estudo de doenças auto-imunes

Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Estudo de doenças Auto-imunes

Doenças Autoimunes endócrinasDoenças Autoimunes endócrinas

Prof. Doutor José Cabeda Técnicas de Imunologia

Patologias autoimunes sistémicas e de órgão

LESLES Lúpus discóideLúpus discóide EsclerodermiaEsclerodermia Citopenias autoimunesCitopenias autoimunes Síndrome de GoodpastureSíndrome de Goodpasture

Cirrose Biliar PrimáriaCirrose Biliar Primária Hepatite crónica activaHepatite crónica activa Síndrome Guillain-BarréSíndrome Guillain-Barré UveiteUveite Fibrose Pulmonar Idiopát.Fibrose Pulmonar Idiopát.

Artrite reumatóideArtrite reumatóide Artrite reumatóide juvenilArtrite reumatóide juvenil Sindrome de SjögrenSindrome de Sjögren DMID (Diabetes )DMID (Diabetes ) PsoriasePsoriase Doença de GravesDoença de Graves Doença de HashimotoDoença de Hashimoto Esclerose MúltiplaEsclerose Múltipla Colite ulcerosaColite ulcerosa Doença de ChronDoença de Chron Miastenia GravisMiastenia Gravis


Doenças Autoimunes endócrinas

Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto)Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) Doença de GravesDoença de Graves Diabete Melitus dependente de InsulinaDiabete Melitus dependente de Insulina Doença da AddisonDoença da Addison


Auto-antigénios de Doenças Autoimunes endócrinas

Tiroidite crónicaTiroidite crónica TiroglobulinaTiroglobulina Peroxidase da Tiroide (TPO)Peroxidase da Tiroide (TPO)

Doença de AddisonDoença de Addison Antigénios AdrenaisAntigénios Adrenais Ovario, Testiculos, Placenta Ovario, Testiculos, Placenta (uso em investigação)(uso em investigação)

HipoparatiroidismoHipoparatiroidismo Antigénios da paratiróide Antigénios da paratiróide (Ag citoplasmáticos)(Ag citoplasmáticos)

Anemia PerniciosaAnemia Perniciosa Células parietais gástricas Células parietais gástricas (subunidades (subunidades e e da ATPase H/K) da ATPase H/K)

Doença de GravesDoença de Graves TSH-R (Receptor da Hormona pituitária tirotropina )TSH-R (Receptor da Hormona pituitária tirotropina )

TSAb imita a acção da TSHTSAb imita a acção da TSH TBAb bloqueia a acção da TSH (existe no hipotiroidismo)TBAb bloqueia a acção da TSH (existe no hipotiroidismo) Testar a presença com células RFTL-5 ou substitutoTestar a presença com células RFTL-5 ou substituto


Diabetes Mellitus

Causada pela destruição das células beta do Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células Tpâncreas, mediada por células T

Estudo da função celular T não é práticaEstudo da função celular T não é prática Presença de Autoanticorpos é marcador da Presença de Autoanticorpos é marcador da

doençadoença Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios

das células beta, devido à sua destruiçãodas células beta, devido à sua destruição Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com

a evolução da doençaa evolução da doença Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISATestados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA


Auto-antigénios na IDDM Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA)Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA)

Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novoExistem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD)Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD)

Bandas de 64Kd e 50KdBandas de 64Kd e 50Kd Insulinoma Antigen (40 e 37Kd)Insulinoma Antigen (40 e 37Kd)

IA-2IA-2 IA-2IA-2

GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes)GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) Anti insulina (IAA)Anti insulina (IAA)

Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novoExistem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a

probabilidade de o doente possuir IDDMprobabilidade de o doente possuir IDDM


Auto-antigénios na IDDM



Doenças Autoimunes do Doenças Autoimunes do

Sistema NervosoSistema Nervoso


Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso

Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-anticorposanticorpos

Miastenia GravisMiastenia Gravis Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na

membrana pós-sináptica do musculomembrana pós-sináptica do musculo

Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES)Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado

pela voltagem, que regula a libertação do transmissor pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculono terminal nervoso do músculo



