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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ - UNIVALI CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS DA TERRA E DO MAR – CTTMar
Jessica Engel Montemor
Avaliação da atividade lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados marinhos de profundidade
Itajaí 2013
i
Jessica Engel Montemor
Avaliação da atividade lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados marinhos de profundidade
Tabalho de Conclusão de Curso Área de conhecimento: Oceanografia Sub- área de conhecimento: Biológica Modalidade: Pesquisa Orientador: Dr. Marcus Adonai Castro da Silva
Itajaí 2013
ii
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao professor Marcus Adonai, pela orientação, paciência, dedicação, apoio e
principalmente confiança para a realização deste projeto.
Ao pessoal do LAMA Tiago e César e também ao Tiago do LBB pelo apoio em todas
as atividade de laboratório.
Aos meus pais e irmão, por proporcionarem a realização deste e sonho e pelo apoio e
incentivo em todos os momentos, principalmente naqueles em que pensei em desistir.
Sem vocês nada teria sido possível. Agradeço a honra de ter vocês sempre presentes
na minha vida, e me apoiando a cada novo passo a ser dado.
Á minha segunda família, onde encontrei apoio e conforto em todos os momentos,
seja nas conversas e concelhos da minha sogra Marly, ou nos momentos em que
precisava de distração, ao Murilo e Amanda.
Ao meu namorado Maurício, não devo a você somente o meu TCC, mas toda a minha
faculdade, ninguém melhor do que você acompanhou toda essa minha jornada, todas
as minhas dificuldades e sempre ficou ao meu lado, me dando força pra seguir em
frente, não deixando nada me abalar. Obrigado pelo companheirismo, pelas ajudas,
pelas noites não dormidas e pelo nosso filho maravilhoso. Nestes 5 anos, mesmo que
de longe nesta reta final, sempre me deu a força e a coragem para continuar.
Ao meu filho Bernardo que me ensina a ser cada dia melhor e que toda dificuldade
vem recompensada em apenas um sorriso seu. Por você entender melhor que gente
grande tudo que passamos nesse momento e por trazer luz, felicidade e prazer aos
meus dias.
Aos amigos mais antigos, que mesmo não tão presentes, estiverem sempre ao meu
lado, principalmente á Melanie, que nos nossos quase 20 anos de amizade provaram
que não é preciso estar sempre perto para se ser amigo, e você mesmo com as
distâncias que enfrentamos ao longo de nossas vidas, permaneceu ao meu lado, me
ensinou a ter garra e coragem, tu é meu exemplo em tudo na vida, agradeço a vida
pela irmã que me deu.
Aos amigos que fiz durante a faculdade, que ajudaram a tornar esse período mais
prazeroso e me proporcionaram momentos e aprendizados que levarei eternamente
comigo.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... iv
LISTA DE APÊNDICES ............................................................................................... vi
RESUMO ..................................................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 4
2.1. Objetivo Geral ................................................................................................... 4
2.2. Objetivos Específicos ...................................................................................... 4
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................. 5
3.1. Elevação do Rio Grande .................................................................................. 5
3.2. Microbiota de Invertebrados Marinhos de Profundidade .............................. 6
3.3. Atividade Lipolítica e Celulolítica de Bactérias Marinhas ............................. 7
4. MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 10
4.1. Amostras e Área de Estudo ........................................................................... 10
4.2. Isolamento e Armazenamento dos Micro-organismos ................................ 10
4.3. Avaliação da Atividade Lipolítica e Endoglucanolítica ................................ 11
4.4. Análise de dados ............................................................................................ 11
5. RESULTADOS ....................................................................................................... 12
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 15
7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 19
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 20
APÊNDICES ............................................................................................................... 27
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Crescimento das colônias e halos nos meios CMC (A) e Tween 20 (B). ...... 11
Figura 2. Distribuição das linhagens isoladas entre as cinco amostras analisadas de
invertebrados marinhos. ............................................................................................. 12
Figura 3. Distribuição das linhagens com atividade lipolítica e endoglucanolítica entre
as cinco amostras analisadas de invertebrados marinhos. ......................................... 12
Figura 4. Distribuição das amostras com atividade percentual de atividade enzimática.
................................................................................................................................... 13
Figura 5. Média e desvio padrão (barras verticais) do índice enzimático nos meios
contendo CMC e Tween 20. Cor amarela, amostra de holotúria; cor violeta, amostra de
coral; cor azul, amostra de ofíuro; cor verde, amostra de ouriço; cor marrom, amostra
de poliqueta. ............................................................................................................... 14
Figura 6. Média e desvio padrão (barras verticais) do crescimento (diâmetro das
colônias) dos mcro-organismos com atividade hidrolitica nos meios contend CMC e
Tween 20. Cor amarela, amostra de holotúria; cor violeta, amostra de coral; cor azul,
amostra de ofíuro; cor verde, amostra de ouriço; cor marrom, amostra de poliqueta. . 14
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Amostras de invertebrados marinhos analisadas no presente estudo e região
de origem. ................................................................................................................... 10
vi
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1. Micro-organismos isolados da região do Lineamento Cruzeiro do Sul. ... 27
Apêndice 2. Micro-organismos isolados da região da Elevação do Rio Grande. ......... 28
vii
RESUMO
Com a dificuldade de acesso e de manutenção de organismos em laboratório, os mares profundos tornam-se ambientes pouco estudados, apesar de sua importância e de abrigarem uma grande diversidade de micro-organismos, os quais são as entidades bióticas mais numerosas e antigas, capazes de colonizar diversos nichos ecológicos, e são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos ecossistemas. Além disso, os micro-organismos representam uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico sustentável. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo isolar e avaliar a atividade lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados marinhos coletados na região da Elevação do Rio Grande e no Lineamento Cruzeiro do Sul, Oceano Atlântico Sul. Para isso, foi feito o isolamento de cinco micro-organismos, pelo método de inoculação em superfície e os meios de cultura Ágar Marinho e R2A Marinho, diluídos (1:5), de amostras de organismos, oriundas das áreas de estudo. Posteriormente, foi feita a avaliação da sua atividade hidrolítica sobre Tween20 e carboximetilcelulose, em ensaios com placas conduzidos a 15ºC, comparados através de índices de atividade enzimática. Como resultado, de 68 organismos isolados, 29 apresentaram alguma atividade hidrolítica, sendo 18 deles lipolíticos. A amostra de coral foi a que rendeu um menor número de linhagens com atividade enzimática, enquanto que a de holotúria apresentou-se como a mais representativa. A partir do cálculo do índice enzimático (I.E.), no meio Tween 20, todas as linhagens apresentaram diferença entre si, com exceção da LAMA 1283 e LAMA 1290, as quais não apresentaram diferença significativa (p=0,999925), sendo estes os organismos com maior atividade lipolítica. Para a hidrólise de CMC a linhagem LAMA 1334 foi a que apresentou maior I.E., comparando com todas as amostras (p<0,005), sendo que 13 amostras apresentaram atividade celulolítica. Tornando possível então a conclusão de que o presente trabalho apresentou bactérias de invertebrados, em especial de equinodermos, com potencial para obtenção de lipases e endoglucanases, sendo estas amostras, de equinodermos, as quais proporcionaram o isolamento de um maior número de bactérias.
