23/10/2012

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Cronograma

Entrega do Relatório 4

Entrega do Relatório 5

Laboratório de informática Simulação computacional de purificação de proteínas

Exercício de Sequenciamento

23/10

30/10 06/11

Aula:

Eletroforese (SDS-PAGE) e Sequenciamento de Proteínas

Prática 6- Procedimento A (Diálise)

Execução e Recolhimento do exerício 7

HOJE

(Prova de Protocolo + Execução e recolhimento Exercício 10)

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Coloração Descoloração

Determinação da massa molecular

Identificação e Sequenciamento da proteína

Tratamento da amostra (SDS + mercaptoetanol) 100 C/5 min

Diálise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Identificação e Sequenciamento de proteínas

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Proteínas

H2PO4-/HPO4

2-

Na+/Cl-

Íons do tampão

H2O 2L H2O 2L

Antesdadiálise Depoisdadiálise

H2O

Diálise Objetivo: Remover o excesso de sais (íons) que atrapalham nas etapas de caracterização da

proteína.

(diluição de 2000x) (diluição de 2000x)

20 de Tampão de Amostra: Tampão (Tris, pH 6.8)

Glicerol SDS Azul de Bromofenol mercaptoetanol

+

-Acrescentar 20 de tampão de amostra - Incubar em água fervente por 5 min

HOJE

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Outros métodos para separação da proteína

Filtração sob pressão Ideal para desalinizar e concentrar amostras

A amostra é forçada a passar através de uma membrana contendo poros de tamanho definido colocando-se o tubo em uma centrífuga

Diálise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Identificação e Sequenciamento de proteínas

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Prática 6- SDS-PAGE 1) Receber o gel preparado e aplicar as amostras preparadas previamente

Poço 1: Padrão de peso molecular

Poço 2: Lisado centrifugado

Poço 3: Material DEAE

Poço 4: Padrão isolado de galactosidase

2) Ligar a fonte

3) Eletroforese até o corante azul de

bromo-fenol atingir a base do gel. Desligar a fonte.

4) Retirar o gel e colocar na solução de coloração (Azul de Coomassie) e depois na de descoloração.

5) Visualizar as bandas das proteínas. Identificar a glicosidase.

5) Determinar o Peso Molecular.

Eletroforese

Mobilidade eletroforética: = v/E = Z/f

v=ZE

fVelocidade

de migração

Carga Líquida

Força do campo elétrico

(V. cm-1)

Coeficiente Friccional

(resistência encontrada pelo íon; é

afetado pelo tamanho/forma do íon)

Eletroforese descreve a migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico.

Voet

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Eletroforese - Aplicações

-Isolar proteínas para análise por MS -Determinar o tamanho (Mr) da proteína

-Acompanhamento de purificação de proteínas

-Acompanhar expressão de proteínas

1. Uso de um campo elétrico

2. Uso de um polímero

(poliacrilamida ou agarose)

3. Proteínas carregadas

negativamente migram para o

polo positivo

4. Migração depende da carga ,

massa, e formato das proteínas

Lenhinger

Eletroforese em Gel

Gel é formado no espaço formado entre duas placas de vidro grapeados contendo espaçadores ( mm)

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S2O82 + e- SO4

TEMED

- Persulfato de amônio + TEMED: Formação de Radicais Livres iniciadores da polimerização

- Radicais derivados do persulfato induzem a reação de polimerização dos monômeros de acrilamida e de bis-acrilamida

Persulfato de Amônio TEMED

R + M RM

RM + M RMM

RMM + M RMMM etc.

Polímero de acrilamida e bis-acrilamida

Ligações cruzadas (bis-acrilamida)

[monômeros] determina o tamanho dos poros

Proteínas (SDS-PAGE)

Tamanho do poro

Gel serve como uma “peneira”

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p ç p gpeso molecular e forma

peso molecular

Agente Denaturante

Torna a proteína carregada negativamente

+

Resumindo: Em SDS-PAGE as proteínas são separadas basicamente pelo tamanho!

No entanto, quando em gel as proteínas são separadas segundo o seu peso molecular

Proteínas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migração quando em eletroforese livre (sem o gel, somente tampão).

v=ZE

f

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forma

mercaptoetanol Ou DTT

Experimentos em dutor permitem observar a presença de dímeros e outras proteínas contendo pontes de disulfeto.

