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O Acaso na Natureza Guia do Aluno

Simulação de uma Análise Genética

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De uma árvore genealógica ao ADN – e voltar Nesta simulação prática, irás investigar a hereditariedade de um único gene

envolvido numa característica genética em

particular. A história base da investigação é a

seguinte:

Amostras individuais de ADN foram doadas

por membros de uma grande família (em

baixo). De cada amostra, parte do gene em

estudo foi amplificado usando a reacção em

cadeia da polimerase (PCR). Isto proporciona

milhões de cópias do ADN para que se

consiga uma detecção mais fácil. O gene em

questão tem dois alelos diferentes (variantes

do gene).

Receberás uma ou mais amostras de ADN

amplificado. A tua tarefa é detectar quais os

alelos presentes em cada amostra cortando o

ADN com uma enzima de restrição e

examinando os fragmentos de ADN

resultantes usando electroforese em

gel. Estes dados genéticos podem ser

combinados com a árvore genealógica

para que possas determinar como é

herdada a característica genética. O

processo está resumido ao lado.

Neste exercício, a característica pode ter sido herdada numa de duas maneiras:

como um característica autossómica recessiva ou como uma característica ligada ao

sexo.

Legenda:

Sample – Amostra; Restriction Enzyme Treatment – Tratamento com

Enzima de Restrição; Autosomal – Autossómica; Sex-linked – Ligada ao

sexo; Dominant allele – Alelo dominante; Recessive Allele – Alelo

recessivo; DNA cut by enzima – ADN cortado pela enzima; base pairs (bp)

– pares de bases (pb); Gel electrophoresis – Electroforese em gel; Trait –

Característica; No trait – Sem característica; Carrier – Portador;

Movement of DNA fragments – Movimento dos fragmentos de ADN.

I NTRODUÇÃO

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Características Autossómicas Recessivas Um membro da família que é homozigótico para o alelo dominante (genótipo DD)

terá apenas ADN do tipo D. Ele não terá a característica. No entanto, alguém que

seja homozigótico para o alelo associado à característica (genótipo dd) só terá ADN

do tipo d. Manifestará, assim, a característica. Indivíduos heterozigóticos (genótipo

Dd) têm ADN dos dois tipos, mas o alelo recessivo (d) estará ocultado pelo alelo

dominante (D) e a característica não se manifestará.

A diferença na sequência do ADN dos alelos D e d é tal que, no alelo d, há uma

sequência de pares de bases que pode ser reconhecida e cortada por uma enzima

de restrição. No entanto, o alelo dominante (D) não tem zona de restrição e, por

isso, não será cortado pela enzima.

Indivíduos que são homozigóticos para o alelo dominante (DD) apenas têm ADN do

tipo D, que não é afectado pelo tratamento com a enzima de restrição. A

electroforese em gel separa fragmentos de ADN pelo tamanho, assim, nestas

amostras, todos os fragmentos de ADN por cortar mover-se-ão em conjunto para

formar uma banda única no gel.

Indivíduos que são homozigóticos para o alelo recessivo (dd) têm apenas ADN do

tipo d, por isso, todo o seu ADN será cortado pela enzima. Isto cria fragmentos de

dois tamanhos diferentes que irão produzir duas bandas no gel depois da

electroforese.

Indivíduos heterozigóticostos (Dd) terão ADN dos dois tipos. Metade dos fragmentos

de ADN (do tipo D) permanecerão por cortar e metade dos fragmentos serão

cortados em dois. Assim, depois da incubação com a enzima de restrição, amostras

de ADN de uma pessoa que é heterozigótica conterão fragmentos de três tipos

diferentes, o que produzirá três diferentes tipos de bandas na electroforese em gel.

Árvore genealógica demonstrativa

das relações entre os sujeitos deste

exercício

Legenda:

Male – Sexo Masculino

Female – Sexo Feminino

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Características ligadas ao sexo O padrão de hereditariedade que detectas ao analisares as amostras de ADN

poderá mostrar que a característica que estás a estudar é transportada nos

cromossomas sexuais (X e Y). Essas características dizem-se ligadas ao sexo.

