8/14/2019 As doenas auto-imunes

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As doenas auto-imunes so um tipo de desordem imunolgica caracterizada pela

diminuio da tolerncia aos componentes do prprio organismo, de modo que ocorre uma

falha no mecanismo de distino entre antgenos constituintes do organismo e aqueles

externos, como vrus e bactrias. Atingindo cerca de 3-5% da populao mundial, asdoenas auto-imunes tm sua origem na complexa interao entre fatores ambientais e

fatores intrnsecos ao organismo, tais como predisposio gentica, alteraes hormonais emesmo uma reduo no controle imuno-regulatrio. O estudo da expresso gnica de doenas auto-imunes pode fornecer evidncias dos

elementos envolvidos tanto no surgimento quanto na progresso e definio do grau de

severidade dessas doenas. Alm disso, possvel aplicar o conhecimento adquirido naconduo mais efetiva do tratamento e na identificao de alvos especficos para o

desenvolvimento de potenciais terapias.

A tecnologia de cDNA microarrays representa uma poderosa ferramenta para tal

propsito, j que possibilita o estudo do perfil de expresso de milhares de genes ao mesmotempo. A utilizao de arranjos de cDNA em alta densidade permite a investigao do

padro de expresso gnica a partir da comparao dos nveis relativos de expresso.

A proposta deste trabalho utilizar a tecnologia de cDNA microarrays para comparar operfil de expresso gnica de linfcitos provenientes de indivduos agrupados segundo trs

doenas auto-imunes distintas, tomando como controle indivduos normais. Foram

utilizados 12 pacientes com lpus eritematoso sistmico (LES), 6 pacientes com artritereumatide (AR), 6 pacientes com diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) e 11 controles.

Essa tarefa foi realizada atravs de duas abordagens complementares: a primeira

consistiu em determinar quais genes so diferencialmente expressos em cada uma das trsdoenas, ou seja, observar os genes que se apresentam de maneira exclusiva em cada

doena auto-imune; a segunda consistiu em analisar os genes comumente expressos nessas

trs desordens, elaborando, dessa forma, um padro de expresso gnica da auto-

imunidade. Preparaes de RNA total provenientes de linfcitos do sangue perifrico dos pacientes

com LES, AR e DM1 e dos indivduos normais foram marcadas com CyDye. O

delineamento experimental consistiu em marcar as amostras de pacientes e controles comum mesmo fluorocromo Cy5 (vermelho) e combin-los num mesmo microarray com

amostras de RNA (cDNA) de referncia marcados com Cy3 (fluorocromo verde).

Os microarrays em lminas de vidro foram preparados com uma seleo de 4.500seqncias de cDNA em duplicata. Todas as hibridaes com microarrays foram realizadas

num sistema automatizado, e as imagens das hibridaes foram geradas num scanner

confocal a laser. Atravs de ferramentas computacionais, as imagens das hibridaes foram

submetidas aos procedimentos de quantificao, normalizao, anlise estatstica eagrupamento hierrquico.

A quantificao das imagens correspondeu atribuio de valores numricos

quantitativos a partir da intensidade do sinal de cada ponto, levando em considerao osinal do background e a filtragem de valores negativos ou nulos. A normalizao de todos

os dados aconteceu por meio de normalizaes intra e entre slides, utilizando mtodos

como o Printtip Lowes e o re-escalonamento dos valores M pelo valor da MedianAbsolute Deviation. A anlise estatstica foi realizada atravs de vrios algoritmos

estatstico-matemticos com o objetivo de selecionar genes significantemente expressos.

Por fim, o agrupamento hierrquico foi obtido de maneira no-supervisionada a partir do

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mtodo dos vizinhos mais prximos, no qual a correlao de Pearson foi utilizada como

medida de similaridade.

O agrupamento hierrquico mostra claramente a separao dos indivduos de acordo

com a doena auto-imune, o que indica uma similaridade no perfil de expresso gnica dospacientes com a mesma doena auto-imune, ao mesmo tempo em que demonstra uma

diferena no padro de expresso desses genes em cada uma das doenas. Os pacientes com LES apresentaram 331 genes diferencialmente expressos quandocomparados aos respectivos controles (p < 0.05). Os pacientes com AR, por sua vez,

apresentaram 303 genes diferencialmente expressos com relao aos seus controles. A

comparao entre os pacientes com DM1 e os respectivos controles no demonstrou genessignificantemente expressos.

Dos genes diferencialmente expressos obtidos para cada uma das doenas auto-imunes,

pde-se observar que 68 genes so comuns entre LES e AR, o que tornou possvel elucidar

um padro de expresso da auto-imunidade. Alm disso, foi possvel determinar os genesexclusivos de cada doena auto-imune: so 263 genes exclusivos para LES e 235 genes

exclusivos para AR, os quais esto associados a processos celulares importantes para a

reao auto-imune, tais como inflamao, metabolismo e comunicao celulares.