Palavras-chave: bactérias, Elevação do Rio Grande, enzimas adaptadas ao frio.
1
1. INTRODUÇÃO
Os ecossistemas marinhos são importantes no estudo dos micro-organismos,
em razão da sua biodiversidade. Estes micro-organismos são as entidades bióticas
mais numerosas e antigas, capazes de colonizar diversos nichos ecológicos. Sua
presença e atividade são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos
ecossistemas. Além disso, os micro-organismos representam uma importante fonte de
recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico
sustentável.
Os benefícios científicos esperados de um maior conhecimento sobre a
diversidade microbiana são extensos (COLWELL, 1997; HUNTER-CEVERA, 1998),
entre eles, a melhor compreensão das funções exercidas pelas comunidades
microbianas nos ambientes e o conhecimento das suas interações com outros
componentes da biodiversidade. Já os benefícios econômicos e estratégicos estão
relacionados com a descoberta de micro-organismos potencialmente exploráveis nos
processos biotecnológicos para produção de: novos antibióticos e agentes
terapêuticos, probióticos, produtos químicos, enzimas e polímeros para aplicações
industriais e tecnológicas, biorremediação de poluentes e biolixiviação e recuperação
de minérios. Outros benefícios incluem o prognóstico e prevenção de doenças
emergentes em seres humanos, animais, plantas, e a otimização da capacidade
microbiana para a fertilização dos solos e despoluição das águas (OLIVEIRA et. al.,
2006).
O potencial destes micro-organismos para biotecnologia já foi demonstrado em
vários trabalhos, incluindo a produção de moléculas como exopolissacarídeos (QIN et
al., 2007), metabólitos secundários como antitumorais (MINCER et al., 2005),
pigmentos (YADA et al., 2008) e enzimas (ZENG et al., 2004).
As enzimas produzidas por micro-organismos de águas profundas merecem
atenção especial, já que conseguem realizar suas atividades em ambientes totalmente
diferentes dos terrestres, com baixas temperaturas e sob altas pressões, e no caso
das lipases e celulases, podem ser utilizadas em diversos processos como a produção
de biocombustíveis e no tratamento de águas residuais (ROSA, 2011).
Há uma crescente atenção na pesquisa de micro-organismos adaptados ao
frio. Estes desempenham um papel importante nos processos de renovação de
nutrientes a baixas temperaturas (KOTTMEIER; SULLIVAN 1990; RIVKIN et al., 1989).
Desde a última década tem havido um esforço contínuo para se conhecer mais sobre
as enzimas de organismos marinhos. Entre as mais citadas com potencial
2
biotecnológico tem-se: proteases (GIONGO, 2006), carboidrases (BERTUCCI; COURI,
2004), peroxidases (DEBASHISH et al., 2005), lipase e celulases (ODISI et al., 2012),
sendo que todas elas foram obtidas de organismos que habitam ambientes marinhos
profundos.
Apesar da sua importância, os mares profundos são ecossistemas pouco
estudados, pela dificuldade de acesso e de manutenção de seus organismos em
laboratório. Mais recentemente, pesquisas com finalidades comerciais e científicas têm
sido realizadas, visando uma maior e melhor exploração de recursos em águas
profundas ao redor do mundo, uma vez que seus habitantes são menos afetados por
mudanças climáticas (mesmo sendo vítimas de degradação via atividades pouco
regulamentadas) (KITAHARA, 2007; VENN et al., 2009). No Brasil, algumas
expedições oceanográficas, têm contribuído para uma melhor compreensão da
biodiversidade desses ambientes, como o Projeto Mar-Eco, o qual é um projeto
internacional de pesquisa que envolve cientistas de 16 países e tem como objetivo
investigar a diversidade da vida animal ao longo das correntes do oceano aberto de
montanhas submarinas, tendo o presente trabalho como objetivo avaliar a atividade
lipolítica e endoglucanolítica de bactérias isoladas de invertebrados coletados na
região da Elevação do Rio Grande e do Lineamento Cruzeiro do Sul, oceano Atlântico
Sul.
3
4
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Isolar e avaliar a atividade lipolítica e endoglucanolítica a 15ºC de bactérias
isoladas de invertebrados coletados na região da Elevação do Rio Grande e do
Lineamento Cruzeiro do Sul, oceano Atlântico Sul.
2.2. Objetivos Específicos
Isolar bactérias de cinco amostras de invertebrados marinhos coletados nas
áreas de estudo.
Avaliar a atividade lipolítica e endoglucanolítica dos micro-organismos isolados
em ensaios em placas conduzidos a 15ºC.
Comparar os organismos obtidos com outras bactérias já avaliadas pelo grupo
de pesquisa, em relação com a atividade lipolítica e endoglucanolítica.
