa a 102C por quatro horas. Em um tubo de

destilao, pesar 0,15 g de sulfato de amnio. Adicionar ao tubo 2,5 g de mistura cataltica e

cerca de 7 mL de cido sulfrico. Levar o tubo para a digesto junto com as amostras realizando

o mesmo procedimento. Aps a digesto, levar ao destilador de nitrognio realizando o mesmo


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procedimento de uma amostra. Aps a destilao, titular o recuperado e calcular o percentual de

nitrognio recolhido (% Nr) atravs da seguinte frmula:

Onde:

% Nr= percentual de nitrognio recolhido;

V = volume gasto de soluo titulante (mL);B = volume do branco (mL);

m = massa de sulfato de amnio (g);

CT = concentrao terica (molaridade) da soluo titulante;

FC = fator de correo da soluo titulante


Triturar o sulfato de amnio em gral e secar em estufa a 102C por quatro horas. Em um tubo dedestilao, pesar 0,25 g de sulfato de amnio. Adicionar 5 g de mistura cataltica e 20 mL de cido

sulfrico. Proceder digesto. Destilar e titular conforme programao do equipamento (com

adio automtica de gua e de hidrxido de sdio). Calcular o percentual de nitrognio recolhido

(% Nr) conforme item 6.4.1.

6.5.3 Recuperao em funo da pureza do sulfato de amnio

O resultado da recuperao (% Nrec) deve ser maior que 99,5%, calculado pela seguinte frmula:

Onde:

% Nr= percentual de nitrognio recolhido;

% N = percentual de nitrognio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amnio (tabela 3).

Tabela 3. Percentual de nitrognio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amnio, para

avaliao da recuperao na determinao de protena bruta (mtodos macro e micro-Kjeldahl).GRAU DE PUREZA PERCENTUAL DE NITROGNIO99,5% 21,09%99,6% 21,12%


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99,7% 21,14%99,8% 21,16%99,9% 21,18%

7 Resultados

Em casos de funcionamento inadequado do equipamento, quebra de tubos ou perda de amostra

durante a realizao do ensaio, os resultados so desconsiderados e o ensaio repetido.

Os resultados so aceitos se observadas todas as precaues analticas e se realizados todos os

procedimentos em conformidade com este mtodo.

7.1 Clculos e expresso dos resultados

O resultado a ser expresso a mdia das duplicatas, em g.100g-1 de protena bruta deve ser

calculado de acordo com as frmulas abaixo:

7.1.1 Clculo do nitrognio total:

Onde:

V = volume de soluo titulante (mL) gasto na titulao;

B = volume gasto (mL) na titulao da prova em branco;

CT = concentrao terica (molaridade) da soluo titulante;

FC = fator de correo da soluo titulante;

m = massa de amostra (g).

7.1.2 Clculo da protena bruta (g.100g-1):

Onde:

PB = protena bruta (g.100 g-1);

% N = nitrognio total;

FE = fator emprico (Tabela 4).

Tabela 4. Fatores empricos de transformao do nitrognio em protena, para clculo da protenabruta de amostras de alimentos pelos mtodos macro e micro-Kjeldahl.


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ALIMENTO FATOR EMPRICOLeite e derivados 6,38Trigo e derivados 5,83Outros alimentos 6,25

Os clculos so realizados atravs da planilha Clculos - Determinao de protena bruta

(Anexo A).

7.1.3 Relao umidade/protena (U/P):

Onde:

Um = Umidade mdia (g.100g-1), determinada conforme MET POA/SLAV/27;

PBm = protena bruta mdia (g.100g-1).

7.2 Validao da planilha

A planilha Clculos Determinao de protena bruta deve ser validada conforme descrito noPOP POA/SLAV/15, atravs de clculos manuais os quais devem ser registrados no formulrio

Validao de planilhas eletrnicas, Anexo M do POP POA/SLAV/15.

8 Arquivamento dos registros

A planilha de clculo deve se mantida protegida na pasta eletrnica Resultados. O formulrio de

validao da planilha de clculos deve ser arquivado conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o

formulrio de padronizao da soluo titulante conforme POP POA/SLAV/09.

