universidade estadual do cearÁ faculdade de...
TRANSCRIPT
0
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
LUCAS SANTIAGO GOMES BRASILEIRO
AVALIAÇÃO DO SÊMEN EQUINO REFRIGERADO EM DILUENTE
A BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP®-105) COM E SEM
GEMA DE OVO
FORTALEZA-CEARÁ
2015
1
LUCAS SANTIAGO GOMES BRASILEIRO
AVALIAÇÃO DO SÊMEN EQUINO REFRIGERADO EM DILUENTE
A BASE DE ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP®
-105) COM E SEM
GEMA DE OVO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Veterinárias. Área de Concentração:
Reprodução e Sanidade Animal. Linha de
Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos
Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. José Ferreira Nunes
Co-orientadora: Dra. Cristiane Clemente de
Mello Salgueiro.
FORTALEZA - CEARÁ
2015
2
3
4
À minha mãe Antonizete. À minha esposa
Ianna. À minha filha Letícia. À minha avó
Fransquinha. Ao meu irmão Felipe. Aos
familiares e amigos, pela força,
companheirismo, apoio e carinho.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me dado força para superar todos os obstáculos e por não ter me deixado
desistir nos momentos mais difíceis.
À minha família, em especial, minha mãe, minha vó e meu irmão pelo apoio.
À minha esposa Ianna, por ter me dado força e incentivo para voltar a estudar, e sendo
compreensiva nos momentos de ausência.
À minha filha, Leticia, que apesar de tão pequena e frágil, é o meu impulso para poder
terminar esta empreitada.
À Universidade Estadual do Ceará por ter me acolhido e proporcionado dois anos de
aprendizado e muitas amizades.
À FUNCAP, pela concessão da minha bolsa de pós-graduação.
À UNESP- Botucatu pela colaboração, atenção e disponibilidade do laboratório para análises
do experimento.
Ao meu orientador, Prof.Dr. José Ferreira Nunes, pelos ensinamentos e principalmente por ter
me acolhido e acreditado em meu potencial.
À Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro, pelos ensinamentos, e pela ajuda na
elaboração do experimento.
À Dra. Erika Bezerra de Menezes, pelos ensinamentos, e pela ajuda na estatística e elaboração
do artigo cientifico.
Ao Prof. Dr. Marco Alvarenga pela ajuda e ensinamentos, e por me receber na UNESP para
que o experimento fosse realizado nas dependências do Laboratório de Reprodução Animal.
Ao Médico Veterinário Luciano Beretta por ter cedido os animais do Centro de Reprodução
LUBBreeding.
À Bárbara Mara Bandeira Santos pelo apoio e pela força no início do mestrado.
À companheira de mestrado, Raisa Rodrigues Santos Rios, pelas conversas, momentos de
diversão e troca de experiência, saber que nos momentos que precisei, pude contar com você.
Aos amigos Ana Gláudia, Alex, Talita, Kelliane, Marcimar, Audália pelo companheirismo,
amizade, e ajudas nos momentos acadêmicos e de lazer.
À todos do Núcleo Integrado de Biotecnologia - NIB, em especial aos estudantes de iniciação
científica: Bruna, Priscila, Leonardo, Lívia, Fábio, Levi pela vivência no LTSCO.
6
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de dois diluentes, sendo um a base de água de
coco (ACP®
-105) e outro a base de leite desnatado (BotuSêmen®) na refrigeração de sêmen
equino. Durante a estação reprodutiva, o sêmen de quatorze equinos foram coletados e
diluidos em três diluentes ACP-105®, ACP105
® + 2,5% de gema de ovo (ACP-105 2,5%) e
BotuSêmen® em uma concentração de 50 × 10
6 espermatozoides/mL. As amostras de sêmen
foram submetidas à refrigeração em container de transporte e refrigeração Botu-Flex® a 15ºC
e 5ºC. Os parâmetros cinéticos foram avaliados em sistema de análise de sêmen
computadorizada após 24 h de resfriamento. A integridade da membrana foi avaliada por
meio de sondas fluorescentes. Os dados não paramétricos foram avaliados pelo teste de
Kruskal-Wallis seguido por comparações múltiplas de Dunn. As variáveis com distribuição
normal foram avaliadas por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. As diferenças foram
consideradas estatisticamente significativas quando P<0,05. Os resultados demonstraram que
MT, MP, VSL e VCL foram similares na analise do sêmen fresco. No entanto, houve
diferenças no VAP e RAP entre ACP-105® 2,5% e BotuSêmen
® sendo o BotuSêmen superior.
