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Extrao de DNA e RNAEnzimas de RestrioUniversidade Federal de Santa CatarinaCentro de Cincias BiolgicasLaboratrio de Polimorfismos Genticos

1Coleta de material biolgico:Quando?De quem?Como?Tratamentos?Quanto mais fresco melhor!Quantidade aceitvelBoa conservao

EPI!Conteno!

Vrias fontes de material biolgico. Todos os tecidos de todos os organismos.2

3SangueTecidosClulas de culturaExtrao plasmdeos de clulas bacterianasPurificao de DNA de gel...1. Extrao de DNADe onde podemos extrair DNA?

4Material de pacientes e controles - LapogeSangue total

Buffy coats

Amostras de tecido

1. Extrao de DNA

ObjetivosObjetivos?Genotipagem?Sequenciamento?IntegridadePurezaQuantidadePCR tamanho?Quantificao de RNA - Expresso?1. Extrao de DNA

1. Extrao de DNAFundamentosLisar eritrcitos (choque osmtico)

Lisar leuccitos (detergentes)

Inativar DNAse (quelante -EDTA)

Precipitar/degradar protenas (sais/proteinase)

Precipitar DNA (etanol)

Reidratao do DNA em gua ou tampo

Principais MtodosFenol-ClorformioSalting-outKits com colunas

1. Extrao de DNA

Lise I: eritrcitosLise II: leuccitosFenol-clorofrmioPrecipitao etanolFenol-Clorformio

1. Extrao de DNA

BaratoSimplesBoa quantidadeBoa qualidadeEstabilidade do DNA

Contaminao da amostra por fenol Reagentes txicos!

1. Extrao de DNA

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002

Salting-out 1. Extrao de DNA

11BaratoSimplesBoa quantidadeBoa qualidadeNo txico

Estabilidade do DNA?Sais contaminantes

1. Extrao de DNA

1. Extrao de DNA Kits

13MUITO SimplesBoa quantidadeBoa qualidadeNo txico

CaroEstabilidade do DNA

1. Extrao de DNA

Similar a extrao de DNAProtocolo bem mais cuidadosoMolcula muito mais instvelAmostra pode ser bem conservado em TRIzol, RNAlater, etc.) - snapshot preciso separ-la do DNA2. Extrao de RNAExtrao de RNA: Anlises de expressoTRIzolRNAlaterKit com colunas

Melhorar essa parte!152. Extrao de RNA

Lise I: eritrcitosTRIzol (fenol-guanidina)ClorofrmioPrecipitao etanolTRIzolPode ser usado para extrao de RNA, DNA e Protenas!

Kit com colunas

Transcrio reversa

(Quebit)(Nanodrop)

Espectrofotmetro - Nanodrop260nm DNA/RNA280nm protena, fenol,..230nm contaminantes (carboidratos, fenol,..)260/230 ~1,8260/230 ~2,0

Armazenar?DNA: -20CEstoque

Uso (diludo)

RNA: -80C

25Endonucleases produzidas por bactrias para se defender de vrus.Quebram o DNA em fragmentos menores, no infecciosos.Reconhecem stios especficos (stios de restrio) no genoma e a corta.So conhecidos mais de 3000 enzimas

Enzima de restrio:

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Enzima de restrio: tipos de clivagemFragmentao DNA!Clonagem!Genotipagem!...

27RFPL: Polimorfismos de comprimento do fragmento de restrioDeteco dos polimorfismos de nucleotdeos nicos (SNPs single nucleotide polymorphisms). Os primers utilizados na PCR flanqueiam a regio que contm, ou no, o stio de clivagem reconhecido pela enzima de restrio utilizada.O produto da PCR posteriormente submetido ao da enzima de restrio.Enzima de restrio: Deteco de SNPs

28Enzima de restrio: como ocorre a clivagem

293 CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTACGTA55 GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCATGCAT3

3 CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTACGTA5 5 GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCATGCAT3 21

2/21/22/21/21/12/21/12/21/21/1

Enzima de restrio: resultado da restrio

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