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KELEN CRISTINA RIBEIRO MALMEGRIM DE FARIAS

Avaliação da reconstituição imunológica em paciente s com

diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla após

transplante autólogo de células tronco hematopoétic as

Ribeirão Preto

2006

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KELEN CRISTINA RIBEIRO MALMEGRIM DE FARIAS

Avaliação da reconstituição imunológica em paciente s com

diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla após

transplante autólogo de células tronco hematopoétic as

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada Orientador: Prof. Dr. Júlio César Voltarelli

Ribeirão Preto

2006

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER

MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A

FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Farias, Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim de

Avaliação da reconstituição imunológica em pacientes com diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla após transplante autólogo de células tronco hematopoéticas. Ribeirão Preto, 2006. 286 p.

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Voltarelli, Júlio César

1. Transplante de células tronco hematopoéticas 2. Doenças auto-imunes 3. Reconstituição imunológica 4. Diabete melito do tipo 1 5. Esclerose múltipla 6. Repertório de células T

FOLHA DE APROVAÇÃO

Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim de Farias

Avaliação da reconstituição imunológica em pacientes com diabete melito do tipo 1 e esclerose

múltipla após transplante autólogo de células tronco hematopoéticas

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. __________________________________________________________________________

Instituição: _______________________________ Assinatura:________________________________

Prof. Dr. __________________________________________________________________________


Prof. Dr. __________________________________________________________________________


Prof. Dr. __________________________________________________________________________


Prof. Dr. __________________________________________________________________________


Aos meus pais, Ronaldo e Mariléa

Ao meu marido, Cléver

Aos pacientes transplantados,

Doutores na arte da vida,

que incansáveis, tornam o desejo de luta maior que o próprio medo

que sedentos de vida, assumem por ela todos os riscos,

o risco mesmo de perdê-la.

Com vocês, estamos sempre aprendendo

que a luta, nem sempre seguida de vitória,

é o que importa e torna preciosa nossa efêmera existência.

Aos que vitoriosos alcançaram o objetivo de viver,

Aos que persistentes continuam lutando,

Aos que perderam a batalha, mas engrandeceram seu espírito

e deixaram em nossa memória a lembrança de sua coragem.

(Autor desconhecido)

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Júlio César Voltarelli pela orientação, confiança e oportunidade de trabalhar em sua linha

de pesquisa. Admiro muito a maneira como conduz sua pesquisa clínica e sua equipe do TMO.

Aproveito a oportunidade para parabenizar-lhe pelos avanços e sucessos conquistados nos últimos

quatro anos nos ensaios clínicos de transplante autólogo de células tronco em doenças auto-imunes.

À diretoria científica e administrativa do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-

FMRP-USP, em cujos laboratórios de pesquisa esse trabalho foi desenvolvido.

Ao coordenador do Centro de Terapia Celular (CEPID da FAPESP), Prof. Dr. Marco Antônio Zago,

pela oportunidade de trabalhar nesse centro de referência em pesquisa, o qual tem obtido muito

sucesso pela sua capacidade de liderança e empenho na formação dos pesquisadores.

Ao Programa de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada, do Departamento de Imunologia e

Bioquímica da FMRP-USP, pelos excelentes professores e pela qualidade de formação que é

oferecida. Agradeço em especial à Ana, que sempre me ajudou com muita atenção, eficiência e

carinho em todos os momentos em que precisei.

À FAPESP, Finep e CNPq pelo apoio financeiro, imprescindível para a realização deste trabalho.

Ao Laboratório de Citometria de Fluxo do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-

FMRP-USP. À Patrícia e Fabiana pela dedicação, presteza e ajuda, que foram imprescindíveis para a

realização deste trabalho. Agradeço pelas centenas de tubinhos marcados, “passados” e analisados,

e também pelos conselhos e discussões sobre os experimentos. Mas, principalmente, agradeço pela

amizade sincera, carinho, conversas, pelos ótimos momentos que passamos e pelas inúmeras

risadas que demos juntas nesses últimos quatro anos!

Ao Laboratório de Biologia Celular do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-

FMRP-USP. À Maristela, Ane Rose e Karina pela ajuda na realização deste trabalho, pela discussão

dos experimentos, e principalmente, pela amizade, apoio e carinho nesses últimos anos. Agradeço

especialmente à Aline, minha estagiária, pela amizade, carinho, dedicação e ajuda imensurável nos

experimentos nesse último um ano e meio.

Ao Laboratório de Biologia Molecular do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do HC-

FMRP-USP. À Dra. Simone e Luciene pela ajuda na realização dos experimentos. Agradeço também

à Carmen pela amizade e por sempre me ajudar com muita atenção e eficiência na parte burocrática

nos momentos em que precisei.

À equipe médica da Unidade de Transplante de medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-

USP, em especial à Dra. Maria Carolina de Oliveira, Dra. Beatriz Stracieri, Dra. Daniela Moraes, Dra.

Belinda Simões e ao Dr. Fabiano Pieroni, pela atenção e presteza no acompanhamento dos

pacientes, encaminhamento das amostras e no fornecimento dos dados clínicos.

À equipe de enfermagem da Unidade de Transplante de medula Óssea do Hospital das Clínicas da

FMRP-USP pela atenção, dedicação, paciência e presteza na coleta das amostras dos pacientes.

À equipe médica do Setor de Doenças Neuromusculares, em especial à Dra. Doralina Brum e ao Dr.

Amilton Barreira, pela colaboração nesse projeto, atenção e presteza no acompanhamento dos

pacientes com esclerose múltipla.

À equipe médica da Divisão de Endocrinologia e Metabolismo do HC-FMRP-USP, em especial ao Dr.

Eduardo Couri e ao Dr. Milton César Foss, pela colaboração nesse projeto, atenção e presteza no

acompanhamento dos pacientes com diabete melito do tipo 1.

Ao Prof. Dr. Jorge Kalil, Prof. Dra. Luiza Guilherme, Prof. Dra. Verônica Coelho e Dra. Kellen Faé, do

Laboratório de Imunologia do Instituto do Coração da FM-USP, pela oportunidade que me deram de

poder desenvolver parte de meu trabalho de doutorado em um grupo de excelência em pesquisa em

Imunologia no Brasil, iniciando-me no estudo do repertório de linfócitos T. Agradeço em especial à

Dra. Kellen pela colaboração nesse trabalho, pelos ensinamentos e explicações, pela ajuda na

realização dos experimentos e na discussão dos resultados. Agradeço pelo carinho e cuidado no

período em que trabalhei em seu laboratório. Agradeço também a todos os outros companheiros do

laboratório que me receberam com carinho, e de alguma forma contribuíram para realização desta

parte do meu trabalho.

Aos pacientes que participaram deste estudo pela compreensão e paciência. Espero ter contribuído,

um pouco que seja, para o entendimento dos mecanismos de ação do transplante autólogo de células

tronco em doenças auto-imunes, para que no futuro essa nova abordagem terapêutica para o

tratamento de doenças auto-imunes possa ser melhorada.

A todos meus companheiros dos laboratórios de pesquisa do Hemocentro que de diferentes formas

contribuíram para este trabalho. Agradeço pela amizade, força e ajuda nos experimentos. Em

especial, agradeço à minha amiga Keikinho pela amizade e carinho, por me escutar tantas vezes, por

compartilhar sonhos e esperanças, e pela ajuda incondicional.

Aos meus “amigos da imuno” (vocês sabem quem são...) pela amizade e carinho sinceros, pela força,

conselhos e apoio nos momentos em que precisei, pelos bons momentos compartilhados em nossas

saídas e encontros, e também pelas nossas conversas sobre nossa paixão que é a Imunologia. Foi

muito bom conviver com vocês nesses últimos quatro anos!

Aos meus queridos pais, Ronaldo e Mariléa, pelo amor e apoio incondicionais que sempre recebi para

ir em busca de meus sonhos. Obrigada por compreenderem minha ausência nesses últimos tempos.

Saibam que cada conquista minha é um triunfo de vocês.

Ao meu querido Cléver, meu amor, minha referência... Agradeço a Deus, sempre, por ter colocado

você em minha vida. Obrigada pela compreensão, carinho, apoio e ajuda incondicionais,

principalmente nesses últimos tempos. Essa conquista também é sua, assim como a sua (lembra?)

também foi minha, e tenho certeza de que outros tantos sonhos nós conquistaremos juntos.

A Deus pela minha existência, pelo amor incondicional, pela saúde, força e capacidade que me dá

todos os dias.

“The marvelous richness of human experience would lose

something of rewarding joy if there were no limitations to

overcome. The hilltop hour would not be half so wonderful if

there were no dark valleys to traverse”.

Helen Keller (1880 – 1968)

RESUMO

Farias, K.C.R.M. Avaliação da reconstituição imunológica em pacient es com diabete melito do

tipo 1 e esclerose múltipla após transplante autólo go de células tronco hematopoéticas. 2006.

286p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo,

Ribeirão Preto, 2006.

Ensaios clínicos têm demonstrado que a imunoablação seguida de transplante autólogo de

células tronco hematopoéticas (TACTH) é capaz de suprimir a atividade inflamatória em pacientes

com doenças auto-imunes (DAIs) e pode induzir remissões clínicas prolongadas nesses pacientes,

mas o mecanismo de ação do TACTH ainda não é bem esclarecido. O racional do TACTH em DAIs

baseia-se na idéia de que a imunoablação intensa possa eliminar as células auto-reativas e que o

novo sistema imune reconstituído dos precursores hematopoéticos possa restabelecer tolerância. O

objetivo deste trabalho foi avaliar a reconstituição imunológica em pacientes com diabete melito tipo 1

(DM, N=11) e pacientes com esclerose múltipla (EM, N=18), seqüencialmente após o TACTH. A

reconstituição imunológica observada nos pacientes com DM (um ano de seguimento pós-

transplante) e nos pacientes com EM (dois anos de seguimento pós-transplante), foi caracterizada por

mecanismos periféricos timo-independentes. Após o transplante, houve uma predominância de

células T de memória central, memória efetora e também de células T efetoras diferenciadas,

principalmente de linfócitos T CD8+. Essas células provavelmente se originam da expansão

homeostática periférica de linfócitos T de memória residuais que sobreviveram ao regime de

condicionamento ou foram re-infundidos com as células tronco no momento do transplante. Os

números de linfócitos T CD4+ e CD8+ naive, incluindo as células T CD4+CD45RA+CD31+ recém-

imigrantes do timo, não recuperaram os níveis basais durante o período pós-transplante analisado.

Após o TACTH, houve uma predominância de células T CD4+ e CD8+ produtoras de citocinas do

padrão TH1 (INF-γ e TNF-α). Por outro lado, foi observado um aumento da porcentagem de células T

CD4+ e CD8+ produtoras de citocinas do padrão TH2 (IL-4, IL-5 e IL-10) no pré-condicionamento e em

alguns períodos após o TACTH. Análises espectrais do repertório da cadeia Vβ dos receptores de

células T (TCRs), por TCRBV CDR3 spectratyping, identificaram quatro padrões básicos de

reconstituição do repertório. O padrão que consistiu na reconstituição da diversidade a partir de um

repertório pré-transplante diverso, foi o mais dominante em todos os pacientes analisados. Para

algumas famílias Vβ foi observado um padrão de reconstituição que consistiu na recuperação da

diversidade a partir de um repertório pré-transplante restrito, o que sugere um aumento da

diversidade do repertório de células T após o transplante. Foram observadas mudanças na

composição do repertório de células T após o TACTH, evidenciadas por alterações qualitativas e

quantitativas dos picos de CDR3 das famílias Vβ, que poderiam explicar a indução da remissão da

doença auto-imune observada na maioria dos pacientes. Foi observada uma rápida reconstituição de

células T CD4+CD25high e um aumento na expressão do gene Foxp3, marcador molecular específico

para células T reguladoras CD4+CD25high, na maioria dos pacientes avaliados. Esses resultados

sugerem uma melhora de mecanismos reguladores que podem contribuir para o restabelecimento da

tolerância imunológica nos pacientes com DM e EM submetidos ao TACTH.

Palavras-chave: Transplante de células tronco hematopoéticas, Doenças auto-imunes,

Reconstituição imunológica, Diabete melito do tipo 1, Esclerose múltipla, Repertório de células T.

ABSTRACT

Farias, K.C.R.M. Analysis of immune reconstitution in type 1 diabete s and multiple sclerosis

patients following hematopoeitic stem cell transpla ntation. 2006. 286p. Thesis (Doctoral) –

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.

Clinical trials have indicated that autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) can

persistently suppress inflammatory disease activity in a subset of patients with autoimmune diseases

(AIDs), but the mechanism of action of the AHSCT has not yet been totally elucidated. The rationale

for HSCT in autoimmune diseases has been the notion that intensive immune depletion could

eliminate autoreactive immune cells irrespective of antigenic specificity and that regenerating the

immune system from hematopoietic precursors could reestablish tolerance. The goal of this work was

to evaluate the immune reconstitution in patients with type 1 diabetes mellitus (DM1; N=11) and

multiple sclerosis (MS; N=18) who received AHSCT. The immune reconstitution observed in the DM1

patients (one year follow-up) and in the MS patients (two years follow-up) was characterized by

peripheral thymic-independent mechanisms. After transplantation, there was a predominance of

central-memory T cells, effector-memory T cells and differentiated-effector T cells, mainly of the CD8+

T cell subset. These cells probably originate from peripheral homeostatic proliferation of residual

memory T cells that have survived the conditioning chemotherapy or were reinfused with the HSC

graft. The numbers of naive CD4+ and CD8+ T cells, including the recent-thymic emigrants

CD4+CD45RA+CD31+, did not revert to baseline levels during follow-up. After transplant, there was a

predominance of TH1 cells, mainly CD8+ T cells, producing INF-γ e TNF-α. In contrast, it was observed

an increased percentage of CD4+ and CD8+ T cells producing TH2 cytokines (IL4, IL-5 and IL-10) at

pre-conditioning and at some time points after AHSCT. Analysis of the T cell receptor Vβ repertoire by

TCRBV CDR3 spectratyping identified four basic patterns of repertoire reconstitution. The pattern that

consisted of reconstitution of diversity from a normally diverse repertoire was the most dominant in the

analyzed patients. For some Vβ families were observed a pattern that consisted of recovery of

diversity from a restricted repertoire, suggesting increased repertoire diversity after AHSCT. There

were changes in the composition of the T cell repertoire post-AHSCT, evidenced by qualitative and

quantitative alterations in the CDR3 peaks, which might explain the induction of the remission of the

autoimmune disease, observed for the majority of the patients. A rapid reconstitution of CD4+CD25high

T cells and an increased expression of the Foxp3 gene, a specific molecular marker for regulatory

CD4+CD25high T cells, were observed in the majority of the analyzed patients. These results suggest

an improvement of the regulatory mechanisms, which might contribute to reestablishment of

immunological tolerance in the DM1 and MS patients submitted to the AHSCT.

Keywords: Hematopoeitic stem cell transplantation, Auto-immune diseases, Immune reconstitution,

Type 1 diabetes, Multiple Sclerosis, T cell repertoire.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Reconstituição de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e granulócitos em pacientes com

diabete melito do tipo 1 após o TACTH......................................................................................72

Figura 2. Reconstituição de linfócitos T e B em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH..73

Figura 3. Reconstituição de linfócitos T, células NK, células NKT-like, e de células dendríticas em

pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH....................................................................74

Figura 4. Reconstituição de linfócitos T CD4 naive, de memória, de memória efetora e efetores

diferenciados em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH ........................................75


diferenciados em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH ........................................76

Figura 6. Expressão de Fas e FasL em linfócitos T CD4+ ou TCD8+, ou em linfócitos B reconstituídos

em pacientes com diabete melito tipo 1 após o TACTH..............................................................77

Figura 7. Expressão de marcadores de ativação celular em linfócitos T CD4+, T CD8+ e linfócitos B

reconstituídos, e reconstituição de linfócitos T CD4+ recém-imigrantes do timo, em pacientes com

diabete melito tipo 1 após o TACTH...........................................................................................78

Figura 8. Reconstituição de linfócitos T CD4+CD25+ e linfócitos T CD4+CD25high em pacientes com

diabete melito tipo 1 após o TACTH...........................................................................................79

Figura 9. Expressão de CTLA-4 e GITR em linfócitos T CD4+CD25high em pacientes com diabete

melito tipo 1 antes e após o TACTH...........................................................................................80

Figura 10. Reconstituição de leucócitos totais, linfócitos, monócitos e granulócitos em pacientes com

esclerose múltipla após o TACTH ..............................................................................................88

Figura 11. Reconstituição de linfócitos T e B em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH...89

Figura 12. Reconstituição de linfócitos T, células NK, células NKT-like, e de células dendríticas em

pacientes com esclerose múltipla após o TACTH.......................................................................90


diferenciados em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH............................................91


diferenciados em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH............................................92

Figura 15. Expressão de Fas e FasL em linfócitos T CD4+ ou TCD8+, ou em linfócitos B reconstituídos

em pacientes com esclerose múltipla após o TACTH.................................................................93

Figura 16. Expressão de marcadores de ativação celular em linfócitos T CD4+, T CD8+ e linfócitos B

reconstituídos, e reconstituição de linfócitos T CD4+ recém-imigrantes do timo, em pacientes com


Figura 17. Reconstituição de linfócitos T CD4+CD25+ e linfócitos T CD4+CD25high em pacientes com


Figura 18. Expressão de CTLA-4 e GITR em linfócitos T CD4+CD25high em pacientes com esclerose

múltipla antes e após o TACTH..................................................................................................96

Figura 19. Porcentagem de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de citocinas intracelulares do padrão

TH1 em pacientes com diabete melito tipo 1 pré- e pós-TACTH................................................100


TH2 em pacientes com diabete melito tipo 1 pré- e pós-TACTH................................................101


TH1 em pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-TACTH...................................................104


TH2 em pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-TACTH...................................................105

Figura 23. Padrões de reconstituição do repertório da cadeia Vβ do TCR pós-TACTH nos pacientes

com diabete melito do tipo 1.....................................................................................................114

Figura 24. Mudanças qualitativas na composição do repertório da cadeia Vβ do TCR após o TACTH

nos pacientes com diabete melito do tipo 1. .............................................................................116

Figura 25. Padrões de reconstituição do repertório da cadeia Vβ do TCR pós-TACTH nos pacientes

com esclerose múltipla.............................................................................................................127

Figura 26. Mudanças na composição do repertório da cadeia Vβ do TCR após TACTH nos pacientes

com esclerose múltipla.............................................................................................................129

Figura 27. Expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares do sangue periférico de pacientes

com diabete melito do tipo após o TACTH................................................................................133

Figura 28. Expressão gênica de Foxp3 em células mononucleares do sangue periférico de pacientes

com esclerose múltipla após o TACTH.....................................................................................134

Figura A.1. Análise de subpopulações linfócitárias do sangue periférico..........................................187

Figura A.2. Análise de subpopulações de células T do sangue periférico ........................................188

Figura A.3. Análise de subpopulações de células T do sangue periférico ........................................189

Figura A.4. Análise de células T naive, efetoras e de memória, e de células dendríticas do sangue

periférico..................................................................................................................................190

Figura A.5. Análise de populações de células T reguladoras CD4+CD25+ do sangue periférico......191

Figura A.6. Análise de subpopulações linfócitárias do sangue periférico..........................................192

Figura B.1. Produção de citocinas intracelulares do padrão TH1 e TH2 por subpolulações linfócitárias

................................................................................................................................................193

Figura B.2. Produção de citocinas intracelulares do padrão TH1 e TH2 por subpolulações linfócitárias

................................................................................................................................................194

Figura B.3. Análise da expressão de CD69 por células T CD3+ estimuladas com PMA e Inonomicina

................................................................................................................................................195

Figura C.1. Método de TCRBV CDR3 Spectratyping.......................................................................196

Figura C.2. Imagem de um gel de seqüenciamento.........................................................................197

Figura H.1. Reação de Real time PCR para genes GAPDH (A) e Foxp3 (B)....................................212

Figura I.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 LSM (DM1), pré

e pós-TACTH...........................................................................................................................214

Figura J.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2),

pré e pós-TACTH.....................................................................................................................219

Figura K.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 WSL (DM3),

pré e pós-TACTH.....................................................................................................................224

Figura L.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 MGB (DM4),

pré e pós-TACTH.....................................................................................................................229

Figura M.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com diabete melito do tipo 1 RFLS (DM5),

pré e pós-TACTH. ..................................................................................................................233

