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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

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Page 1: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Prof. Victor Pessoa

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TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

* O DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado

(sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química

era geralmente analisada por meios indiretos como a sequência de

proteínas); * A partir da década de 70, novas tecnologias foram desenvolvidas

permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num

processo chamado de CLONAGEM GÊNICA (muitas dessas técnicas

são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética

Microbiana - permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo

enfoque).

Page 3: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

* A TECNOLOGIA DO DNA

RECOMBINANTE, como se

convencionou denominar este

conjunto de técnicas, tem uma

ampla aplicação:

a)Estudar mecanismos de

replicação e expressão gênica,

b)Determinar da sequência de um

gene e, consequentemente, da

proteína que ele codifica, ou no

desenvolvimento de culturas

microbianas capazes de produzir

substâncias úteis tais como a

insulina humana, hormônio de

crescimento, vacinas e enzimas

industriais em grandes quantidades.

Page 4: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO* Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da

replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula

hospedeira na qual ele estava inserido (percebeu-se que a inabilidade

de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era

devido a presença de NUCLEASES altamente específicas que clivavam

o seu DNA).* As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são

divididas em várias classes (estrutura, atividade, sítios de

reconhecimento e clivagem);

* As enzimas do Tipo II (mais importantes na Tecnologia do DNA

Recombinante) são proteínas que clivam o DNA no mesmo sítio do seu

reconhecimento (o sítio de reconhecimento deste tipo de enzima é

normalmente uma sequência palindrômica.

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Clivagem no eixo de simetria

Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria

Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades

coesivasPodem se ligar, por complementaridade,

a outro DNA (DNA ligase)

Page 7: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

A primeira letra representa

o gênero e as outras duas a

espécie, seguido de um

algarismo romano (ou outra

letra) que indica a ordem da

descoberta ou a linhagem

da qual ela foi isolada. Por

exemplo, a enzima de

restrição denominada de

EcoRI é purificada de uma

Escherichia coli que carrega

um fator de transferência de

resistência RI, enquanto que

a Hind III é isolada da

Haemophilus influenzae,

linhagem d III.

Page 8: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

* Os fragmentos gerados por

digestão com enzima de restrição

são geralmente detectados pela

separação destes fragmentos por

ELETROFORESE EM GEL DE

AGAROSE. Os fragmentos migram

em função de seus pesos

moleculares, sendo que os

menores migram mais

rapidamente.

Page 9: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

CONSTRUÇÃO DE UM DNA RECOMBINANTE

1 - Uma enzima de restrição particular reconhece somente uma

sequência única de bases;

2 - DNAs de origem diferente, sob a ação da mesma enzima de

restrição, produzem fragmentos com o mesmo conjunto de

extremidades fitas simples (portanto, fragmentos de dois diferentes

organismos - por exemplo, bactéria e homem - podem ser ligados por

renaturação das regiões de fita simples;

3 – Ligação dos fragmentos por meio da enzima DNA ligase (ligação

permanente).

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Page 11: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

Esquema representativo da

construção de uma molécula

de DNA recombinante

Page 12: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Prof. Victor Pessoa

Construção de uma molécula de DNA recombinante portando o

gene humano da insulina a ser expresso em bactéria (produção em

larga escala)

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VETORES DE CLONAGEM

* Após o isolamento de um determinado gene, obtido pela clivagem

com enzimas de restrição, este fragmento de DNA deverá ser inserido

numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar esta

informação genética em centenas de cópias. Este processo de

amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os

chamados vetores de clonagem molecular.

PLASMÍDEOS = pequenas moléculas de DNA circular de fita dupla, presentes em algumas bactérias

BACTERIÓFAGOS OU FAGOS = desoxirribovírus (vírus de DNA) que infectam bactérias

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Sítios de clivagem pelas enzimas

de restrição

Origem de replicação (sequência de DNA

que permite que o vetor seja replicado na

célula hospedeira)

gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina, o

qual distingue a célula transformada da célula não

transformada. As células transformadas com tais

vetores são capazes de crescer num meio contendo o

antibiótico, enquanto que as células não tranformadas

acabam morrendo.

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Replicação do fago no interior da célula hospedeira. Após adsorção

(1) e injeção (2) do genoma do fago na bactéria, a via lítica indicada

pelos números 3, 4 e 5 leva a formação de novas partículas virais.

Alternativamente, a via lisogênica (6) pode ser ativada levando à

integração do material genético viral ao genoma da bactéria

hospedeira.

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APLICAÇÕES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBIANTE

* PCR – Polymerase chain-reaction (reação em cadeia da

polimerase)* Eletroforese

* DNA Fingerpinting

* Organismos geneticamente modificados e transgênicos

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PCR – POLYMERASE CHAIN-REACTION (REAÇÃO EM CADEIA

DA POLIMERASE)

* A reação em cadeia da polimerase (PCR – sigla em inglês)

consiste em um método de amplificação de DNA (múltiplas cópias)

sem o uso de organismos vivos, bactérias ou leveduras, por exemplo.

* Não requer necessariamente o uso de radioisótopos ou outros

compostos tóxicos / envolve, essencialmente, a preparação de uma

mistura contendo uma amostra de DNA a ser amplificada e primers

(iniciadores) específicos;* Etapas:

1 – Desnaturação da dupla-hélice de DNA;

2 – Hibridização dos primers às fitas de DNA separadas;

3 – Polimerização (extensão) da fita complementar de DNA.

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ELETROFORESE

* Eletroforese é a técnica pela qual fragmentos de DNA de diferentes

tamanhos, obtidos com o uso de enzimas de restrição, são separados

em um gel de agarose.1 - O DNA (amostra) é posto em um poço do gel de agarose;

2 – Amostra submetida a um campo elétrico;

3 – Migração do DNA na direção do pólo positivo (uma vez que a

molécula de DNA é negativa devido à presença de grupamentos

de fosfato);

4 – Separação dos fragmentos de acordo com o peso molecular

deste (quanto maior, mais lenta a migração e vice-versa).

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Animação eletroforese

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Perfil eletroforético dos lotes de mosquitos procedentes de bairros da

cidade de Fortaleza (janeiro de 2006 a março de 2009), e do Parque

Adahil Barreto (julho de 2007). [1 – Marcador de peso molecular (100

bp DNA ladder); 2, 3, 4, 5, 6 e 9 – lotes negativos para vírus dengue; 7

– Lote 35 exibindo banda de aproximadamente 290 pb (DENV-3); 8 –

Lote 35 exibindo banda de aproximadamente 119 pb (DENV-2); 10 –

Lote 34 exibindo banda de aproximadamente 290 pb (DENV-3); 11 –

Lote 35 exibindo bandas de aproximadamente 119 pb e 290 pb

(DENV-2 e DENV-3, respectivamente); 12 – Controle negativo; 13 –

Controle positivo