A tecnologia do A tecnologia do DNA recombinante DNA recombinante

e suas aplicaçõese suas aplicaçõese suas aplicaçõese suas aplicações

As enzimas de restriçãosão proteínas produzidaspor bactérias para prevenirou restringir a invasão deum DNA estranho. Elasatuam como tesouras deDNA, cortando o DNA

Enzimas de restrição

DNA, cortando o DNA invasor em diversos fragmentos sem função.As enzimas de restrição reconhecem e cortam posições específicas ao longo da molécula de DNA, nos chamados sítios de restrição.

Enzimas de restrição

Um sítio de restrição é formado por uma sequência de 4 a 6pares de bases, chamados de palíndrome (ou sequência palindrômica).

O nome da enzima EcoRI vem da bactéria na qual esta enzimafoi descoberta: Escherichia coli cepa RY 12 (EcoR), e o I, porque estafoi a primeira enzima de restrição encontrada neste organismo. Estaenzima cliva cada fita de DNA, no sítio de restrição, entre as bases G eA . Depois que as clivagens são feitas, o DNA permanece unido apenasA . Depois que as clivagens são feitas, o DNA permanece unido apenaspor pontes de hidrogênio entre as quatro bases do meio. Como aspontes de hidrogênio são ligações fracas, o DNA se separa.

↓5´ GAATTC 3´ Sítios de clivagem3´ CTTAAG 5´

↑5´ G AATTC 3´ DNA clivado3´ CTTAA G 5´

Métodos para introdução de DNAexógeno em células

- fusão de protoplastos--microinjeção--transformação

A fusão de protoplastos é umA fusão de protoplastos é ummétodo especialmente importantepara a manipulação genética decélulas vegetais.

Métodos para introdução de DNA

exógeno em células

Durante o processo detransformação, os genes são transferidosde uma bactéria para

Métodos para introdução de DNA

exógeno em células

outra como DNA `nu` em solução.Uma célula receptoracom uma nova combinação de genesé um híbrido ou célularecombinante.

Fontes de DNA

-bibliotecas de genescontendo cópias naturaisde genes

-bibliotecas de genes contendo cópias de DNA complementarcomplementar

-síntese artificial de DNA

Uma biblioteca de genesé uma coleção de um grande número de fragmentos de DNA oriundos de um genoma.

Fontes de DNAAs transcriptases reversas lêem uma sequência de RNA e sintetizam uma sequência de DNA complementar. Estas enzimas são produzidas por vírus de RNA que convertem seusgenomas de RNA para DNA quandoinfectam um hospedeiro.Esta técnica é útil para a expressão Esta técnica é útil para a expressão de genes eucarióticos em procariotos. O RNA mensageiro destes genes sofreu processamentona célula eucariótica, e os íntronsforam retirados, restando apenas assequências codificantes. A transcriptasereversa pode converter esse mRNA em um gene ´contínuo´ formado somente de sequências codificantes de protéina.

Transgênicos Transgênicos –– O que são e como O que são e como podem ser obtidos ?podem ser obtidos ?

ü Qualquer organismo em que se tenha introduzido umaou mais seqüências de DNA/RNADNA/RNA (genes),provenientes de uma outra espécie ou uma seqüênciamodificada de DNADNA da mesma espécie.modificada de DNADNA da mesma espécie.

ü Organismos que têm seus genomas normaisadicionados de um ou mais genes.

ØØ AlimentosAlimentos GeneticamenteGeneticamente ModificadosModificados –– São alimentoscompostos contendo OGMsOGMs ou derivados destes.

Transgênicos Transgênicos –– O que são e como O que são e como podem ser obtidos ?podem ser obtidos ?

üü ManipulaçãoManipulação genéticagenética queque consisteconsiste nana adiçãoadição dede umum ououmaismais genesgenes estrangeirosestrangeiros ((animais, vegetais oumicroorganismos)) aoao genomagenoma ((conjunto dos genes de uma

ØØ Transgênese ouTransgênese ou TransgeniaTransgenia

microorganismos)) aoao genomagenoma ((conjunto dos genes de umaespécie)) dede umum serser vivovivo qualquer,qualquer, animal,animal, vegetalvegetal ououmicroorganismomicroorganismo..

ü Atividade de produção e manipulação de moléculas deDNA/RNADNA/RNA recombinante.

ü Também denominada de TransformaçãoTransformação GenéticaGenética..

O gene e seus componentesO gene e seus componentes

Melhoramento TradicionalMelhoramento Tradicional

Melhoramento por TransgeniaMelhoramento por TransgeniaMelhoramento por TransgeniaMelhoramento por Transgenia

vvO que é preciso para a O que é preciso para a Transgenia:Transgenia:

üGene de interesse econômico localizado e isolado, clonado e seqüenciado

üTécnica apropriada de transgenia

Transgênicos Transgênicos –– Como podem ser Como podem ser obtidos?obtidos?

üTécnica apropriada de transgenia

üGenes marcadores/seleção: resistência a antibióticos e a herbicidas

üTécnica de regeneração de uma nova planta a partir da célula e/ou tecido transformado

üExpressão fenotípica do gene(s) introduzido(s)

Formas de TransgeniaFormas de Transgenia

üTransferência Indireta de Genes• Intermediada pelas bactériasAgrobacterium tumefaciens e Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenesrhizogenesrhizogenesrhizogenes

üTransferência Direta de Genes• Baseada em métodos físicos/químicos(Eletroporação e BiobalísticaEletroporação e Biobalística)

VetoresVetores HospedeirosHospedeiros UtilizaçãoUtilizaçãoPlasmídeos

Cosmídeos

Bactérias / levedurasclonagem

Bacteriófagos

Virus Terapia gênicaCélulas eucarióticas

A tecnologia do DNA recombinante

Cortar o DNA com Cortar o DNA com enzimas de enzimas de

restriçãorestrição

Inserir fragmentos Inserir fragmentos em vetoresem vetores

Fragmento 1Fragmento 1

Fragmento 2Fragmento 2

Fragmento 3Fragmento 3

Fragmento 4Fragmento 4

Introduzir vetores Introduzir vetores em bactérias por:em bactérias por:

eletroporação ou eletroporação ou choque térmicochoque térmico

Transformação Transformação bacterianabacteriana

EletroporaçãoEletroporação

PlaqueamentoPlaqueamento