Figura N.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................238

Figura O.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla SSS (EM3), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................243

Figura P.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla DFG (EM4), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................248

Figura Q.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla ARJTA (EM5), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................252

Figura R.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla SHGE (EM6), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................257

Figura S.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla MFM (EM8), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................261

Figura T.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla GG (EM1), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................266

Figura U.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT no paciente com esclerose múltipla OLP (EM10), pré e

pós-TACTH..............................................................................................................................270

Figura V.1. Repertório da cadeia Vβ do RCT nos indivíduos-controle saudáveis DN12 e DN20.......274

Figura W.1. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente com

diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH .........................................................278


diabete melito do tipo 1 LSM (DM1) (A) e WLS (DM3) (B) pré- e pós-TACTH...........................279


diabete melito do tipo 1 MGB (DM4) (A) e RLFS (DM5) (B) pré- e pós-TACTH.........................280

Figura X.1. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico do paciente com

esclerose múltipla GG (DM1) (A) e SSS (EM3) (B) pré- e pós-TACTH .....................................281


esclerose múltipla DFG (EM4) (A) e ARJTA (EM5) (B) pré- e pós-TACTH...............................282


esclerose múltipla SHGE (EM6) (A) e MFM (EM8) (B) pré- e pós-TACTH ...............................283

Figura Y.1. Freqüência das famílias Vβ do RCT em linfócitos T do sangue periférico dos indivíduos-

controle saudáveis DN12 e DN20 ............................................................................................285

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Pacientes com esclerose múltipla submetidos ao TACTH..................................................38

Tabela 2. Pacientes com diabete melito do tipo 1 submetidos ao TACTH..........................................39

Tabela 3. Seqüência dos primers utilizados na amplificação das famílias Vβ do TCR........................48

Tabela 4. Tamanho esperado do produto de PCR da amplificação VB-CB (em pares de bases) para o

segmento CDR3 de 10 aminoácidos ..........................................................................................50

Tabela 5. Avaliação clínica pós-TACTH nos pacientes com esclerose múltipla..................................60

Tabela 6. Avaliação clínica pós-TACTH nos pacientes com diabete melito do tipo 1..........................61

Tabela 7. Análise da diversidade do repertório Vβ do TCRs dos pacientes com diabete melito do tipo

1 pré e seqüencialmente após o TACTH. .................................................................................111

Tabela 8. Freqüência das famílias Vβs do TCR com expansões relevantes em linfócitos T do sangue

periférico dos pacientes com diabete melito do tipo 1, pré e seqüencialmente após o TACTH..117

Tabela 9. Análise da diversidade do repertório Vβ dos TCRs dos pacientes com esclerose múltipla

pré e seqüencialmente após o TACTH.....................................................................................121

Tabela 10. Freqüência das famílias Vβs do TCR com expansões relevantes em linfócitos T do sangue

periférico dos pacientes com esclerose múltipla, pré e seqüencialmente após o TACTH. .........131

Tabela D.1. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas nos

controles saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e pós-transplante ..............198





Tabela D. 4. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controles

saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para cada

subpopulação celular analisada ...............................................................................................201

Tabela D.5. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controles

saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para cada

subpopulação celular analisada ...............................................................................................202

Tabela E.1. Valores de média, desvio padrão e mediana das subpopulações celulares analisadas nos

controles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-transplante ......................203





Tabela E.4. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controles

saudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para cada subpopulação

celular analisada......................................................................................................................206

Tabela E.5. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controles

saudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para cada subpopulação

celular analisada......................................................................................................................207

Tabela F.1. Valores da média, desvio padrão e mediana das populações de células T CD4+ ou CD8+

produtoras de citocinas nos controles saudáveis e pacientes com diabete melito do tipo 1, pré- e

pós-transplante ........................................................................................................................208

Tabela F.2. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controles

saudáveis e de pacientes com diabete melito do tipo 1 pré- e pós-transplante, para as

populações de células T CD4+ ou CD8+ produtoras de citocinas .............................................209

Tabela G.1. Valores da média, desvio padrão e mediana das populações de células T CD4+ ou CD8+

produtoras de citocinas nos controles saudáveis e pacientes com esclerose múltipla, pré- e pós-

transplante...............................................................................................................................210

Tabela G.2. Valores de p encontrados nas análises estatísticas entre os grupos de controles

saudáveis e de pacientes com esclerose múltipla pré- e pós-transplante, para as populações de

células T CD4+ ou CD8+ produtoras de citocinas.....................................................................211

Tabela I.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e

freqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com

diabete melito do tipo 1 LSM (DM1), pré- e pós-TACTH...........................................................215

Tabela J.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


diabete melito do tipo 1 ALSR (DM2), pré- e pós-TACTH .........................................................220

Tabela K.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


diabete melito WSL (DM3), pré- e pós-TACTH.........................................................................225

Tabela L.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


diabete melito do tipo 1 MGB (DM4), pré- e pós-TACTH ..........................................................230

Tabela M.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


diabete melito do tipo 1 RLFS (DM5), pré- e pós-TACTH .........................................................234

Tabela N.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla GG (EM1), pré- e pós-TACTH.....................................................................239

Tabela O.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla SSS (EM3), pré- e pós-TACTH....................................................................244

Tabela P.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla DFG (EM4), pré- e pós-TACTH ...................................................................249

Tabela Q.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e

freqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico do paciente com com

esclerose múltipla ARJTA (EM5), pré- e pós-TACTH................................................................252

Tabela R.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla SHGE (EM6), pré- e pós-TACTH.................................................................258

Tabela S.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla MFM (EM8), pré- e pós-TACTH...................................................................262

Tabela T.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla WRS (EM9), pré- e pós-TACTH ..................................................................267

Tabela U.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e


esclerose múltipla OLP (EM10), pré- e pós-TACTH..................................................................271

Tabela V.1. Freqüência individual (%) dos segmentos da região CDR3 de cada família Vβ do RCT e

freqüência total (%) de cada família Vβ em linfócitos T do sangue periférico dos indivíduos-

controle saudáveis DN12 e DN20 ............................................................................................275

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

� aa - aminoácido

� APC - do inglês “antigen presenting cell” ou célula apresentadora de antígeno

� ATG - do inglês “anti-thymocyte-globulin” ou globulina anti-linfocitária

� BEAM - BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan

� CD - do inglês "cluster of differentiation", ou grupamento de diferenciação

� CDR - do inglês “complementary determinant region”, ou região determinante de

complementariedade

� CTLA-4 - do inglês “citotoxic T lymphocyte-associated molecule-4”, ou molécula 4 associada ao

linfócito T citotóxico

� DAIs - Doenças auto-imunes

� DEPC - dietilpirocarbonato

� DM - Diabete melito do tipo 1

� DMSO - dimetilsulfóxido

� DNA - do inglês “desoxirobonucleic acid” ou ácido desoxirribonucléico

� dNTP - desoxi-nucleotídeos trifosfato

� EAE - do inglês “experimental autoimmune encephalomyelitis”, ou encefalite auto-imune

experimental

� EDSS - Expanded Disability Status Score

� EDTA - sal di-sódico do ácido etilenodiaminotetracético

� EM - Esclerose Múltipla

� FACS - do inglês "Fluorescence-Activated Cell Sorter"

� FITC - do inglês "fluorescein isothiocyanate" ou isotiocianato de fluoresceína

� G-CSF - do inglês “granulocyte-colony stimulating factor” ou fator estimulador de colônias de

granulócitos

� GM-CSF - do inglês “granulocyte macrophage-colony stimulating factor” ou fator estimulador de

colônias de granulócitos e macrófagos

� HLA - do inglês “Human Leukocyte Antigens” ou antígenos leucocitários humanos

� IFN-γ - do inglês “gamma interferon” ou interferon gama

� IL - interleucina

� LES - Lúpus eritematoso sistêmico

� MBP - do inglês “myelin basic protein” ou proteína básica de mielina

� MHC - do inglês “Major Histocompatibility Complex” ou Complexo Principal de

Histocompatibilidade

� PBMCs - do inglês “peripheral blood mononuclear cells”, ou células mononucleares de sangue

periférico

� PBS - do inglês “phosphate buffer saline”, ou tampão salina fosfato

� PE - "PhycoErythrin" ou ficoeritrina

� PCR - do inglês "polymerase chain reaction" ou reação de polimerização em cadeia

� Pré-cond - pré-condicionamento

� Pré-mob - pré-mobilização

� q.s.p - quantidade suficiente para

� TCR - inglês “T cell receptor”, ou receptor de célula T

� RNA - do inglês “ribonucleic acid” ou ácido ribonucléico

� RNAm - ácido ribonucléico mensageiro

� RPMI - meio Roswell Park Memorial Institute

� SBF - soro bovino fetal

� TA - temperatura ambiente

� TACTH - Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas

� TCTH - Transplante de células tronco hematopoéticas

� TH - T "helper” - células T auxiliadoras

� TNF-α - do inglês “tumor necrosis factor alpha” ou fator de necrose tumoral alfa

� Treg - célula T reguladora

� Tris - Tris-hidroximetil aminometano básico

� Tx - transplante

� Vα - região variável da cadeia alfa do receptor de célula T

� Vβ - região variável da cadeia beta do receptor de célula T

SUMÁRIO

1 Introdução....................................................................................................................................1

1.1 Auto-imunidade e doenças auto-imunes.................................................................................2

1.2 Diabete melito do tipo 1..........................................................................................................9

1.3 Esclerose múltipla ................................................................................................................13

1.4 Transplante de células tronco hematopoéticas em doenças auto-imunes .............................17

1.5 Mecanismos de ação do TCTH autólogo em doenças auto-imunes ......................................23

1.6 Repertório do receptor de células T em doenças auto-imunes..............................................28

2 Objetivos ...................................................................................................................................31

2.1 Objetivo geral .......................................................................................................................32

2.2 Objetivos específicos............................................................................................................32

3 Casuística, Material e Métodos ..................................................................................................33

3.1 Delineamento do estudo.......................................................................................................34

3.2 Casuística ............................................................................................................................34

3.3 Controles saudáveis.............................................................................................................37

3.4 Isolamento das células mononucleares do sangue periférico................................................37

3.5 Imunofenotipagem das subpopulações celulares do sangue periférico .................................39

3.6 Detecção de citocinas intracelulares em linfócitos T ativados................................................41

3.7 Extração de RNA pelo método de Trizol ...............................................................................43

3.7.1 Eletroforese de amostras de RNA em gel de agarose sob condições desnaturantes ....44

3.8 Transcrição reversa..............................................................................................................45

3.8.1 Validação da transcrição..............................................................................................45

3.9 Método de TCRBV CDR3 Spectratyping...............................................................................46

3.9.1 Reação de PCR (Vβ-Cβ) para determinação das famílias Vβ do Receptor de Células

(TCR) ....................................................................................................................................46

3.9.2 Reação de elongação Vβ-Cβ (Run-off).........................................................................47

3.9.3 Preparo do gel de seqüenciamento..............................................................................47

3.9.4 Preparo das amostras e aplicação no gel de seqüenciamento......................................48

3.9.5 Perfil da região CDR3 do RTC, cálculo do tamanho da região CDR3 do RTC e da

freqüência das famílias Vβ, pelo método de TCRBV CDR3 Spectratyping ..................................49

3.10 Análise da expressão de Foxp3 por Real Time RT- PCR..................................................51

3.11 Análise estatística ............................................................................................................53

4 Resultados.................................................................................................................................55

4.1 Resultados Clínicos..............................................................................................................56

4.1.1 Pacientes com esclerose múltipla.................................................................................56

4.1.2 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ........................................................................57

4.2 Avaliação da reconstituição imunológica após o TACTH.......................................................62


4.2.2 Pacientes com esclerose múltipla.................................................................................81

4.3 Avaliação do perfil de citocinas após o TACH.......................................................................97


4.3.2 Pacientes com esclerose múltipla...............................................................................102

4.4 Análise da diversidade do repertório de linfócitos T ............................................................106

4.4.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ......................................................................109


4.5 Análise da expressão do gene Foxp3 em células mononucleares.......................................132

4.5.1 Pacientes com diabete melito do tipo 1 ......................................................................132


5 Discussão ................................................................................................................................135

5.1 Avaliação da reconstituição imunológica após o TACTH.....................................................136

5.2 Perfil de citocinas após o TACTH .......................................................................................154

5.3 Diversidade do repertório de células T após o TACTH........................................................157

5.4 Análise da reconstituição de células T reguladoras e da expressão de Fopx3 após o TACTH...

..........................................................................................................................................162

6 Conclusões..............................................................................................................................166

Referências ....................................................................................................................................170

Apêndices e Anexo.........................................................................................................................186

1 Introdução

Introdução 2

1.1 Auto-imunidade e doenças auto-imunes

As doenças auto-imunes (DAIs) constituem um grupo complexo e heterogêneo de doenças

que ocorrem em 3-5% da população geral. As DAIs são caracterizadas pela perda da tolerância

imunológica a antígenos próprios e conseqüente destruição tecidual por células auto-reativas e auto-

anticorpos (revisado por Davidson e Diamond, 2001; Marrack et al., 2001). Nas doenças auto-imunes

órgão-específicas (por exemplo, diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla), as células auto-

reativas e auto-anticorpos são direcionados contra componentes próprios expressos somente num

tecido ou tipo celular específico. Nas doenças auto-imunes sistêmicas (por exemplo, lúpus

eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica e artrite reumatóide), as células auto-reativas e auto-

anticorpos são direcionados contra vários auto-antígenos que são usualmente expressos numa

grande variedade de tecidos, estando presentes no núcleo, no citoplasma ou na superfície celular

(revisado por Davidson e Diamond, 2001; Marrack et al., 2001). Critérios para auto-imunidade foram

definidos por Rose e Bona (1993), que postularam que a prova direta da auto-imunidade em

humanos é a capacidade de transferir adotivamente a doença pela transferência de células imunes;

prova indireta é a capacidade de transferir uma doença auto-imune experimental (que mimetiza a

doença auto-imune humana) pela transferência adotiva de células imunes, e a demonstração de que

a doença responde a agentes imunossupressores.

As DAIs constituem uma importante causa de morbidade e mortalidade ao redor do mundo.

Várias dessas doenças são muito difíceis de tratar e impossíveis de curar, pela razão óbvia de que os

alvos da resposta imune, os auto-antígenos, não podem ser eliminados. As DAIs representam um

problema econômico-social relevante, pois afetam freqüentemente adultos jovens, principalmente

mulheres (revisado por Rioux e Abbas, 2005).

Durante vários anos o dogma central da imunologia baseava-se na deleção clonal de células

auto-reativas como único mecanismo de tolerância imunológica para a prevenção da auto-imunidade.

A visão atual sobre tolerância imunológica reconhece que um nível baixo de auto-reatividade é

fisiológico (Dighiero e Rose, 1999) e crucial para o funcionamento normal do sistema imune. Auto-

antígenos ajudam a formar o repertório de linfócitos maduros e a sobrevivência das células T naive e

de células B na periferia requer exposições contínuas a antígenos próprios (Goldrath e Bevan, 1999).

Uma vez que não existem diferenças fundamentais entre as estruturas de antígenos próprios e de

antígenos não-próprios, a idéia é que os linfócitos evoluíram não para distinguir o “próprio” do “não-

Introdução 3

próprio”, com tinha sido proposto anteriormente, mas para responder a antígenos somente em certos

microambientes, geralmente na presença de citocinas e outros fatores inflamatórios. Assim,

atualmente a auto-reatividade não é mais vista mais como patológica, mas sim como fisiológica. Uma

vez que a auto-reatividade é fisiológica, o desafio é entender como isso se torna um processo

patológico e como as células imunes, principalmente células T e B, contribuem para a injúria tecidual

(Davidson e Diamond, 2001).

Portanto, as DAIs se desenvolvem quando linfócitos auto-reativos escapam dos mecanismos

de tolerância imunológica, são ativados e começam a atacar os tecidos próprios. Embora os

mecanismos pelos quais isso ocorre ainda não sejam completamente esclarecidos, acredita-se que o

desenvolvimento de DAIs é resultante de uma interação entre fatores genéticos, fatores ambientais e

eventos estocásticos (revisado por Rioux e Abbas, 2005). As baixas taxas de concordância para as

DAIs entre gêmeos idênticos sugerem uma contribuição fundamental de fatores ambientais para

desenvolvimento da auto-imunidade. Os genes de suscetibilidade descritos são relacionados a

moléculas de HLA, citocinas, moléculas co-estimuladoras, vias de sinalização de apoptose,

receptores de antígenos, células reguladoras, depuração de imunocomplexos, e dentre outros

(revisado por Marrack et al., 2001).

De acordo com a suscetibilidade genética, as DAIs podem ser classificadas como simples ou

complexas. As DAIs simples são causadas por alterações num único gene, tais como as doenças:

ALPS (autoimmune lymphoproliferative syndrome; causada por mutações nos genes Fas ou FasL,

que levam à ausência de apoptose de linfócitos T e B auto-reativos), a IPEX (immune dysregulation,

polyendocrinopathy, enteropathy , X-linked syndrome; causada por mutação do gene Foxp3, que leva

à ausência de geração de células T reguladoras) e a APS-1 (autoimmune polyendocrine syndrome;

causada por mutação do gene AIRE, que leva à expressão diminuída de auto-antígenos no timo,

resultando na seleção negativa defeituosa de células T auto-reativas).

Por outro lado, as DAIs complexas resultam da combinação de vários alelos de

suscetibilidade (de lócus diferentes), fatores ambientais (tais como níveis de hormônios, infecções

virais ou microbianas, dieta) e de eventos estocásticos. Exemplos de DAIs complexas são o lúpus

eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica, artrite reumatóide, diabete melito do tipo 1, esclerose

múltipla, doença de Crohn, dentre outras (revisado por Rioux e Abbas, 2005).

Introdução 4

Mecanismos de tolerância imunológica

Tolerância central e periférica

A diversidade dos repertórios de células T e B são gerados durante o desenvolvimento

dessas células no timo e na medula óssea, respectivamente, através de mecanismos de

recombinação somática que envolvem o rearranjo dos genes dos TCRs (T cell receptors, ou

receptores de células T) e dos BCRs (B cell receptors, ou receptores de células B), resultando em

uma diversidade enorme de células T ou B que expressam receptores de diferentes especificidades.

Cada célula T ou B apresenta um único receptor rearranjado entre de bilhões de possibilidades. No

caso das células B, diversidade adicional é gerada pelo processo de hipermutação somática, que

consiste na substituição de nucleotídeos nos genes dos BCRs, e ocorre nos órgãos linfóides

periféricos durante fases tardias da resposta imune.

O repertório de células T é determinado pelos processos de seleção positiva e negativa que

ocorrem no timo, durante os quais os timócitos são selecionados e amadurecem. A afinidade do TCR

por complexos MHC-peptídeo próprio é o parâmetro crucial que determina o destino do timócito e

constitui a base dos processos seleção positiva e negativa. Assim, timócitos cujos TCRs não

reconhecem ou reconhecem com afinidade muito baixa os complexos MHC-peptídeos-próprios,

morrem por negligência, sendo este o destino da maioria dos timócitos. Os timócitos duplo-positivos

que expressam TCRs com baixa afinidade por complexos MHC-peptídeos próprios, apresentados por

células epiteliais do córtex tímico do indivíduo, recebem sinais para sobreviver e se diferenciar em

células T maduras. Esse processo é chamado de seleção positiva. Já, os timócitos duplo-positivos

cujos TCRs apresentam alta afinidade por complexos MHC-peptídeos próprios são selecionados pelo

processo de seleção negativa que será discutido adiante.

Entre 20 a 50% dos TCRs e dos BCRs gerados pela recombinação V(D)J ligam-se com

afinidade potencialmente perigosa à auto-antígenos (revisado por Goodnow et al., 2005). Uma vez

que somente 3-5% da população desenvolve doenças auto-imunes, é notável que esse número

imenso de receptores auto-reativos é tão bem regulado na maioria das pessoas. Esta regulação

deve-se a mecanismos de tolerância imunológica que lidam com as células T e B que expressam

esses receptores auto-reativos com alta afinidade por antígenos próprios. Os mecanismos de

tolerância imunológica pode ser divididos em mecanismos de tolerância central e mecanismos de

tolerância periférica. Na tolerância central, linfócitos imaturos que reconhecem antígenos próprios

Introdução 5

com alta afinidade nos órgãos linfóides centrais (medula óssea para as células B e timo para as

células T) morrem por apoptose (deleção clonal), ou fazem “edição” do receptor, ou são

funcionalmente “inativados” (anergia clonal). Na tolerância periférica, os linfócitos auto-reativos

maduros que encontram auto-antígenos na periferia são mortos por apoptose induzida por ativação,

ou são funcionalmente “inativados” (anergia clonal), ou são controlados por mecanismos supressores

mediados por células T reguladoras (revisado por Walker e Abbas, 2002; Goodnow et al., 2005).