Numa fêmea existem dois cromossomas X, por isso, um único alelo recessivo (a)

pode ser mascarado por um alelo dominante (A) no outro cromossoma. Isto é

semelhante à expressão de características nos cromossomas autossómicos

descritos acima. No entanto, muito poucos genes do cromossoma X, que é maior,

têm um gene correspondente no cromossoma Y, mais pequeno. Assim, num macho

com um cromossoma X e um Y, é improvável que um alelo recessivo no

cromossoma X seja mascarado por um no Y. Assim, características ligadas ao sexo

recessivas são extremamente raras em fêmeas, mas são mais facilmente

encontradas em machos.

Enzimas de restrição: cortando o ADN Enzimas que cortam sequências específicas de ADN chamam-se endonucleases ou enzimas de

restrição. Têm este nome porque são feitas por bactérias para restringir a proliferação de vírus

invasores. Diferentes tipos de enzimas de restrição cortam diferentes sequências de bases no ADN.

Estas enzimas podem ser usadas para ajudar a detectar a presença de diferentes formas de

determinados genes (alelos).

Imagem 1: A enzima de restrição (uma proteína) BamHI ligada a uma

porção de ADN, vista ao longo do eixo do ADN. A representação

esquemática da enzima é feita a amarelo, magenta e cinzento. O ADN, no

centro, é representado como um modelo de linhas.

Imagem 2: A BamHI ligada a uma pequena porção de ADN. A proteína está

representada por uma fita com diferentes tons de azuis para as duas cadeias

que a constituem. Desta vez, o ADN está representado por um modelo cheio.

Estes modelos em computador foram produzidos utilizando RASMOL. A informação de ambos os modelos provém do Banco

de Dados de Proteínas (Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb). Para procurar esta informação, introduza o código de

identificação: 1BHM

Electroforese em gel do ADN A electroforese em gel é usada para separar fragmentos de ADN de diferentes

tamanhos. Primeiro, obtém-se um gel a partir de agarose – uma forma muito pura de

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agar, obtida de algas marinhas. Numa das extremidades do tanque onde é colocado

o gel, há vários pequenos orifícios (poços) feitos pelos dentes de um pente que foi

introduzido no gel antes de ele ter solidificado. Uma solução tampão é vertida sobre

o gel, para que encha os orifícios e entre em contacto com os eléctrodos em cada

extremidade do gel. São os Iões presentes na solução tampão que vão conduzir a

electricidade. Esta solução também impede o gel de secar.

Os fragmentos invisíveis de ADN são misturados com um pequeno volume tampão

de amostra que contém uma solução densa de açúcar, de modo que, quando é

adicionada aos pequenos orifícios, afunda-se, levando o ADN consigo.

Uma corrente eléctrica é aplicada aos eléctrodos, criando um campo eléctrico ao

longo do gel. Os grupos fosfato conferem carga eléctrica negativa aos fragmentos de

ADN, de modo que o ADN migra através do gel em direcção ao eléctrodo positivo.

Os fragmentos mais pequenos movimentam-se rapidamente através do gel poroso –

fragmentos maiores viajam mais lentamente. Deste modo, os pedaços de ADN são

separados pelo tamanho. O tampão de amostra também se move através do gel,

para que se possa acompanhar a progressão da electroforese. Depois da

electroforese, o gel é corado de modo a revelar a presença do ADN. Cada banda

individual no gel é constituída por milhões de fragmentos de ADN do mesmo

tamanho.

Legenda:

Buffer solution (over gel) – Solução tampão (sobre o gel); Loading Dye – Tinta contrastante; DNA

fragments are in this area – Os fragmentos de ADN estão nesta área; Wells – Orifícios; Electrode –

Eléctrodo; Direction of DNA movement – Sentido do movimento do ADN

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Utilização das microsseringas As microsseringas deste kit estão desenhadas de modo a serem usadas com pontas

descartáveis. Cada ponta deve ser usada uma única vez e a seguir ser colocada no

lixo. As pontas estão marcadas com 2 e 10 microlitros (µL), permitindo que

pequenos volumes de líquido sejam medidos com precisão. Obterás melhores

resultados se adoptares as respectivas precauções:

• Nunca puxes o êmbolo para fora da seringa – quando o re-inserires, o selo pode

ficar danificado;

• Antes de encheres a microsseringa, puxa o êmbolo um pouco para fora (1-2mm).

