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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009

AVALIAÇÃO DA AÇÃO CLASTOGÊNICA DO ÓLEO DE Cnidoscolus phyllacanthus

(Mart.) Pax. et K. Hoffm EM CÉLULAS MEDULARES

João Pordeus Neto1; Onaldo Guedes Rodrigues2;Ednaldo Queiroga de Lima2; Maria das graças Veloso Marinho2; José Pires Dantas3

RESUMO Este trabalho teve o propósito de investigar o potencial toxicológico de Cnidoscolus phyllacanthus (faveleira), por meio de teste de metáfase em células de medula óssea de camundongos. Para tal, utilizou-se o óleo essencial da planta e um fármaco de ação antineoplásica Ciclofofsfamida (CPA 1.000mg em 100mL (m/v)), que foram inoculados por via intraperitonial em camundongos heterogêneos (Mus músculos). Foram utilizados 5 animais, sendo que 3 foram inoculados com o óleo essencial, 1 com CPA (grupo controle positivo) e 1 animal apenas com água destilada (grupo controle negativo). Foram analisadas 250 células por lâmina, e 04 lâminas para cada dose, totalizando 1.000 células analisadas, mais 250 células para o grupo controle sem a droga. Os resultados obtidos neste modelo revelam que o óleo de faveleira não provocou danos nas células medulares de camundongos.

Unitermos: Mutagênese, citotoxicidade, danos cromossomais, floresta da Caatinga.

ASSESSMENT OF OIL IN ACTION clastogenic Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. K. et Hoffm IN CELLS MEDULAR

ABSTRACT This work was the purpose of investigating the potential impact of Cnidoscolus phyllacanthus (faveleira) through test of metaphase cells in the bone marrow of mice. To this end, we used the essential oil of the plant and a drug antineoplastic Ciclofofsfamid of action (CPA 1.000mg in 100mL (m/v)), which were inoculated in mice by i.p. heterogeneous (Mus muscles). 5 animals were used, while 3 were inoculated with the essential oil, 1 with CPA (positive control group) and 1 animal only with distilled water (negative control group). We analyzed 250 cells per slide, and 04 slides for each dose, totaling 1.000 cells analyzed, additional 250 cells in the control group without the drug. The results of this model show that the oil faveleira did not cause damage to bone marrow cells of mice.

Uniterms: Mutagenesis, cytotoxicity, chromosomes damage, Caatinga’s forest. INTRODUÇÃO

O semi-árido brasileiro, também conhecido como polígono da seca, compreende uma área de quase um milhão de km2, abrangendo a maior parte de todos os estados nordestinos, bem como o norte de Minas Gerais. Além da ocorrência da seca, a região semi-árida no Brasil é caracterizada pela má distribuição das águas e das chuvas, elevada evapotranspiração e ocorrência de solos salinos, sendo considerada um ecossistema frágil (Agenda 21, 1992).

Entretanto, é uma das regiões semi-áridas com uma das mais elevadas densidades demográficas, em relação a outras regiões semi-áridas, com 20 habitantes/km2. Nesta região encontram-se os maiores bolsões de pobreza e todas as mazelas que lhes acompanham, tais como analfabetismo,

1 Bolsista do PIBIC, Graduação em Medicina Veterinária (UFCG), Patos – PB: [email protected] 2 Professor Adjunto IV-Farmacologia, Médico Veterinário, colaboradores, Farmacêutico bioquímico/Bióloga, Unidade Acadêmica de Ciências Biológicas. Universidade Federal de Campina Grande-UFCG, Av. Santa Cecília, Rodovia Patos/Teixeira, s/n, Patos – PB, Cx Postal 64, CEP: 58.700.970, Fone: 83-34239713, Fax: 83-34239537, Cel: 87263745: [email protected] 3Professor Adjunto, Químico, Departamento de Química de Materiais - UEPB.

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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009 fome, mortalidade infantil e deficiência dos serviços básicos de educação, saúde e saneamento. As condições ambientais adversas e a pobreza generalizada propiciam o desmatamento, a prática de irrigação inadequada, pastoreio excessivo e o sobre-cultivo. Tudo isto acelera o ritmo da degradação do solo, dos recursos hídricos e da qualidade de vida da população, culminando no processo de desertificação, que constitui, sem dúvida o mais grave problema ambiental da região semi-árida.

De um modo geral, a pesquisa científica em diversas áreas tem contribuído para atenuar os efeitos destas condições adversas, notadamente no campo das ciências agrárias. O delineamento de estratégias eficientes de melhoramento de plantas depende do conhecimento das propriedades genéticas das populações (Arriel et al., 2005). O conhecimento da variabilidade genética dos caracteres de interesse do melhorista é possível por meio de informações sobre parâmetros genéticos populacionais (Vencovsky e Barriga, 1992; Resende, 2002), e torna o melhoramento dos caracteres almejados muito mais precisos.

Na área florestal, estudos neste sentido têm proporcionado grandes avanços, principalmente, com os gêneros Eucalyptus e Pinus.

O conhecimento das características físicas e químicas de frutos e sementes, assim como a variabilidade das mesmas, dentro das populações de plantas é importante para o melhoramento dessas características. Além disso, fornece subsídios para o estudo sobre diferenciação de espécies (Cruz, 2003), classificação de grupos ecológicos (Castellani, 2003), caracterização de germoplasma e manejo da fauna silvestre (Kuniyoshi, 1983).

Todos esses esforços têm sido feitos no sentido de dar qualidade biológica e ecológica as espécies com potencial nutricional tem sido feito. Na implementação do seu uso na alimentação humana e animal, são necessários algumas análise que identifique o potencial toxicológicos que é realizado com o uso das partes comestíveis ou com compostos obtios dessas partes.

Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm. (faveleira) é uma destas plantas, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Pode ser empregada para recuperação de áreas degradadas, alimentação animal e humana, medicina, serraria e energia, dentre outros usos (Passos, 1993; Ng e Wege, 1996; Lorenzi,1998). Pesquisas realizadas com a faveleira até o momento demonstraram que a espécie é muito importante para o desenvolvimento da região semi-árida, em virtude de seus múltiplos usos, alta disseminação e completa adaptação às condições adversas dessa região.

Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm. (Faveleira) Espécies do gênero Cnidoscolus são tipicamente encontradas em ambientes semi-árido e

subtropical seco como aqueles do norte do México e nordeste do Brasil (Luz et al., 1999). Cnidoscolus chayamansa e Cnidoscolus aconitifolius são plantas hortículas, nativas do México, conhecidas popularmente por "chayas". Na era pré-colombiana tem relatos de que C. chayamansa

foi uma valiosa planta hortícula das tribos Maias no sudeste do México. Esta espécie ocorre também na Guatemala e é consumida por povos indígenas daquele país. Cnidoscolus phyllacanthus

(faveleira) é uma destas plantas, que se destaca pela sua extraordinária resistência à seca. Pode ser empregada para recuperação de áreas degradadas, alimentação animal e humana, na medicina popular, serrarias e como fonte de energia, dentre outros usos. Pesquisas realizadas com a faveleira até o momento demonstraram que a espécie é muito importante para o desenvolvimento da região semi-árida, em virtude de seus múltiplos usos, alta disseminação e completa adaptação às condições adversas dessa região. A faveleira é conhecida também por favela e faveleiro (Duque, 1980). Espécie pertencente à família Euphorbiaceae, trata-se de uma planta oleaginosa, xerófila, decídua, heliófila e pioneira. Atinge 4 a 8 metros de altura, dotada de copa alongada ou arrendondada e rala. Tronco curto e ramificado desde a base, mais ou menos cilíndrico, com casca fina, lenticelada e quase lisa, de 20 a 35 cm de diâmetro. É encontrada em todos os estados do nordeste brasileiro até o norte de Minas Gerais, principalmente nas regiões do Sertão e Caatinga (Lorenzi, 1998).

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O sistema reprodutivo da faveleira foi estudado por Silva (2002). Ambas pesquisas constataram que a espécie é alógama. Embora possa ocorrer autofecundação, a ocorrência de monoicia e, principalmente, protogenia são responsáveis pela predominância da fecundação cruzada.

A faveleira possui raiz tuberosa e xilopódios, com reservas alimentares produzidas no período chuvoso, através da fotossíntese e absorção de minerais pelas raízes. Essas reservas acumulam-se nestes órgãos subterrâneos para a manutenção do vegetal na seca e permite o aparecimento de novas folhas, flores e frutos. As raízes tuberosas são revestidas externamente por camadas suberosas fortes, impregnadas de suberina gordurosa, impermeável. Internamente, contém um líquido viscoso composto de amido, água, ácidos orgânicos, mucilagem, cristais de oxalato de cálcio, carbonatos, fosfatos e açúcares diversos. Desta forma, a espécie é resistente à seca, armazena água e reservas para as épocas de escassez (Duque, 1980).

Uma característica marcante da espécie é a presença abundante de espinhos cáusticos, que dificulta o manejo e exploração da planta. Sua picada causa sensação desagradável às pessoas que, inadivertidamente, tocam as suas extremidades pontiagudas (Braga, 1976). Entretanto, são encontrados exemplares inermes em populações nativas de faveleira (Moreira et al., 1974). De modo particular como forrageira, o uso de plantas sem espinhos é recomendável por diversas razões, como por exemplo ao permitir uma melhor circulação de animais e de seus tratadores e diminuir os riscos de ferimentos (Drumond et al., 1999).

Gomes (1977) relata que quase todas as partes da faveleira são aproveitadas para a alimentação animal. Ovelhas e cabras comem-lhes as folhas maduras à proporção que, em fins do período chuvoso, vão caindo. Nas grandes estiadas, o gado rói a sua casca. Suas sementes alimentam bovinos, suinos, caprinos, ovinos, asininos e equinos. As aves domésticas muito as apreciam. A torta extraída de suas sementes é também muito rica em proteína e sais minerais. Trata-se, portanto, de excelente forragem concentrada, um substituto da torta de algodão.

Trabalhos mais minuciosos sobre seu aproveitamento forrageiro foram iniciados na década de 1980, com avaliações do valor nutritivo de seu feno (Souza et al., 1980), produtividade da faveleira nativa, potencial forrageiro de faveleira sem espinho (Vianna e Carneiro, 1991), e avaliação bromatológica e valor nutritivo (Passos, 1993). De um modo geral, considerando o bom teor de proteína bruta (17,32%) e uma excelente palatabilidade de suas sementes e ramas, e a sua alta disseminação e completa adaptação às condições adversas, a faveleira pode ser classificada como uma das forrageiras de maior potencial do semi-árido do Nordeste do Brasil.

Pesquisas sobre métodos de extração de um princípio ativo para o combate da leucemia têm sido realizadas em alguns países da Ásia (Endo et al., 1992; Ohta et al., 1994; Ho e Chen, 1995) e na Austrália (Ng e Wege, 1996).

Lorenzi (1998) também salienta a importância da planta em programas de reflorestamentos heterogêneos destinados a revegetação de áreas degradadas, por se tratar de uma planta rústica e de rápido crescimento. Sua madeira é moderadamente pesada (densidade 0,55 g/cm3), macia ao corte, de baixa resistência mecânica, muito sujeita ao apodrecimento, e pode ser empregada para caixotaria, forros, lenha e carvão. Em áreas degradadas merece destaque o trabalho desenvolvido por Drumond et al. (1999), numa área coberta por rejeitos finos da Mineração Caraíba, situada no Sertão Baiano, em Jaguarari-BA. Uma avaliação realizada quando as plantas, no campo, atingiram em média 40 cm de altura, demonstrou bons resultados para a espécie plantada em covas com adição de 15 litros de substrato (argila + areia + esterco), com sobrevivência de 100%.