O principal mecanismo de tolerância central é a deleção clonal, que constitui a morte dos

linfócitos que apresentam receptores “proibidos” ou auto-reativos com alta afinidade por antígenos

próprios, por apoptose. Outro mecanismo é a edição do receptor, ou seja, a célula que apresenta um

receptor com alta afinidade por antígenos próprios pode “editar” esse receptor, passando por outra

recombinação V(D)J para apresentar um receptor diferente que não seja auto-reativo. Esse é um dos

principais mecanismos de tolerância no desenvolvimento de células B. O terceiro mecanismo de

tolerância central constitui em mudanças bioquímicas intrínsecas e mudanças na expressão gênica

que reduzem a capacidade da célula de ser ativada através do receptor auto-reativo. Esse fenômeno

é chamado de anergia clonal, ou seja, um estado de não-responsividade ao antígeno específico,

mesmo em condições ótimas de estimulação (revisado por Hogquist et al., 2005).

Em relação às células T, o mecanismo principal da tolerância central é a deleção clonal, ou

seja, a eliminação dos timócitos que expressam TCRs com alta afinidade por antígenos próprios

apresentados por células dendríticas e células epiteliais da medula do timo (deleção clonal). Os

mecanismos de tolerância central por anergia clonal e edição de receptor também ocorrem, mas têm

um papel menos importante. Esses três mecanismos “inativam” ou eliminam células T auto-reativas

de alta afinidade e são considerados os mecanismos de seleção negativa (revisado por Hogquist et

al., 2005). No entanto, vale notar que durante a seleção negativa no timo, algumas células T que

apresentam afinidade alta por auto-antígenos são selecionadas por mecanismos ainda não

completamente esclarecidos, resultando na diferenciação de células T com fenótipo “regulador”

(revisado por Hogquist et al., 2005).

Finalmente, se células T e B auto-reativas evadirem os três mecanismos de tolerância central

descritos acima, fenômeno chamado de “ignorância imunológica”, mecanismos de tolerância

periférica se tornam responsáveis pelo controle das mesmas na periferia (revisado por Walker e

Introdução 6

Abbas, 2002; Goodnow et al., 2005). Dentre eles, vale destacar o mecanismo periférico de supressão

ativa das células auto-reativas por células T reguladoras que será discutido a seguir.

Células T reguladoras

Como discutido anteriormente, o sistema imune desenvolveu vários mecanismos para

estabelecer e sustentar a auto-tolerância imunológica (a ausência de resposta a antígenos próprios),

incluindo eliminação física (deleção clonal) ou inativação funcional (anergia). Existem várias

evidências de que a supressão ativa de células T auto-reativas, mediada por células T, constitui um

outro mecanismo essencial de auto-tolerância (revisado por Shevach, 2000; Maloy e Powrie, 2001;

Coutinho et al., 2001; Sakaguchi, 2004). Embora a idéia de células T que controlam negativamente

respostas imunes não seja nova para os imunologistas, já houve grande controvérsia em relação à

sua existência e se elas constituem uma entidade celular funcionalmente distinta. Além disso, houve

dúvidas de sua importância no controle de desordens imunológicas como as doenças auto-imunes.

Nos últimos anos, entretanto, ressurgiu o interesse pelas células T supressoras ou reguladoras em

várias áreas da imunologia básica e clínica (revisado por Sakaguchi, 2004; Baecher-Allan e Hafler,

2004). Este interesse é parcialmente devido ao melhor entendimento de que o sistema imune normal

produz endogenamente, uma subpopulação de células T que é altamente especializada para função

supressora e que anormalidades no número ou função dessas células podem ser a causa de

doenças auto-imunes ou inflamatórias em animais ou em humanos (revisado por Sakaguchi, 2004).

A co-existência de células T auto-reativas e protetoras foi revelada pela auto-imunidade

sistêmica observada em camundongos linfopênicos após a transferência de células T CD4+ naive, ou

pela proteção contra o desenvolvimento da auto-imunidade conferida pela co-transferência de uma

subpopulação de células T CD4+ que expressa cadeia α do receptor de IL-2 (CD25) (Sakaguchi et al.,

1995). Evidências recentes sugerem que as próprias células T CD4+CD25+ são auto-reativas, e que

esta propriedade tem um papel essencial no desenvolvimento da linhagem de células T reguladoras

(Tregs). Assim, a auto-reatividade pode ser benéfica como parte de um mecanismo celular dedicado

à prevenção da auto-imunidade (revisado por Kronenberg e Rudensky, 2005).

A maioria das Tregs são CD4+ e expressam constitutivamente a molécula CD25 (cadeia α do

receptor de IL-2, IL-2Rα) (Sakaguchi et al., 1995). São produzidas normalmente pelo timo como uma

subpopulação de células T funcionalmente distintas e maduras, e constituem aproximadamente 2-

Introdução 7

10% da população de células T CD4+ (revisado por Sakaguchi, 2004). Além da geração tímica de

células Tregs CD4+CD25+, células T periféricas não-Treg podem adquirir a expressão de Foxp3 e

converter-se em células Tregs in vivo após estimulação antigênica crônica ou em condições de

linfopenia (Apostolou e Boehmer, 2004; Curotto de Lafaille et al., 2004; Walker et al., 2003).

As células Tregs CD4+CD25+ produzem citocinas reguladoras tais como IL-10, IL-4 e TGF-β

(transforming growth factor-β), e também expressam preferencialmente as moléculas CTLA-4

(cytotoxic T lymphocyte antigen-4, regulador negativo da ativação de células T; receptor para CD80 e

CD86), GITR (glucocorticoid-induced TNFR-family related receptor) e PD-1 (programmed death-1).

Entretanto, a identificação de Tregs durante respostas imunes ou em tecidos inflamados é complicada

porque a maioria desses marcadores, inclusive o CD25, são também expressos em células T recém-

ativadas não-reguladoras (revisado por Sakaguchi, 2004). Recentemente, a molécula CD27 foi

identificada como um marcador estável em células Tregs que pode ser usado em conjunto com CD25

para distinguir Tregs de células T efetoras em tecidos inflamados (Ruprecht et al., 2005).

As Tregs CD4+CD25+ são funcionalmente competentes quando isoladas ex vivo, e após

estimulação pelo TCR são capazes de suprimir a proliferação e produção de IL-2 de células T

CD4+CD25- ou células T CD8+ de maneira contato-dependente (revisado por Shevach, 2000;

Sakaguchi, 2004). Experimentos de transferência adotiva usando células marcadas revelaram que as

células Tregs proliferam in vivo e sobrevivem por longos períodos, mostrando sua capacidade de

auto-renovação (Gavin et al., 2002). Vale ressaltar que, após expansão, as células Tregs mantém ou

até aumentam sua capacidade supressora. Estes dados, em combinação com a origem tímica das

células Tregs, sugerem que estas células constituem mesmo uma linhagem celular específica.

Vários mecanismos tentar explicar a supressão mediada por células Tregs in vivo.

Primeiramente, a expressão elevada pelas células Tregs do IL-2R de alta afinidade pode resultar na

competição pela IL-2 com as outras células. No entanto, é improvável que esse seja o principal

mecanismo, pois mesmo na presença de IL-2 exógena, as células Tregs inibem a regulação positiva

de RNAm de IL-2 em células T respondedoras (Thornton et al., 2004). Além da privação de IL-2, duas

citocinas imunossupressoras, IL-10 e TGF-β, foram implicadas num mecanismo supressor ativo

mediado por células Tregs in vivo (revisado por Sakaguchi, 2004). No entanto, outros tipos celulares,

incluindo células T não-reguladoras, produzem essas citocinas.

Introdução 8

Estudos in vitro mostraram que as células Tregs suprimem respostas de células T CD4+ ou T

CD8+ por um mecanismo contato-dependente, mas independente de IL-10 e TGF-β (revisado por

Shevach, 2000). Foi sugerido que esse mecanismo envolve a sinalização “reversa” pelo crosslinking

de moléculas B7 na superfície de células dendríticas ou de células T, após ligação à CTLA-4 (o

receptor de alta afinidade para as moléculas B7 que é expresso em níveis elevados pelas células

Tregs). Em células dendríticas, o crosslinking das moléculas B7 leva à indução de indoleamine-2,3-

dioxygenase (IDO), resultando na depleção local de triptofano (Mellor et al., 2004). Em células T, as

conseqüências bioquímicas da ligação das moléculas B7 pelo CTLA-4 expresso nas células Tregs

são desconhecidas. Foi mostrado também que, em camundongos e humanos, células Tregs ativadas

são capazes de matar células T-alvo pela via dependente da perforina e granzima (Grossman et al.,

2004). Em resumo, apesar do acúmulo de informação sobre os mecanismos moleculares da função

supressora das células Tregs CD4+CD25+, estes ainda não foram totalmente identificados e

esclarecidos (revisado por Kronenberg e Rudensky, 2005).

Embora a expressão de CD25 venha sendo essencial para o isolamento e enumeração das

células Tregs CD4+CD25+, seu emprego como um marcador fenotípico de células Tregs CD4+CD25+

durante respostas imunes é muito limitado, pois células T CD4+ e T CD8+ recém-ativadas, não-

reguladoras, expressam transientemente a molécula CD25. A busca por um marcador específico de

células Tregs em camundongos resultou na identificação do fator de transcrição Foxp3, que é

expresso em células Tregs mas não em células T recentemente ativadas. Foi mostrado que as

células Tregs CD4+CD25+ expressam especificamente o gene regulador Foxp3, que codifica um fator

de transcrição chamado de forkhead transcription factor 3, que controla seu desenvolvimento e

função (Hori et al., 2003; Fontenot et al., 2003; Khattri et al., 2003). A expressão retroviral do gene

Foxp3 em células T periféricas CD4-CD25+ de camundongos ou humanos resultou na aquisição da

função supressora por essas células. Portanto, a expressão de Foxp3 pode ser usada como um

marcador molecular específico para células Tregs CD4+CD25+ (revisado por Kronenberg e Rudensky,

2005).

Alguns anos antes da identificação do Foxp3 como marcador específico de células Tregs,

mutações no gene Foxp3 (localizado no cromossomo X) tinham sido identificadas como causa de

uma desordem auto-imune fatal observada em pacientes (denominada IPEX, immune dysregulation,

polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) e em camundongos mutantes que desenvolvem

Introdução 9

espontaneamente esta doença auto-imune (denominados scurfy mice). A doença se manifesta em

homens, mas não em mulheres heterozigotas. No entanto, aproximadamente 50% das células T

dessas mulheres não expressam Foxp3 (Bennett et al., 2001; Brunkow et al., 2001).

Durante o desenvolvimento das células T, timócitos com alta afinidade por complexos MHC-

peptídeo próprio podem vir a regular positivamente o gene Foxp3 em resposta ao aumento do tempo

ou da força de sinalização pelo TCR, em combinação com a sinalização por CD28 e com outros

sinais desconhecidos. Após a indução de Foxp3, timócitos se transformam numa linhagem de células

Tregs e têm função de manter as respostas de células T sob controle, desse modo prevenindo a auto-

imunidade (revisado por Fontenot e Rudensky, 2005; Kronenberg e Rudensky, 2005).

Embora outras populações de células T potencialmente supressoras tenham sido descritas

(células NKT, TR1, TH3 e outras), seus mecanismos de geração e função ainda não estão bem

esclarecidos, bem como suas funções supressoras ainda não foram realmente comprovadas

(revisado por Bach, 2003). Desse modo, atualmente, os pesquisadores têm se concentrado no estudo

das funções das células Tregs CD4+CD25+Foxp3+. Existem várias evidências atuais de que as células

Tregs CD4+CD25+Foxp3+ atuam na supressão da ativação imune, funcionando como mediadores

críticos da homeostasia imune e da auto-tolerância (Fontenot e Rudensky, 2005). Assim, tem sido

mostrado que a população de células Tregs CD4+CD25+Foxp3+ é ativamente engajada no controle de

uma variedade de respostas imunes fisiológicas e patológicas e podem ser exploradas não somente

para a prevenção de ou tratamento de doenças auto-imunes, mas também para a indução de

tolerância a antígenos não-próprios (tolerância a transplantes), controle negativo de respostas imunes

aberrantes (como alergias) e aumento da defesa do hospedeiro (por exemplo, na imunidade tumoral e

imunidade microbiana) (revisado por Sakaguchi, 2004; Sakaguchi, 2005).

1.2 Diabete melito do tipo 1

O diabete melito do tipo 1 (DM), é uma doença auto-imune órgão-específica mediada por

células T de padrão TH1, e caracterizada pela destruição seletiva de células β pancreáticas

produtoras de insulina. A doença clínica manifesta-se somente após destruição de aproximadamente

80-90% das células β. O processo destrutivo das células β leva à falta do hormônio insulina, que

resulta num estado de hiperglicemia, devido ao aumento da produção hepática de glicose e

diminuição da captura de glicose da circulação. Na ausência de insulina, também ocorre um aumento

Introdução 10

da quebra de gordura e da oxidação de ácidos graxos, que resulta numa excessiva produção de

cetonas. Se não tratados, os distúrbios metabólicos levam progressivamente à depressão do sistema

nervoso central, coma e morte. Assim, pacientes necessitam de tratamento permanente com insulina

exógena para sobrevivência. Algumas complicações crônicas graves são os problemas vasculares

que levam à insuficiência renal, cegueira, doença cardíaca e úlceras crônicas. A taxa de destruição

das células β varia de paciente para paciente, mas tende a ser mais agressiva em crianças e

adolescentes. O diabete melito do tipo 1 desenvolve-se mais freqüentemente durante a infância e

adolescência, mas pode aparecer na idade adulta também (revisado por Notkins et al., 2002).

O DM é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva com insulina

(conhecida como ITT). Ensaios clínicos de tratamentos com ciclosporina, azatioprina/corticóides, ou

anticorpo monoclonal anti-CD3, visando à preservação funcional das células β, vêm sendo realizados

com resultados significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira (revisado por Palmer

et al, 2004). Mais recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas vem sendo proposto como

alternativa terapêutica para o DM.

A suscetibilidade ao DM é determinada por fatores genéticos e ambientais. A importância da

herança genética do DM foi determinada por estudos de incidência da doença em famílias

acometidas. O risco de desenvolvimento de DM em parentes de indivíduos diabéticos de primeiro

grau é de 5-6%, comparado com o risco de 0,4% na população geral. Além disso, a taxa de

concordância para a doença é muito maior em gêmeos monozigóticos (30-40%) do que em gêmeos

dizigóticos (6%) (revisado por Notkins e Lernmark, 2001; Notkins, 2002; Kelly et al., 2003). Embora

esta observação seja indicativa da grande contribuição genética para o risco de desenvolvimento de

DM, a relativa baixa taxa de concordância entre gêmeos idênticos sugere que os genes de

suscetibilidade têm baixa penetrância, ou seja, nem todos os indivíduos de alto risco para DM irão

desenvolver a doença.

Os primeiros genes de suscetibilidade para DM encontrados foram os genes que codificam

para o sistema HLA, localizados no cromossomo 6p21. Dentre os alelos de HLA que conferem

suscetibilidade estão o DRB1 (que codificam as moléculas DR3 e DR4) e os alelos DQA1 e DQB1

(que codificam as moléculas DQ2 e DQ8, respectivamente). Estudos subseqüentes demonstraram

uma associação entre o DM e a região do gene da insulina no cromossomo 11p. Embora outros lócus

de suscetibilidade tenham sido descritos posteriormente, estudos demonstraram que o lócus IDDM1

Introdução 11

(situado na região dos genes do HLA) é o principal determinante genético do risco de

desenvolvimento de DM, responsável por 42% da herança genética familiar de DM. Por outro lado, o

lócus IDDM2 (região do gene da insulina) contribui com 10% da suscetibilidade genética (revisado por

Notkins et al., 2002; Kelly et al., 2003).

A discordância entre gêmeos idênticos reflete a geração de diferentes repertórios de células

imunes através dos rearranjos randômicos dos genes que codificam os receptores das células T e B,

e a ocorrência de eventos estocásticos ou de mutações somáticas. Além disso, indica a importância

dos fatores não-genéticos ou ambientais no desenvolvimento do DM. A importância dos fatores

ambientais é apoiada pela variação sazonal da incidência do DM, com a maioria dos casos ocorrendo

entre o outono ou inverno, e a variação geográfica da incidência da doença. Os fatores ambientais

relacionados ao o risco de desenvolvimento do DM incluem infecções virais (principalmente pelos

vírus coxsackie B4 e da rubéola), dieta na infância, vacinação, influências climáticas, toxinas e

estresse (Knip e Akerblom , 1999).

O estágio precoce do DM é caracterizado por uma insulite, devida à infiltração das ilhotas

pancreáticas por células mononucleares imunes, incluindo linfócitos T e B, monócitos, células

dendríticas e células NK (Itoh et al, 1993). Embora ela possa refletir uma resposta inflamatória normal

em resposta à injúrias teciduais causadas por infecções virais por exemplo, foi mostrado que o

infiltrado celular contribui diretamente para a destruição das células β pancreáticas (revisado por

Roep, 2003). Macrófagos e células dendríticas são as primeiras células a infiltrarem as ilhotas

pancreáticas. Além de apresentaram antígenos das células β aos linfócitos, uma vez ativados

produzem citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6, TNF-α e INF-β) e óxido nítrico, e contribuem

também para a destruição das células β (revisado por Mathis et al., 2001). A detecção de células T

auto-reativas contra auto-antígenos presentes nas células β pancreáticas, que incluem a insulina, o

GAD (glutamic acid decarboxylase) e a IA-2 (protein tyrosine phosphatase 2), no sangue periférico de

indivíduos diabéticos recém-diagnosticados, demonstrou que mecanismos de auto-imunidade estão

envolvidos na destruição das células β (Naquet et al., 1988; Atkinson et al., 1992; Hawkes et al.,

2000).

Estudos em animais demonstraram que as células T têm um papel essencial na patogênese

do DM. Os camundongos NOD (Non-Obese Diabetic) desenvolvem espontaneamente diabete

insulino-dependente e compartilham várias características imunológicas e patológicas com a doença

Introdução 12

humana (revisado por Anderson e Bluestone, 2005). O desenvolvimento da doença nesses animais

requer a presença de ambas células T CD4+ e CD8+. Camundongos NOD sem timo ou NOD/scid

(severe combined immundeficiency) não desenvolvem insulite ou diabete (Ogawa et al., 1985;

Christianson et al., 1993). Além disso, células T isoladas de camundongos NOD são capazes de

transferir a doença para animais não-diabéticos e acelerar o início da diabete em camundongos NOD

neonatos (Wicker et al., 1986; Bendelac et al., 1987). Embora ambas as células T CD4+ TH1 e células

T CD8+ sejam importantes na patogênese do DM, trabalhos mostraram que as células T CD8+

citotóxicas são as principais células efetoras na destruição das células β pancreáticas.

Citocinas do padrão TH1 produzidas pelas células T CD4+ e também por T CD8+ são essenciais

para patogênese da DM, pois potencializam respostas imunes mediadas por células, incluindo a

ativação de macrófagos. Dois mecanismos celulares de destruição das células β foram descritos, o

mecanismo associado ao reconhecimento (1) e o mecanismo associado à ativação (2) (revisado por

Mathis et al., 2001; Roep et al., 2003; Jun et al., 2002). No mecanismo (1) a célula T CD8+ é ativada

diretamente pelo reconhecimento de antígenos das células β apresentados por moléculas de MHC de

classe I presentes nas próprias células β pancreáticas. A ativação das células T CD8+

conseqüentemente provoca a morte das células β por contato célula-célula através das vias de

sinalização por Fas/FasL (Itoh et al., 1997) ou perforina/granzima (Kagi et al., 1997). De acordo com o

segundo mecanismo (2), as células T CD4+ ou T CD8+ reconhecem antígenos das células β

indiretamente, apresentados por APCs (células dendríticas ou macrófagos) no contexto de moléculas

de MHC de classe II ou classe I, respectivamente. A ativação resultante das células T leva à morte

das células β mediada por células T CD8+ citotóxica (através de receptores de superfície Fas/FasL ou

TNF-α/TNF-R), à liberação de citocinas pró-inflamatórias e mediadores de morte celular pelas células

T, à ativação de macrófagos com conseqüente aumento de sua capacidade citotóxica, e à ativação

das células β e estimulação da produção de mediadores de morte célula por elas mesmas (revisado

por Mathis et al., 2001; Roep et al., 2003; Jun et al., 2002).