9 Referncias

BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Mtodos analticos fsico-

qumicos para controle de produtos crneos e seus ingredientes, sal e salmoura. Instruo

Normativa n. 20, de 21de julho de 1999. Braslia: Dirio Oficial da Unio, Seo 1, de 27 de julho

de 1999.

BRASIL. Ministrio da Agricultura e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Instruo

Normativa n 68 de 12 de dezembro de 2006. Mtodos analticos fsico-qumicos para

controle de leite e produtos lcteos.Braslia: Dirio Oficial da Unio, 14/12/2006.


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10 Anexos

Anexo A MET/POA/SLAV/37/01 Planilha Clculos Determinao de protena bruta.

11 Alteraes

Substituda concentrao do cido sulfrico de 0,1 N por 0,05 M;

Item 1: excludono Laboratrio de Produtos de Origem Animal POA/SLAV;

Item 3.1: includo cido clordrico (HCl);Item 6: excludoDados brutos Determinao de protena bruta (Anexo A)., includoDados

brutos, Anexo A do POP POA/SLAV/15 - Procedimentos de rotina na anlise fsico-qumica de

produtos de origem animal;

Item 6.1.1.5: includoNa capela de exausto;

Itens 6.3.1 e 6.3.2: includocido clordrico 0,1 M;

Item 6.4: includo A padronizao da soluo titulante dever ser registrada no formulrio

Padronizao da soluo titulante, Anexo D do POP POA/SLAV/09 - Controle de reagentes,

preparo de solues, curvas de calibrao e padronizao de solues titulantes;

Itens 6.4.1 e 6.4.2: includos;

Item 7.1: excludo O clculo realizado atravs das planilhas eletrnicas Clculos

Determinao de protena bruta (Anexo B) disponvel no computador da unidade. Includo O

resultado a ser expresso a mdia das duplicatas, em g.100g-1 de protena bruta e deve ser

calculado de acordo com as frmulas abaixo;

Item 7.2: excludoquinzenalmente, atravs de clculos manuais que devem ser registrados no

formulrio Validao da planilha de clculos - Determinao de protena bruta (Anexo C).

Includo validada conforme descrito no POP POA/SLAV/15, atravs de clculos manuais os

quais devem ser registrados no formulrio Validao de planilhas eletrnicas, Anexo M do POP

POA/SLAV15;

Item 8: excludos O formulrio Dados Brutos Determinao de protena bruta deve ser

arquivado na pasta Dados Brutos e O formulrio de Validao da Planilha de Clculos

Determinao de protena bruta deve ser arquivado na pasta Validao de Planilha de Clculos

da unidade. Includo O formulrio de validao da planilha de clculos deve ser arquivado


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conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o formulrio de padronizao da soluo titulante

conforme POP POA/SLAV/09;

Item 10: excludosAnexo A MET/POA/SLAV/37/01 Formulrio Dados Brutos Determinao de

protena bruta e Anexo C MET/POA/SLAV/37/01 Formulrio Validao da planilha de clculos -

Determinao de protena bruta. SubstitudoAnexo B porAnexo A;

Anexo A: Formulrio Dados Brutos Determinao de protena bruta substitudopela planilha

Clculos Determinao de protena bruta;

Anexo B: agora Anexo A. Excludoscampos: referente a recuperao do nitrognio e a data;

Anexo C: Formulrio Validao da planilha de clculos - Determinao de protena bruta,

excludo.

No h necessidade de complemento de relatrio de confirmao de desempenho em

funo das alteraes realizadas.

12 Responsabilidades

O Responsvel pelo POA/SLAV deve garantir a elaborao, aprovao, emisso, distribuio de

cpias, implementao, capacitao do pessoal para execuo, gerenciamento de no

conformidades, anlise crtica e reviso deste MET.

A UGQ responsvel pela verificao deste MET.

Elaborao/Reviso: Aprovao: Verificao:

Ana Paula Pereira de Melo POA/SLAV Cristhiane Cattani POA/SLAV Rosane Carlessi UGQ

Data: 21/07/2014 Data: 21/07/2014 Data: 24/07/2014

met poa slav 39 02 proteina bruta

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