SDS

Proteína

SDS

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Gel de aplicação ou empilhamento

Visualização de Proteínas após Eletroforese

1. Coloração com o corante

(Coomassie blue, Prata)

2. Descoloração com ácido acético

Lenhinger

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Estimativa do Peso Molecular de Proteínas

( SDS Gel Electrophoresis)

Lenhinger

d D

Rm =d/D

D= Migração total d = Migração individual de cada banda

Mr

Mr = massa molecular (ou peso molecular)

Cromatografia de Exclusão

dD

Rm =d/D

Mr

Mr = massa molecular(ou peso molecular)

SDS-PAGE

Migração relativa

Eluição relativa

Método bastante sensível Fornece valores de PM com alta presisão

Precisão 5-10 %

Precisão 10 %

Espectrometria de Massas

Precisão 0.001 %

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Eletroforese em Gel-Bidimensional

Objetivo: Maximizar a separação de proteínas

(c) Eletroforese em gel bidimensional

Focaliza ção isoel étrica SDS gel electrophoresis

Lenhinger

Primeira Dimensão Segunda Dimensão

Separa de acordo com o pI Separa de acordo com o tamanho

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Focalização Isoelétrica

1. Eletroforese em gradiente de pH

2. Proteínas são distribuídas ao longo

do gradiente de pH de acordo com o

valor do seu pI.

3. Cada proteína é “ focalizada” em uma faixa estreita de pH próxima ao seu

pI

Lenhinger

Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E. coli

- mais de 2,000 proteínas podem ser visualizadas

Lenhinger

Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas

Proteínas de interesse podem ser identificadas utilizando-se anticorpos

Proteínas são identificadas por espectrometria de massas

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Diálise

Eletroforese (SDS-PAGE)

Identificação e Sequenciamento de proteínas

Espectrometria de massas

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Genoma

A sequência de aminoácidos pode ser determinada pela

sequência do DNA do gene que o codifica

Proteoma

No entanto, sequenciamento do gene NÃO:

- Localiza pontes de disulfeto (S-S) - Identifica modificações pós-traducionais

Sequenciamento de Proteínas

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(a) Determinação da composição/proporção de aminoácidos: Hidrólise ácida (HCl 6 M)

Fig 7-6 Separação e Análise de aminoácidos por HPLC. (Voet 3ed).

1) hidrólise também pode ser realizada em meio básico, utilizando 2-4 M de NaOH

2) A hidrólise também pode ser realizada por digestão enzimática: Ex. Pronase (mistura de proteases)

3) A separação e análise dos aminoácidos pode ser feita por diversas técnicas como HPLC ou cromatografia em camada delgada (TLC).

Na TLC (thinlayerchromatografy) os aminoácidos são revelados (p. ex. com nihidrina) e identificados utilizando-se padrões.

(b) Identificação da extremidade amino-terminal utilizando: Reagente de Sanger (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno, FNDB)

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(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman

Fenilisotiocianato(PITC)

Ácido trifluoracético

(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman

Limitações: Tempo de análise longo Grande quantidade de amostra

Atualmente o método de escolha para o sequenciamento tem sido a espectrometria de massas

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Sequenciamento de proteínas

grandes requer a clivagem parcial da

cadeia polipeptídica (enzimas)

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O sequenciamento dos peptídeos derivados da clivagem parcial da proteína pode ser feita por:

-Degradação de Edman (técnica pouco usada atualmente)

-Espectrometria de Massas (técnica mais utilizada atualmente devido a maior sensibilidade e

especificidade do método)

Identificação e Sequenciamento de Proteínas por Espectrometria de massas (MS)

Aspectos históricos

� Apesar da espectrometria de massa ser utilizada a muito anos para o estudo de moléculas orgânicas, sua aplicação para o estudo de macromoléculas foi, por muito tempo, limitado por problemas técnicos.

� Macromoléculas como proteínas, DNA e carboidratos são fragmentados

pelos processos necessários para ionizar as moléculas no vácuo do aparelho.

� Porém, com o advento de duas novas técnicas de ionização, isto mudou, e hoje a espectrometria de massas é uma ferramenta importante em biologia.

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Requisito fundamental para análise no espectrômetro de massas

Geração de íons em fase gasosa

Mas como volatilizar uma macromolécula???

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2002/fenn-lecture.html

Nobel Prizes - Chemistry

John B. Fenn is the chemist who invented

the ELECTROSPRAY method

(1988).

Professor of Chemistry at Yale University, USA, and at Virginia Commonwealth University, USA

Koichi Tanaka research engineer who

developed the MALDI technique

(1987). Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan.

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Métodos de Ionizações Brandas Proteínas são ionizadas pela aquisição de prótons (íons c/ carga positiva) A carga é adquirida pela protonação de resíduos básicos da proteína (Lys, Ar

[M + nH]n+

Massa da proteína

A ionização por electrospray produz proteínas carregadas com múltiplas cargas

A ionização por MALDI produz proteínas monocarregadas

É possível identificar proteínas através da análise das massas do peptídeos gerados (Peptide Mass Fingerprinting) e utilização de softwares que fazem a busca dos peptídeos detectados em banco de dados (p. ex. MASCOT)

A espectrometria de massas permite determinar a massa da proteína/peptídeo com alta

precisão (<0.001%). A precisão de massa na eletroforese (SDS-PAGE) é de 5-10 %.