A etiologia auto-imune do DM é também demonstrada pela presença de auto-anticorpos

circulantes específicos contra antígenos das células β pancreáticas. Estes auto-anticorpos são

detectados em 85-90% dos indivíduos com DM ao diagnóstico. Ainda não está claro se eles

participam diretamente da destruição das células β ou aparecem secundariamente devido à liberação

Introdução 13

de auto-antígenos das ilhotas danificadas por outros componentes do sistema imune. Não obstante,

os auto-anticorpos são ótimos marcadores da patogênese do DM. O aparecimento deles precede o

início da doença clínica, freqüentemente em vários meses a vários anos (revisado por Notkins, 2002),

o que explica o fato dos pacientes apresentarem auto-anticorpos contra vários antígenos das células

β no momento em que os sintomas clínicos se tornam aparentes. Desse modo, a presença de vários

auto-anticorpos pode ser usada como um marcador sensível para prever os riscos de

desenvolvimento do DM, embora alguns indivíduos positivos para auto-anticorpos não desenvolvam a

doença auto-imune (Bingley et al., 1997).

1.3 Esclerose múltipla

A esclerose múltipla (EM) é uma doença auto-imune inflamatória, mediada por células T de

padrão TH1, que afeta especificamente o sistema nervoso central (SNC). A EM, assim como outras

DAIs, geralmente se manifesta em adultos jovens, acometendo principalmente mulheres.

Em seu início, a EM é clinicamente caracterizada como EM surto-remissiva (EM-SR,

observada em 85-90% dos pacientes) ou EM progressiva primária (EM-PP, observada em 10-15%

dos pacientes). As recaídas (ou “ataques”, ou “surtos”) são tipicamente subagudas, uma vez que os

sintomas se desenvolvem durante algumas horas a vários dias, persistem por vários dias a semanas,

e depois se dissipam gradualmente. Os surtos são provavelmente causados pela entrada de células T

auto-reativas ativadas (anti-mielina) no SNC, causando inflamação aguda associada à edema. A

capacidade dos esteróides de rapidamente interromper os sintomas da EM, sugere que o edema

agudo e sua subseqüente resolução correspondem à recaída clínica (surto) e à remissão,

respectivamente.

A progressão dos pacientes com EM-SR é muito variável. Em geral, se não forem tratados

aproximadamente 50% dos pacientes necessitarão de apoio para caminhar dentro de dez anos após

o início da EM. No início da doença, as lesões que capturam gadolíneo por ressonância magnética

nuclear (RMN) são freqüentes e consistentes com o influxo de células auto-reativas ativadas no SNC,

causando uma perturbação da barreira hemato-encefálica. O aumento na freqüência dos surtos e

recuperação inadequada nos primeiros anos da doença clínica predizem uma deterioração mais

rápida. A observação de múltiplas lesões que capturam gadolíneo por RMN também prediz um curso

mais grave da doença. (revisado por Hafler, 2004; Hemmer et al, 2002; Compston e Coles, 2002).

Introdução 14

Entretanto, com o tempo, a capacidade de recuperação após os surtos diminui e a

incapacidade neurológica começa a piorar. Aproximadamente 40% dos pacientes com EM-SR param

de apresentar os surtos e desenvolvem uma desordem neurodegenerativa progressiva secundária,

associada à inflamação crônica do SNC, conhecida como EM progressiva secundária (EM-PS). A

evolução da forma progressiva secundária da doença é associada com uma diminuição significante

da freqüência de lesões que capturam gadolíneo e do volume do parênquima cerebral (atrofia

cerebral). Enquanto no início, a forma EM-SR era sensível à imunossupressão, à medida que o tempo

passa, a resposta da EM à imunoterapia diminui e pode desaparecer em formas tardias da EM-PS.

Atualmente, ao invés de ser considerada como uma doença com duas formas, a EM vem

sendo considerada uma doença contínua, mas caracterizada inicialmente por eventos inflamatórios

agudos, e posteriormente pela indução secundária de um processo neurodegenerativo, refratário à

imunoterapia. Já a forma primária progressiva é caracterizada desde o início pela ausência de surtos,

mas por um declínio gradual da incapacidade neurológica. Clinicamente, essa forma de EM está

associada à falta de resposta a qualquer forma de imunoterapia (revisado por Hafler, 2004; Hemmer

et al, 2002; Compston e Coles, 2002).

O conceito da EM como uma doença auto-imune inflamatória deriva do fato que a EM

responde a tratamentos imunomoduladores ou imunosupressores. Glucocorticóides são

administrados em altas doses durante as exacerbações clínicas da doença e atuam reduzindo a

inflamação, o edema e produção de citocinas pró-inflamatórias. O tratamento com INF-β ou com

Glatiramer-acetate (GA, copolymer-1, Cop-1) constituem terapias aprovadas para a EM-SR. Ademais,

vários agentes quimioterapêuticos que apresentam efeitos imunossupressores mais intensos e

duradouros, tais como a ciclofosfamida, mixantrone e azatioprina, são usados em estágios mais

avançados da doença, ou seja, na transição de EM-SR para EM-PS, ou em pacientes que não

respondem às terapias aprovadas (revisado por Hemmer et al, 2002; Hafler, 2004; Sospedra e Martin,

2005).

A etiologia da EM ainda não foi esclarecida, mas com base no conhecimento atual, acredita-

se que a doença se desenvolve em indivíduos geneticamente suscetíveis e requer o

desencadeamento por fatores ambientais. A EM é altamente prevalente em caucasianos (0,05 -

0,15%), mas raramente observada em asiáticos e africanos. Parentes de primeiro grau de indivíduos

afetados têm um risco aproximadamente 20-50 vezes maior de desenvolver de doença (2-5%), e a

Introdução 15

taxa de concordância entre gêmeos idênticos varia entre 20-35% em diferentes estudos (25% nos

estudos mais recentes) (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra e Martin, 2005). Indivíduos

suscetíveis apresentam um ou mais genes de suscetibilidade na região do HLA no cromossomo

6p21, que são responsáveis por 10-60% do risco genético para EM (Haines et al., 1998).

Similarmente a outras DAIs mediadas por células T, os genes do HLA que conferem suscetibilidade à

EM são o HLA-DR, o HLA-DQ, o haplótipo HLA-DR15 em caucasianos (DRB1*1501, DRB5*0101,

DQA1*0102, DQB1*0602), e outros DRs em populações etnicamente mais distantes (Haines et al.,

1998; Dyment et al., 2004).

Entre os fatores ambientais relacionados à etiologia da EM estão os agentes infecciosos

virais ou bacterianos (principalmente o herpesvírus 6, o Epstein-Barr vírus e a bactéria Chlamydia

pneumoniae), além de influências hormonais, comportamentais, climáticas e geográficas (revisado

por Coo e Aronson, 2004). Dois principais mecanismos foram propostos para explicar como infecções

virais ou bacterianas poderiam induzir a EM (bem como outras DAIs): (1), mimetismo molecular,

ativação de células auto-reativas pela reatividade cruzada entre antígenos próprios e não-próprios;

(2), bystander activation, assume que células auto-reativas sejam ativadas em decorrência de

eventos inflamatórios não-específicos que ocorrem durante as infecções. Uma terceira proposta seria

que as infecções induziriam a EM através da combinação desses dois mecanismos descritos

(revisado por Sospedra e Martin, 2005).

Rivers et al. (1933) mostraram que a injeção de suspensões de medula espinhal ou cérebro

em macacos saudáveis induzia uma doença similar à EM, levando à hipótese de que a EM tratava-se

de uma doença auto-imune. Várias décadas depois, pesquisadores mostraram que a injeção de

componentes protéicos da bainha de mielina, juntamente com um adjuvante em camundongos naive

suscetíveis, causava encefalomielite, que atualmente é conhecida como EAE (experimental

autoimmune encephalomyelitis, ou encefalomielite auto-imune experimental) (Pettinelli e McFarlin,

1981; Ben-Nun e Cohen, 1982). Trabalhos mostraram que a EAE era induzida em camundongos

naive pela transferência adotiva de células T anti-mielina, mas não pela transferência de auto-

anticorpos. Esse fato levou os pesquisadores a concluírem que a EM constitui uma doença auto-

imune mediada por células T.

As células T CD4+ TH1 auto-reativas apresentam um papel central na patogênese da EM

devido a várias observações: (1), células T CD4+ contribuem para o infiltrado de células inflamatórias

Introdução 16

encontradas no SNC e líquor, em pacientes com EM; (2), o risco genético para EM é conferido em

grande parte por moléculas HLA-DR e HLA-DQ; (3), a produção de auto-anticorpos, ativação de

células T auto-reativas CD8+ e vários outros aspectos das respostas adaptativa e inata são, pelo

menos em parte, controladas por células T CD4+ TH1 (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra e

Martin, 2005). No contexto de funções efetoras, as células T CD8+ são mais diretamente envolvidas

na injúria do SNC do que as células T CD4+, pelas seguintes razões, dentre outras: (1), exceto para a

microglia, nenhuma célula residente do SNC expressa MHC de classe II; (2), expansões oligoclonais

proeminentes de células T CD8+ são encontradas no líquor e no SNC de pacientes com EM

(Jacobsen et al, 2002); (3), a expressão de MHC de classe I é induzida em neurônios danificados. Em

resumo, ambas respostas de células T CD4+ e T CD8+ contribuem para patogênese da EM, embora

em diferentes estágios e com funções distintas (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra e Martin,

2005).

A MBP (myelin basic protein), a PLP (proteolipid protein) e a MOG (myelin oligodendrocyte

glycoprotein) constituem os principais auto-antígenos alvos de células T auto-reativas e de auto-

anticorpos em pacientes com EM. Embora a MBP seja a proteína da mielina mais estudada, ela

constitui a segunda proteína mais abundante da mielina (30-40%), após a PLP (revisado por Hemmer

et al, 2002; Sospedra e Martin, 2005).

A observação de que os níveis de imunoglobulinas encontram-se elevados no líquido

cefalorraquidiano de pacientes com EM, mas não no soro, indica uma produção local por células B.

Além disso, as imunoglobulinas apresentam uma distribuição oligoclonal, ou seja, são produzidas por

células B em expansão clonal (Qin et al., 1998). Essas observações sugerem um papel importante

para as células B e auto-anticorpos na patogênese da EM. Além de células B servirem como APCs

para células T auto-reativas, as células B auto-reativas produzem auto-anticorpos anti-mielina que

podem ser encontrados em áreas de desmielinização ativa no SNC do paciente com EM (Genain et

al, 1999). Os auto-anticorpos podem causar desmielinização pela opsonização da mielina para

fagocitose ou via ativação do sistema complemento (revisado por Hemmer et al, 2002; Sospedra e

Martin, 2005).

Introdução 17

1.4 Transplante de células tronco hematopoéticas em doenças auto-imunes

A maioria dos pacientes com DAIs tem uma expectativa de vida quase normal. No entanto,

alguns pacientes sofrem com formas de auto-imunidade graves e progressivas, resistentes a terapias

convencionais. O transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH) tem sido nos últimos anos

uma alternativa terapêutica para pacientes com essas DAIs graves e refratárias aos tratamentos

convencionais.

O TCTH envolve a administração de células tronco hematopoéticas (CTHs), que têm a

capacidade de auto-renovação e de originar todos os tipos celulares maduros do sistema

hematopoético, imunológico e possivelmente alguns tipos celulares não-hematopoéticos (Kondo et

al., 2003). O receptor é preparado para o transplante por um tratamento imunossupressor potente,

geralmente quimioterapia ou radioterapia, seguido pela infusão de células hematopoéticas autólogas

(TCTH autólogo; células coletadas do próprio paciente antes da imunossupressão) ou de células

hematopoéticas alogênicas (TCTH alogênico; células coletadas de um doador compatível), para

restaurar o sistema hematopoético e imunológico do receptor rapidamente, evitando citopenias

prolongadas (Burt et al., 2002; Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Sykes e Nikolic, 2005).

Foi mostrado que este procedimento consegue curar DAIs em modelos animais e há alguns

anos tem sido explorado em vários ensaios clínicos de faseI/II (Sykes e Nikolic, 2005; Popat et al.,

2005; Hough et al., 2005). Até agora, o TCTH autólogo tem sido preferido ao TCTH alogênico devido

à elevada toxicidade e grande potencial de rejeição observados em transplantes alogênicos. Além

disso, o risco da ocorrência de GVHD (“Graft-Versus-Host-Disease”) em TCTH alogênicos, que é

devido ao ataque de células T alogênicas do doador contra alo-antígenos do receptor, é relacionado a

taxas de mortalidade e morbidade significantes.

A iniciativa de se empregar imunossupressão em altas doses seguida de TCTH autólogo no

tratamento de DAIs partiu de dois conjuntos de evidências. O primeiro derivou da observação de

casos isolados de pacientes que apresentavam concomitantemente doença auto-imune e neoplasia

hematológica ou aplasia de medula óssea e que, após serem submetidos a transplante de medula

óssea alogênico para tratamento da doença hematológica, obtiveram remissões prolongadas da

doença auto-imune, sem recaídas da mesma (Nelson et al.,1997). Vale ressaltar que o transplante

autólogo não-manipulado, nesta mesma situação, não produziu os mesmos resultados benéficos em

alguns estudos, provavelmente devido à re-inoculação das células auto-reativas com o enxerto (Euler

Introdução 18

et al., 1996). O segundo conjunto de evidências originou-se de estudos de auto-imunidade em

modelos animais, que discutiremos a seguir.

Modelos animais de auto-imunidade e TCTH

Estudos em modelos animais estabeleceram a base racional para o transplante de células

tronco hematopoéticas em DAIs, mas também demonstraram que a suscetibilidade para DAIs parece

residir nas células hematopoéticas. O transplante de células da medula óssea de camundongos NZB

(lupus-prone) em linhagens de camundongos não-suscetíveis letalmente irradiados, induziu síndrome

lúpica nesses camundongos (Morton e Siegel, 1974). A transferência de DAIs por meio de células

hematopoéticas foi subseqüentemente confirmada para várias doenças, através de vários modelos

animais de lúpus eritematoso sistêmico (LES), encefalomielite auto-imune experimental (EAE), artrite

induzida por adjuvante, síndrome anti-fosfolípide e diabete melito do tipo 1 (Ikehara et al., 1990).

Por outro lado, resistência a DAI pode ser também transferida para linhagens de camundongos

suscetíveis por meio de células hematopoéticas. Em camundongos, o transplante de células

hematopoéticas alogênicas de linhagens de animais não-suscetíveis preveniram o desenvolvimento

de LES, diabete tipo 1, EAE e outras DAIs (Ikehara et al., 1985; Ikehara et al., 1998). Em humanos, o

papel das células hematopoéticas e das células estromais no desenvolvimento da patologia auto-

imune não é muito esclarecido. No entanto, alguns relatos clínicos sugerem uma contribuição crítica

de células tronco hematopoéticas defectivas no desenvolvimento da patologia auto-imune (Bargetzi et

al., 1997; Lampeter etal., 1998).

Infelizmente, estudos em animais mostram que a prevenção do início da auto-imunidade é

muito mais fácil do que a reversão da doença auto-imunes já estabelecida. Até 2004, por exemplo,

mais de 195 métodos para prevenção ou retardo do início de diabete tipo 1 em camundongos NOD

foram identificados (Roep et al., 2004). No entanto, somente poucas abordagens terapêuticas foram

efetivas na reversão de diabete tipo 1 e LES já estabelecidos, sendo uma delas o TCTH alogênico

(Ikehara et al., 1989; Yasumizu et al., 1987).

Os estudos que revelaram o potencial da imunossupressão em altas doses e do TCTH para o

tratamento da auto-imunidade foram realizados em vários modelos experimentais diferentes de

doenças auto-imunes (van Bekum, 2000a; van Bekum, 2000b; van Bekum, 2002), pois não existia um

consenso em relação a quais modelos seriam os mais representativos da doença auto-imune

Introdução 19

humana. Existem dois tipos distintos de modelos experimentais de doenças auto-imunes, os modelos

de doenças auto-imunes hereditárias ou espontâneas e os modelos de doenças auto-imunes

induzidas por auto-antígenos (van Bekkum, 2002). Nas doenças da primeira categoria, os fatores

genéticos predominam na patogênese da doença, e os sintomas desenvolvem com a idade na

maioria ou em todos dos membros da linhagem. Esses modelos incluem síndromes lúpus-like em

camundongos, diabete medito insulino-dependente em camundongos e ratos, e uma síndrome

complexa de artrite/colite/dermatite em ratos transgênicos para HLA-B27.

Na segunda categoria, as doenças auto-imunes não se desenvolvem espontaneamente, mas

requerem indução pela imunização com antígenos de tecidos específicos (por exemplo, antígenos de

cérebro, no caso da encefalomielite auto-imune experimental (EAE), que constitui um modelo da EM

humana; antígenos teciduais como o colágeno, no caso da artrite induzida por colágeno; ou

antígenos bacterianos como do Mycobacterium tuberculosis, no caso da artrite induzida por

adjuvantes). Foi demonstrado em experimentos de cruzamento, que a suscetibilidade e a resistência

à indução da doença auto-imunes, são amplamente determinadas geneticamente, por isso as

doenças auto-imunes só podem ser induzidas em linhagens específicas de camundongos. Entretanto,

influências ambientais também são envolvidas nas formas de doenças auto-imunes induzidas (van

Bekkum, 2003). Uma vez que a etiologia das doenças auto-imunes humanas complexas é

multifatorial, como discutido anteriormente, onde os fatores dominantes são genéticos tanto quanto

ambientais, a visão atual é que as doenças auto-imunes induzidas representem modelos de doenças

mais realísticos para investigações pré-clínicas.

No caso de DAIs espontâneas, o TCTH singênico (isto é, TCTH de um doador geneticamente

idêntico), realizado em animais jovens, não conseguiu prevenir a auto-imunidade clínica, entretanto, o

TCTH alogênico de uma linhagem resistente para outra suscetível, preveniu a doença, e em alguns

casos, quando realizado logo após o início da doença, melhorou as manifestações auto-imunes

(Yasumizu et al, 1987). Esses resultados levaram alguns pesquisadores a concluir que a auto-

imunidade decorre de alterações nas células tronco hematopoéticas (Good e Ikehara, 1997).

Em contraste, estudos em modelos de doenças auto-imunes induzidas realizados por van

Bekkum e colaboradores (2000) mostraram uma resposta terapêutica de transplante singênicos ou

pseudoautólogos no tratamento dessas doenças. Em modelos animais o TCTH singênico (isto é,

TCTH de um doador geneticamente idêntico) pode ser usado ao invés de TCTH autólogo. Por

Introdução 20

exemplo, a recuperação da paresia induzida pela EAE foi mais rápida em animais tratados com

irradiação corpórea total e transplante singênico comparada à recuperação observada em animais

não-tratados, embora transplantes alogênicos fossem melhores na prevenção de recaídas

espontâneas ou induzidas pela imunização com mielina (van Gelder e van Bekkum, 1995; van Gelder

et al., 1993).

Os resultados dos estudos de van Bekkum e colaboradores (2003) sugeriram que o sucesso do

transplante de células tronco autólogo depende da completa erradicação dos componentes efetores

da doença auto-imune, ou seja, das células T efetoras ativadas e de memória. Quando traduzidos

para a clínica, os dados experimentais indicaram que os pacientes deveriam ser submetidos a um

regime de condicionamento (ou imunossupressão) que induzisse o máximo de linfoablação e que o

enxerto fosse depletado de células T (van Bekkum, 2003). Quanto maior foi a intensidade da terapia

de condicionamento usada, maior foi o sucesso do auto-TCTH na EAE (van Bekkum, 2003; Burt et

al., 1998a).