Isto dar-te-á algum ar extra para no fim conseguires expulsar a última gota de líquido

da ponta da microsseringa;

• Ao administrares líquidos, segura a microsseringa o mais próximo possível da

posição vertical e ao nível dos teus olhos, para que possas ver aquilo que estás a

fazer;

• Remove a gota de líquido da ponta da microsseringa tocando na parede interior do

microtubo;

• Não toques na ponta da microsseringa com os teus dedos. Existem proteases e

DNAses no teu suor que podem contaminar e degradar os reagentes que estás a

pipetar.

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Legenda:

Microsyringe – Microsseringa; Important hold

here don’t touch the tip! – Importante segura

aqui. Não toques na ponta!; Calibrated tip –

Ponta calibrada

Unidades de volume Um microlitro corresponde à milionésima parte

do litro

1 litro (L) = 1 000 mililitros

1 mililitro (mL) = 1 000 microlitros (µl)

I NSTRUÇÕES

PRÁT I CAS

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Distribuição da amostra de ADN a. Coloca uma ponta limpa na microsseringa. Coloca 20µL da solução de ADN

que recebeste num tubo contendo uma enzima de restrição liofilizada. Mistura

o líquido e a enzima liofilizada com cuidado, arrastando o líquido para cima e

para baixo, na ponta, algumas vezes. O líquido no tubo da enzima deverá

apresentar uma distinta tonalidade azul, mas não deverá haver uma

concentração de corante no fundo do tubo.

b. Fecha bem o tubo com uma tampa.

c. Escreve o número da amostra no tubo usando uma caneta com tinta à prova

de água. Escreve perto da borda do tubo, onde é mais improvável que a tinta

se apague.

d. Coloca o teu tubo num suporte flutuante junto das outras amostras de ADN

(provavelmente de outros estudantes).

Notas • A enzima liofilizada foi conservada com uma solução tampão apropriada e um corante azul. É

essencial acrescentar o volume correcto de líquido no tubo e garantir que os seus componentes se

misturam bem. Isto porque as enzimas de restrição podem ser menos eficazes se forem usadas em

excesso ou com uma concentração errada de solução tampão. Por exemplo, numa concentração

inapropriada de solução tampão, a enzima EcoRI pode cortar moléculas de ADN na sequência AATT

em vez de cortar a longa e mais específica sequência GAATTC.

• As enzimas de restrição providenciadas no kit trabalham melhor a 37ºC. A maior parte das enzimas

de restrição estão acabadas de desnaturar e, uma vez rehidratadas, devem ser utilizadas

imediatamente.

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Legenda:

Important Mix well after dispensing – Importante Mexer bem

depois de colocar o ADN; Numbered DNA sample – Amostra

de ADN numerada; Label here – Identifica o tubo aqui; Dried

restriction enzyme – Enzima de restrição liofilizada

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Incubação a. Confirma que os tubos contendo o ADN estão bem tapados e, de seguida,

incuba-os num banho de água ou numa incubadora a 37ºC, durante 30 a 45

minutos. Durante a incubação, a enzima de restrição cortará as moléculas de ADN numa zona específica, se

essa zona estiver presente. Isto produzirá, dos

fragmentos originais de 6500 pares de bases que te

foram fornecidos, fragmentos de 2500 e 4000 pares de

bases. Se não existir uma zona apropriada para a

restrição, os fragmentos de ADN permanecerão inteiros.

Depois de algumas horas, a acção enzimática acabará.

Preparação do gel

a. Se ainda não foi feito, usa um forno microondas ou um banho de água a

ferver para derreter algum gel de agarose gel (0.8% p/v feito na solução

tampão TBE). Agita o líquido e certifica-te que não há aglomerados ou fibras

de agarose que permaneçam por dissolver. Guarda a agarose derretida num

banho de água ou numa incubadora a 55-60ºC até ser necessária.

b. Corta dois pedaços do tecido de fibra de carbono, cada um com

aproximadamente 42mm x 22mm. Estes serão os eléctrodos de cada lado do

tanque do gel. Verifica se os eléctrodos encaixam correctamente em cada

extremidade do tanque, depois retira-os e coloca-os de lado.

c. Coloca um pente de 4 ou 6 dentes na ranhura de uma das extremidades do

tanque do gel e depois coloca-o numa superfície direita. Isto é necessário

porque, se o gel solidifica num determinado ângulo, os fragmentos de ADN

não se moverão uniformemente pelo gel.

