Enzimas de restrição ou Enzimas de restrição ou endonucleasesendonucleases de restrição de de restrição de

tipo IItipo IIDescoberta

Sistemas de modificação restriçãoComo actuam

Aplicações

Lise de bactérias após infecção fágica

Sistemas de Restrição-Modificação

Modificação e restrição de um vírus, controlado pel o hospedeiro

X

Y

X

X Y

YY

YX

X

X

Modificação do DNA Modificação do DNA METILAÇÃOMETILAÇÃO

2) Principal dador dos grupos metilo: SAM (S-adenos il metionina)

1) Modificação do DNA- METILAÇÃO

SAM

S-adenosil-homocisteína

Homocisteína

Metionina

H2OCH3

ATP CH3 activo

Exemplo de Exemplo de metilaçãometilação

MetilaçõesMetilações mais frequentesmais frequentes

• m6A- N6-metiladenina• m5C- C5-metilcitosina• m4C- N4-metilcitosina• hm5C- C5-hidroximetilcitosina

Tipo I- ex sistema EcoKI, que só clivam DNA NÃO METILADOTipo II- consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NÃO METILADOTipo III

Sistemas de Restrição-Modificação

Sistemas de Modificação (metilases sítio-específicas)

Dam (N6) G*ATCDcm (C5) C*CAGG e C*CTGG

Só METILAM

Sistemas de Restrição (endonucleases)

McrA- C*CGGMcrB- G*CMrr- C*AC e C*AG

Só clivam sequências METILADAS

Características das enzimas dos Sistemas de Características das enzimas dos Sistemas de ModificaçãoModificação --RestriçãoRestrição

de tipo I, II e IIIde tipo I, II e III

Sequências de reconhecimentoSequências de reconhecimentodas enzimas de restriçãodas enzimas de restrição

Tipo I

EcoAI GAGNNNNNNNGTCAEcoKI AACNNNNNNGTGCStySPI AACNNNNNNGTRC

Tipo II

EcoRI G/AATTCBalI TGG/CCAPstI CTGCA/G

Tipo III

EcoP151 CAGCAGEcoPI AGACCHinfIII CGAAT

Locais de corte, se^quências de reconhecimento, loca is de restrição

N- A, C, G ou T; R- G ou A

Corte na, ou muito próximo da sequência de reconhecimento que é PALINDRÓMICA e de 4 a 8 pb

Corte na mais de 1000 pb da sequência dereconhecimento que é bipartida e assimétrica

Corte a 24-26 pb a jusante da sequência dereconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb

PalíndromosPalíndromos

RADAR

MADAM IN EDEN I’AM ADAM

ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

Endonucleases de tipo II

• AccI Acinetobacter calcoaceticus• AluI Arthrobacter luteus• BamHI Bacillus amyloliquefaciens H• EcoRI Escherichia coli• HaeIII Haemophilus aegyptius• Sau3AI Staphylococcus aureus 3A

Type II restriction enzymes

Natureza das extremidades geradas após corte com as enzimas de restrição, é determinada pelo lado da ligação fosfo diéster onde ocorre o

corte

3’-OH5’-P

Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de Resultado da digestão do DNA com diferentes enzimas de restriçãorestrição

Extremidades cegas e coesivas (ou salientes)

Extremidades 5’ e 3’projectadas

As mesmas extremidades coesivas, produzidas pordiferentes enzimas de restrição

a 5’ do eixo de simetria a 3’ do eixo de simetria

Sistema de Sistema de modificaçãomodificação --restriçãorestrição das enzimas de tipo das enzimas de tipo IIII

(Exemplo)

A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferência de grupos metilo de

SAM para as adeninas marcadas com * na sequência de reconhecimento

A enzima de restrição cliva na sequência de reconhecimento:

A modificação da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da

clivagem pela EcoRI

…aactGAATTCtcgac……ttga CTTAAGagctg…

…aactG AATTCtcgac……ttga CTTAA Gagctg…

…aact G A * A T T C tcgac……ttga C T T * A A G agctg…

Sistema de Sistema de ModificaçãoModificação --RestriçãoRestriçãoTipo ITipo I -- sistema sistema EcoKEcoK

HsdM DNA metilaseMetila na sequência AN6ACNNNNNNGTGC ou GCN6ANNNNNNGTTO DNA isolado numa estirpe hsdM- é clivado num hospedeiro HsdR

HsdR Enzima de restriçãoA ausência desta actividade permite a entrada de DNA propagado em estirpes ou fontes que não E. coli

HsdS Determinante da especificidade de HsdM e HsdRA mutação HsdS elimina a actividade de HsdM e HsdR

Enzimas de Tipo I ligam-se à sequência alvo, metila ndo-a, ou clivando o DNA, consoante o estado de metilação dest e

Cliva DNA não metilado

GenótiposGenótipos e e fenótiposfenótipos de de mutantesmutantes hsdhsd no sistema no sistema EcoEcoKK

GENÓTIPOFENÓTIPO

hsdS hsdR hsdM

+

++

+++

+

++-

--

r- m-

r- m-

r- m+

r+ m+

A subunidade HsdM é indispensável à função de restri ção por HsdR

Sistema de ModificaçãoSistema de ModificaçãoMetilaçãoMetilação DamDam

1- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), bloqueadas por metilação Dam

ClaI G*ATCGAT

XbaI TCTAG*ATC

MboI G*ATC

Metilação Dam: G m6ATC (grupo metilo na posição N6 da adenina: N6-metiladenina )

2- Enzimas de restrição de tipo II (ex.), não bloqueadas por metilação Dam

BamHI GG*ATCC

PvuI CG*ATCG

Sau3AI G*ATCA negrito - a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de tipo II

Uma sequência de DNA pode sofrer diferentes metilações, adquirindo diferentes padrões de metilação , consoante a especificidade das metilases da célulaEx.