Foi mostrado também que o período no qual o transplante é realizado é muito importante. Por

exemplo, no tratamento de EAE em camundongos SLJ, o transplante autólogo somente foi efetivo se

realizado precocemente no início da doença, antes de ocorrerem injúrias significativas do tecido alvo

Nesse caso, quase reversão completa foi conseguida, mas nenhum efeito do transplante autólogo foi

observado em estágios mais avançados da doença (Burt et al., 1998a).

Em resumo, enquanto o TCTH alogênico mostrou-se muito efetivo em reverter auto-imunidade

em todos os modelos animais estudados, o TCTH autólogo não foi capaz de reverter com sucesso,

diabete melito do tipo 1 e LES. No entanto, surpreendentemente, níveis variáveis de remissão foram

conseguidos após o TCTH autólogo em vários modelos experimentais de DAIs, como miastenia

gravis, artrite induzida por adjuvante e EAE (van Bekkum, 2003).

Assim, essas várias observações em modelos animais de TCTH autólogos ou alogênicos

sugeriram que ambas abordagens seriam benéficas para a terapia de pacientes com DAIs refratárias,

embora o TCTH autólogo seja mais seguro. Não obstante, os estudos em animais indicam que a

resistência à DAIs reside na célula tronco hematopoética e pode ser transferida por ela (Ikehara et al.,

1985; Ikehara et al., 1990; Ikehara et al., 1998). Desse modo, o transplante de células tronco

hematopoéticas alogênicas poderia resultar na possível cura da DAI, e além disso, na tolerância a

Introdução 21

antígenos do doador, permitindo a aceitação de outros tecidos do doador (por exemplo, ilhotas

pancreáticas), sem o uso de terapia imunossupressora crônica.

Além disso, a maior eficácia do TCTH alogênico em alguns modelos animais de DAIs sugere

que células T alogênicas do doador sejam capazes de eliminar linfócitos auto-reativos do receptor, e

portanto mediar a forma benéfica de imunoterapia chamada de GVA (“graft-versus autoimmunity”).

Porém, não existe razão para esperar que essas respostas imunes sejam específicas para linfócitos

auto-reativos. Após o TCTH alogênico, podem ocorrer concomitantemente respostas imune deletérias

do enxerto contra o hospedeiro (“graft-versus-host response”). Desse modo, dadas as complicações

como GVHD e falha de enxertia após o TCTH alogênico e os resultados positivos do TCTH autólogo

em modelos animais descritos acima, o TCTH autólogo é a abordagem mais lógica para o resgate

hematopoético e vem sendo amplamente utilizado em ensaios clínicos.

Mais recentemente, vários grupos têm utilizado protocolos de condicionamento não-

mieloablativos ou em doses reduzidas em TCTH alogênicos, para indução de tolerância ao

transplante e restabelecimento da auto-tolerância em modelos animais de DAIs (revisado por Sykes e

Nikolic, 2005). Embora estes avanços recentes têm tornado o TCTH alogênico menos tóxico, ele

ainda constitui um procedimento de risco que muito provavelmente não irá substituir os tratamentos

atuais para formas de DAIs menos graves e tratáveis.

Ensaios clínicos de TCTH autólogo em doenças auto-i munes

Com base em todos os fatores discutidos acima, o TCTH autólogo é atualmente preferido ao

TCTH alogênico em ensaios clínicos. Nos últimos anos, vários ensaios clínicos de imunossupressão

em altas doses seguida de TACTH foram iniciados em pacientes com esclerose múltipla (EM),

esclerose sistêmica, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico e miastenia gravis (Burt et al.,

1998b, Burt et al., 2003; Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Tyndall et al., 2005).

Esses ensaios têm utilizado regimes de condicionamento de intensidade variável, variáveis

tipos de depleção de células T (in vivo ou ex vivo) e diferentes fontes de células tronco e protocolos

de mobilização. Para obtenção das células para o TACTH, antes do condicionamento as células

tronco são mobilizadas da medula para o sangue periférico, o que permite a coleta dessas células

sem uso de anestesia geral. A maioria dos protocolos usa o G-CSF (granulocyte colony-stimulating

factor) e/ou ciclofosfamida, uma droga mielossupressora mas que leva a uma expressiva mobilização

Introdução 22

das células tronco. O protocolo do TACTH permite que tratamentos imunoablativos intensos sejam

usados nos pacientes com DAIs refratárias aos tratamentos convencionais.

Dados obtidos desses ensaios clínicos sugerem que o TACTH é viável e pode levar a remissão

das DAIs (Burt et al., 2003; Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Tyndall et al., 2005). Embora os

resultados variem de doença para doença, mais de um terço dos pacientes tem apresentado

remissões completas e prolongadas, freqüentemente sem necessidade de uso de drogas

imunossupressoras (Tyndall et al., 2005). Em algumas doenças, no entanto, recaídas são

relativamente freqüentes. No entanto, dos pacientes que recaem, vários passam a responder aos

tratamentos convencionais que não eram efetivos antes do transplante.

Desde 1996, ao redor de 1000 transplantes já foram realizados mundialmente em vários

ensaios clínicos de fase I/II. A toxicidade e mortalidade relacionada ao transplante diminuiu ao longo

do tempo com o aumento da experiência na aplicação desse tratamento, melhor seleção de pacientes

e modificações nos protocolos de tratamento. Ensaios clínicos randomizados de fase III que irão

comparar o TACTH com a terapia convencional, foram recentemente iniciados nos Estados Unidos e

Europa (Popat et al., 2005; Hough et al., 2005; Tyndall et al., 2005). Idealmente, esses resultados

irão ajudar a esclarecer se os benefícios do TACTH devem-se somente à depleção temporária os

linfócitos auto-reativos pela imunossupressão intensa ou ao restabelecimento de mecanismos de

regulação imune que limitam a auto-imunidade. Além disso, estes estudos fornecerão prova de

eficácia, que é necessária para uma aplicação mais ampla do TACTH no tratamento de DAIs.

Os pacientes com EM constituem o maior grupo de pacientes com doenças auto-imunes que já

foram tratados com TACTH até o momento (Burt et al., 2005). Estudos clínicos de fase I e II têm sido

conduzidos em pacientes com EM progressiva primária e secundária. A mobilização das células

tronco hematopoéticas é realizada com ciclofosfamida combinada com fator estimulador de colônia de

granulócitos (G-CSF) ou somente com G-CSF. O primeiro e maior grupo de transplantes foi realizado

em 85 pacientes com EM, cujos resultados foram registrados no EBMT (European Group for Blood

and Marrow Transplantation). Neste ensaio clínico, foi utilizado o regime de condicionamento BEAM

(BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan). Cerca de 6% dos pacientes faleceram devido a fatores

tóxicos, foi observada melhora neurológica em 21% dos pacientes e uma sobrevida livre de

progressão em 74% dos pacientes com doença progressiva secundária ou primária (Tyndall et al.,

2005).

Introdução 23

Nesse estudo, as lesões inflamatórias agudas do tecido nervoso, detectadas utilizando a

imagem de ressonância magnética nuclear (RMN) por captura de gadolíneo, foram significativamente

reduzidas, demonstrando a eficácia do TACTH no tratamento da EM. No entanto, foi observado que a

deterioração da função neuronal pode continuar no caso de doença em fase avançada. Um estudo

randomizado de fase III, denominado ASTIMS (Autologous Stem Cell Transplantation International

Multiple Sclerosis trial), foi iniciado na Europa em 2004 e irá avaliar aproximadamente 200 pacientes

ao longo de vários anos após o TACTH utilizando a RMN para avaliação da função neuronal dos

pacientes (Tyndall et al., 2005).

No Brasil, o TACTH em DAIs vem sendo realizado desde 2001 em alguns centros, mas

principalmente na Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo e no Hospital Israelita Albert Einstein

em São Paulo. Pacientes portadores de formas graves e progressivas de esclerose múltipla e

doenças reumáticas (lúpus eritematoso sistêmico, esclerose sistêmica e arterite de Takayasu),

refratárias às terapias convencionais, são tratados com terapia de imunossupressão em altas doses

seguida pelo TACTH (Voltarelli e Ouyang, 2003; Voltarelli et al., 2004b; Voltarelli et al., 2005a;

Voltarelli et al., 2005b). Desde o início de 2004, o TACTH está sendo realizado como tratamento de

pacientes com diabete melito do tipo 1 recém-diagnosticados, exclusivamente no Brasil (Voltarelli et

al., 2004a; Voltarelli, 2004c; Voltarelli, 2006). O objetivo do TACTH nesses pacientes é de preservar a

quantidade residual de células β das ilhotas pancreáticas (Burt et al., 2002a; Voltarelli, 2004c), uma

vez que quando a doença clínica é diagnosticada já houve a perda de aproximadamente 80-90% das

células β pancreáticas (Notkins, 2002). O TACTH é realizado nos pacientes dentro de no máximo seis

semanas após o diagnóstico. Entre os vários critérios de inclusão, um dos mais importantes, além do

diagnóstico recente, é positividade para anticorpos anti-GAD65 ao diagnóstico.

1.5 Mecanismos de ação do TCTH autólogo em doenças auto-imunes

Conforme discutido anteriormente, as DAIs são determinadas por fatores genéticos e

ambientais. Se e quando um indivíduo geneticamente predisposto desenvolverá uma doença auto-

imune, orgão-específica ou sistêmica, dependerá do contato com agentes ambientais, infecciosos ou

não-infecciosos (revisado por Marrack et al., 2001; Davidson e Diamond, 2001). Estudos

retrospectivos de pacientes que migraram de áreas de alta incidência para áreas de baixa incidência

Introdução 24

de DAIs sugerem que existe um período latente, caracterizado por um atraso de vários anos entre o

contato com o agente ambiental hipotético e o início da doença clínica (revisado por Openshaw et al.,

2002). Esses conceitos de fatores ambientais e período latente foram importantes para a constituição

da base racional do TCTH autólogo como tratamento de DAIs.

Conforme proposto por Openshaw et al. (2002), se somente a predisposição genética for

suficiente para o desenvolvimento de auto-imunidade clínica, então a predisposição para a doença

reside exclusivamente nas células tronco hematopóeticas, e o melhor resultado que pode ser

esperado do TCTH autólogo seria um efeito anti-inflamatório temporário conferido pela

imunossupressão em altas doses. Em contraste, se exposições a fatores ambientais específicos em

períodos críticos são importantes, então a terapia de imunossupressão em altas doses seguida pelo

TCTH autólogo poderia levar a uma “mudança cronológica” (“time-shift” ou “re-setting”) da doença

auto-imune clínica para um período mais precoce, análogo ao período latente, restaurando a auto-

tolerância no paciente. Esta hipótese pressupõe que respostas a re-exposição às circunstâncias

ambientais que levaram ao desencadeamento da auto-imunidade serão suficientemente diferentes,

de modo que auto-imunidade clínica não irá reaparecer (Tyndall e Koike, 2002; Openshaw et al.,

2002).

Com base nessa primeira hipótese proposta, outras três hipóteses não mutuamente

exclusivas, foram formuladas para explicar o mecanismo de ação do TACTH em DAIs (Burt et al.,

2002b; Muraro e Martin, 2003): (1) a imunoablação intensa elimina a resposta imune patogênica, (2) o

TACTH reconstitui um sistema imune novo e tolerante, (3) as células tronco hematopoéticas

promovem reparo tecidual. No entanto, apesar do rápido acúmulo de experiência clínica durante os

últimos dez anos, dados sobre o mecanismo de ação do TACTH em doenças auto-imunes humanas

eram muito escassos até 2004, quando os primeiros estudos mais elaborados de reconstituição

imunológica começaram a aparecer na literatura (Sun et al., 2004; Muraro et al., 2005; Farge et al.,

2005; de Kleer et al., 2005; Kötter et al., 2005). Atualmente, esses trabalhos apresentam informações

que começam a explicar os mecanismos de ação do TACTH baseando-se em observações da

reconstituição imunológica nos pacientes.

Atualmente, o mecanismo mais aceito e que vem sendo demonstrado nos trabalhos recentes é

a “reprogramação” do sistema imune após o TACTH, e constitui uma junção das duas primeiras

hipóteses citadas anteriormente (Burt et al., 2002b; Muraro e Martin, 2003). De acordo com esse

Introdução 25

mecanismo, primeiramente a imunossupressão em altas doses elimina as células B e T auto-reativas

de memória. Em seguida, baseando-se no fato de que fatores ambientais desconhecidos tenham um

papel essencial no desencadeamento da DAI, é possível que a eliminação do repertório de células B

e T pré-existente permita que o sistema imune do paciente reinicie do zero, gerando novas células B

e T que sejam auto-tolerantes após o TACTH (revisado por Sykes e Nikolic, 2005).

Porém, não está claro se as células T e B de memória são completamente removidas do

sistema hematopoético, linfóide e de órgãos alvos, por qualquer que seja o regime de

condicionamento. Assim, a imunoablação incompleta pode ser responsável pelas elevadas taxas de

recaída precoce observada em alguns ensaios clínicos de TACTH (Tyndall et al, 2005). Não obstante,

há evidências de melhora e remissão da DAI após TACTH mesmo com imunoablação incompleta

(revisado por Muraro e Douek, 2006).

A manutenção de reações auto-imunes depende de múltiplas populações celulares e existem

várias evidências de alterações em número e função de algumas populações celulares após o

TACTH. Por exemplo, a quimioterapia intensa induz uma redução significativa e prolongada de

células T CD4+, que é caracterizada pela inversão da razão CD4+:CD8+, predominância de células T

de memória e regeneração de células T predominantemente por mecanismos timo-independentes

(revisado por Guillaume et al., 1998; Jameson et al., 2002). Estas células T reconstituídas podem

exibir suscetibilidade aumentada à apoptose e funções alteradas (Hakim et al., 1997; Singh et al.,

1999; Muraro et al., 2005). Assim, a imunoablação intensa e a reconstituição imunológica alterada

podem levar à remissão clínica da DAI nos primeiros meses após o TACTH.

Um estudo recente (Muraro et al., 2005) mostrou pela primeira vez que a remissão clínica

observada em pacientes com EM após o TACTH, que é acompanhada pela supressão da atividade

inflamatória, não é decorrente somente da imunossupressão que esses pacientes recebem, mas de

mudanças qualitativas profundas no sistema imunológico que demonstram uma renovação do

compartimento de células T nesses pacientes. Dois anos após o TACTH, os pacientes apresentaram

uma diversidade clonal mais ampla do repertório do TCR e uma extensa renovação das

especificidades clonais comparadas com o pré-transplante, que é devida à produção de novas células

T naive pelo timo desses pacientes.

No entanto, concomitante ao reaparecimento de novas células T naive, dois outros trabalhos

mostraram a reconstituição tímica de células T auto-reativas após o TACTH. Openshaw et al. (2000)

Introdução 26

mostraram que a resposta proliferativa de células mononucleares à MBP (myelin basic protein) ou

peptídeos imunodominantes da MBP estava significantemente suprimida em pacientes com EM pelo

menos até 20 meses pós-TACTH, no entanto houve uma mudança no padrão de reconhecimento

antigênico após o transplante. Mais recentemente, Sun et al. (2004) demonstraram o reaparecimento

de células T auto-reativas anti-mielina por volta de 12 meses após o TACTH também em pacientes

com EM, concomitante à reconstituição de novas células T naive produzidas pelo timo. Vale ressaltar

que os pacientes com EM desses estudos continuaram em remissão clínica da doença mesmo com o

reaparecimento de células T auto-reativas anti-mielina, demonstrando que a remissão da doença

após o transplante não deve-se somente à eliminação das células auto-reativas patogênicas mas

também a outras mudanças determinadas pelo TACTH.

Traynor et al. (2000) mostraram que ocorrem mudanças significativas no padrão de citocinas

em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) após o TACTH. A expressão de interleucina-4

(IL-4), citocina do tipo TH2, foi encontrada aumentada em linfócitos de pacientes com lúpus

eritematoso sistêmico antes do transplante e normalizou após o TACTH. Por outro lado, os níveis de

interferon-γ (IFN-γ), que estavam abaixo do normal nesses pacientes antes do transplante,

aumentaram para níveis normais após o TACTH. Num estudo mais recente, de Kleer et al. (2005)

mostraram evidências que sugerem uma “reprogramação” de células auto-reativas em crianças com

artrite juvenil idiopática (AJI) após o TACTH. Usando APCs artificiais (lipossomas conjugados com

complexos MHC-peptídeo) para isolar células auto-reativas contra um peptídeo da Hsp60 (heat shock

protein 60; auto-antígeno importante na AJI), eles demonstraram que o TACTH induz a mudança do

fenótipo pró-inflamatório (caracterizado por elevados níveis de RNAm de IFN-γ e T-bet) das células

auto-reativas pré-transplante para um fenótipo tolerante pós-transplante (caracterizado por elevados

níveis de RNAm de IL-4 e GATA-3).

Dois trabalhos recentes mostraram uma restauração de células T reguladoras (Tregs)

CD4+CD25high após o TACTH. Verda et al. (2005) mostraram um aumento significante do número

absoluto de células T CD4+CD25high em pacientes com doença de Crohn após TCTH não-

mieloablativo. Em outro estudo recente, de Kleer et al. (2005) mostraram também a restauração da

freqüência de células Tregs CD4+CD25high em crianças com artrite juvenil idiopática (AJI) após o

TACTH, de números significantemente reduzidos antes do TACTH (comparando-se aos de indivíduos

saudáveis) para níveis normais após o transplante. Os autores sugerem que esta recuperação deve-

Introdução 27

se à proliferação homeostática das células CD4+CD25high durante os primeiros meses da

reconstituição imunológica, e à produção tímica de novas células Tregs CD4+CD25high que expressam

Foxp3 numa etapa posterior da reconstituição. Estes trabalhos indicam que a restauração das células

Tregs CD4+CD25high poderia contribuir para o restabelecimento da homeostasia imune, indução da

tolerância imune e remissão da DAI após o TACTH.

Os conceitos de homeostasia imune e proliferação homeostática são importantes para o

entendimento dos mecanismos de reconstituição imunológica que serão discutidos nesse trabalho. A

homeostasia imune é um processo auto-regulador que visa à manutenção da estabilidade do sistema

imunológico. Nesse contexto, a homeostasia de células T refere-se à manutenção/preservação do

número de células T ao longo do tempo. Isto pode ser conseguido pela simples sobrevivência das

células ou por um balanço entre morte e proliferação celular. A proliferação homeostática ou

expansão homeostática constitui um dos mecanismos homeostáticos que controlam o tamanho e

composição da população de células T maduras. A proliferação homeostática ocorre como

conseqüência de uma deficiência periférica de linfócitos (linfopenia) em resposta a fatores

homeostáticos, que incluem citocinas (IL-7 e IL-15) e sinais provenientes da estimulação por

complexos MHC-peptídeo próprio (Jameson, 2002; Muraro e Douek, 2006).

Em resumo, os trabalhos recentes descritos acima substanciam a indução da “regeneração” de

um sistema imune novo e tolerante como o racional do TACTH em DAIs, e provêem a base racional

para os ensaios clínicos, futuros ou em andamento, dessa estratégia terapêutica em DAIs.

Além da restauração da auto-tolerância, há a hipótese de que o TACTH poderia também levar

à regeneração de tecidos que são destruídos pela DAI. Teoricamente, isto poderia ser possível pela

regeneração tecidual por células tronco endógenas uma vez que a auto-imunidade fosse revertida, ou

pela diferenciação de células tronco hematopoéticas (CTHs) ou de outras células tronco re-infundidas

no paciente no transplante, em tecidos não-hematopoéticos. Após o TCTH alogênico em

camundongos NOD no início da doença, foi mostrado que ocorre uma regeneração endógena de

ilhotas pancreáticas (Zorina et al., 2003). Foi também mostrado que células tronco transplantadas

promoveram a regeneração endógena pancreática (Mathews et al., 2004; Hess et al, 2003).

Entretanto, estudos em camundongos NOD após TCTH alogênico para diabete já estabelecida

mostraram que a regeneração endógena das ilhotas não consegue manter normoglicemia e sugerem

que o transplante de ilhotas seja necessário para corrigir a doença (Nikolic et al, 2004).

Introdução 28

Recentemente, vários grupos demonstraram que CTHs podem diferenciar-se em células hepáticas,

células do miocárdio, dos rins e em outros tipos de células não-hematopoéticas, incluindo células das

ilhotas pancreáticas (Zulewski et al., 2001; Jiang et al., 2002), mas é possível que estes estudos

reflitam fusão celular ao invés de diferenciação a partir de CTHs infundidas no transplante (Terada et

al., 2002). Portanto, o potencial das CTHs para a regeneração tecidual após o TACTH em pacientes

com DAIs é ainda controverso e consiste uma área de intensa investigação.