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Legenda:

Foam block that floats – Suportes de espuma que

flutuam; Incubate for 30-45 minutes – Incubar

durante 30-45 minutos

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d. Tendo cuidado para não te queimares, agita a garrafa de novo e verte cerca

de 10mL de agarose derretida no tanque do gel de modo a que encha a

cavidade central e flua por debaixo e entre os dentes do pente. Tenta não

adicionar agarose em demasia – precisarás de um gel liso e não com curvas.

Se derramares solução de agarose nas áreas perto das extremidades do

tanque, deixa-a repousar – poderás retirá-la mais tarde quando estiver

repousada.

e. Deixa o tanque em repouso por 20-30 minutos, até o gel ficar duro (o gel

ficará opaco assim que estiver sólido).

Carregamento do gel a. Verte ligeiramente cerca de 10mL da solução tampão TBE no tanque de gel.

O líquido deverá cobrir a superfície do gel e escorrer para as áreas de cada

extremidade.

b. Com extremo cuidado, remove o pente do gel, permitindo que a solução

tampão encha os orifícios deixados pelo pente. Tem cuidado para não

rasgares os orifícios ao puxares o pente.

c. Coloca o tanque do gel num local onde possa permanecer em repouso

enquanto decorre a electroforese.

Legenda:

Molten agarose can scald – Agarose derretida

pode queimar; Flat side of the comb – Lado liso

do pente; Molten agarose – Agarose derretida;

Carbon fibre tissue – Tecido de fibra de carbono;

Cut two electrodes – Corta dois eléctrodos

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Verás mais facilmente aquilo que vais fazer a seguir se colocares o tanque do gel

numa superfície escura, por exemplo, um pedaço de papel preto. Como alternativa,

podes colar uma fita preta no fundo do tanque, debaixo dos orifícios.

d. Coloca uma ponta nova na microsseringa.

Acrescenta 2µL de tampão de amotra ao

tubo contendo o ADN que queres carregar.

Mistura a tinta e a amostra de ADN

agitando vigorosamente a mistura para

cima e para baixo na ponta da

microsseringa.

e. Pipeta a mistura de tampão de amostra e

ADN para dentro de um dos poços,

segurando a ponta acima do orifício mas

debaixo da solução tampão (vê a

ilustração). Tem muito cuidado para não

perfurares o fundo do orifício com a ponta

da microsseringa.

f. Anota qual o ADN que colocaste dentro de

cada orifício (escreve no lado de fora do

tanque de gel com um marcador, se

necessário).

g. Repete os passos d-f com as outras

amostras de ADN digerido (talvez de outros

estudantes da tua turma). Para evitar

contaminação cruzada, usa sempre uma

ponta nova para cada amostra.

h. Se estás a utilizar um pente de quatro dentes

para fazer os orifícios, acrescenta 2µL de ADN marcador num dos orifícios no

gel. Se utilizaste um pente de 6 dentes, acrescenta apenas 1µL ADN

marcador a um dos orifícios.

Legenda:

TBE buffer over gel – Solução tampão TBE

sobre o gel; Loading dye – Corante de ADN;

DNA sample – Amostra de ADN; Black card

under gel tank reveals the wells – Um papel

escuro debaixo do tanque permite que se

vejam os orifícios; Electrodes – Eléctrodos.

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Correr o gel a. Coloca um eléctrodo em cada

extremidade do tanque, como mostra

a ilustração. Junta os eléctrodos a

pilhas usando fios com molas de

crocodilo. Deverão ser utilizadas

pilhas suficientes (em série) para

fornecer uma voltagem total de não

mais de 36 volts. Certifica-te que o terminal positivo da

bateria está ligado ao eléctrodo mais afastado dos orifícios.

b. Certifica-te que há contacto entre a solução tampão e os eléctrodos

(acrescenta um pouco mais de tampão TBE se for necessário). Se a corrente

estiver a passar, deverás ver bolhas vindo de ambos os eléctrodos.

c. Deixa o gel a correr em repouso durante algumas horas. Numa sala mais

quente, talvez seja necessário colocar o tanque de gel num saco de plástico

para reduzir a evaporação da solução tampão. Como alternativa, poderás

usar um pente com seis dentes para tapar o tanque.

d. Desliga as pilhas assim que o corante azul alcançar o fim do gel. Se deixares

as baterias ligadas, o ADN ultrapassará o fim do gel.

e. Limpa as molas de crocodilo com água da torneira e seca-os bem para

prevenir a corrosão.