5
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1. Elevação do Rio Grande
O Oceano Atlântico Sul foi formado pela separação das placas da América do
Sul e da África há 175 - 90.000.000 anos atrás. Sua configuração e tamanho são
resultantes de dois processos de espalhamento independentes: um que formou o
Atlântico Norte no Mesozóico, iniciado a cerca de 200 milhões de anos atrás, e outro
que formou o Atlântico Sul, 100.000 mil anos mais tarde. Este processo de
espalhamento resultou na formação de conexões com outros três oceanos: do Sul,
Pacífico e Índico (FAIRHEAD e WILSON, 2004). Por ser relativamente jovem, o
Atlântico Sul é estreito e tem uma alta proporção entre margem continental e águas
profundas (LEVIN e GOODAY, 2003).
Cordilheiras meso-oceânicas e as cadeias de montes submarinos são
estruturas proeminentes do mar profundo que atraem considerável atenção pela sua
biodiversidade, pesca e recursos minerais (CLARK et al., 2010). A Elevação do Rio
Grande é uma feição positiva do Atlântico Sul, que alcança profundidades mais rasas
que 600m e é circundada por assoalho oceânico com profundidades médias de
4.000m. A Elevação do Rio Grande está além dos limites da plataforma continental
jurídica brasileira, ou seja, está em águas internacionais, uma região conhecida como
"A Área".
A origem da Elevação do Rio Grande ainda é cercada de controvérsias.
Mohriak et. al., (2010) elencam as seguintes hipóteses para a origem desta feição: (i)
um edifício vulcânico ou platô enraizado no manto, (ii) uma zona de cisalhamento
intraplaca afetando as crostas continental e oceânica, (iii) uma área oceânica com uma
atividade ígnea anormal causada por um ponto quente ou uma anomalia térmica no
manto, (iv) um paleo-centro de expansão do assoalho oceânico formado durante o
Cretáceo, (v) uma área de excessiva atividade vulcânica resultante de uma
diferenciação do manto devido a descompressão adiabática, e (vi) um remanescente
isolado de crosta continental, deixado para trás durante o processo de separação
América do Sul-África. São muitas as possibilidades, demonstrando que ainda existe
muito a se fazer.
O potencial para a exploração sustentável destes ecossistemas profundos,
como a elevação do Rio Grande, e a necessidade de sua conservação têm sido um
tema de crescente preocupação em todo o mundo e motivaram iniciativas científicas
modernas (McINTYRE, 2010). Uma dessas iniciativas, MAR-ECO, foi proposta em
6
2001 para estudar a diversidade e ecologia do norte da Dorsal Meso-Atlântica
(BERGSTAD e GODO, 2003).
Historicamente, esta extensa e topográfica área dos fundos oceânicos foi
pobremente amostrada, com exceção dos ecossistemas quimiossintéticos que se
encontram ao longo de pequenas porções de cume. Iniciativas como a de 2006, para
expandir as atividades de amostragem e estudos para o Atlântico Sul dorsal meso-
oceânica desmembrada do projeto MAR-ECO, apoiado pelo (Censo da Vida Marinha
em Seamounts) projeto CenSeam (CONSALVEY et al., 2010), vieram a enriquecer os
estudos.
A primeira expedição de campo realizada em 2009 para amostrar a biota
pelágica e bentônica do sul da Dorsal Meso-Atlântica efetivamente iniciou o "South
Atlantic MAR-ECO" (SA MAR-ECO), projeto voltado para melhorar o conhecimento
sobre os padrões de biodiversidade desta área oceânica vasta e pouco
conhecida(Perez et. al., 2012). Desde então outras três amostragens foram realizadas,
sendo a mais recente a bordo da embarcação NPq Yokozuka neste ano, na qual foram
coletadas as amostras estudadas neste trabalho.
3.2. Microbiota de Invertebrados Marinhos de Profundidade
Os animais que não possuem notocorda nem coluna vertebral são conhecidos
como invertebrados. Esse grupo é muito grande e inclui animais que apresentam
formas e comportamentos bem diferentes. Eles podem ser encontrados nos mais
diversos ambientes (aquáticos ou terrestres) e podem ser parasitas de plantas ou de
outros animais (BONECKER et. al., 2002).
O número de bactérias que residem nestes invertebrados podem ser tão
variados e numerosos que podem constituir, por exemplo, até 60% da biomassa total
de esponjas (OLSON; MCCARTHY; 2005). Isto evidência que as bactérias têm papel
fundamental nas funções biológicas de seus hospedeiros, atuando na nutrição, saúde
e substâncias de defesa. O papel destes micro-organismos nos ecossistemas de
recifes e corais não está bem elucidado, sendo que os micro-organismos podem atuar
como saprofíticos ou patógenos, ou ainda desenvolver outras funções importantes no
ecossistema (SHNIT-ORLAND & KUSHMARO; 2008). Em relações simbiônticas com
corais a microbiota pode contribuir para obtenção de nutrientes como o nitrogênio e
fósforo ou ainda desenvolver funções importantes de proteção contra patógenos.
As bactérias marinhas são seres procariontes, na sua grande maioria são
gram-negativas, flageladas e não esporuladas, podendo ocorrer Gram-positivas,
7
apresentam formas variadas como bacilos, cocos, vibriões e espirilos (MUNN, 2004).
As Gram-negativas são representadas principalmente pelos gêneros: Cythophaga,
Flavobacterium, Oceanospirillum, Pseudomonas, Roseobacter, Shewanella e Vibrio
(GONTANG; FENICAL; JENSEN, 2007). Dentre a biodiversidade de Gram-positivas,
os filos Actinobacteria (Actinomicetos) e Firmicutes (gêneros Bacillus e Clostridium)
são amplamente encontrados. Conhecidos como saprófitos do solo, Bacillus e
Clostridium são componentes de sedimentos marinhos (GROSSART et al., 2004 apud
RODRIGUES, 2008).