Anemia Hemolitica AutoimuneAnemia Hemolitica Autoimune


Anemias Hemoliticas autoimunes


Anemias Hemoliticas autoimunes:Técnicas diagnósticas laboratoriais

Direct Antiglobulin Test (DAT)Direct Antiglobulin Test (DAT) Demonstra o “coating” dos RBC com Ab Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivoin vivo Usado para investigar :Usado para investigar :

Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA)Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) Hemólise induzida por drogasHemólise induzida por drogas Doença Hemolitica do recém-nascidoDoença Hemolitica do recém-nascido Reacção aloimune á transfusãoReacção aloimune á transfusão

Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estávelEm WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando

o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentesatinge zonas mais quentes

Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgGEm PCM (semelhante ao CAD mas com IgG sangue coag.sangue coag. Activ. complemento Activ. complemento falsos positivos falsos positivos


DAT: procedimento1.1. Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento)Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento)2.2. Preparar RBC (2-4%) em PBSPreparar RBC (2-4%) em PBS3.3. 1 gota RBC em 3 tubos (1 gota RBC em 3 tubos (IgG, IgG, C3b/C3d, e albumina como controlo)C3b/C3d, e albumina como controlo)4.4. Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm)Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm)5.5. Adicionar 2 gotas de Adicionar 2 gotas de IgG, IgG, C3b/C3d, e 6% albuminaC3b/C3d, e 6% albumina6.6. Misturar e spin o tubo com Misturar e spin o tubo com IgG 15’’-3400rpmIgG 15’’-3400rpm7.7. Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e

microscópicamente para a presença de aglutinaçãomicroscópicamente para a presença de aglutinação8.8. Incubar 5 min-RT os restantes tubosIncubar 5 min-RT os restantes tubos9.9. Repetir 6 e 7 para os restantes tubosRepetir 6 e 7 para os restantes tubos10.10. Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio)

a cada tubo negativoa cada tubo negativo11.11. Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10

Em Indivíduos recentemente transfundidos separar os eritrócitos Em Indivíduos recentemente transfundidos separar os eritrócitos transfundidos (mais densos) por centrifugação. Se existir AIHA ambas as transfundidos (mais densos) por centrifugação. Se existir AIHA ambas as populações apresentam DTA positivo. Se apenas 1 população for positiva populações apresentam DTA positivo. Se apenas 1 população for positiva trata-se de Reacção transfusional tardia.trata-se de Reacção transfusional tardia.


Eluição de anticorpos de RBC

Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente)especificamente)

Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos)(promove a dissociação dos anticorpos)

CentrifugarCentrifugar Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorposRecolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Neutralizar o sobrenadante com solução tamponadaNeutralizar o sobrenadante com solução tamponada


Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos

Cold reactive Ab reagem a 0-4ºCCold reactive Ab reagem a 0-4ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºCAnticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC

1.1. Colher e manter amostra a 37ºCColher e manter amostra a 37ºC2.2. Spin 3400rpm-1minSpin 3400rpm-1min3.3. Incubar 5’ a 37ºCIncubar 5’ a 37ºC4.4. 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC5.5. Agitar; incubar 1 hora a 37ºCAgitar; incubar 1 hora a 37ºC6.6. Spin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamenteSpin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamente7.7. Repetir 5 e 6 a 30ºCRepetir 5 e 6 a 30ºC8.8. Repetir 5 e 6 a 22ºCRepetir 5 e 6 a 22ºC

Pos a 30 e 22ºC Pos a 30 e 22ºC Ig patológicas Ig patológicas Pos só a 22ºC Pos só a 22ºC Cold aglutininCold aglutinin A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSAA reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA


Indirect Antiglobulin Test (IAT):(Antibody screen for RBC-Ab)