Caracterização física e química de frutos e sementes

O conhecimento das características físicas e químicas de frutos e sementes, assim como a variabilidade das mesmas, dentro das populações de plantas, são importantes para o melhoramento dessas características, seja no sentido de aumento ou uniformidade. Por exemplo, a distinção das sementes por peso e tamanho pode ser uma maneira de aprimorar os lotes em relação à uniformidade de emergência e vigor das plântulas. A caracterização biométrica e química de frutos e sementes fornece subsídios para o estudo sobre diferenciação de espécies (Cruz, 2001),

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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009 classificação de grupos ecológicos (Castellani, 2003), caracterização de germoplasma, manejo da fauna silvestre (KuniyoshI, 1983), entre outras diversas áreas de estudo.

Na maioria dos casos, para as espécies arbustivas e arbóreas existe antagonismo entre o tamanho das sementes e o número de sementes por fruto (Cruz, 2001). O tamanho e o peso de frutos e sementes, bem como o número de sementes por fruto, são características genéticas da espécie. Dentro da mesma espécie, existem variações individuais devidas às influências de fatores bióticos e abióticos, durante o desenvolvimento das sementes e à variabilidade genética. Assim, o tamanho e o peso da semente podem variar entre plantas da mesma espécie e também entre sementes de uma mesma planta.

Com o desenvolvimento da semente, há acúmulo de substâncias químicas e elas aumentam de peso. A composição química das sementes também é definida geneticamente e pode ser influenciada pelas condições ambientais a que foram submetidas as plantas que as originaram. As principais substâncias armazenadas pelas sementes são os carboidratos, os lipídios e as proteínas (Carvalho e Nakagawa, 2000). O principal carboidrato de reserva nas sementes é o amido e são denominadas amiláceas as sementes com predominância deste componente. As sementes são oleaginosas quando os lipídios são predominantes e proteicas quando as proteínas predominam (Popinigis, 1985).

A morfologia e a composição química das sementes estão diretamente relacionadas com a regeneração natural, determinando o comportamento delas durante a dispersão, formação do banco de sementes e de plântulas, germinação e longevidade (Kageyama e Viana, 1991). O conhecimento da composição química da semente pode ser aplicado ao manejo e conservação da fauna silvestre e em estudos de dieta de herbívoros (Kuniyoshi, 1983). Apesar da importância do estudo da composição química da semente, há poucos trabalhos de pesquisa com espécies florestais (Castellani, 2003). Caracterização física e química em faveleira

Os primeiros estudos de importância tecnológica sobre o aproveitamento industrial da faveleira foram realizados por Santa Rosa (1943). Seus trabalhos abordaram informações sobre as características do óleo da semente e a viabilidade de exploração racional da planta, no processo de desenvolvimento do nordeste do semi-árido. Além de estudar a fração lipídica da semente da faveleira para fins de alimentação humana o autor pesquisou também as tortas resultantes da extração do óleo, vendo, neste material, uma valiosa fonte de alimentação animal. Outros estudos sobre a caracterização física e química do fruto e sementes da faveleira foram realizados por Moura Fé et al. (1977); Arriel et al. (2000) e Silva (2002) e os principais resultados estão apresentados na Tabela 01.

As sementes são de testa dura e lisas e as amêndoas (endosperma + embrião) ricas em óleo comestível (Lima, 1989). A composição química do óleo tem boas características nutricionais, uma vez que contém, em média, 70% de ácidos não saturados, especialmente de ácido linoleico. O seu percentual de ácidos graxos é semelhante ao encontrado no óleo de algodão. Lorenzi (1998) relata que as sementes fornecem óleo comestível, porém, ainda sem aplicação comercial. Braga (1976) lembra da necessidade de um estudo botânico agrícola minucioso para que a espécie seja integrada em definitivo na economia regional do Nordeste. Nesta mesma linha de pensamento, Lima (1989) justifica que o emprego do óleo comestível estará na dependência de se conseguir uma variedade que não esteja armada de espinhos urticantes e, principalmente, cujos frutos sejam indeiscentes, pois a maturação distribuída num longo período de tempo e a conseqüente deiscência explosiva de seus frutos dificultam sobremaneira a colheita de um alto percentual das sementes produzidas. Por outro lado, estudos recentes, por análises espectrocópicas, têm identificado compostos derivados do benzociclohepteno como a favelina methyl ether, a favelina, e o deoxofavelina, extraídos da Cnidoscolus phyllacanthus e que desenvolveram atividade citotóxica (Endo, et al., 2001), analisando o extrato das espécies Cnidoscolus chayamansa McVaugh e C. aconitifolius (P. Mill.) I.M. Johnston), utilizando um ensaio enzimático por uma técnica de espectro UV-vis,

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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009 observaram a presença de glicosídios cianogênicos e quando analisado por cromatrografia em camada de alta performance foi identificado como linamarina. Tabela 01. Caracterização física e química do fruto e semente da faveleira.

Caracteres MOURA FÉ

et al. (1977) ARRIEL et al.

(2000) ARRIEL et al. (2005) SILVA (2002)

Fruto Forma Comprimento (cm) Diâmetro (cm) Sementes/fruto Pericarpo (%) Semente (%)

Elipsoidal 2,65 1,50 1,32

71,70 28,30

- - -

2,50 - -

- - - - - -

- 2,70 2,20

- - -

Semente Peso de 100 sementes (g) Tegumento (%) Amêndoa (%) Comprimento (cm) Largura (cm) Espessura (cm) Umidade (%) Proteína (%, N x 6,25) Extrato etéreo (%) Amido (%) Cinzas (%)

56,8 39,3

60,72 - - -

8,20 20,50 29,30

6,20 3,60

29,7 - - - - - - - - - -

- - -

1,44 0,79 0,52

- - - - -

26,2 - -

1,40 0,80 0,50

- - - - -

Amêndoa Umidade (%) Proteína (%, N x 6,25) Extrato etéreo (%) Cinzas (%) Carboidratos totais (%)

4,60 32,30 45,20

4,40 13,50

- - - - -

- - - - -

- - - - -

Tegumento Umidade (%) Proteína (%, N x 6,25) Extrato etéreo (%) Cinzas (%)

7,40 8,90

10,50 2,80

- - - -

- - - -

- - - -

Apesar de possuirmos uma diversidade de plantas com potencial nutricional, algumas questões

precisam ser respondidas; como por exemplo; se elas apresentam algum risco a saúde humana e animal, se usadas como uma fonte alimentar. A avaliação dos efeitos tóxicos de plantas, é uma condição necessária para o seu uso nesta condição.