Notas • Os iões na solução tampão TBE usada no gel

conduzem a electricidade. Esta solução tampão é

alcalina. Em condições alcalinas, os grupos fosfato

do ADN têm carga negativa e, assim, o ADN move-

se na direcção do eléctrodo positivo (ânodo) quando

em presença de corrente eléctrica. O EDTA (ácido

etilenodiaminotetracético) presente na solução

tampão “aniquila” iões divalentes (tal como o Mg2+).

Isto ajuda a prevenir danos no ADN, uma vez que

esses iões são necessários (como co-factores) às

enzimas (DNases) que degradam o ADN.

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Legenda:

Electrodes – Eléctodos

Perigo de choques eléctricos sérios se o equipamento for ligado directamente a uma tomada

Legenda:

Warning! Use no more than 36 volts – Aviso! Não

usar mais de 36 volts; Place the comb over the tank to

reduce evaporation – Colocar um pente sobre o

tanque para reduzir a evaporação

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• O tampão de amostra não afecta o ADN mas desloca-se através do gel ligeiramente à sua

frente (como se fosse um fragmento de ADN de, aproximadamente, 300 pares de bases).

Coloração do ADN a. Retira e coloca de parte os eléctrodos. Verte a solução tampão para fora do

tanque (esta pode ser guardada e reutilizada várias vezes, mas não

indefinidamente).

b. Calça umas luvas de protecção para

prevenir que o corante manche a tua

pele.

c. Deixa o gel no tanque. Verte

aproximadamente 10mL de corante

de ADN (Azure A) na superfície do

gel.

d. Deixa-o durante exactamente 4

minutos e, de seguida, coloca a tinta

numa frasco para reutilização.

(Assim como a solução tampão, o

corante de ADN pode ser reutilizado

diversas vezes antes de precisares

de o substituir. No entanto, poderás

reparar que a tinta velha pode

precisar de ficar no gel durante um

pouco mais de 4 minutos).

e. Limpa a superfície do gel com água

destilada ou água deionizada com

extrema precaução. Verte a água e

deita-a fora.

f. Coloca o tanque de gel num saco de plástico para prevenir que o gel seque e,

de seguida, deixa o gel “revelar” durante a noite.

g. No símbolo (quadrado ou círculo) de cada pessoa na árvore genealógica,

grava o número de bandas visíveis no gel que contém o ADN dessa pessoa.

Os resultados de todas as amostras ajudar-te-ão a determinar o padrão de

hereditariedade do gene em estudo.

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Legenda: Azure A moves down through the gel staining the DNA – O

azure A desloca-se através do gel corando o DNA; 1 kb ruler

– régua de 1 kb; Millimetre graph beneath the gel is a

convenient way to measure distances – Colocar papel

milimétrico debaixo do gel é uma boa maneira de medir as

distâncias; Wells – Orifícios; DNA bands: the patterns you

see will match those shown here – Bandas de ADN: os

padrões que vais observar coincidem com os aqui ilustrados;

Loading dye – Corante de DNA

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Notas • Géis manchados podem ser guardados indefinidamente num saco de plástico selado e guardado

num frigorífico. Não os exponhas a luz solar forte nem uses água com cloro, uma vez que a cor

desaparecerá.

• O ADN marcador presente neste kit contém fragmentos dos seguintes tamanhos (em kb): 12 216;

11 198; 10 180; 9 162; 8 144; 7 126; 6 108; 5 090; 4 072; 3 054; 2 036; 1 636; 1 018; 506; 517. Os

fragmentos mais pequenos do marcador desaparecerão no fim do gel.

ADN e enzimas de restrição O ADN e as enzimas de restrição contidas nesta simulação são seguras para

manuseamento nas escolas. Não provêm de humanos e o seu uso não apresenta

quaisquer tipos de preocupações éticas ou de segurança. Não foram utilizados

nenhuns seres vivos. No entanto, a limpeza é importante para prevenir a

contaminação cruzada e assegurar o sucesso da experiência. Salpicos de enzimas

ou de solução de ADN devem ser limpos com prontidão.