Da mesma maneira, as bactérias associadas com invertebrados marinhos são
bastante diversificadas. Li et al. (2007), por exemplo, estudaram as bactérias
associadas com esponjas do Mar da China, tendo isolado várias linhagens com
atividade hidrolítica. Os micro-organismos obtidos pertenciam a dois filos bacterianos,
Proteobacteria e Firmicutes, sendo o gênero Bacillus o mais frequentemente isolado.
Já Mourino (2008) observou alta carga de Vibrio nas águas do Laboratório de
Camarões Marinhos, da Universidade Federal de Santa Catarina. Costa (2006)
estudou os víbrios associados ao cultivo de camarão L. vannamei em fazendas do
Ceará. Pereira et. al., (2007) investigaram a presença de víbrios em 40 amostras de
ostras (Crassostrea rhizophoreae) servidas em 15 restaurantes da Cidade do Rio de
Janeiro.
Rosenberg et. al., (2007) iniciou a investigação da microbiologia no coral
focada na camada de muco da sua estrutura, utilizando técnicas de cultura
tradicionais. Estes estudos demonstraram que esta camada suporta uma comunidade
de bactérias benéficas, diversas e abundantes, incluindo fixadoras de azoto e
decompositores de quitina. Já os esqueletos de coral, são estruturas porosas
habitadas por uma variedade de bactérias. Estas podem ser cruciais para a
sobrevivência do coral, quando perde a suas algas endossimbióticas, causando uma
doença conhecida como branqueamento do coral.
3.3. Atividade Lipolítica e Celulolítica de Bactérias Marinhas
Celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre
materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. Estas enzimas são biocatalisadores
altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais
a glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à possibilidade de sua
conversão em etanol (OLSSO; HAHN-HAGERDAL, 1996).
8
A classificação das celulases, de acordo com seu local de atuação no substrato
celulósico, pode se apresentar em três grandes grupos: endoglucanases (EnG), que
clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases (ExG), que atuam na
região externa da celulose; e b-glicosidases (BG), que hidrolisam oligossacarídeos
solúveis em glicose (CASTRO, 2010)
A endoglucanase possui como nome sistemático, segundo a IUBMB –
International Union of Biochemistry and Molecular Biology –, 1,4-β-D-glucana-4-
glucano-hidrolase. É a enzima do complexo celulolítico responsável por iniciar a
hidrólise. Tal enzima hidrolisa randomicamente as regiões internas da estrutura amorfa
da fibra celulósica, liberando oligossacarídeos de diversos graus de polimerização
(GP) e, consequentemente, novos terminais, podendo ser um redutor (quando a
glicose possui uma hidroxila heterosídica livre) e um não redutor (quando a hidroxila
heterosídica da molécula da extremidade participa de ligação com a glicose
adjacente). A EnG é a enzima celulolítica responsável pela rápida solubilização do
polímero celulósico (redução do GP), devido à sua fragmentação em oligossacarídeos
(FRACHEBOUD, CANEVASCINI, 1989). As endoglucanases são produzidas
principalmente por fungos, bactérias e protozoários (KUMAR et al., 2008).
A literatura mostra a produção de endoglucanases por actinomicetos, em
especial Streptomyces, em diferentes substratos, a estirpe de Streptomyces, a T3-1,
produziu 40,3 U/ mL em 1,5% de CMC e sulfato de amônio, ureia e peptona, porém os
nutrientes utilizados não eram substratos de baixo custo. Streptomyces sp. isolada de
solo do Canadá foi cultivada em uma solução de sais de Mandel contendo peptona,
tween 80 em 1,0% de celulose cristalina e produziu 11,8 U/mL de CMCase; enquanto
Thermomonospora sp., um actinomiceto alcalotermofílico, quando cultivado em meio
contendo celulose de papel em pó, extrato de levedura e Tween 80, apresentou um
pico de atividade de 23 U/mL, e quando cultivado em farelo de trigo a atividade foi de
8,5 U/mL (PACHECO et. al., 2011).
Uma outra classe de enzimas com grande relevância são as lipases
(triacilglicerol acilhidrolases E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise total
ou parcial de triacilglicerol (TAG), formado por três ácidos graxos de cadeia longa
ligados na forma de ésteres a uma molécula de glicerol, fornecendo diacilglicerol
(DAG), monoacilglicerol (MAG), glicerol e ácidos graxos livres.
Apresentam capacidade de agir apenas na interface óleo/água sendo as
enzimas que agem em ésteres solúveis em água, ou que hidrolisam outros lipídios,
excluídas desta definição. Além disso, não precisam de cofatores, e catalisam não só
reações de hidrólise, como também de síntese, como esterificação, interesterificação,
9
transesterificação, alcoólise e aminólise, e por atuar sobre substratos não naturais
(AEHLE, 2007).
As lipases apresentam variadas aplicações: em tratamento de esgoto ou caixas
de gordura, produção comercial de biodiesel e produção de alimento e algumas
drogas. No tratamento de esgoto ou em caixas de gordura, as lípases atuam
diminuindo custos de manutenção e reduzindo impactos negativos ao meio ambiente
(AEHLE, 2007). Na produção comercial de biodiesel, são ótimas diminuindo a
quantidade de resíduos e facilitando a recuperação do produto final. Comparando-se
combustíveis fósseis com biocombustíveis, o segundo apresenta a vantagem de ser
uma fonte de energia renovável (SALIS; et. al., 2007). Na indústria alimentícia, seu uso
está associado à produção de queijos, sucos de frutas e vegetais, clarificação de
sucos e vinhos, panificação e cervejaria (BERTUCCI; COURI, 2004). E, em algumas
drogas, possuem a capacidade de reduzir os efeitos colaterais causados pelas
mesmas (KIM et al., 2007).
Há relativamente poucos estudos com micro-organismos lipolíticos de
ambientes marinhos. Park et al, (2007) estudou a linhagem Vibrio GMD509 exibindo
atividade lipolítica, isolada a partir de ovos de lebre do mar, Aplysia kurodai,
caracterizando uma nova enzima lipolítica. Seo et al. (2005), por outro lado,
descreveram uma nova espécie bacteriana com atividade lipolítica, Phtobacterium
frigidiphilum, isolada de sedimentos marinhos coletados a 1450m, em um monte
submarino. A atividade lipolítica desta bactéria foi visualizada em Ágar Marinho
contendo o substrato tributirina (ODISI et. al., 2012).