O monitoramento de lesões no DNA

A mutação do conteúdo informacional e estrutura dos genomas nos seres vivos vai depender da presença de mecanismos precisos de replicação que garantam a reprodução exata do ADN nas células. Entretanto, sem alterações no conteúdo do ADN não teríamos evolução. Mutações representam a única fonte de variabilidade onde, através da ação da seleção natural novas informações são acrescentadas ao conteúdo genético de uma população e, eventualmente, levando ao surgimento de novas variantes e espécies. Mutação, portanto, pode ser definida como qualquer mudança hereditária, na seqüência ou no número de nucleotídeos do ADN de uma célula. Em geral estas mudanças levam à expressão de proteínas estruturais ou enzimas com funções alteradas, sendo detrimentais para o indivíduo (Bicudo, 1987).

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As mutações podem ser classificadas de diferentes maneiras dependendo do aspecto a ser enfocado. Nos organismos diplóides como os eucariotes, ou os merodiplóides nos procariotes, as mutações podem ser classificadas como dominantes ou recessivas em função da expressão ou não do fenótipo alterado, respectivamente. Mutações podem Ter natureza estrutural (incidem sobre um gene estrutural) ou reguladora, onde a sua expressão é detectada pela inabilidade em controlar outro gene. Mutações podem também ser classificadas como letais, quando os portadores não sobrevivem, ou ainda somática ou germinativas, estas últimas sendo transmitidas para gerações futuras (Gardner e Snustad, 1986).

Quanto ao tipo de alteração no ADN as mutações podem ser classificadas em três grupos gerais: (i) gênicas ou pontuais, (ii) cromossômicas, e (iii) genômicas (Gardner e Snustad, 1986; Burns e Bottinho, 1991).

As mutações pontuais são aquelas que envolvem alterações na seqüência de nucleotídeos em um ou mais de um códon e podem ocorrer pela substituição de bases, deleção ou adição de uma ou mais bases. As mutações tipo troca de base que levam à modificação de um códon pela substituição de um aminoácido distinto daquele presente na proteína original são chamadas de mutações de troca de sentido, enquanto que geram um dos três códons de terminação, interrompendo precocemente a tradução, são denominadas mutações sem sentido. As mutações de troca de base podem, ainda ser divididas em transições (troca de uma purina por outra purina ou troca de uma pirimidina por outra pirimidina) ou transversões (troca de uma purina por pirimidina ou vice-versa). As mutações por adição ou deleção de bases acarretam em mudanças do referencial de leitura na tradução, alterando a composição de aminoácidos de toda a proteína a partir do ponto onde ocorreu a mutação, sendo chamadas de mutação de troca de referencial ou “frameshift” (Bicudo, 1987; Henrique e Querol, 1987).

Mutações pontuais, como a troca de bases e mudanças de referencial, causam alterações relativamente pequenas no ADN e são detectáveis apenas pelos efeitos na expressão do gene alterado, levando as mudanças no fenótipo correspondente. Quando a mudança altera a atividade bioquímica da proteína, pode ocorrer uma mutação fenotípica, como no caso da hemoglobina na anemia falciforme e, da insulina no diabetes (Villa e Brentani, 1987; Henriques e Querol, 1987; Burns e Bottinho, 1991).

Mutações cromossômicas são conhecidas pelas alterações grosseiras na estrutura dos cromossomos sendo usualmente detectadas pelo exame microscópio de células em metáfase e envolvem quebras, e eventualmente reunião de material cromossômico durante o ciclo celular e incluem as inversões e translocações. As alterações encontradas são de dois tipos: cromossômicas e cromatídicas, dependendo da fase do ciclo celular no qual ocorre a mutação. Se a mutação ocorre nas fases G0, G1 e no começo da fase S, a aberração será do tipo cromossômica (Evans, 1984). Há diferentes esquemas para classificar os diferentes tipos de aberrações. È importante é que os diferentes tipos de aberrações (gap, isso gap, fragmento acêntrico simples, fragmento acêntrico duplo, quebra cromossômica, quebra cromatídica, anel e rearranjo cromossômico, células pulverizadas) sejam analisadas e apresentadas separadamente calculando-se a freqüência de aberrações por células e para cada tipo de aberração (Preston, 1987; Adler, 1984).

Mutações de origem exógenas estão relacionadas com danos no ADN causados pelos chamados agentes mutagênicos, definidos como elementos físicos (por exemplo, irradiação eletromagnética com luz ultravioleta, raios X, gama e alfa, choque térmico e campos magnéticos), químicos (agentes alquilantes, análogos de base, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, e outros) ou biológicos (certos vírus) capazes de causar danos ao ADN levando ao surgimento de mutações (Singer e Gruber, 1983. Drake, 1989; Brusick, 1987, Brusick, 1994). Os agentes mutagênicos, em geral, causam um aumento na taxa de mutação de todos os genes de uma célula (Burns e Bottino, 1991). Os agentes mutagênicos ambientais são de particular interesse, pois, a eles estamos constantemente expostos, como os poluentes que estão no ar, água e alimentos, aumentando consideravelmente os riscos de indução de mutações e câncer no homem e nos animais (Vijg, 1993; King et al., 1994).

Testes Citogenéticos para a Determinação da Genotoxicidade

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Os testes citogenéticos em roedores são os mais utilizados por se aproximarem mais de um resultado ideal no que se refere à avaliação da mutagenicidade de agentes genotóxicos e sua extrapolação para outras espécies animais inclusive para o homem. A proximidade filogenética, a natureza das células, a presença de processos fisiológicos (metabolismo) atuando na absorção, distribuição, ativação e excreção da droga fazem destes testes os paradigmas dos ensaios toxicológicos e genotóxicos (Matter e Tsucjimoto, 1980; Carano e Natarajan, 1988).