1.6 Repertório do receptor de células T em doenças auto-imunes

O receptor de células T (TCR) é um heterodímero de membrana, formado por cadeias α e β

ou por cadeias γ e δ. Cada cadeia α, β, γ ou δ é formada por um domínio variável e um domínio

constante. O TCR αβ é formado por duas cadeias polipeptídicas com domínios variáveis (Vα e Vβ) e

domínios constantes (Cα e Cβ). Análises da estrutura tridimensional do TCR αβ mostraram que os

domínios variáveis Vα e Vβ formam três alças que interagem com o complexo MHC/peptídeo (Garcia

et al., 1996). Estas alças correspondem às Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). Os

genes Vα e Vβ codificam as regiões CDR1 e CDR2, e a região CDR3 é gerada pela recombinação

somática dos segmentos V e J para Vα, e os segmentos V, D e J para Vβ, sendo esta a região de

maior variabilidade e está envolvida no reconhecimento dos peptídeos apresentados pelas moléculas

de MHC (Davies e Bjorkman, 1988; Garcia et al., 1999; Goldrath et al., 1999). A região CDR3 varia

em extensão dependendo da adição ou remoção de nucleotídeos nas ligações VD e DJ durante o

processo de recombinação. Assim, a diversidade do repertório de TCR resulta do rearranjo de

diferentes segmentos gênicos, de sua ligação imprecisa, da adição de nucleotídeos durante o

processo de recombinação e da combinação de diferentes cadeias α e β ou γ e δ (Davis e Bjorkman,

1988). Teoricamente, o limite da diversidade do repertório do TCR seria de mais de 1 x 1013

especificidades. No entanto, não pode haver mais especificidades de TCR do que o número de

células T totais num indivíduo. Assim, foi mostrado que a diversidade em camundongos é de 1-2 x

108 especificidades diferentes, e em humanos é de 1 x 1012 (Nikolich-Zugich et al., 2004).

Atualmente, o repertório do TCR pode ser analisado por citometria de fluxo, pelo uso de

anticorpos monoclonais anti-Vβ ou Vα específicos ou por técnicas de PCR (Reação em Cadeia da

Polimerase) e Real Time PCR. Essas técnicas permitem a identificação e quantificação de famílias

Introdução 29

preferencialmente expandidas. Alternativamente, o repertório do TCR pode ser analisado pela técnica

de Immunoscope ou CDR3 Length Spectratyping. Considerando que o padrão de distribuição dos

picos de CDR3 da cadeia Vβ do TCR numa população policlonal normal de células T segue uma

curva de Gauss, esta técnica permite detectar variações no padrão de distribuição desses segmentos

numa dada população celular. Assim, qualquer expansão clonal anormal no repertório pode ser

detectada como picos que se desviam da distribuição gaussiana normal dos segmentos de CDR3

(Pannetier, 1993; Pannetier, 1995).

Vários estudos indicam que pacientes com DAIs apresentam restrição (skewing) do repertório

de linfócitos T, com expressão anormal de algumas famílias Vβ. Essas anormalidades são causadas

por expansões oligoclonais de algumas populações de células T, que são instáveis e

preferencialmente observadas no início das DAIs. Essas perturbações do repertório de células T

naive podem contribuir para a predisposição do indivíduo ao desenvolvimento da DAI (revisado por

Davidson e Diamond, 2001; Sospedra e Martin, 2005).

Holbrook et al. (1996) mostraram que linfócitos do sangue periférico de pacientes com lúpus

eritematoso sistêmico apresentam restrições do repertório da cadeia Vβ do TCR. Igualmente, em

pacientes com doença de Crohn, as células T encontradas nos segmentos do trato intestinal afetados

apresentam restrição do repertório, mas não as encontradas nos segmentos não-envolvidos (Posnett

et al., 1990).

Mais recentemente, Gran et al (1998) mostraram anormalidades do repertório de células T

isoladas do sangue periférico de pacientes com EM, com expansões significantes das famílias Vβ9,

Vβ1, Vβ11 e Vβ22. Em outro estudo, expansões oligoclonais de células T foram encontradas no

líquido cefalorraquidiano de pacientes com EM (Gestri et al., 2001). Muraro et al. (2002) mostraram

que pacientes com EM-SR apresentam expansões de linfócitos circulantes expressando

determinadas famílias Vβ mais freqüentemente do que em controles normais, além disso 80% essas

expansões são oligoclonais e correlacionam-se significantemente com atividade inflamatória da EM

detectada por RMN e com respostas imunes contra a MBP. Matsumoto et al. (2003) também

mostraram a presença de células T em expansões oligoclonais, particularmente expressando a

família Vβ5.2, no sangue periférico de pacientes com EM. Em outro estudo recente em pacientes com

EM, foi mostrado um aumento da reatividade à mielina e da secreção de IFN-γ por células T CD4+ e T

Introdução 30

CD8+ com distribuição alterada dos picos de CDR3 (Laplaud et al., 2004). Em pacientes com diabete

melito do tipo 1 recém-diagnosticado, Luppi et al (2000) demonstraram uma restrição do repertório do

TCR, com expressão preferencial da família Vβ7.

Interessantemente, Traynor et al. (2002) mostraram, pela primeira vez, que o TACTH poderia

causar mudanças na composição do sistema imune e levar à normalização do repertório de células T

em pacientes com DAIs. Os autores analisaram a diversidade do repertório de células T em pacientes

com lúpus eritematoso sistêmico submetidos à terapia de imunossupressão em altas doses seguida

pelo TACTH, e mostraram que o repertório de células T que era restrito nesses pacientes antes do

transplante apresentou uma distribuição normal (comparável a de um indivíduo controle saudável)

após o TACTH.

2 Objetivos

Objetivos 32

2.1 Objetivo geral

Avaliar a reconstituição imunológica em pacientes com as doenças auto-imunes diabete melito

do tipo 1 e esclerose múltipla, submetidos à terapia de imunossupressão em altas doses seguida pelo

transplante autólogo de células tronco hematopoéticas.

2.2 Objetivos específicos

Avaliar, previamente e seqüencialmente após o transplante:

1. Diversas subpopulações celulares do sistema imune no sangue periférico.

2. O perfil de produção de citocinas intracelulares por linfócitos T do sangue periférico.

3. A diversidade de linfócitos T do sangue periférico, por meio do estudo do repertório da cadeia

Vβ do receptor de células T.

4. A expressão do gene Foxp3 em células mononucleares do sangue periférico.

3 Casuística, Material e Métodos

Casuística, Materiais e Métodos 34

3.1 Delineamento do estudo

Tratou-se um estudo prospectivo conduzido com o objetivo de se estudar a reconstituição

imunológica em pacientes com doenças auto-imunes (diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla)

submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses seguida de transplante autólogo de

células tronco hematopoéticas. Este trabalho foi desenvolvido no Centro de Terapia Celular (CEPID

FAPESP) do Centro Regional de Hemoterapia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HC-FMRP-USP) em colaboração com a Unidade de

Transplante de Medula Óssea (TMO) do HC-FMRP-USP, o Setor de Doenças Neuromusculares e a

Divisão de Endocrinologia e Metabolismo do HCFMRP.

3.2 Casuística

Foram incluídos nesse estudo pacientes com diabete melito do tipo 1 e esclerose múltipla, que

foram submetidos ao tratamento com imunossupressão em altas doses seguida de transplante

autólogo de células tronco hematopoéticas, na Unidade de TMO do Hospital das Clínicas da FMRP-

USP, de dezembro de 2002 a dezembro de 2005. Foram estudados onze pacientes com diabete

melito do tipo 1 e dezoito pacientes com esclerose múltipla transplantados.

As Tabelas 1 e 2 sumarizam as principais características dos pacientes, dados clínicos de

antes do transplante e dados sobre o procedimento do transplante. Os protocolos de transplante

específicos para essas doenças auto-imunes foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital das

Clínicas da FMRP-USP (Diabetes melito do tipo 1 - Proc. 10095/02, Esclerose múltipla - Proc.

2693/2001) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (Diabetes melito do tipo 1 - RG 7160,

Esclerose múltipla - RG 2944), e os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e

esclarecido. Nesses protocolos, estão definidos os critérios de seleção dos pacientes.

Os pacientes com esclerose múltiplos submetidos ao TACTH, apresentavam formas

progressivas da doença (Poser et al, 1983), refratárias ao tratamento com corticosteróides e IFN-β.

Entre os dezoito pacientes, quatorze tinham a forma de esclerose múltipla progressiva secundária

(EM-PS), três apresentavam esclerose múltipla progressiva primária (EM-PP) e uma paciente tinha a

forma surto-remissiva da doença (EM-SR) (Hafler et al., 2004; Compston e Coles, 2002).

Os pacientes com diabete melito do tipo 1 submetidos ao TACTH foram pacientes recém-

diagnosticados. O TACTH foi realizado nesses pacientes dentro de no máximo seis semanas após o


diagnóstico. Com exceção do primeiro paciente, que foi diagnosticado após episódio de cetoacidose

diabética, foram excluídos do protocolo todos pacientes que já tinham apresentado episódios de

cetoacidose diabética antes do diagnóstico. Todos os pacientes apresentavam anticorpos anti-GAD65

positivos ao diagnóstico.

O esquema do tratamento de imunossupressão em altas doses seguida de TACTH constituiu-

se de quatro fases: fase de mobilização das células tronco hematopoéticas, fase de condicionamento

(imunossupressão), infusão das células tronco hematopoéticas (ou transplante propriamente dito) e o

seguimento do paciente após o transplante.

Fase de mobilização das células tronco hematopoética s. As células tronco hematopoéticas

foram mobilizadas da medula óssea para o sangue periférico nesses pacientes com ciclofosfamida e

G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor). A ciclofosfamida (2 g/m2) foi infundida em duas doses

(12 em 12 horas) e o G-CSF (10 � g/Kg/dia) foi administrado em duas doses (12 em 12 horas), 24

horas após última dose de ciclofosfamida e continuado até o término da coleta das CTH por

leucoaférese. O início da coleta foi determinado pela contagem de leucócitos e de células CD34+ no

sangue periférico: leucócitos >1000/mm3 e células CD34+ >10 células/mm3. A aférese foi realizada em

uma ou duas vezes até atingir o valor mínimo de 3,0 x 106 CD34+/kg de peso. Foram coletadas entre

3,4-25,1 x 106 células CD34+/kg (média 8,5x106/kg) dos pacientes com EM, e entre 5,8-23,1 x 106

células CD34+/kg (média 10.6 x 106/kg) dos pacientes com DM. Após a coleta, as células tronco

hematopoéticas foram criopreservadas em solução crioprotetora contendo 10% de dimetilsulfóxido e

armazenadas em nitrogênio líquido até o momento do transplante.

Fase de condicionamento. Os regimes de condicionamento foram diferentes para as duas

doenças auto-imunes transplantadas (Tabelas 1 e 2 ). Os pacientes com diabete melito do tipo 1

receberam ciclofosfamida e globulina anti-timocitária (ATG, antithymocyte globulin) de coelho. A

ciclofosfamida foi administrada em quatro doses de 50 mg/kg/dia nos dias -6, -5, -4 e -3 antes do

transplante. A ATG de coelho foi administrada na dose de 0,5 mg/dia no dia -6, e na dose de 1 mg/dia

nos dias -5, -4, -3 e -2.

Os onze primeiros pacientes com esclerose múltipla (pacientes 1 - 11) receberam um regime

de condicionamento constituído de poliquimioterapia denominado BEAM (BCNU, 300 mg/m2 no dia -

6; etoposide, 200 mg/m2 nos dias -5 a -2; ARA-C, 200 mg/m2 nos dias -5 a -2; e melphalan, 200

mg/m2 nos dias -5 a -1) associado a ATG de cavalo (15 mg/kg/dia nos dias -5, -3, -1, +1, +2 e +3


(Tabela 1 ). O segundo grupo de pacientes com esclerose múltipla (pacientes 12 - 18) foi submetido

ao mesmo regime de condicionamento dos pacientes com diabete melito do tipo 1, constituído de

ciclofosfamida e ATG de coelho.

Infusão das células tronco hematopoéticas. A infusão das células tronco hematopoéticas

ocorreu no dia 0 (data do transplante) e G-CSF (5 � g/Kg/day) foi administrado do dia +5 até que a

contagem de neutrófilos atingisse valor >1,000/mm3. Na maioria do pacientes, foi infundida a

quantidade total de células CD34+ coletada.

A enxertia da medula após o TACTH foi definida como: 1, enxertia de leucócitos: primeiro dia

entre três dias consecutivos em que o número de neutrófilos foi >500 células/µl; 2, enxertia de

plaquetas: primeiro dia em que o número de plaquetas foi >20.000, sem que o paciente tenha

recebido infusão de plaquetas nos últimos 7 dias.

Seguimento do paciente após o transplante. Os pacientes permaneceram internados na

Unidade de TMO do HC-FMRP-USP até a ocorrência da enxertia e em seguimento ambulatorial

intensivo (de diário a semanal) no Hospital-Dia até aproximadamente 60 dias após o transplante.

Após esse período, os pacientes retornaram às suas casas, e compareceram a consultas periódicas

de acompanhamento no ambulatório da Unidade de TMO do HC-FMRP-USP.

Foram colhidas amostras de sangue periférico dos pacientes nos seguintes períodos: pré-

mobilização (ou basal, ou pré-transplante), pré-condicionamento (amostras são colhidas poucas

horas antes do início do condicionamento), e dias D+60, D+100, D+180, D+270, D+360, D+540,

D+720 pós-transplante. As coletas das amostras de sangue periférico foram adaptadas aos retornos

dos pacientes ao hospital após o transplante. Portanto, nem sempre a data das coletas coincidiram

exatamente com as datas programadas citadas anteriormente. Além disso, nem todos os pacientes

possuem amostras coletadas de todos os períodos citados acima, devido principalmente ao estado

clínico do paciente ou ao não comparecimento do paciente aos retornos determinados. O primeiro

paciente com esclerose múltipla (GG) foi transplantado antes do início desse estudo, portanto não

foram coletadas amostras de pré-mobilização, pré-condicionamento e dos primeiros meses após o

TACTH desse paciente.


3.3 Controles saudáveis

As amostras de sangue periférico de indivíduos-controle saudáveis foram obtidas de doadores

de sangue de repetição do Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto do Hospital das

Clínicas da FMRP-USP, sob consentimento informado. Foram colhidas amostras de sangue periférico

de 10 doadores com idade menor que 30 anos (Grupo 1; que foi usado para comparação com o

grupo dos pacientes com diabete melito do tipo 1) e de 10 doadores com idade entre 30 - 55 anos

(Grupo 2; que foi usado para comparação com o grupo de pacientes com esclerose múltipla).

3.4 Isolamento das células mononucleares do sangue periférico

Amostras de 50-70 ml sangue periférico de pacientes pré ou pós-TACTH, colhidas na presença

de heparina sódica (14UI/ml), foram separadas por centrifugação em gradiente de densidade, técnica

descrita por Boyum (1974). As amostras foram diluídas 1:2 em tampão fosfato salina (PBS), aplicadas

cuidadosamente sobre o gradiente de Ficoll Hypaque (d=1,077, Amersham-Pharmacia, Uppsala,

Suécia), e centrifugadas a 500g por 30 minutos a temperatura ambiente (TA) para obtenção da

camada de células mononucleares. As células presentes na interfase plasma-Ficoll Hypaque foram

cuidadosamente coletadas e lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em RPMI 1640 (GIBCO-

BRL, Life Technologies, New York, USA) contendo 10% soro bovino fetal (Hyclone, Logan, USA) e

contadas em câmara de Newbauer. Para congelamento, 5x106 células mononucleares foram

ressuspensas em solução de congelamento gelada, constituída de soro bovino fetal (Hyclone, Logan,

USA) + 10% de DMSO (Dimetilsulfóxido, Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) gelada. As células

foram aliquotadas em tubos de congelamento de 1 ml gelados e colocadas em freezer a -20°C por 30

minutos, transferidas para freezer -80°C overnight e depois para um tanque de nitrogênio líquido.


Tabela 1. Pacientes com esclerose múltipla submetidos ao TACTH.

PPAACCIIEENNTTEE SSEEXXOO// IIDDAADDEE ((AANNOOSS))

TTIIPPOO EEMM

EEDDSSSS PPRRÉÉ--

TTAACCTTHH RRMMNN PPRRÉÉ--TTAACCTTHH RREEGGIIMMEE CCOONNDDIICCIIOONNAAMMEENNTTOO

DDAATTAA TTAACCTTHH

TTEEMMPPOO PPÓÓSS--TTAACCTTHH ((MMEESSEESS))

1. GG M/50 PS 5,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 21.08.02 40

2. SAF F/48 PS 6,0 Ausência BEAM +ATG cavalo 29.01.03 OB

3. SSS M/37 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 19.05.03 31

4. DFG M/51 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 16.06.03 30

5. ARJTA M/51 PS 6,5 Presença BEAM +ATG cavalo 04.10.03 27

6. SHGE F/42 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 19.02.04 22

7. RMVL F/37 PS 6,0 Ausência BEAM +ATG cavalo 22.03.04 OB

8. MFM F/42 PS 7,0 ND BEAM +ATG cavalo 02.06.04 18

9. WRS M/21 PP 6,5 Presença BEAM +ATG cavalo 22.07.04 17

10. OLP M/52 PP 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 09.09.04 15

11. LST M/28 PS 6,5 Ausência BEAM +ATG cavalo 03.11.04 OB

12. SHC M/45 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 11.05.05 7

13. MAFC F/48 SR 4,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 10.06.05 6

14. RPS M/54 PP 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 21.06.05 6

15. CMBM F/36 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 24.08.05 4

16. LFL F/34 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 23.08.05 4

17. LBSL F/42 PS 6,0 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 20.10.05 2

18. CC M/50 PS 6,5 Ausência Ciclofosfamida + ATG coelho 04.11.05 1

TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas; EM, esclerose múltipla; PS, esclerose múltipla progressiva secundária; PP, esclerose múltipla primária progressiva; SR, esclerose múltipla surto-remissiva; EDSS, Expanded Disability Status Score (Anexo 1 ); RMN, Ressonância Magnética Nuclear; Ausência, ausência de lesões de atividade inflamatória por RMN; Presença, presença de lesões de atividade inflamatória por RMN; BEAM, BCNU, etoposídeo, aracitin, melfalan; ATG, Antithimocyte globulin, G-CFS, Granulocyte-colony stimulating factor; OB, óbito; ND, não determinado. Regime de mobilização: Ciclofosfamida (2g/m2) + G-CSF (10 � g/Kg/dia). Regime de condicionamento: BEAM + ATG cavalo (6x 15mg/kg/dia), ou Ciclofosfamida (4 x 50 mg/Kg/dia) + ATG coelho (4,5 mg).


Tabela 2. Pacientes com diabete melito do tipo 1 submetidos ao TACTH.

PPAACCIIEENNTTEE SSEEXXOO// IIDDAADDEE ((AANNOOSS))

AANNTTIICCOORRPPOO AANNTTII--GGAADD6655

((UUII//MMLL))

DDOOSSEE IINNIICCIIAALL DDEE IINNSSUULLIINNAA ((IIUU//KKGG//DDIIAA))

DDAATTAA TTAACCTTHH TTEEMMPPOO PPÓÓSS--

TTAACCTTHH ((MMEESSEESS))

1. LSM M/24 36,0 0,48 12.01.04 23

2. ALSR M/27 49,0 0,29 15.03.04 20

3. WSL M/21 1,1 0,39 03.05.04 19

4. MGB M/15 22,0 0,36 05.07.04 17

5. RLFS M/16 51,0 0,52 03.02.05 10

6. CPS M/14 17,0 0,26 03.05.05 7

7. TAS F/20 4,0 0,48 25.05.05 7

8. RAOA M/16 48,0 0,35 12.09.05 3

9. PMR F/18 102,0 0,42 20.09.05 3

10. CTO F/17 44,0 0,61 10.10.05 2

11. VTR M/16 11,0 0,10 22.11.05 1

TACTH, Transplante autólogo de células tronco hematopoéticas. Níveis séricos de anticorpos anti-GAD antibodies foram dosados por radioimnunoensaio usando kits comerciais (R.S.R. Limited, Cardiff, UK), laboratórios do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Resultados foram considerados positivos se > 1U/ml. Regime de Mobilização: Ciclofosfamida (2g/m2) + G-CSF (10 � g/Kg/dia). Regime de condicionamento: Ciclofosfamida (4X 50 mg/Kg/dia) + ATG coelho (4,5 mg).