Algumas bactérias produtoras de lípases são as do gênero Halomonas e
Marinobacter. Kaye et al,. (2004) procuraram avaliar a diversidade fisiológica e
filogenética de bactérias de fontes hidrotermais do oceano profundo. Como resultado,
quatro isolados foram totalmente caracterizados e, através de sequenciamento
genético, classificados e nomeados como Halomonas neptunia, H. sulfidaeris, H.
axialensis e H. hydrothermalis. Em outro trabalho, por sequenciamento genético, foi
descoberta uma nova espécie para o gênero Marinobacter, a M. excellens. Esta foi
encontrada a partir de 5 estirpes de bactérias halofílicas, gram-negativas isoladas de
amostras de sedimento coletadas na Baía de Chazhma, mar do Japão (GORSHKOVA
et al., 2003). Além destes, autores como Xiang et al. (2004) estudaram micro-
organismos lipolíticos psicrófilos dos gêneros Psychrobacter, Pseudoalteromonas e
Pseudomonas, do filo Proteobacteria, sendo isolados de sedimentos profundos do
Oceano Pacífico.
10
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Amostras e Área de Estudo
A área de estudo compreendeu a Elevação do Rio Grande e o Lineamento
Cruzeiro do Sul, localizados na parte oeste do Oceano Atlântico Sul. As amostras
estudadas foram coletadas pelo biológo Dr. André Oliveira de Souza Lima (da
Universidade do Vale do Itajaí) durante a expedição Iatá-Piuna, a bordo da
embarcação NPq Yokozuka entre abril e maio de 2013, com o submergível Shinkai
6500 tendo seu percurso da África do Sul até o Rio de Janeiro, sendo o primeiro
submergível tripulado no Oceano Atlântico Sul. No total, foram analisadas cinco
amostras de invertebrados marinhos (Tabela 1).
Tabela 1. Amostras de invertebrados marinhos analisadas no presente estudo e região de origem.
Profundidade (m)
Grupo Organismo Origem
4129 Equinodermo Holotúria Lineamento Cruzeiro do Sul 4203 Anelídeo Poliqueta Lineamento Cruzeiro do Sul 3752 Equinodermo Ouriço do mar Lineamento Cruzeiro do Sul 1251 Cnidário Coral negro Elevação do Rio Grande 1251 Equinodermo Ofiúro Elevação do Rio Grande
4.2. Isolamento e Armazenamento dos Micro-organismos
Para o isolamento dos micro-organismos, as amostras de invertebrados foram
trituradas em água marinha estéril, na proporção 1:9. Em seguida, as amostras
homogeneizadas foram diluídas de forma decimal em série (até 10-4), utilizando como
diluente água marinha estéril. Posteriormente, placas de Petri contendo os meios Ágar
Marinho Diluído (AMD) e R2A Marinho Diluído (R2AD), ambos na proporção 1:5, foram
inoculadas com alíquotas de 100μl das diluições previamente preparadas, em
duplicata, e incubadas a 5ºC por quatro semanas. Transcorrido o tempo de incubação,
as placas foram examinadas e três colônias de cada tipo morfológico presentes, de
cada placa, selecionadas e repicadas para novas placas de meio de cultura, para seu
isolamento. Este processo foi repetido até a obtenção de colônias puras. Os micro-
organismos isolados foram armazenados em ultrafreezer (-80ºC), em caldo marinho
suplementado com glicerol a 20%.
11
4.3. Avaliação da Atividade Lipolítica e Endoglucanolítica
As bactérias isoladas foram analisadas quanto à sua atividade de lipases e
endoglucanase. Para tanto, em placas de Petri contendo meio sólido suplementado,
separadamente, com os substratos Tween20 (para evidenciar a atividade lipolítica) e
carboximetilcelulose (CMC, para evidenciar a atividade endoglucanolítica) a 0,5%
(SMIBERT; KRIEG, 1994). A partir da colônia isolada, placas de Ágar Marinho
contendo os substratos mencionados foram inoculadas de forma pontual em triplicata,
com auxilio de palitos de dentes autoclavados, e incubadas a 15ºC por duas semanas.
Transcorrido o tempo de incubação, os diâmetros das zonas de hidrólise (fh) foram
medidos, assim como o diâmetro das colônias (fc), e índices de atividade enzimática
(IE) foram calculados utilizando-se a fórmula: IE = fh/fc (HANKIN; ANAGNOSTAKIS,
1975). Todas as bactérias isoladas foram avaliadas.
Para evidenciar as zonas de hidrólise de CMC, as placas de Petri foram
inundadas com uma solução de vermelho do congo à 0,1%, para a atividade
endoglucanolítica. Após 20 minutos, as placas foram lavadas com solução de NaCl a
5M, sendo então possível a visualização dos halos de produção enzimática. Para as
placas contendo Tween20 não foi necessária a aplicação de corantes para
evidenciação do halo de produção enzimática (Figura 1).
Figura 1. Crescimento das colônias e halos nos meios CMC (A) e Tween 20 (B).
4.4. Análise de Dados
O crescimento (diâmetro das colônias) e os índices enzimáticos foram
comparados entre os micro-organismos com atividade, utilizando-se a Análise de
Variância e o teste post hoc de Tukey, com o software Statistica versão 8.0. Foram
considerados significantes valores que apresentaram níveis de p inferiores a 0,05.
A B
12
5. RESULTADOS
Neste trabalho foram obtidas através do isolamento, 68 linhagens de bactérias
das cinco amostras analisadas. Destas, 53% foram obtidas das amostras de holotúria
e ofiúro, das quais foram os únicos que, as bactérias presentes, tiveram atividade
enzimática tanto celulolítica quanto lipolítica. Conforme a Figura 2 pode-se observar
que a amostra de Coral foi a que rendeu menos quantidade de linhagens.