O exame microscópico dos cromossomos para a detecção de aberrações estruturais, alterações numéricas e troca de cromátides irmãs são os procedimentos melhor estabelecidos para a avaliação dos efeitos genotóxicos de drogas sobre as células de mamíferos.

Nos ensaios citogenéticos in vivo, os camundongos são inoculados com a droga a ser testada e, depois de completado o ciclo celular, as células da medula óssea, baço, rins, fígado, gônadas, ou órgãos fetais são removidos e analisados quanto à sua incidência de lesões cromossômica em microscopia ótica. Análises citogenéticas são realizadas através do monitoramento de aberrações cromossômica de células em metáfase, oriundas de quebra nos cromossomos ou cromátides, rearranjos ou perda de fragmentos ou cromossomos inteiros, ou pela frequência de micronúcleos.

Este estudo teve o propósito de investigar o potencial toxicológico de Cnidoscolus

phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm por meio de teste de metáfase em células de medula óssea de camundongos (Mus musculus). MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório Multiusuário de Pesquisas Ambientais – LAMPA da Universidade Federal de Campina Grande – UFCG, no Centro de Saúde e Tecnologia Rural -CSTR, Campus de Patos - PB.

Os ensaios in vivo com células de medula óssea foram realizados em camundongos heterogênios (Mus musculus), machos, oriundos do infectório do CSTR. Padronização da Dose de CPA (ciclofosfamida) em Relação aos Efeitos Genotóxicos em células de mamíferos

Nos ensaios preliminares para a padronização da dose da Ciclofosfamida (CPA), fármaco de ação antineoplásica empregado como controle positivo nos experimentos in vivo, foi utilizado um grupo de 05 animais. Os camundongos foram inoculados com doses de 10, 25, 50 e 100 mg de CPA/kg de peso corporal via i.p., com volume máximo de 0,1 ml/10g de peso. A diluição da droga foi feita em água destilada estéril. Foram analisadas 250 células por lâmina, e 04 lâminas para cada fêmur, totalizando 1.000 células analisadas. Padronização do óleo essencial de Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm

Nos experimentos in vivo com o óleo essencial de Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm, a administração foi feita por via i.p., dose única. foi de 0,2 ml/animal em uma diluição de 1:4 (m/v). Teste de Metáfase em Células de Medula Óssea de Camundongos

Os animais foram inoculados com uma solução de colchicina (1%), via i.p. na dose de 0,1 ml/10g de peso corporal, 22 horas após terem recebido o óleo essencial de Cnidoscolus

phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm ou a CPA. Após 24 horas os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os fêmures foram extirpados, dissecados e cortados a altura das epífises proximais. Com uma seringa e agulha, tipo tuberculina (1,0ml), foi injetada no canal medular dos fêmures dos camundongos 0,3 ml de uma solução isotônica de NaCl (0,9 %) deixando-se escorrer as células da medula óssea dentro de um tubo de centrífuga contendo 2,7 mL da solução de NaCl. A suspensão de células foi homogeneizada várias vezes com uma pipeta de Pasteur fina e, em seguida, centrifugada a 1.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento homogeneizado em 4 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M). A suspensão foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 25 minutos para hipotenização e

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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009 lise das células. A suspensão foi, em seguida, centrifugada a 1000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante descartado. Ao sedimento, foi adicionado o fixador (metanol: ácido acético 3:1), recém preparado, sendo as células ressuspensas até obter-se uma solução homogênea sem grumos. O processo de fixação das células foi repetido duas vezes sendo diminuído os volumes dos fixadores para 3 ml nas duas últimas centrifugações. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as células serão ressuspensas, novamente. Em lâminas previamente limpas e totalmente desengorduradas, mantidas submersas em água destilada gelada, foram pingadas 2 a 3 gotas do material sobre uma película de água que se forma sobre as lâminas. Em seguida as lâminas foram secas em papel de filtro e, ligeiramente, flambadas em lamparina a álcool onde foram coradas pelo método de Giemsa e analisadas ao microscópio ótico convencional.

Avaliação da Toxidez do óleo essencial de Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm Empregando-se o Índice Mitótico

O grau de toxidez do óleo foi determinado através dos valores dos índices mitóticos empregando-se a fórmula IM (%) = Número de células metafásicas X 100/Total de células (SIEGEL, 1979).

A obtenção do óleo das sementes e preparação da torta da faveleira foi realizada no Laboratório de Química da Universidade Estadual da Paraíba (UEPB)

Teste de Metáfase em células de medula óssea de camundongos

A aplicação do óleo da semente de Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm foi feita em um grupo de 03 animais, incluindo 01 camundongo como controle positivo, inoculado com CPA, na dose estabelecida com os resultados dos estudos de padronização da dose e 01 camundongo não inoculado mantido como controle negativo. Os animais foram inoculados com uma solução de colchicina (1%), via i.p. na dose de 0,1 ml/10g de peso corporal, 22 horas após terem recebido o óleo da semente de Cnidoscolus

phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm ou a CPA. Após 24 horas os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical.

Em seguida, os fêmures foram extirpados, dissecados e cortados a altura das epífises proximais. Com uma seringa e agulha, tipo tuberculina, foi injetada no canal medular dos fêmures dos camundongos 0,3 ml de uma solução isotônica de NaCl (0,9 %) deixando-se escorrer as células da medula óssea dentro de um tubo de centrífuga contendo 3,0 mL da solução de NaCl.

A suspensão de células foi homogeneizada várias vezes com uma pipeta de Pasteur fina e, em seguida, centrifugada a 1.000 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento homogeneizado em 4 ml de solução hipotônica de KCl (0,075M). A suspensão foi deixada em repouso à temperatura ambiente durante 25 minutos para hipotenização e lise das células. A suspensão foi, em seguida, centrifugada a 1000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante descartado. Ao sedimento, adicionou-se o fixador (metanol: ácido acético 3:1), recém preparado, sendo as células ressuspensas até obter-se uma solução homogênea sem grumos.