3.5 Imunofenotipagem das subpopulações celulares do sangue periférico

Amostras de 5 ml sangue periférico dos pacientes pré ou pós-TACTH foram coletadas na

presença de EDTA (8.55 mg/tubo) para a realização de contagens hematológicas e

imunofenotipagem por citometria de fluxo. As contagens hematológicas foram realizadas em contador

de células automático (Coulter, Beckman Coulter Inc., Miami, USA) para obtenção do número

absoluto de glóbulos brancos, linfócitos, monócitos e granulócitos.

Alíquotas de 100 µl de sangue periférico total foram incubadas por 20 minutos a TA no escuro

com 5 µl de anticorpos monoclonais ou isotipos controles diretamente conjugados a fluorocromos

(isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), peridinin chlorophyl protein (PercP) ou

ficoeritrina-CY5 (PE-CY5)), adquiridos da Becton-Dickinson (San Diego, CA, USA) ou Pharmingen

(BD Bioscience, San Diego, CA, USA), e previamente titulados. Foram feitas marcações duplas ou

triplas para a análise das diversas subpopulações linfocitárias. Todas as incubações foram realizadas

no escuro para evitar perda de fluorescência. Em seguida as amostras de sangue foram incubadas

com 1 ml de solução de fixação e lise (FACs lysing solution, Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA)

por 10 minutos a TA, para fixação das células e lise dos eritrócitos. As células foram centrifugadas por

5 minutos a 500 g, lavadas duas vezes com tampão FACS (PBS, 0.2% de soro bovino fetal, 0.02% de


azida sódica), ressuspensas em 200 µl de tampão FACS e analisadas imediatamente no citômetro de

fluxo FACSort (Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA).

As seguintes subpopulações linfocitárias foram analisadas: CD3+ (linfócitos T totais),

CD3+CD4+ (linfócitos T helper ou auxiliares), CD3+CD8+ (linfócitos T citotóxicos), CD19+ (linfócitos B),

CD3-CD16+,56+ (células “natural killer”, NK), CD3+CD16+,56+ (células NKT-like), CD3+CD69+,

CD3+HLADR+ e CD3+CD25+ (marcadores de ativação celular em linfócitos T), CD19+CD38+

(marcadores de ativação celular em linfócitos B), CD4+CD45RA+CD31+ (linfócitos T auxiliares virgens,

recém-imigrados do timo), CD4+(CD8+)CD27+CD45RO- (linfócitos T naive), CD4+(CD8+)CD27+

CD45RO+ (linfócitos T de memória central), CD4+(CD8+)CD27-CD45RO+ (linfócitos T de memória

efetora), CD4+(CD8+)CD27-CD45RO- (linfócitos T efetores diferenciados), CD4+CD25high (células T

reguladoras), CD4+CD25highCTLA-4+ (células T reguladoras que expressam CTLA-4 ou CD152),

CD4+CD25highGITR+ (células T reguladoras que expressam GITR), CD3+TCRαβ+ e CD3+TCRγδ+

(expressão de receptor de célula T αβ ou γδ), CD3+CD4+Fas+, CD3+CD8+Fas+, CD3+CD19+Fas+,

CD3+CD4+FasL+, CD3+CD8+FasL+ (expressão de moléculas relacionadas à apoptose, Fas (CD95) e

FasL (CD178) em linfócitos T e B).

Populações de monócitos CD45+CD14+ e CD14+CD25+ também foram analisadas para

verificar e excluir contaminação de monócitos na gate de linfócitos. Foram analisadas também duas

subpopulações de células dendríticas do sangue periférico, as células dendríticas linfóides (LIN-

CD11c-HLADR+) e células dendríticas mielóides (LIN-CD11c+HLADR+). LIN (lineage) corresponde a

uma mistura de anticorpos contra vários antígenos de superfície característicos de algumas linhagens

celulares (os quais são ausentes em células dendríticas): CD3, CD19, CD20, CD14, CD45, CD34,

CD16, CD56. Controles isotípicos (IgG1-FITC, IgG2a-PE e IgG1-PercP) foram incluídos em todos os

experimentos para determinação de marcações inespecíficas.

Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1),

estabelecida com base nos parâmetros de tamanho (FSC) e granularidade (SSC). Foram adquiridos

20.000 eventos/amostra. As análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest (Becton-

Dickinson, San Diego, CA, USA). As células mortas foram excluídas por tamanho e granularidade. As

diversas subpopulações celulares foram analisadas usando-se dois ou três tipos de fluorocromos. No

caso de marcações duplas, os eventos da gate de linfócitos (R1) foram analisados para marcação

com os diferentes anticorpos por dot plots de fluorescência 1 (FL1, FITC - isotiocianato de


fluoresceína) versus fluorescência 2 (FL2, PE - ficoeritrina). Ou então, em outro tipo de análise de

marcação dupla, foi selecionada uma determinada subpopulação por uma gate R2 (por exemplo,

FL1), e a marcação de fluorescência 2 (FL2, PE) nessa gate R2 foi representada por um histograma

de FL2.

No caso de marcações triplas, foram feitos dot plots de FL1 versus FL2, em seguida foi

desenhada uma gate R2 na população duplo-positiva. A marcação de fluorescência 3 (FL3, PercP ou

PE-CY5) nessa gate R2 foi representada por um histograma de FL3. Ou então, em outro tipo de

análise de marcações triplas, foi selecionada uma determinada subpopulação por uma gate R2 (por

exemplo, FL1), e foram feitos dot plots de FL1 versus FL2 para análise dos eventos da gate R2.

Para análise das subpopulações de células dendríticas do sangue periférico, foi feito um dot

plot de FL3 versus FL2 (HLADR-Percp versus LIN-FITC), em seguida foi desenhada uma gate R1 na

população de células HLADRhighLIN-. Em seguida, a marcação de fluorescência na gate R1 foi

analisada por um dot plot de FL3 versus FL2 (HLADR-Percp versus CD11c-PE). As células

dendríticas linfóides são LIN-CD11c-HLADR+ (gate R3) e as células dendríticas mielóides são LIN-

CD11c+HLADR+ (gate R2).

Os resultados das análises de imunofenotipagem foram expressos em porcentagem de células

positivas ou valores absolutos que foram calculados multiplicando-se o valor da porcentagem obtida

pelo número de linfócitos/µl, que foi determinado pelas contagens hematológicas da amostra de

sangue periférico. Exemplos dessas análises de experimentos de imunonofenotipagem por citometria

de fluxo encontram-se representadas no Apêndice A.

3.6 Detecção de citocinas intracelulares em linfóci tos T ativados

A produção de citocinas por linfócitos T CD4 (CD3+CD8-) ou CD8 (CD3+CD8+) ativados foi

detectada por citometria de fluxo, realizando-se marcação intracelular das citocinas produzidas pelos

linfócitos após ativação com um estímulo policlonal (Jung et al., 1993; Masher et al., 1999). A

padronização do ensaio (concentração dos reagentes, tempo de incubação) foi feita utilizando-se

células de indivíduos-controle saudáveis. Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas

e criopreservadas como descrito anteriormente. Para o ensaio de produção de citocinas intracelulares

as células mononucleares foram descongeladas, lavadas duas vezes com RPMI 1640 (GIBCO-BRL,

Life Technologies, New York, USA) contendo 10% de soro bovino fetal (Hyclone, Logan, USA) e


ressuspensas nesse meio de cultura (2x106 células/ml). Em seguida, as células foram estimuladas

com 25 ng/ml de PMA (forbol-miristato-acetato; Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha) e 1 µg/ml de

Ionomicina (Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha), na presença ou não de Brefeldina A (Sigma-

Aldrich, Steinhein, Alemanha) por 6 horas. A Brefeldina A (10 µg/ml) foi adicionada à cultura nas

últimas 4 horas do ensaio. A Brefeldina A é um metabólito fúngico que interfere com o transporte

vesicular do retículo endoplasmático rugoso para o complexo de Golgi, servindo como um inibidor do

transporte de proteínas, e desse modo promovendo o acúmulo das citocinas sintetizadas de novo no

complexo de Golgi.

Foram feitos três tipos de amostras: 1, controle não-estimulado (células + Brefeldina A), usado

para determinar o nível de síntese residual de citocinas devido à ativação in vivo; 2, amostra

estimulada (células + Brefeldina A + PMA + Ionomicina); 3, controle da ativação (células + PMA +

Ionomicina), usado para determinar o nível de ativação celular por meio da expressão do marcador de

ativação precoce CD69 (Nakamura et al., 1989), cuja expressão de superfície é significantemente

inibida na presença de Brefeldina A. O cálculo da resposta específica das células ao estímulo

policlonal foi calculado da seguinte maneira: (AE - ICAE) - (CNE - ICCNE), onde AE = amostra

estimulada; ICAE = isotipo controle da amostra ativada; CNE = controle não-estimulado; ICCNE =

isotipo controle do controle não-estimulada.

Após incubação de 6 horas com os estímulos, as células (0,5x106 células/amostra) foram

incubadas com 200 µl de 0.5 M EDTA por 15 minutos a TA, e em seguida marcadas com anticorpos

monoclonais, previamente titulados, contra os antígenos de superfície (CD3/CD8 ou CD3/CD69) ou

isotipos controles, por 20 minutos a TA. Os anticorpos são diretamente conjugados a fluorocromos, e

foram adquiridos da Becton-Dickinson (San Diego, CA, USA) ou Pharmingen (BD Biosciences, San

Diego, CA, USA). Todas as incubações foram realizadas no escuro para evitar perda de

fluorescência. Após a marcação, as células foram lavadas com tampão FACS, centrifugadas por 5

minutos a 500 g, ressuspensas em 1 ml de solução de fixação e lise (FACs lysing solution, BD, San

Diego, CA, USA), incubadas por 10 minutos a TA e congeladas a -80°C overnight. Em seguida, as

células rapidamente descongeladas, centrifugadas por 5 minutos a 500g, ressupensas em 500 µl de

solução de permeabilização (FACS permeabilizing solution, BD, San Diego, CA, USA) e incubadas

por 10 minutos a TA. Após lavagem com tampão FACS, as células foram incubadas com anticorpos

anti-citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-5 e IL-10) ou isotipos controles intracelulares diretamente


conjugados a fluorocromos por 30 minutos a TA. As células foram então lavadas novamente,

ressuspensas em 200 µl de tampão FACS e analisadas no citômetro de fluxo FACSort (Becton-

Dickinson, San Diego, CA, USA). Controles isotípicos (IgG1-FITC, IgG2a-PE e IgG1-Percp) foram

incluídos em todos os experimentos para determinação de marcação inespecífica.

Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1),

estabelecida com base nos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC). Foram

adquiridos 20.000 eventos/amostra. As análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest

(Becton-Dickinson, San Diego, CA, USA). Os eventos da gate de linfócitos (R1) foram analisados por

dot plots de fluorescência 1 (FL1, anti-CD8-FITC) versus fluorescência 3 (FL3, anti-CD3-PercP). Em

seguida, foram desenhadas uma gate R2 na população duplo-positiva (CD3+CD8+, de linfócitos T

CD8+) e uma gate R3 na população CD3+CD8- (que contém linfócitos T CD4+ em sua grande

maioria). Esse tipo de marcação foi escolhido pois a expressão da molécula CD4 é drasticamente

diminuída em linfócitos ativados com PMA e ionomicina. A expressão de CD8 também diminui, no

entanto em proporções bem menores. A marcação de fluorescência 2 (FL2, anti-citocinas-PE) na gate

R2 foi representada por um histograma de FL2. Exemplos dessas análises de experimentos de

citocinas intracelulares por citometria de fluxo encontram-se representadas no Apêndice B.

3.7 Extração de RNA pelo método de Trizol

A extração do RNA das células mononucleares do sangue periférico foi realizada pelo método

descrito por Chomzynski et al. (1987), o qual utiliza solução de Trizol (GIBCO BRL Life Technologies,

Grand Island, NY, USA) para isolamento de RNA total. Trizol é uma solução monofásica de fenol e

isotiocianato de guanidina que rompe a célula mantendo a integridade do RNA. Partindo de uma

suspensão de aproximadamente de 5x106 células mononucleares resuspensas em 200 µl de solução

fisiológica previamente tratada com DEPC (Dietilpirocarbonato; Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha),

adicionou-se 1ml de Trizol. Esta solução foi homogeneizada e então incubada por 5 minutos a

temperatura ambiente, para permitir completa dissociação de complexos de nucleoproteínas. Em

seguida adicionou-se 0,2 ml de clorofórmio para cada ml de trizol, seguido de agitação vigorosa por

aproximadamente 15 segundos. O material foi posteriormente incubado por 2 a 3 minutos à

temperatura ambiente e centrifugado por 15 minutos a 1120 g a 4oC.


Após esta centrifugação ocorre a separação da solução em três fases (aquosa, interface e

orgânica). A fase aquosa foi transferida para um novo tubo contendo 0,5 ml de álcool isopropílico

para cada ml de trizol, para a precipitação do RNA. Este tubo foi homogeneizado por inversão,

seguido de incubação por 10 minutos ou overnight a -80°C e então centrifugado novamente a 1120 g

por 15 minutos a 4oC. O sobrenadante foi removido e o “pellet” de RNA lavado com etanol 75%

diluído em água DEPC seguido de centrifugação a 640 g por 5 minutos a 4oC. O RNA assim obtido foi

deixado secar por 5 minutos para evaporação do etanol e então ressuspendido em 10µl de água

DEPC. Este material foi mantido a -80oC até o momento da transcrição. Após extração, o RNA obtido

foi quantificado através de leitura em espectrofotômetro (Beckman, DU530, Fullerton, CA, USA) nos

comprimentos de onda (λ) de 260 e 280 nm. O grau de pureza da amostra foi verificado através da

análise da relação entre 260 e 280nm, sendo considerada uma boa extração aquela que apresentou

valores entre 1,8 a 2,0. Para o cálculo da concentração da amostra considerou-se que a densidade

ótica (DO) igual a 1 corresponde a 40 µg de RNA /ml no comprimento de onda de 260 nm.

3.7.1 Eletroforese de amostras de RNA em gel de aga rose sob condições

desnaturantes

Após a quantificação das amostras de RNA foi preparado um o gel sob condições

desnaturantes para visualização da integridade do RNA. Um volume total de 70 ml de agarose

fundida foi misturado a 20 ml de formaldeído 37% e 22 ml de tampão de migração MOPS 5X (20,6g

de MOPS dissolvidos em 800 mL de acetato de sódio 50mM, pH 7,0 ajustado com NaOH 2N e

adicionado 10 ml de EDTA 0,5M pH 8,0; volume final ajustado para 1000 ml). Durante o tempo de

solidificação do gel, as amostras de RNA (4,5 µl de solução de RNA, com cerca de 3 µg RNA) foram

desnaturadas em 2,0 µl de tampão MOPS 5X, 3,5 µl de formaldeído 37% (Merck, Alemanha) e 10,0 µl

de formamida, por 15 minutos a 65°C. Após esse tempo, as amostras foram colocadas

imediatamente no gelo, sendo adicionados 1,0 µl de brometo de etídeo diluído 3:1 (solução estoque

10mg/mL) e 2,0 µl de dye loading solution (1/10 do volume). Após eletroforese a 80 V durante 90

minutos, as bandas de RNA foram visualizadas em transiluminador UV.


3.8 Transcrição reversa

Após constatação da qualidade e pureza do RNA, a transcrição reversa do RNA para cDNA foi

realizada utilizando um kit comercial (Superscript III First Strand Synthesis System for RT-PCR,

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Foram adicionados num tubo de 0,2 ml: 2µg de RNA total (em 2µl),

1µl de oligo(dT)20 (50 µM/µl), 1µl 10 mM dNTP mix e água DEPC q.s.p. 8 µl. Esta mistura foi incubada

a 65oC por 5 minutos em termociclador para remoção de estruturas secundárias, e então colocada

em gelo por pelo menos 1 minuto. Em seguida foi preparada a mistura de síntese de cDNA: 2 µl

tampão para PCR 10X (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 4 µl 25 mM MgCl2, 2 µl 0,1 M DTT,

1µl RNaseOUTTM (40U/µL), e 1 µl da enzima transcriptase reversa SuperScript III RT (200 U/µl).

Foram adicionados 10 µl dessa mistura de síntese à mistura de RNA/primer. Os componentes da

reação foram gentilmente misturados e centrifugados brevemente, incubados por 50 minutos a 50°C

e a reação foi terminada a 85°C por 5 minutos e colocada em gelo. Em seguida, o tubo de reação foi

centrifugado brevemente e incubado por 20 min com 1 µl de RNase H, e o cDNA foi estocado a -

20oC.

3.8.1 Validação da transcrição

O gene da β-actina tem sido comumente utilizado como controle da reação de transcrição do

RNA em cDNA. Para esta reação foram utilizados 2 µl do cDNA transcrito, 2,5 µl de tampão para

PCR 10X, 1,0 µl de 1,5 mM MgCl2, 3 µl de 10 mM dNTP mix, 1 µl de cada primer (10 µM), 0,3 µl de

Taq polimerase (5 unidades/µl) e água DEPC q.s.p. 25µl. Os reagentes foram misturados e

centrifugados brevemente, colocados em termociclador pré-aquecido a 94oC, e submetidos a um

passo de desnaturação inicial por 2 minutos a 94oC, seguido por 30 ciclos de PCR (desnaturação a

94oC por 40 segundos, anelamento a 55oC por 1 minuto e extensão a 72oC por 1 minuto,

completados por uma extensão final de 10 minutos a 72oC). Em seguida, o produto da reação foi

mantido a 4°C e carregado em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo (0,5µg/ml) e

submetido à corrida eletroforética a 100 V durante 30 minutos. O tamanho esperado do produto de

PCR é de 353 pb.


3.9 Método de TCRBV CDR3 Spectratyping

Este método permite analisar a diversidade do repertório de linfócitos T e detectar de

populações celulares em expansão clonais (Pannetier et al., 1993; Pannetier et al.,1995). Esta técnica

é iniciada por uma amplificação por PCR dos segmentos Vβ-Cβ do TCR utilizando primers

específicos para cada uma das famílias Vβ. O produto desta reação é submetido à outra amplificação

por PCR que inclui um primer adicional marcado com fluorocromo. Nesta reação amplifica-se o

segmento gênico que contém a região CDR3 (do inglês Complementarity-Determining Regions) do

TCR, uma vez que esta região está localizada entre os segmentos V-D-J. Em seguida, estes

segmentos amplificados por PCR são separados em gel de seqüenciamento e, com o auxílio de um

seqüenciador automático e do software Gene MapperTM (Applied Biosystem), é possível calcular o

tamanho (em pares de bases) dos diferentes segmentos (picos) de CDR3, o número de picos de

CDR3, estimar a freqüência de cada família Vβ no repertório do TCR, e analisar a clonalidade e

distribuição (gaussiana ou não-gaussiana) dos picos na região CDR3. Um esquema do método de

TCRBV CDR3 Spectratyping é mostrado na Figura C.1 (Apêndice C ).

3.9.1 Reação de PCR (V ββββ-Cββββ) para determinação das famílias V ββββ do Receptor de

Células (TCR)

Esta reação de PCR possibilita a amplificação do segmento gênico Vβ-Cβ do TCR. Para um

volume final de reação de 50µl, foram utilizados 4% de cDNA transcrito, tampão 10X (500mM KCl e

100mM Tris-HCl), 2mM MgCl2, 200µM dNTP, 0,5µM do primer CB e 0,5µM do primer � Vβ específico,

1 U Taq polimerase e água qsp 50µl. Esta reação foi processada em termociclador por 1 minuto e 30

segundos a 94oC, seguidos de 40 ciclos de 30 segundos a 94o C, 45 segundos a 60o C, 45 segundos

a 72oC, completados com uma extensão final de 4 minutos a 72o C. A Tabela 3 mostra a seqüência

dos primers utilizados para a amplificação das 24 famílias Vβ, bem como o tamanho esperado do

produto de PCR. O produto de amplificação foi carregado em gel de agarose 1,5% corado com

brometo de etídeo (0,5µg/ml) e submetido à corrida eletroforética de 100 V por 1 h 30 min.