Figura 2. Distribuição das linhagens isoladas entre as cinco amostras analisadas de
invertebrados marinhos.
Vinte e nove das sessenta e oito linhagens obtidas, apresentaram alguma
atividade enzimática, e destas 18 apresentaram atividade lipolítica. A amostra de
holotúria apresentou-se como a mais representativa para obtenção de bactérias com
atividade endoglucanolítica, enquanto que para bactérias com atividade lipolítica a
amostra que mais se destacou foi a de Ouriço (Figura 3).
46%
31%
23%
Celulolíticas
28%
11%
44%
17%
Lipolíticas
Holotúria
Poliqueta
Ouriço
Coral
Ofíuro
Figura 3. Distribuição das linhagens com atividade lipolítica e endoglucanolítica entre as cinco
amostras analisadas de invertebrados marinhos.
13
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Holotúria Poliqueta Ouriço Coral Ofíuro
Nenhuma atividade
Ambas as atividades
Atividade celulolítica
Atividade lipolítica
Figura 4. Distribuição das amostras com atividade percentual de atividade enzimática.
Treze linhagens apresentam atividade endoglucanolítica, das quais seis foram
isoladas de holotúria [LAMA 1287, LAMA 1290, LAMA 1291, LAMA 1292, LAMA 1295
e LAMA 1298]. Destas seis, duas linhagens [LAMA 1290 e LAMA 1295] também
apresentaram atividade lipolítica, juntamente com outras três bactérias [LAMA 1281,
LAMA 1282 e LAMA 1283].
A segunda amostra que rendeu o maior número de linhagens celulolíticas foi a
de coral, com quatro linhagens com essa atividade enzimática. Nenhuma linhagem de
coral apresentou atividade lipolítica. Três linhagens obtidas da amostra de ofiúro
apresentaram atividade celulolítica [LAMA 1334, LAMA 1344 e LAMA 1348], e lipolítica
[LAMA 1339, LAMA 1340 e LAMA 1345].
Dois micro-organismos da amostra de poliqueta [LAMA 1303 e LAMA 1305] e
oito linhagens da amostra de ouriço [LAMA 1310, LAMA 1311, LAMA 1316, LAMA
1317, LAMA 1319, LAMA 1320, LAMA 1321 e LAMA 1322] apresentaram atividade
lipolítica, sendo este último o grupo mais representativo (44% do total de organismos
lipolíticos). Os micro-organismos destes invertebrados não apresentaram atividade
endoglucanolítica.
Os I.E.s foram analisados por ANOVA, e pode-se observar que, em relação á
atividade lipolítica, as linhagens LAMA 1283 e LAMA 1290 não apresentaram
diferença entre si (p=0,999925) (Figura 4), sendo os organismos com maior atividade
lipolítica. Para a hidrólise de CMC a linhagem LAMA 1334 foi a que apresentou maior
I.E. (Figura 4), se destacando das demais (em comparação com todas as amostras
p<0,005).
14
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
LAM
A 1
33
4
LAM
A 1
28
7
LAM
A 1
29
2
LAM
A 1
29
0
LAM
A 1
32
8
LAM
A 1
34
4
LAM
A 1
34
8
LAM
A 1
32
7
LAM
A 1
29
1
LAM
A 1
29
5
LAM
A 1
29
8
LAM
A 1
33
0
LAM
A 1
32
5
CMC
(mm)0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
LAM
A 1
28
3
LAM
A 1
29
0
LAM
A 1
28
2
LAM
A 1
28
1
LAM
A 1
32
0
LAM
A 1
34
0
LAM
A 1
32
1
LAM
A 1
32
2
LAM
A 1
30
3
LAM
A 1
33
9
LAM
A 1
31
6
LAM
A 1
30
5
LAM
A 1
31
7
LAM
A 1
31
1
LAM
A 1
31
9
LAM
A 1
31
0
LAM
A 1
34
5
LAM
A 1
29
5
Tween 20
(mm)
Figura 5. Média e desvio padrão (barras verticais) do índice enzimático nos meios contendo
CMC e Tween 20. Cor amarela, amostra de holotúria; cor violeta, amostra de coral; cor azul,
amostra de ofíuro; cor verde, amostra de ouriço; cor marrom, amostra de poliqueta.
Quando observamos o tamanho do diâmetro das colônias, vemos que, com
exceção da amostra LAMA 1310 (ouriço) que possuí um I.E. inferior, todas as outras
seguiram um padrão constante para o Tween20 (Figura 5). Já para no meio contendo
CMC, a amostra que não acompanhou o crescimento padrão foi LAMA 1325 (coral),
ambas tendo crescimento superior as demais.
Associando-se o I.E. com o crescimento das colônias, é possível observar que
a amostra que apresentou o maior I.E. para o CMC foi a que apresentou o menor
crescimento da colônia, enquanto que para o Tween 20 a linhagem com maior I.E.
apresentou-se com crescimento de colônia mediano. Para a linhagem com menor I.E.
de CMC, observou-se que esta se apresentou como a colônia de maior crescimento,
enquanto que para o Tween 20 não pode-se obter relação entre a linhagem com
menor valor de I.E. e o crescimento da colônia.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
LAM
A 1
32
5
LAM
A 1
32
7
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A 1
29
5
LAM
A 1
34
4
LAM
A 1
29
8
LAM
A 1
32
8
LAM
A 1
29
0
LAM
A 1
33
0
LAM
A 1
28
7
LAM
A 1
29
2
LAM
A 1
29
1
LAM
A 1
34
8
LAM
A 1
33
4
CMC
(mm)
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
LAM
A 1
31
0
LAM
A 1
33
9
LAM
A 1
29
5
LAM
A 1
32
1
LAM
A 1
30
3
LAM
A 1
34
5
LAM
A 1
31
6
LAM
A 1
28
3
LAM
A 1
31
9
LAM
A 1
34
0
LAM
A 1
32
2
LAM
A 1
31
7
LAM
A 1
31
1
LAM
A 1
32
0
LAM
A 1
28
2
LAM
A 1
29
0
LAM
A 1
28
1
LAM
A 1
30
5
Tween 20
(mm)
Figura 6. Média e desvio padrão (barras verticais) do crescimento (diâmetro das colônias) dos
mcro-organismos com atividade hidrolitica nos meios contend CMC e Tween 20. Cor amarela,
amostra de holotúria; cor violeta, amostra de coral; cor azul, amostra de ofíuro; cor verde,
amostra de ouriço; cor marrom, amostra de poliqueta.