Routine pre-transfusion testRoutine pre-transfusion test Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados

para aglutinação em 2 fases:para aglutinação em 2 fases: 37ºC com agente “enhancer”*37ºC com agente “enhancer”* Após adição de Após adição de -IgG (reagente coombs)-IgG (reagente coombs)

Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivos devidos a alo-anticorposfalsos positivos devidos a alo-anticorpos

WAIHA geralmente pan-RBCWAIHA geralmente pan-RBC

* BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente)* BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente)


Estudo de Alergias

Quantificação de alergéniosQuantificação de alergénios


Estudo de Alergias

Estudos Estudos in-vivoin-vivo


Quantificação de Alergénios

Skin testingSkin testing Protein contentProtein content Quantificação de alergénios individuais Quantificação de alergénios individuais

(RIA,ELISA, etc)(RIA,ELISA, etc) ImunoelectroforeseImunoelectroforese PAGEPAGE ImunoblotingImunobloting Inhibition immunoassaysInhibition immunoassays


Skin testing

Para controlar a possibilidade de choque sépticoPara controlar a possibilidade de choque séptico Médico disponível em SOSMédico disponível em SOS Garrote disponível em SOSGarrote disponível em SOS 1 mg epinefrina disponível em SOS1 mg epinefrina disponível em SOS

Seringa hipodérmica com 100 Seringa hipodérmica com 100 L alergénioL alergénio Injecção de 20-50 Injecção de 20-50 L, cerca de 3mm diâmetroL, cerca de 3mm diâmetro Observação aos 15 minObservação aos 15 min

Medir dois diâmetros e calcular médiaMedir dois diâmetros e calcular média Nova observação aos 30 minNova observação aos 30 min


Skin testing


Estudo de Alergias

Testes LaboratoriaisTestes Laboratoriais


Testes laboratoriais para estudo de alergias

Determinação de IgE totalDeterminação de IgE total Determinação de IgE específica para um alergénioDeterminação de IgE específica para um alergénio Screening multialergénicoScreening multialergénico Imunoblotting com alergéniosImunoblotting com alergénios Medida de alergénios caseirosMedida de alergénios caseiros Skin testingSkin testing


Determinação de IgE total

Captura com Captura com IgE conjugada com suporte IgE conjugada com suporte sólidosólido

LavarLavar Reagir com Reagir com IgE marcada IgE marcada LavarLavar Detectar a marcação (radioactividade ou Detectar a marcação (radioactividade ou

actividade enzimática)actividade enzimática)


Determinação de IgE específica para um alergénio

Alergénio ligado a matriz sólidaAlergénio ligado a matriz sólida Adicionar soro doenteAdicionar soro doente Incubar e lavarIncubar e lavar Reagir com Reagir com IgE marcadaIgE marcada LavarLavar Detectar a marcação (radioactividade ou Detectar a marcação (radioactividade ou

actividade enzimática)actividade enzimática)


Multiple Alergen Screens

Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólidaConjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Ex:Ex:

Mistura de árvoresMistura de árvores Mistura de relvasMistura de relvas Mistura de sementesMistura de sementes Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust

mitesmites Pelo de cão e gatoPelo de cão e gato Etc...Etc...


Specific IgE Inhibition immunoassays

Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivasdiluições sucessivas

Usar PBS como 0% inibição Usar PBS como 0% inibição Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro

do doente e incubar 2 horas com agitaçãodo doente e incubar 2 horas com agitação Alergénio ligado a suporte sólidoAlergénio ligado a suporte sólido Fazer um ensaio de detecção de IgE específicaFazer um ensaio de detecção de IgE específica Calcular a % inibição para cada diluição do inibidorCalcular a % inibição para cada diluição do inibidor Fazer um plot da inibição em função da Fazer um plot da inibição em função da

concentração de inibidorconcentração de inibidor

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