O processo de fixação das células foi repetido duas vezes sendo diminuído os volumes dos fixadores para 3 ml nas duas últimas centrifugações. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi descartado e as células, novamente ressuspensas. Em lâminas previamente limpas e totalmente desengorduradas, mantidas submersas em água destilada gelada, foram pingados 2 a 3 gotas do material sobre uma película de água que se forma sobre as lâminas. Em seguida as lâminas foram secas em papel de filtro e, ligeiramente, flambadas em lamparina a álcool onde foram coradas pelo método de Giemsa e analisadas ao microscópio ótico convencional. Obtenção do Óleo das Sementes de Faveleira

Sementes de plantas de faveleira com e sem espinhos coletadas nas localidades de Sousa, Patos, Santa Luzia, São Mamede e São José do Sabugi na Paraíba e Caicó, Santana do Seridó, Parelhas e Acari no Rio Grande do Norte, foram submetidas à extração de óleo com obtenção da torta, como também a utilização dessa na fabricação da fuba na relação 1 + 1 + 3 (fubá, açúcar e farinha).

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O óleo foi extraído das sementes por dois processos: um mecânico e um caseiro; no processo mecânico, a prensagem, e no processo caseiro, as sementes foram moídas, colocou-se a pasta em água fervendo e coletou-se a porção do óleo na forma de espuma que flutua sobre a água, transferindo para uma panela, submetida a aquecimento até a evaporação total da água, resultando como produto o óleo.

Para a obtenção da torta das sementes trituradas da faveleira, tomaram-se as sementes depois de lavadas e secas ao sol e trituradas em moinho manual (caseiro), procedendo-se em seguida a peneiragem para retirar o excesso de casca. Obtida a torta da semente, esta foi acrescida de farinha e açúcar na relação estabelecida (1 + 1 + 3), passando-se novamente a mistura total no moinho para sua inteira homogeneização. RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização Química do Óleo de Sementes de Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. et K. Hoffm

Cavalcanti (2007) estudando a comparação lipídica e protéica da faveleira com e sem espinhos, observou que a composição centesimal da farinha integral das amêndoas caracterizou a faveleira como uma oleaginosa típica, por apresentar teor lipídico de aproximadamente 40%. A faveleira sem espinhos apresentou maior teor de proteína (35,77%) em relação à faveleira com espinhos (33,00%). O óleo apresentou baixo índice de acidez e de peróxido, revelando estar em bom estado de conservação e elevada resistência à degradação oxidativa e houve predominância dos ácidos graxos insaturados, dentre eles o ácido linoléico. A composição química do óleo tem boas características nutricionais, uma vez que contém em média 70% de ácidos graxos insaturados.

Na variedade da faveleira com espinho, os ácidos graxos saturados representaram 31,73%, sendo os ácidos graxos C16:0 (20,87%) e C18:0 (10,55%) os mais abundantes. Para a variação sem espinho, 29,13% foram dos ácidos graxos saturados e destes 18,85% foram do ácido graxo C16:0 e 9,98% do C18:0. O ácido graxo C14:0 foi o menos abundante em ambas.

Dos ácidos graxos analisados o ácido oléico apresentou diferença significativa entre os óleos das duas variedades de faveleira e os demais não foram estatisticamente diferentes.

Os ácidos graxos insaturados representaram 68,27% para a variedade com espinho e 70,67% para a sem espinho. Na variedade com espinho os ácidos graxos C18:2 e C18:1 apresentaram em maior percentagem com 49,45% e 17,8% respectivamente, já o ácido graxo C18:3 apresentou menor percentagem com 1,02%. O mesmo perfil foi observado para a variedade sem espinho, onde os ácidos graxos C18:2 e C18:1 apresentaram 53,22% e 16,55% respectivamente e o ácido graxo C18:3 apresentou 0,91% do total de ácidos graxos. O ácido oléico (C18:1) e linoléico (C18:2) da serie ômega-9 e ômega-6, respectivamente, somam 67,25% dos ácidos graxos totais para o óleo da faveleira com espinhos e 69,77% para o óleo da sem espinho (Cavalcanti, 2007).

Os ácidos graxos insaturados são mais importantes para a saúde humana que os ácidos graxos saturados e a predominância desses ácidos determinam à qualidade do óleo. Os ácidos graxos saturados que possuem 12, 14 e 16 átomos de carbono em sua cadeia, aumentam as concentrações séricas do colesterol, já os ácidos graxos insaturados reduzem o nível de colesterol no sangue.

Os ácidos graxos essenciais são poliinsaturados que não podem ser sintetizados pelas células dos mamíferos a partir de acetil-CoA e, portanto, têm de ser ingeridos através da alimentação. Os mamíferos não possuem enzimas capazes de inserir dupla ligação nas posições n-6 e n-3 das cadeias hidrocarbonadas dos ácidos graxos. Os ácidos graxos essenciais linoléico (ω-6) e linolênico (ω-3) estão presentes em abundância em óleos vegetais como o de algodão, girassol, milho e o de soja. Em função disso, o mercado mundial apresenta uma gama bastante ampla de suplementos alimentares de ácidos graxos poliinsaturados ω-3 e ω-6 e de produtos, nos quais estes ácidos são incorporados como leites e derivados, fórmulas lácteas infantis, biscoitos, pães, ovos, massas e sucos de frutas. Em vista deste grande potencial, pesquisas voltadas a esta área têm relatado a aplicação de diferentes métodos físicos, químicos e enzimáticos visando a obtenção de

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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009 concentrados de ácidos graxos poliinsaturados, a partir de substratos como óleos vegetais, animais e microbianos (Carvalho & Nakagawa, 2003).