Gm6ATC (Dam)GATm5CGATm4CGAThm5C

As enzimas de restrição podem apresentar diferentes sensibilidadesaos diversos padrões de metilaçãoEx: Sau3A1

CLIVA NÃO CLIVAGm6ATC

GATm5CGATm4CGAThm5C

Diferentes Diferentes padrões de padrões de metilaçãometilaçãovsvs

diferentes sensibilidadesdiferentes sensibilidades de clivagemde clivagem

Enzimas de restrição tipo II, Enzimas de restrição tipo II, com diferente sensibilidade à com diferente sensibilidade à metilaçãometilação

DpnII não CLIVA CLIVA DpnI

GATC Gm6ATC GATCCTAG CTm6AG CTAG

Sau3AI CLIVA

GATC Gm6ATCCTAG CTm6AG

DpnI só corta sequência de reconhecimento quando metiladaDpnII “ “ “ “ “ “ não metiladaSau3AI “ “ “ “ “ metilada e não metilada

CLIVA

DpnI DpnII GATC

SÓ CLIVA NÃO CLIVA

GATC G*ATC

Metilase

GAT C

Protecçãoda

Restrição

NÃOCLIVA

As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII terão que possuir padrões de metilação adequados à protecção da restriçãopor cada uma destas enzimas

G*AT C

Aplicação das enzimas de restrição de tipo II

DNA cloning

• One of the most important goals of recombinant DNA technology is to clone a particular gene of interest or otherDNA fragment of interest

• The approach used to clone a specific gene, depends to a largedegree on:– the gene– what is known about it– objective

• Among the several tools needed for cloning, lets consider :– restriction enzymes– vector DNA– DNA ligase– host cell

DNA cloning...

Isolating and cloning a DNA fragment

Construction of a recombinant DNA molecule

Reacção de ligação entre duas moléculas de DNA

VECTORS

• Central component of gene cloning experiments

• Two types of naturally ocurring DNA molecules:– Plamids – Bacteriophages

• Properties– Self-replicating– Unique restriction enzymes cleavage sites– Selectable marker– Easy to recover

Marcas importantes de um Marcas importantes de um plasmídioplasmídio

Marca de resistência a um antibiótico para o qual a estirpehospedeiro é sensível

Clones de um Clones de um plamídioplamídio recombinanterecombinante

Bacteria cell transformation

• Introduction of recombinant DNA molecules into a host(ex. E. coli)

• Different procedures: – inducing competence (CaCl2, MgCl2, Licl)– electroporation

Transformed cells are isolated inSELECTION MEDIA

(a) Introduction of free DNA into bacterial cells (TRANSF ORMATION)

Competent bacterial cells + Recombinant DNA plasmid

SELECTION MEDIA

Recombinant DNA clones

Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell

Cell divides and vectors are passed to progeny

Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules

Ex. ANTIBIOTIC selection ofplasmid DNA (recombinant and non-recombinant)

Non-recombinant DNA plasmid .Bacteria cells harbouring this plasmidwill grow, but won’t be recombinant clones

Within the host, vector directs the copy number of recombi nant DNA molecules.

Características dos hospedeirosCaracterísticas dos hospedeirosvsvs

metilaçãometilação

Ex.DNA recombinante amplificado numa estirpe Dam G*ATC

G*ATC G*ATC

CT*AG CT*AG

MboI GATC não cliva G*ATCCTAG sequências metiladas CT*AG

Sau3AI GATC cliva G*ATCCTAG sequências metiladas CT*AG

Características dos hospedeirosCaracterísticas dos hospedeirosvsvs

metilaçãometilação

Ex.DNA humano *CpG

Clonagem em estirpes (mutantes em Sistemas de Restrição)

mcrA - McrA- C m5CGG

mcrBC - McrBC- G m5CGh5CGN4C

IsoesquizómerosIsoesquizómeros1- Reconhecem a mesma sequência e clivam nos mesmos locais

AccIII TCCGGAAGGCCT Extremidades compatíveis com

XmaIBspEI TCCGGA

AGGCCT CCCGGGGGGCCC

2- Reconhecem a mesma sequência mas clivam em locais diferentes

Acc65I GGTACC XmaI CCCGGGCCATGG GGGCCC

KpnI GGTACC SmaI CCCGGGCCATGG GGGCCC

3- Reconhecem a mesma sequência mas apresentam diferente sensibilidade à metilação

DpnII e MboI não clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado

DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI não cliva G*ATC não metilado e ainda clivam emlocais diferentes

MspI e HpaII são isoesquizómeros , mas HpaII é bloqueada pela metilação em CG, realizada nos mamíferos e pelas enzimas de modificação Dcm.

MspI- não é sensível à metilação, Dcm ou metilação CpG dos mamíferos, ie, Cm5CGG. No entanto não cliva em m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG

HpaII- não cliva em Cm5CGG, m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG

Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcrA - e mcrBC -

e posteriormente clivá-lo com MspI? E com HpaII? Porquê?

Metilação em organismos eucariotas- um outro significado biológico

• Mto variável consoante o organismo em causa. Ex. Drosophila- DNA não metilado

• Geralmente a metilação está associada a mecanismos de silenciamento génico

REGULAÇÃO EPIGÉNICAAlteração da expressão génica que não se deve a alterações na sequênciade DNA, mas a algo que “a somar à sequência de DNA”, influi a expressãogénica, como seja:

- modificação de bases- factores proteicos que se ligam ao DNA