3.9.2 Reação de elongação V ββββ-Cββββ (Run-off )

Inicialmente, foi realizada uma reação de PCR amplificando o segmento gênico Vβ-Cβ do TCR

conforme protocolo descrito acima e o produto de PCR assim gerado foi utilizado para a reação de

elongação. Esta reação foi realizada utilizando primer Cβ interno marcado com fluorocromo (FAM) [5´

CAC AGC GAC CTC GGG TGG G 3´]. Para a reação de elongação utilizou-se tampão 10x contendo

500mM KCl e 100mM Tris-HCl, 3mM MgCl2, 200µM dNTP, 0,5µM primer CB marcado, 0,2U Taq

polimerase e água qsp 8µL, seguido da adição separadamente de 2µL do produto de PCR de cada

uma das 24 famílias Vβ. Esta reação foi então processada em termociclador por 1 minuto e 30

segundos a 94oC, seguidos de 8 ciclos de 30 segundos a 94oC, 45 segundos a 60oC, 45 segundos a

72oC, completados com uma extensão final de 45 minutos a 72oC.

3.9.3 Preparo do gel de seqüenciamento

A análise do tamanho (pares de bases) dos diferentes segmentos (picos) de CDR3

amplificados pelas reações de PCR foi realizada em gel de seqüenciamento (6% de poliacrilamida, 8

M de uréia e 1x tampão Tris-Borato-EDTA (TBE)). As placas de vidro foram lavadas com detergente

não abrasivo e enxaguadas com água corrente e depois com água destilada. Antes do acoplamento

das placas no suporte de migração, as mesmas foram limpas novamente com água destilada quente

para completa remoção de resíduos. Para uma solução de 50 ml de gel foram pesados 18g de uréia e

1,3 a 1,4g da resina Amberlite (Sigma-Aldrich, Steinhein, Alemanha), acrescidos de 24,5 ml de água

destilada e 5,2 ml de solução 40% de acrilamida/bis-acrilamida 19/1 (BioRad, Hercules, CA, USA).

Esta solução foi colocada em agitação leve até dissolução completa da uréia. Em seguida, esta

solução foi filtrada em filtro de 0,22 µm contendo em sua parte inferior 5 ml de tampão Tris-Borato-

EDTA (TBE 10x). O volume da solução foi completado para 50 ml com água destilada. Por último,

acrescentou-se 250 µl de solução de persulfato de amônia 10% e 35µl de TEMED (Amresco, Solon,

Ohio, USA) e homogeneizou-se lentamente. Com o auxílio de uma seringa, o gel foi carregado nas

placas de vidro e utilizado após completa polimerização (aproximadamente 1h).


Tabela 3. Seqüência dos primers utilizados na amplificação das famílias Vβ do TCR

FFAAMMÍÍLLIIAA

VVBB SSEEQQÜÜÊÊNNCCIIAASS DDOOSS PPRRIIMMEERRSS VVBB--CCBB

((PPAARREESS DDEE BBAASSEESS))

EESSPPEECCIIFFIICCIIDDAADDEESS AAMMPPLLIIFFIICCAADDAASS

VB1 5’ CCGCACAACAGTTCCCTGACTTGC 3’ 322 VB1S1

VB2 5’ GGCCACATACGAGCAAGGCGTCGA 3’ 360 VB2S1, S2

VB3 5’ CGCTTCTCCCTGGATTCTGGAGTCC 3’ 299 VB3S1

VB4 5’ TTCCCATCAGCCGCCCAAACCTAA 3’ 325 VB4S1

VB5 5’ AAGCTCTGAGCTGAATGTGAACGCC 3’ 299 VB5S1, S2, S3, S5, S6, S7, S8

VB6 5’ CTCTGAAGATCCAGCGCACAGAGC 3’ 292 VB6S1, S3, S4, S5, S7, S11, S14

VB7 5’ CCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTC 3’ 320 VB7S1, S2, S3

VB8 5’ CCATGATGCGGGGACTGGAGTTGC 3’ 406 VB8S1, S2, S3

VB9 5’ TTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGC 3’ 279 VB9S1, S2

VB10 5’ CCACGGAGTCAGGGGACACAGCAC 3' 277 VB10S1

VB11 5’ TGCCAGGCCCTCACATACCTCTCA 3’ 276 VB11S1

VB12 5’ TGTCACCAGACTGGGAACCACCAC 3’ 449 VB12S2, S3, S4

VB13 5’ CACTGCGGTGTACCCAGGATATGA 3’ 456 VB13S1, S2, S3, S4, S6, S7, S8, S9

VB14 5’ GGGCTCGGCTTAAGGCAGACCTAC 3’ 398 VB14S1

VB15 5’ CAGGCACAGGCTAAATTCTCCCTG 3’ 311 VB15S1

VB16 5’ GCCTGCAGAACTGGAGGATTCTGG 3’ 279 VB16S1

VB17 5’ TCCTCTCACTGTGACATCGGCCCA 3’ 295 VB17S1

VB18 5’ CTGCTGAATTTCCCAAAGAGGGCC 3’ 322 VB18S1

VB19 5’ TCTCAATGCCCCAAGAACGCACCC 3’ 320 VB19S1

VB20 5’ TGCCCCAGAATCTCTCAGCCTCCA 3’ 337 VB20S1

VB21 5’ TCCAGCCTGCAAAGCTTGAGGACT 3’ 283 VB21S1, S3, S4

VB22 5’ GATCCGGTCCACAAAGCTGG 3’ 287 VB22S1

VB23 5’ TGAACTGAACATGAGCTCCTTGG 3’ 295 VB23S1

VB24 5’ GACATCCGCTCACCAGGCCTG 3’ 288 VB24S1

CB 5’ CGGGCTGCTCCTTGAGGGGCTGCG 5’

3.9.4 Preparo das amostras e aplicação no gel de se qüenciamento

O produto de PCR da reação de run-off foi diluído (1:10) em água. Em seguida 2µl desta

diluição, acrescidos de 1� µl de marcador de peso molecular (Gene Scan™ - 500 Rox standard,

Applied Biosystems) e 2µl de tampão para carregar amostra (loading buffer - formamida, acrescida de

blue dextan, 50 mg/ml e EDTA, 25 mM na proporção 5:1). Esta solução foi colocada em termociclador


a 950C por 2 minutos para completa desnaturação do produto de PCR. As amostras foram mantidas

em gelo até o momento da aplicação no gel de seqüenciamento, no qual foram carregados 5µl de

amostra/poço. Os produtos de PCR da reação de run-off foram submetidos à corrida eletroforética por

2 h 30 min em um seqüenciador de DNA automático (ABI 377 Prism DNA Sequencer, Applied

Biosystem, Foster City, CA, USA).

3.9.5 Perfil da região CDR3 do RTC, cálculo do tama nho da região CDR3 do RTC e da

freqüência das famílias V ββββ, pelo método de TCRBV CDR3 Spectratyping

Considerando que a região CDR3 está compreendida entre os resíduos de aminoácidos 95-

106 da cadeia variável β do TCR (Pannetier et al., 1993; Pannetier et al., 1995) e que a posição dos

primers VB e CB utilizados são fixas, o tamanho observado para o produto de PCR VB-CB marcado

depende do tamanho da junção V(D)J de cada TCR específico. O tamanho (em pares de bases) do

segmento CDR3 com 10 resíduos de aminoácidos para cada família Vβ foi estimado previamente

(Pannetier et al., 1993; Pannetier et al., 1995), como mostrado na Tabela 4 .

Estes valores são utilizados para o cálculo de cada segmento de CDR3 pelo software Gene

Mapper™ (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA), sendo comparados com um marcador de peso

molecular conhecido (Gene Scan™ - 500 Rox standard, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)

que é carregado juntamente com as amostras a serem analisadas na corrida eletroforética. Este

marcador de peso molecular é conjugado com o fluorocromo denominado “Rox”, diferente do

fluorocromo denominado “Fam” utilizado na reação de run-off para os segmentos VB-CB. Isto

possibilita a discriminação de diferentes tamanhos (em pares de bases) detectados pelos raios lasers

emitidos pelo seqüenciador automático. Como mencionado anteriormente, o pico correspondente a

10 resíduos de aminoácidos é definido por um número de pares de bases conhecido. Assim, como

cada 3 pares de base correspondem a 1 resíduo de aminoácido, é possível portanto definir o número

de aminoácidos de cada segmento de CDR3 para uma determinada família Vβ. No entanto, a

definição exata do tamanho e seqüência dos segmentos de CDR3 é possível somente após o

seqüenciamento desta região.

A distribuição dos segmentos de CDR3 pode apresentar um perfil policlonal normal com

distribuição como uma Curva de Gauss, com segmentos variando de 4 a 16 resíduos de aminoácidos,

sendo os tamanhos de 8 a 10 resíduos de aminoácidos os mais freqüentes. Ou ainda, pode


apresentar um perfil policlonal anormal, diferente de uma distribuição de Gauss, podendo chegar a

um perfil oligoclonal (com poucos picos de CDR3) ou monoclonal (pico de CDR3 único

correspondente a uma população de células T em expansão clonal).

Tabela 4. Tamanho esperado do produto de PCR da amplificação VB-CB (em pares de bases) para o segmento CDR3 de 10 aminoácidos

FFAAMMÍÍLLIIAA VVBB TTAAMMAANNHHOO PPRROODDUUTTOO

((PPAARREESS DDEE BBAASSEESS)) FFAAMMÍÍLLIIAA VVBB TTAAMMAANNHHOO PPRROODDUUTTOO

((PPAARREESS DDEE BBAASSEESS))

VB1 189 VB13 323

VB2 227 VB14 265

VB3 166 VB15 178

VB4 192 VB16 146

VB5 166 VB17 161

VB6 159 VB18 189

VB7 187 VB19 187

VB8 273 VB20 204

VB9 146 VB21 150

VB10 144 VB22 153

VB11 143 VB23 161

VB12 316 VB24 154

A Figura C.2 (Apêndice C ) mostra exemplo de imagem gerada após a corrida eletroforética

dos produtos de PCR obtidos após a reação de elongação (run-off) num gel de seqüenciamento.

Essa imagem foi analisada pelo software Gene Mapper™ (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA),

gerando os gráficos de distribuição dos segmentos da região CDR3. (Apêndices I-M : pacientes com

diabete melito; Apêndices N-U : pacientes com esclerose múltipla; Apêndices V : indivíduos-controle

saudáveis). Os gráficos (ou espectros) representam a intensidade de fluorescência em unidades

arbitrárias em função do comprimento da região CDR3 em pares de bases. A análise fornecida pelo

software inclui o tamanho do pico (expresso em pares de bases), e a altura e área de cada pico.

Foram considerados positivos os picos com área de intensidade de fluorescência ≥500 unidades

arbitrárias. Nos gráficos, os picos destacados em azul correspondem ao segmento de CDR3 com 10

resíduos de aminoácidos. A partir desses gráficos, foi calculada a freqüência de cada pico de CDR3

de cada família Vβ e a freqüência total de cada família Vβ para uma determinada amostra, a partir do

valor da área dos picos de fluorescência, segundo as seguintes fórmulas: % VBn = (área pico VBn/ Σ

área todos VB) X 100, % VB total = (Σ área todos picos VB/ Σ área todos VB) X 100, respectivamente.


Em nosso trabalho, a diversidade do repertório da cadeia Vβ do TCR foi analisada com base no

complexity score descrito por Wu et al. (2000). O complexity score é um sistema de pontuação que

quantifica as mudanças no repertório Vβ do TCR ao longo do tempo.

De acordo com esse sistema, primeiramente a complexidade dentro de cada família Vβ é

determinada pela contagem do número de picos. Então as famílias são classificadas com uma

pontuação de 0 a 8, baseada no grau de complexidade (ou diversidade). A complexidade normal é

caracterizada por uma distribuição gaussiana dos diferentes tamanhos de transcritos para uma

determinada família, e pela quantidade de 8-10 picos para cada família Vβ. A pontuação 0 é dada se

a família é ausente, a pontuação 1 é atribuída se a família Vβ apresentar somente um único pico

monoclonal, a pontuação 2 é dada se a família apresentar um perfil biclonal, a pontuação 3 é dada se

a família apresentar 3 picos, e assim por diante. Finalmente, a pontuação 8 é atribuída a um

spectratype de 8 picos ou mais, com uma aparência diversa, complexa e policlonal. Assim, o

complexity score geral é calculado pela soma dos complexity scores de cada família Vβ. No nosso

trabalho, o complexity score máximo é de 192 (8 X 24 famílias Vβ).

3.10 Análise da expressão de Foxp3 por Real Time RT- PCR

A análise da expressão do gene Foxp3 nas células mononucleares do sangue periférico dos

pacientes, antes e após o transplante, foi feita por Real Time RT-PCR. As reações foram realizadas

em placas de 96 poços, utilizando os reagentes SYBR-Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

Foster City, CA, USA) e o equipamento 7500 Real Time PCR system (Applied Biosystems, Foster

City, CA, USA). O RNA foi extraído das células mononucleares dos pacientes pelo método de Trizol e

o cDNA foi sintetizado e validado para a amplificação do gene da β-actina. O gene endógeno GAPDH

(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) foi utilizado como gene de referência para normalizar

as reações de PCR para a quantidade e qualidade de RNA total usada nas reações de transcrição

reversa.

A determinação da intensidade de fluorescência na reação foi feita pelo cálculo do ∆Rn (∆Rn =

Rn+ - Rn-), onde Rn+ = intensidade de emissão do SYBR-Green intensidade de emissão do ROX em

um dado momento da reação, e Rn- = intensidade de emissão do SYBR-Green intensidade de

emissão do ROX, antes da amplificação. O composto ROX é utilizado como controle interno passivo,

pois a fluorescência que emite tem intensidade constante durante toda a reação, enquanto que o a


fluorescência emitida pelo SYBR-Green aumenta à medida que este se liga nas duplas fitas de DNA.

Durante os ciclos iniciais da reação, não há acúmulo de produtos de amplificação e os valores de ∆Rn

permanecem na linha de base (fluorescência do ROX > SYBR-Green). Na fase logarítmica da reação

ocorre acúmulo dos produtos de amplificação e a ∆Rn ultrapassa a linha de base. Para a

quantificação relativa, após a reação foi estabelecido um valor de ∆Rn, que é uma linha de corte

(threshold) para cada curva de amplificação de um dado par de primers, definida acima da

fluorescência inespecífica. O número do ciclo em que a ∆Rn da amostra cruza o threshold

corresponde ao Ct (cycle threshold) da amostra. O valor de Ct é preditivo da quantidade de RNAm

alvo presente na amostra.

Os primers utilizados nas reações de amplificação foram desenhados pelo programa Primer

Express (Applied Biosystems, EUA). Na padronização das reações de real time RT-PCR, os cDNAs e

primers foram titulados e foi calculada a eficiência da amplificação para o gene endógeno (GAPDH) e

para gene alvo (Foxp3). Os pares de primers utilizados foram: GAPDH (5’-TGG TCT CCT CTG ACT

TCA-3’, 5’-AGC CAA ATT CGT TGT CAT-3’); Foxp3 (5’-GAG AAG GGC AGG GCA CAA T-3’, 5’-GTG

CCA TGC AGG CCC ACC-3’). O produto de amplificação do gene GAPDH é 117 bp e do gene Foxp3

de 101 bp. Os primers foram usados na concentração final de 200 nM. As reações foram preparadas

em triplicatas num volume final de 10 µl. A reação de real time RT-PCR foi iniciada a 95ºC por 10

minutos, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC e 1 minuto a 60ºC, de acordo com o manual de

instruções do fabricante ABI PRISM 7500. O máximo coeficiente de variação permitido entre as

triplicatas foi de 1%, caso contrário o experimento foi repetido.

A especificidade dos primers foi avaliada pela curva de dissociação dos produtos de PCR, que

pode detectar amplificações inespecíficas, incluindo primer-dimers (Apêndice H ). Para isso, após a

reação, a placa foi submetida a um segundo programa: 95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto e 95°C

por 1 minuto. A curva de dissociação consiste na monitorização da fluorescência das amostras em

relação ao aumento de temperatura. A fluorescência das amostras decresce com o aumento da

temperatura, pois à medida que as pontes de hidrogênio, que mantém as duplas fitas unidas se

rompem (devido ao aumento de temperatura), o SYBR-Green é liberado. A fluorescência é emitida

somente quando o DNA está em dupla fita. Assim, quando observamos somente um pico de

fluorescência em uma dada temperatura significa que houve amplificação de um produto específico.

Esta temperatura é a temperatura de anelamento ou melting point (Tm) do produto de amplificação.


A normalização e quantificação relativa da expressão gênica foram realizadas pelo método de

2-∆∆CT (Livak et al., 2001), onde CT = threshold cicle (ciclo da reação em que a fluorescência da

amostras excede o threshold), e ∆∆CT = (CT, alvo - CT, endógeno) pós-transplante - (CT, alvo - CT, endógeno) pré-

transplante. Usando o método de 2-∆∆CT, os dados são representados como diferença (em vezes) na

expressão gênica, que foi normalizada para um gene endógeno de referência e é relativa a um

controle ou calibrador. Em nossos experimentos, o calibrador usado foi o valor basal ou pré-

transplante. Para o calibrador, o ∆∆CT é igual a zero e 20 é igual a um, assim mudança na expressão

gênica relativa ao período pré-transplante é igual a um. Para os períodos pós-transplante, o valor de

2-∆∆CT indica a diferença (em vezes) na expressão gênica relativa ao período pré-transplante.

O método 2-∆∆Ct para cálculo da expressão gênica assume que a eficiência de amplificação do

gene alvo e do gene de referência é igual a 2, ou seja, 100%. Para o cálculo da eficiência foi utilizada

a equação E = 10(-1/slope), onde E corresponde à eficiência e slope corresponde ao coeficiente de

angulação da curva (Bustin, 2000; Pfaffl, 2001). Para cada gene estudado foi realizada uma reação

com diluições seriadas de amostra de cDNA (1/5 a 1/1250) e o primers de interesse. Os valores de Ct

obtidos foram plotados em gráfico para cálculo do slope e da eficiência. A eficiência de amplificação

do gene GAPDH foi igual a 2,07 e do gene Foxp3 foi igual a 2,05. A correlação entre a eficiência das

amplificações foi de 0,998. O Apêndice H mostra as curvas de amplificação, as curvas de

dissociação, as curvas de amplificação com o threshold e o cálculo da eficiência de amplificação dos

genes estudados.

3.11 Análise estatística

A significância estatística das mudanças imunológicas foi avaliada longitudinalmente por

modelos de efeitos mistos. Os modelos lineares de efeitos mistos (efeitos aleatórios e fixos) são

utilizados na análise de dados onde as respostas de um mesmo indivíduo estão agrupadas e a

suposição de independência entre observações num mesmo grupo não é adequada (Schall et al.,

1991). Foi utilizado o procedimento PROC MIXED do software SAS (SAS/STAT® User’s Guide,

Version 8.02, SAS Institute Inc., 1999, Cary, Carolina do Norte, EUA). Os box-plots foram preparados

utilizando o software estatístico MINITAB Release 14 (Minitab Inc., USA). As extremidades das caixas

indicam o primeiro e terceiro quartis, as linhas dentro das caixas indicam a mediana, os pontos dentro

das caixas a média, e as barras se estendem do valor máximo ao mínimo. Os valores "máximos" e


"mínimos" são calculados, respectivamente, pelas expressões: Upper limit = Q3 + 1.5 (Q3 - Q1) e

Lower limit = Q1- 1.5 (Q3 - Q1), onde Q1 é o primeiro quartil e Q3 é o terceiro quartil. Qualquer valor

fora desses limites são os outliers, acusado nos gráficos com um círculo cheio. Os asteriscos no eixo

X indicam significância estatística (p<0,05).

As diferenças entre os valores dos indivíduos saudáveis versus pré-mobilização, e entre os

valores pré-mobilização versus todos os outros seguimentos pós-transplante, foram consideradas

estatisticamente significantes quando p valor menor que 5% (p <0,05). Tabelas com todos os valores

de média, desvio padrão e mediana dos resultados, assim como o valor de p, encontram-se nos

Apêndices D-G (Apêndices D e F: resultados pacientes com diabete melito do tipo 1; Apêndices F e

G: resultados pacientes com esclerose múltipla). No texto em Resultados, todos os valores absolutos

(células/µl) ou porcentagem (%) foram apresentados como média ± desvio padrão.

Referências

Referências 171

Referências *

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