Os ácidos graxos poliinsaturados ω-6 (ácido linoléico) e ω-3 (ácido linolênico), além de suas ações sobre o metabolismo do colesterol e dos lipídios são importantes para a manutenção e fluidez das membranas celulares, formação de eicosanóides, modulação do sistema imunológico e controle da agregação plaquetária. São precursores do ácido araquidônico, que metabolicamente se transformam em ácidos graxos poliinsaturados de cadeias longas. Estes ácidos graxos fazem parte da estrutura das membranas biológicas.

Proteínas nas Sementes

As proteínas de sementes vegetais têm sido classificadas, de acordo com a sua solubilidade em albuminas, globulinas, prolaminas e glutelinas. As globulinas são as principais proteínas de reserva das dicotiledôneas e são caracterizadas pelos altos níveis de arginina, glutamina e asparagina, no entanto são pobres em aminoácidos sulfurados como metionina e cisteína. As globulinas têm sido exaustivamente caracterizadas, devido a sua importância nutricional, em leguminosas oleaginosas e não oleaginosas. A faveleira com (63,37%) e sem (63,91%) espinhos apresentaram a fração de globulinas como uma das mais expressivas das proteínas analisadas e, por isso, seguem um perfil para proteínas de reserva vegetais, principalmente nas espécies de leguminosas oleaginosas e não oleaginosas. As demais frações foram de albumina com 16,46% (FCE) e 16,05% (FSE), glutelina com 11,67% (FCE) e 11,34% (FSE) e prolamina com a menor percentagem 1,23% (FCE) e 1,27% (FSE) (Cavalcanti & Nakagawa, 2007).

A importância das proteínas vegetais apresentadas na forma de farinhas, concentrados e isolados protéicos já é bastante difundida. O aumento gradual da utilização das proteínas vegetais deve-se a sua abundância, baixo custo de produção e propriedades nutricionais e funcionais adequadas (Wang e Zayas, 1991).

O termo propriedade funcional é definido como toda propriedade não-nutricional que influi no comportamento de certos componentes de um alimento (Ordonez et al., 2005). As propriedades funcionais de uma proteína determinam seu comportamento durante o processamento, estocagem e preparação, e controla sua conveniência como ingrediente alimentar. Os atributos funcionais requeridos pela proteína incluem solubilidade, coagulação pelo calor, absorção de água e óleo, capacidade de formar gel, propriedades emulsificantes, propriedades espumantes e boas propriedades sensoriais (Kinsella, 1979). Essas propriedades influenciam na aceitação e no consumo do produto final (Sze-Tao e Sathê, 2000).

Os isolados protéicos exibiram perfil de solubilidade típico de proteínas vegetais, apresentando menor índice de solubilidade entre o pH 4,0 e 5,0, evidenciando o ponto isoelétrico das proteínas. Uma boa solubilidade alcançada pelos isolados protéicos da faveleira evidencia seu uso em bebidas, produtos de panificação, massas em geral e alimentos semi-sólidos. O isolado protéico da faveleira com espinhos apresentou maior capacidade de absorção de água em relação ao isolado protéico da faveleira sem espinhos, porém na capacidade de absorção de óleo não houve diferença entre as duas variedades. Os isolados protéicos apresentaram boa capacidade de emulsificação favorecendo seu uso em emulsões tipo maionese. Quando avaliadas através da atividade e da estabilidade de emulsão os isolados apresentaram performance apropriada favorecendo o uso também em emulsões cárneas (salsichas, lingüiças, patês) e sorvetes (Cavalcanti, 2007).

Em relação aos aminoácidos a farinha desengordurada da faveleira com espinhos foi analisada por HPLC e apresentou valores segundo a Tabela 2.

Tabela 2 - Composição dos aminoácidos das proteínas em estudo.

Aminoácidos* Unidade de Concentração

(mg AA/g proteína na amostra)

FD - FCE

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Valina (Val) 3,02

Leucina (Leu) 34,35

Isoleucina (Ile) 3,15

Treonina (Thr) 18,95

Lisina (Lys) 12,22

Histidina (His) 13,93

Fenilalanina (Phe) 14,11

Tirosina (Tyr) 8,93

Triptofano (Trp) NA

Cisteína (Cys) 1,52

Metionina (Met) 7,86

AE 118,05

Glicina (Gly) 15,99

Alanina (Ala) 22,19

Serina (Ser) 19,27

Asparagina (Asp) 37,64

Glutamina (Glu) 69,24

Argenina (Arg) 41,01

Prolina (Pro) 26,97

AT 350,36

E/T (%) 33,69

* valores obtidos em laboratório – por HPLC. Observa-se que dos aminoácidos essenciais, o que apresentou maior teor foi a leucina com

34,35 mg/g de proteína na amostra (Cavalcanti, 2007). Avaliação da atividade clastogênica de Cnidoscolus phyllacanthus (Mart.) Pax. Et. K. Hoffm

Para a análise dos efeitos clastogênicos em medula óssea de camundongos óleo de favela foram analisads 250 células em metáfase por dose administrada, totalizando 1.000.Os resultados apresentados na tabela 3, mostram que não ocorreu nenhum efeito aberrante sobre o ADN dos animais expostos ao óleo de favela. As quebras cromossômicas ocoreram nas metáfases dos animais expostos a CPA (Figura 1).

Tabela 3- Resultado das análises dos cromossomos, em células metafásicas, da medula óssea de

camundongos tratados com óleo de favela. Fármaco testado

Doses usadas

Tipos de aberrações cromossômicas (AC) CP MD GAP QCRTD FAZ FAD RCR

Óleo de favela 0,1mL/animal - - - - - - -

CPA 10 mg/Kg 06(12) 12(24) 10(20) 22(24) 22(44) - 1(2) Negativo - - - - - - - -

Tipos de lesões cromossômicas: células pulverizadas (CP), células com múltiplas quebras ou muito danificadas (MD), células com pequenas falhas (GAP), células com quebras cromáticas (QRTD), fragmentos acêntricos simples (FAZ), fragmentos acêntricos duplos (FAD), rearranjo cromossômico (RCR), ciclofosfamida (CPA= controle positivo), negativo (controle negativo).

