Endonucleases de restrição

Tesouras da Natureza

• As enzimas de restrição, só se encontram em seres procariontes.

• Reconhecem e degradam o DNA de organismos exógenos.

• As bactérias enfrentam, apesar de não possuírem sistema imunitário, a invasão de DNA exógeno há milhões de anos e desenvolveram estas enzimas como mecanismos de protecção que preservam o seu próprio DNA enquanto destroem o DNA invasor.

EXEMPLO:

• As endonucleases de restrição são classificadas em três tipos: I,II e III.

• As endonucleases de tipo II são as mais interessantes para os biólogos moleculares. Não precisam de ATP para trabalhar e, mais importante, quase todas actuam em sequências simétricas e cortam dentro dessa sequência.

• As sequências específicas têm usualmente 4 a 6 pares de bases de DNA, cortando as ligações açúcar- fosfato do DNA.

• Geralmente a sequência-alvo é um palíndromo, pois é lida simetricamente, isto é, de 5’→3’ nas duas cadeias. A sequência a seguir apresentada é a sequência de reconhecimento da EcoRI, endonuclease de restrição isolada a partir da E. coli.

5’ N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 3’

3’ N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5’

A EcoRI reconhece e corta o DNA no mesmo local nas duas cadeias.

5’ N-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-N 3’

3’ N-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-N 5’

Assim, quando se separa o DNA cortado pela EcoRI obteremos extremidades chamadas coesivas ou adesivas (corte assimétrico) porque se podem sobrepor novamente.

5’ N-N-N-G 5’ A-A-T-T-C-N-N-N 3’

3’ N-N-N-C-T-T-A-A 5’ G-N-N-N 5’

• Nem todas as enzimas de restrição produzem extremidades coesivas. Algumas fazem cortes simétricos resultando extremidades denominadas abruptas ou rectas.

A sequência a seguir apresentada é a sequência de reconhecimento da SmaI, endonuclease de restrição isolada a partir da Serratia marcescens.

5’ N-N-N-N-C-C-C-G-G-G-N-N-N-N 3’

3’ N-N-N-N-G-G-G-C-C-C-N-N-N-N 5’

Neste caso, o resultado é:

5’ N-N-N-N-C-C-C 5’ G-G-G-N-N-N-N 3’

3’ N-N-N-N-G-G-G 5’ C-C-C-N-N-N-N 5’

• Em conclusão, da especificidade da sequência de determinada molécula de DNA, cada enzima de restrição gera um conjunto único de fragmentos.

• Outros exemplos de endonucleases de restrição:

• Quais as enzimas que produzem:

a) Extremidades abruptas?

b) Extremidades coesivas?

M

• A disponibilidade de tal ampla gama de enzimas serve para os pesquisadores, como ferramenta das mais variadas aplicações biotecnológicas, tais como na indústria farmacêutica, na agricultura e na medicina, entre outras.

• Dentre os exemplos mencionados, as endonucleases que produzem fragmentos de DNA com extremidades coesivas são uma das pedras angulares da tecnologia do DNA recombinante.

• Nesta aula iremos utilizar ferramentas básicas de Bioinformática.

• A Bioinformática deu os primeiros passos com o Projecto do Genoma Humano em 1987 e surge actualmente como a pedra basilar da Bioquímica e da Genética.

• A Bioinformática consiste no depósito e análise de sequências genéticas em bases de dados e consequente manipulação e análise destas sequências com a utilização de ferramentas (software) específicas.

• As sequências (de DNA ou de proteínas) que são determinadas de novo podem ser comparadas com as já existentes nos bancos de dados, sendo efectuada uma busca de similaridades e de sequências homólogas. Sequências de DNA que codificam proteínas podem ser traduzidas, por meio de software adequado e disponível livremente, e a sequência de aminoácidos resultante pode ser também comparada com outras. Relações filogenéticas podem, então, ser estabelecidas entre genes ou proteínas homólogas em diferentes organismos.

Através da Bioinformática é possível:

realizar diagnósticos clínicos desenvolver novos e altamente específicos produtos farmacêuticos estudar e controlar surtos epidémicos.

Por outro lado a Bioinformática é a ferramenta da globalização da Ciência, ou seja, do armazenamento, organização, integração e gestão de bases de dados universais.

• Como aplicação deste assunto os alunos irão resolver a ficha de trabalho que a seguir se apresenta, utilizando ferramentas básicas de Bioinformática.