Ainda mais, é possível realizar o sequenciamento completo de cada peptídeo. Isso é importante para identificação de novas proteínas e de modificações pós-traducionais.

Vantagens da utilização de espectrometria de massas

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Mistura de Peptídeos

Determinação das massas de cada peptídeo por espetrometria de massas

Determinação da massa da proteína intacta

por espectrometria de massas

Sequenciamento de cada peptídeo por MS/MS

Digestão enzimática

*PMF = Peptide Mass Fingerprinting; **PFF = Peptide Fragmentation Fingerprinting

Identificação e Caracterização da Proteína

Proteína Desconhecida

Busca das massas dos peptídeos

em Banco de Dados (PMF*)

Busca das sequências em banco de dados de

sequências (PFF**)

Estratégias para a identificação de proteínas por e spectrometria de massas

Match (proteína conhecida)

No Match (proteína desconhecida)

Match (proteína conhecida)

No Match (proteína desconhecida)

Caracterização de uma nova proteína

Em geral a proteína é isolada de gel 2D...

Peptide Mass Fingerprinting (PMF)

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Proteínas podem ser identificadas através das massas de peptídeos gerados na sua hidrólise por enzimas conhecidas. Os dados das massas dos peptídeos são colocados em um tipo de google para proteínas (ex. Mascot)

a) Busca em banco de dados de proteínas b) Comparação dos peptídeos detectados com os peptídeos teóricos obtidos na digestão de proteínas com a protease utilizada no experimento c) Match! Identificação.

Espetro de massa dos peptídeos gerados pela clivagem da proteína com uma protease

ex.: MASCOT

Identificação de proteínas por “ peptide massfingerprint(PMF)”

Exemplo: Identificação da beta-glicosidase

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Procedimento: Remoção da banda da glicosidase, digestão com tripsina e análise por espectrometria de massas

Obs. O protocolo de digestão utilizado inclui uma alquilação prévia dos tiois livres com iodoacetamida,

1179.511

963.414

1333.524

1515.656742.326

898.397

1783.703

2065.844 2383.8363313.0822938.198 4074.899

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Inte

ns. [

a.u

.]

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500m/z

Espetro de massa dos peptídeos derivados da digestão da beta-glicosidase com tripsina

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Modificações variáveis mais comuns

Durante o preparo da amostra para análise no espectrômetro de massa é comum realizar a redução de pontes de disulfeto (beta-mercaptoetanol ou DTT) e a alquilação do tiolato (SH livre) (p. ex. alquilação com iodoacetamide)

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As massas detectadas são comparados com as massas teóricas da proteína através

de softwares específicos (neste exemplo utilizou-se o Biotools da Bruker)

IDO NO MASCOT

Parâmatros utilizados na busca pelo Mascot

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Resultado do Mascot mostrando as sequências que tiveram match (em vermelho) O match ocorre quando a massa experimental bate com a teórica

Massasquenãotiverammatch.Essasmassaspodemserde

umaoutraproteínaoudepeptídeosquesofreramalguma

modificação.

Massas que tiveram match

Conclusões da busca no Mascot

Os dados de análises dos peptídeos derivados da digestão tríptica da banda retirada do gel de eletroforese mostram que a proteína purificada corresponde à beta-glicosidase de SpodopteraFrugiperda. A cobertura da sequência foi de 23 % com um erro de .5 Da. É possível atingir uma cobertura maior usando erros maiores (47 % com um erro de 2 Da), porém isso pode levar à interpretações errôneas sobre a identificação da proteína. Apesar da cobertura ser aparentemente baixa, as sequências que foram cobertas (sequências que tiveram o match) possibilitam realizar a identificação da proteína com um score de 121. Esse score indica o grau de significância do resultado e para a busca realizada, scores acima de 86 são significantes (p<0.05).

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Sequenciamento de peptídeos por espectrometria de massas

Antigamente o sequenciamento era feito pela degradação de Edman.

Atualmente o método de escolha é a espectrometria de massas.

Peptídeos podem ser fragmentados no espectrômetro de massa

A clivagem mais comum ocorre na ligação peptídica, gerando íons da série y e b.

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128.06 163.07 71.03

Lys (K)

Glu(E)

Espectro MS/MS de um peptídeo

b2-b1 147.02

Phe (F)

y2-y1 128.06

Gln (Q)

Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Capítulo 9, página 382-383

Seleção e fragmentação de peptídeo (MS/MS)

1179.511

963.414

1333.524

1515.656742.326

898.397

1783.703

2065.844 2383.8363313.0822938.198 4074.899

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

4x10

Inte

ns.

[a.u

.]

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500m/z

Espectro de massa dos fragmentos de do íon de m/z 1179.511

Espectro de massa da mistura de peptídeos

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30/10/2012 (Turma A) 06/11/2012 (Turma B) LABORATÓRIO DE INFORMÁTICA