15
6. DISCUSSÃO
Neste estudo foram avaliados micro-organismos extraídos de invertebrados
marinhos, obtidos de zonas profundas região da Elevação do Rio Grande e do
Lineamento Cruzeiro do Sul, oceano Atlântico Sul, quanto à produção de lipase e
endoglucanase. Investigar a atividade de micro-organismos de ambientes extremos,
bactérias e suas enzimas metabólicas, se torna interessante não apenas por motivos
científicos, como também para desenvolvimento comercial, devido à atividade
catalítica alta em baixas temperaturas e especificidades incomuns destes organismos
(ZHANG; ZENG, 2008).
Neste trabalho a amostra de holotúria esteve entre as duas que
proporcionaram o isolamento de um maior número de micro-organismos. Isto está de
acordo com a sugestão de Zhang e colaboradores (2012) de que as bactérias atuam
na digestão de detritos no trato intestinal destes invertebrados. Estes autores
relataram o isolamento de 141 bactérias de holotúrias, sendo Bacillus e Vibrio os
principais gêneros identificados. As bactérias isoladas no presente estudo não foram
identificadas, porém para uma melhor avaliação dos resultados sugere-se que o
mesmo seja feito em realização de trabalhos futuros.
Os ofiúros constituem o único grupo de equinodermos que ocorrem em
populações densas. O sistema nervoso relativamente primitivo e sensorial dos
equinodermos tem sido incapaz de produzir um comportamento social com os outros
de sua própria espécie. Reese (1966) sugere que as agregações são dadas como
respostas individuais às características físicas do ambiente, por exemplo, estrelas
frágeis poderiam se reunir em áreas onde há fortes correntes e comida abundante,
podendo explicar a elevada presença de linhagens bacterianas na amostra deste
grupo de organismos, analisada no presente estudo.
A amostra de coral foi a que apresentou um menor número de linhagens de
bactérias com atividade enzimática. Isto pode ser explicado por Rosenberg et. al.,
(2007) onde a abundância de bactérias na camada de muco foi estimada em 105-106
unidades formadoras de colônias (UFC) por ml. Curiosamente, estes valores são de
aproximadamente 0,2 % do total de contagens bacterianas que foram determinadas
microscopicamente. Porém os autores ressaltam que há diferentes populações
bacterianas no muco, no esqueleto e no tecido a partir do mesmo fragmento de coral,
podendo acarretar em diferentes resultados nos estudos. Diversos autores relataram a
presença Vibrio, Aspergillus, Aurantimonas, Thalassomonas, e Serratia como
patógenos de corais em diferentes regiões.
16
No presente trabalho os micro-organismos exibiram variação tanto no diâmetro
dos halos quanto na própria formação deste. Isto pode ser devido ao fato das enzimas
excretadas por algumas bactérias não possuirem capacidade específica para degradar
o Tween 20 e/ou CMC, sendo que as bactérias podem apresentar divergência quanto
à degradação do substrato (JAEGER et al., 1994). Para o Tween 20 a variação
ocorreu entre 11,47 e 2,35mm e para o CMC foi entre 7,10 e 2,30mm. As linhagens
LAMA 1305, para Tween 20, e LAMA 1334, para CMC, foram as que apresentaram o
menor crescimento de colônia, sendo que esta última apresentou o maior Índice
enzimático, podendo indicar um alto potencial de produtividade enzimática, ao
contrário da linhagem LAMA 1325, a qual obteve maior crescimento da colônia, porém
baixo I.E., ressaltando que colônias pequenas com halos grandes resultam em valores
maiores de IE.
De modo geral, as linhagens que mais se diferiram do padrão das demais, nos
índices enzimáticos, foram as obtidas da amostra de ouriço, que proporcionou o
isolamento de maior quantidade de bactérias lipolíticas. Burnett (1997) explicou que
muitas espécies de equinodermos, em todas as cinco classes existentes, contêm
bactérias simbiontes subcuticulares (SCB), que tem sido objeto de estudo considerável
no que diz respeito à sua distribuição sistemática entre os equinodermos, possível
função e potencial para utilização em ensaios subletais de stress. Embora haja alguma
sugestão de que SCB pode estar envolvido com o metabolismo do nitrogênio, a
compreensão da base da simbiose, bem como as possíveis vantagens ou
desvantagens, quer hospedeiros ou simbiontes, é limitada. Com a possível
degradação de lipídeos para a colonização do hospedeiro, por estas bactérias
simbiontes subcuticulares, justifica-se o maior isolamento de micro-organismos
lipolíticos das amostras de ouriço. Para o substrato CMC apenas uma linhagem da
amostra de ofiúro apresentou uma diferença considerável na atividade hidrolítica, em
relação com as demais. Vale ressaltar que esta amostra foi a que rendeu um menor
número de linhagens bacterianas. É possível que este menor número de organismos
esteja relacionado com a presença de bactérias que não cresçam nos meios de
cultura empregados no isolamento. Isto é relatado para vários tipos de amostras, e
sugere uma relação de dependência da maioria da microbiota com seu hospedeiro.
Algumas cepas isoladas se destacaram em relação com seus índices
enzimáticos (Figura 3), sugerindo produção de enzima em quantidades maiores, e
que, em vez de permanecerem no interior das células, foram excretadas no meio
(MADIGAN et al., 2004). Estas enzimas extracelulares podem ser encontradas no
meio de cultivo ou de propagação celular, sendo então mais facilmente isoladas e
avaliadas. As enzimas originadas das bactérias possuem diferentes aplicações e
17
efeitos, como na área de álcool industrial para liquefação e sacarificação de
amiláceos, lavagem e limpeza na remoção de manchas, peles e couros para remoção
de elastina, alimentos protéicos na obtenção de hidrolisados e xaropes de alto teor de
frutose (KIELING, 2002). Portanto os micro-organismos que se destacaram no
presente estudo, podem ser avaliados de forma mais pontual para que sejam
aproveitados para suas respectivas aplicações.