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Determinação dos índices mitóticos em células de medula óssea de camundongos tratados com óleo de favela

Foi realizada uma avaliação do nível de interferência da exposição do óleo de favela e de CPA, no ciclo celular; mais especificamente sua ação anti-mitótica, pela determinação do índice mitótico (IM) das células extraídas da medula óssea de camundongos. Para o cálculo do IM, foram utilizadas as mesmas lâminas, preparadas para o teste de metáfase. Enquanto que os valores o IM para os animais expostos a CPA foi de 2,47%, nos animais expostos ao óleo de favela esse índice foi 0,25%. A dose de CPA-10mg/Kg foi a que determinou menor efeito clastogênico nas células dos animais expostos (Tabela 4). Os resultados indicam que o uso de favela não produz lesões irreversíveis ao ADN em mamíferos. Os testes para detecção de compostos carcinógenos de grande confiança são os bioensaios com ratos e camundongos. Praticamente todos os compostos químicos com efeito cancerígeno para o homem o são também para animais experimentais quando aplicados adequadamente (Silva, 2003). A influência de compostos naturais ou de síntese é responsável por vários danos ao DNA e estes efeitos podem gerar mutações em animais e plantas (Bertoletti, 2001).

Tabela 4- Determinação dos valores dos índices mitóticos das células da medula óssea de

camundongos, tratados com o óleo de favela.

Tratamentos Doses Nº de animais Teste de metáfase

Proliferação celular (IM%)

Óleo de favela 0,1ml/animal 03 – duas repetições Sim 0,25

CPA 01 - duas repetições Sim 2,47

Negativo 01 - duas repetições Sim 0,67

Determinação da atividade clastogênica da ciclofosfamida Os resultados apresentados na tabela 5 mostram que a CPA, na dose de 10mg/kg de peso corporal, induziu aberrações cromossômicas tipo fragmentos acêntrico simples, não sendo encontrados outros tipos de aberrações nesta dose. De acordo com os resultados obtidos por Chagas et al., 2000, observaram que a dose de 10 mg/kg foi a que proporcionou um melhor resultado positivo com menor indução de efeitos colaterais. Na dose de 100mg/kg de peso corporal 68,8% das células em metáfase apresentavam aberrações cromossômicas com danos celulares excessivo. Ocorreu a predominância de metáfases com cromossomos pulverizados (32%) e metáfases com quebras múltiplas (8%)(Figura 1 A). Na dose de 50mg/kg de peso corporal foi observado que 36% dos cromossomos em metáfase apresentavam aberrações sendo a mais freqüente os fragmentos acêntricos simples (10%) e cromossomos com múltiplas quebras (12%), além de outras lesões com menor freqüência (Figura 1 B). Com a dose de 25mg/kg de peso corporal foi induzido lesões cromossômicas do tipo fragmentos acêntricos simples (8,8%) e os cromossomos apresentando falhas simples ou “Gaps”(4,8%) (Figura 1 C). Em estudos realizado por Moreira et al. (1974) no teste de linfócitos humanos no reconhecimento do efeito clastogênico e citotóxico da 5-fluorouracil , foi utilizada a ciclofosfamida como controle positivo e a mesma interferia no crescimento celular confirmando assim o seu efeito mutagênico.

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ISSN 1983-4209 - Volume 03 – Número 01 – 2009 Figura 1 – (A) com 100 mg/kgMicrografia mostrando células de medula óssea em metáfase, com predominância de pulverização cromossômica. (B) com 50 mg/kg cromossomos muito danificados (setas pretas). (C) com 25 mg/kg um cromossomo com quebra cromática. (M.O. 200X).

Segundo Almeida et al. (2005) na avaliação do efeito mutagênico da palma forrageira ( Opuntia fícus-indica Mill) através do teste de micronúcleo em medula óssea de ratos (Rattus

novergicus, linhagem wistar in vivo) foi utilizado 4 grupos experimentais e um deles incluía a ciclofosfamida no controle positivo que teve ação no material genético do animal, fazendo com que ocorresse dano ao cromossomo e ele quebrasse ou fosse desviado completamente do seu caminho normal, que seria ir para o núcleo durante a divisão celular, comprovando dessa maneira seu efeito mutagênico.

Tabela 3 - Avaliação da atividade clastogênica do CPA em cromossomos metafísicos da medula

óssea de camundongos machos.

AC: cromossomos pulverizados (CP); cromossomos muito danificados (MD); cromossomos com falhas pequenas (GAPs); cromossomos com quebras cromatídicas (Q.CTD.); fragmentos acêntricos simples (FAS); rearranjo cromossômico (RCR). Fonte: Chagas et al., 2000.

CONCLUSÕES

O óleo essencial da faveleira além de não produzir genotoxidade em células metafásicas da medula óssea de camundongos, não apresenta ação clastogênica no DNA celular não causando mutação estrutural a nível cromossômico e não interfere na dinâmica do ciclo celular.

A determinação do efeito não clastogênico do óleo essencial da faveleira, pode contribuir para o uso seguro do mesmo pela população alvo.

AGRADECIMENTOS

TIPOS DE ABERRAÇÕES CROMOSSOMICAS (AC) a Dose usada

(mg/kg) Animais por dose

CP MD GAPs Q.CTD. FAS RCR TOTAL/AC (%)

10 5 0 0 0 0 3(1,2) 0 3 (1,2) 25 5 0 52 12 (4,8) 10 (4) 22

(8,8) 1 (0,4) 50 (20)

50 5 10 (4) 30 (12) 15 (6) 5 (2) 25 (10) 5 (2) 90 (36) 100 5 80 (32) 20 (8) 20 (8) 10 (4) 30 (12) 10 (4) 170 (68)

- 5 0 0 0 0 0 0

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Ao CNPq pela bolsa de Iniciação Científica. Aos voluntários PIBIC que ajudaram no desenvolvimento desse trabalho e a administração da UFCG e UEPB pelo apoio e logística.

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