Os tubos de plástico (polipropileno) usados e as pontas das microsseringas podem

ser colocadas no lixo normal ou recicladas sem qualquer tipo de precaução especial.

Gel de agarose Se for usado um forno de microondas para derreter o gel de agarose, certifica-te de

que o gel é colocado num recipiente que não esteja selado. Se não estiver

disponível um forno de microondas, em substituição do mesmo, podem ser usados

um banho de água a ferver ou uma placa de aquecimento. Deves mexer o gel

enquanto este aquece para evitar que queime. Não se recomenda o uso do bico de

Bunsen para derreter o gel de agarose.

Cuidado! Agarose quente e derretida pode escaldar e, por isso, deve ser manuseada com extrema precaução

Tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) Quando usado conforme as indicações, este tampão não necessita de normas de

segurança especiais. O tampão usado pode ser eliminado directamente pelo cano.

NORMAS

de

S EGURANÇA

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Tecido do Eléctrodo O eléctrodo de fibra de carbono poderá libertar pequenas fibras, o que poderá

causar uma ligeira irritação da pele se manuseares o tecido durante muito tempo.

Será uma precaução sensata usares luvas se achares que o tecido é desagradável

de manusear. As fibras libertadas são, no entanto, demasiado grandes para

entrarem nos pulmões, por isso, não será necessário usares uma máscara. As fibras

são solúveis em fluídos corporais e são completamente biodegradáveis.

Energia eléctrica Aviso! O equipamento para a electroforese em gel foi concebido para funcionar a

baixas voltagens (não excedendo os 36 volts) com pilhas secas. Esta voltagem

jamais deverá ser ultrapassada, uma vez que os componentes eléctricos em uso

não estão isolados do utilizador.

Aviso! Se se ligar este equipamento a uma fonte de electricidade podem ocorrer choques eléctricos fatais

Corante de ADN (Azure A em etanol) A solução concentrada de corante de ADN concentrado é inflamável e deve ser

mantida longe de chamas. O corante é Azure A que, quando diluída como indicado,

forma uma solução de 0.04% em 20% de etanol. Nesta concentração, não apresenta

nenhum risco para a tua segurança, embora seja necessário o devido cuidado para

evitar derrames do líquido na pele ou nos olhos, como por exemplo, usar luvas e

óculos de protecção. O corante utilizado pode ser diluído em água e deitado fora

pelos canos.

Corante do tampão da amostra (Azul de bromofenol/Sucrose) Quando usado segundo as indicações, este corante contrastante não apresenta

quaisquer riscos. O corante usado pode ser deitado fora pelos canos.

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Mais informações de segurança Mais informações sobre segurança envolvendo trabalho prático com ADN poderá ser

encontrada no seguinte artigo:

Delpech, R. And Madden, D. (2001): “Working with DNA” in Topic in

Safety (Third Edition) Association for Science Education. ISBN:

0863573169.

www.ase.org.uk

Este artigo e mais informação pode ser encontrada no sítio do NCBE:

www.ncbe.reading.ac.uk

DNA Science: A first course in recombinant DNA technology by D.A. Micklos and G.A. Freyer (1990)

Cold Spring Harbor Laboratory Press / Carolina Biological Supply Company. ISBN: 0 89278 411 3.

Brown, N. (1995) Electrophoresis for the visually impaired: the modification of the Lambda protocol

and its use with visually impaired A-level students. Journal of Biological Education 29 (3) 166–169.

Illuminating DNA by Dean Madden (2000) National Centre for Biotechnology Education. ISBN: 0 7049

1370 4.

Recombinant DNA and biotechnology: A guide for students by Helen Kreuzer and Adrianne Massey

(2001) Second edition. American Society for Microbiology

Press. ISBN: 1 55581 176 0.

ABC of clinical genetics by Helen M. King (1997) BMJ Publishing Group. ISBN: 0 7279 1101 5.

Genome. The autobiography of a species in 23 chapters by Matt Ridley (2000) Fourth Estate. ISBN: 1

85702 835 X.

The Human Genome The Wellcome Trust Web site:

www.wellcome.ac.uk/genome

Exploring our molecular selves US National Institutes of Health Web site:

www.nhgri.nih.gov/educationkit/

The molecular modelling software RASMOL (mencionado na página 3) is available free-of-charge

from:

www.umass.edu/microbio/rasmol

RECURSOS

AD I C I O N A I S