A característica de bactérias marinhas apresentarem várias enzimas
hidrolíticas extracelulares é conhecida, pois são estas enzimas que permitem que os
micro-organismos participem na biodegradação de moléculas complexas de
polissacarídeos, proteínas e ácidos de nucléicos (ROMANENKO; KALINOVSKAYA;
MIKHAILOV 2000). Pereira (2009) encontrou atividade enzimática extracelular em sete
das vinte e uma linhagens analisadas. As amostras de ouriço, polvo e anêmona são
exemplos destas. Outro fator muito estudado é a atividade antimicrobiana retirada de
extratos de vários invertebrados marinhos como esponjas, corais e moluscos. Há
variantes entre as atividades desenvolvidas pelos corais, sendo que estes podem
possuir grandes ou pequenas atividades microbianas, isto pode ser explicado pela
associação que o coral possui com seus micro-organismos, por exemplo. Em estudos
realizados por Ritchie e colaboradores (2006) foi demonstrado que o muco que
determinados corais excretam podem inibir o crescimento de micro-organismos
potencialmente invasivos e mais de 20% das bactérias presentes neste muco
possuíam alta atividade antimicrobiana.
Pereira (2009) observou que das 72 bactérias cultivadas, 21 foram lipolíticas,
sendo que destas, 42,85% foram obtidas das amostras de ouriço, corroborando com o
presente estudo onde 44% dos micro-organismos lipolíticos foram provenientes da
amostra de ouriço. Maior atividade enzimática ocorreu sobre o substrato lipídico no
presente estudo, assim como observado por Rosa (2011), que relatou atividade
lipolítica em 67% dos isolados, e Cherobin (2009), no qual todos os isolados
apresentaram atividade lipolítica. Diniz (2012), estudando bactérias isoladas de
amostras de água, observou que quatorze das vinte cepas apresentou halos de
secreção de enzimas em três dos quatro substratos testados na temperatura de 30ºC,
cinco cepas apresentaram halos de secreção de enzimas em dois substratos testados
a 15ºC e, para a temperatura de 5ºC, somente cinco cepas apresentaram secreção
enzimática para o substrato lipase. Para o substrato CMC do mesmo estudo, nas três
temperaturas testadas, nenhuma cepa apresentou secreção enzimática, diferindo-se
do presente trabalho, onde das vinte e nove linhagens obtidas, onze foram de
atividade celulolítica. Isto demonstra que os invertebrados podem ser uma melhor
fonte de micro-organismos com atividade endoglucanolítica.
18
Comparando-se os trabalhos realizados com diferentes amostras e ambientes,
pode-se observar que Pereira (2009) e Cherobin (2009), relatam diferentes
porcentagens de micro-organismos lipolíticos, 29% e 100%, respectivamente, sendo
que ambos estudaram micro-organismos isolados de invertebrados marinhos. No
presente trabalho 26% (n=18) dos micro-organismos isolados apresentaram atividade
lipolítica. Por outro lado, Rosa (2011), estudando amostras de sedimento observou
que 66% apresentaram atividade lipolítica, enquanto que Diniz (2012), estudando
amostras de água, observou aproximadamente 38% de micro-organismos com esta
atividade. Portanto, não se pode concluir qual tipo de amostra proporcionou o
isolamento de um maior número de organismos com atividade lipolítica, porém os
micro-organismos, de maneira geral, podem ser considerados com um bom meio para
a produção enzimática.
19
7. CONCLUSÃO
As amostras de equinodermos proporcionam o isolamento de um maior número
de bactérias.
As bactérias de invertebrados, em especial de equinodermos, apresentaram
potencial para a obtenção de lipases e endoglucanases.
As bactérias de invertebrados são fontes melhores de organismos
endoglucanolíticos, enquanto que bactérias lipolíticas podem ser igualmente
obtidas de outros tipos de amostras, como água e sedimentos.
20
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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27
APÊNDICES
Apêndice 1. Micro-organismos isolados da região do Lineamento Cruzeiro do Sul.
Código Meio Mergulho Amostra Data
LAMA 1281 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1282 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1283 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1284 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1285 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1286 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1287 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1288 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1289 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1290 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1291 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1292 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1293 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1294 Ágar Marinho Diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1295 R2A marinho diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1296 R2A marinho diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1297 R2A marinho diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1298 R2A marinho diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1299 R2A marinho diluído #1333 Holotúria (Psychropotes) 23/04/2013
LAMA 1300 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1301 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1302 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1303 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1304 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1305 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1306 Ágar Marinho Diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1307 R2A marinho diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1308 R2A marinho diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1309 R2A marinho diluído #1336 Ocilodactilis 26/04/2013
LAMA 1310 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1311 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1312 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1313 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1314 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1315 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1316 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1317 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1318 Ágar Marinho Diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1319 R2A marinho diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1320 R2A marinho diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1321 R2A marinho diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
LAMA 1322 R2A marinho diluído #1334 Ouriço (Echinoidea) 24/04/2013
28
Apêndice 2. Micro-organismos isolados da região da Elevação do Rio Grande.
Código Meio Mergulho Amostra Data
LAMA 1332 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1333 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1334 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1335 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1336 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1337 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1338 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1339 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1340 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1341 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1342 R2A marinho diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1343 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1344 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1345 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1346 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1347 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1348 Ágar Marinho Diluído #1338 Brisingidae (Asteride) 30/04/2013
LAMA 1323 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1324 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1325 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1326 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1327 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1328 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1329 R2A marinho diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1330 Ágar Marinho Diluído #1338 Coral 30/04/2013
LAMA 1331 Ágar Marinho Diluído #1338 Coral 30/04/2013
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