Após 24 h de incubação, diferenças significativas foram observadas no VAP, RAP, VSL e
VCL entre os diluentes BotuSêmen e ACP-105®. A motilidade total e progressiva foi maior
nos diluentes ACP-105®
2,5% e BotuSêmen®. Não houve diferença nos parâmetros cinéticos
MT, MP, VCL e RAP obtidas no sêmen resfriado a 15ºC e 5ºC por 24h nos diluentes ACP
2,5% e BotuSêmen. Também Não houve diferença significativa na análise da integridade de
membrana plasmática entre os diluentes ACP-105 2,5% e BotuSêmen®. O estudo demonstrou
que o diluidor ACP-105®
associada a baixa concentração de gema de ovo (2.5%) foi efetivo
na preservação de espermatozoides de equino por 24 h. Estes resultados são úteis para
melhorias no processo de preservação espermática estabelecendo bases para o
desenvolvimento de novos diluentes inclusive para outras espécies de equideos destacando-se
o jumento nordestino e outras espécies em risco de extinção.
Palavras-chave: Equino. Água de coco em pó. ACP-105. Diluentes. Refrigeração.
7
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the efficacy of equine sperm cooled in ACP®
-105
and BotuSemen®. During the breeding season, ejaculates from fourteen stallions were
collected and ejaculates were diluted to 50 × 106 sperm/mL in extenders including ACP
®-105,
ACP®105+ 2,5% egg yolk (ACP-105 2,5% EY), BotuSemen
®. Extended semen was then
cooled in cooling device at 15ºC and 5ºC. Sperm kinetics was evaluated by computer assisted
sperm analyser after 24h of cooling. The integrity of sperm membrane was assessed by
fluorescence staining. Kruskal-Wallis test followed by Dunn test were used to evaluate sperm
parameters of non-parametric data. Variables of normally distributed populations were
examined through one way ANOVA followed by Tukey's test. The level of statistical
significance was set at P < 0.05.Results showed that MT, MP, VSL and VCL were similar in
fresh semen. However, there were differences in VAP and RAP between ACP-105 2.5% EY
and BotuSemen®. After 24h of incubation, significant differences were observed in VAP,
RAP, VSL and VCL between BotuSemen and ACP-105®
. Total and progressive motility were
found greater in ACP 2.5% EY and BotuSemen. There were no differences in the sperm
kinetics including MT, MP, VCL and RAP obtained from cooled semen samples at 15ºC and
5ºC for 24h in ACP 2.5% EY and BotuSemen. No significant differences were observed in
PMI between ACP-105 2.5% EY and BotuSemen® extenders. In summary, we demonstrate
that a ACP-105® associated with low concentration (2.5%) egg yolk was effective for
preservation of stallion spermatozoa for 24 hours. These findings are useful for the
improvement of sperm preservation procedures and set a foundation for the development of
novel extenders for the preservation of semen from other equine species as well as
endangered species.
Keywords: Stallion. Powdered coconut water. ACP-105. Extenders. cooling.
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Parâmetros cinéticos e de motilidade do sêmen fresco e resfriado nos
diluentes ACP-105®, ACP105
® + 2,5% de gema de ovo (ACP-105 2,5%)
e BotuSemen®...............................................................................................
38
Tabela 2- Parâmetros cinéticos e de motilidade do sêmen fresco e resfriado por 24
horas a 15ºC e 5ºC nos diluentes ACP-105®, ACP105
® + 2,5% de gema
de ovo (ACP-105 2,5%) e BotuSemen®.......................................................
38
Tabela 3- Integridade de membrana plasmática do sêmen fresco e resfriado por 24
horas a 15ºC e 5ºC nos diluentes ACP-105®, ACP105
® + 2,5% de gema
de ovo (ACP-105 2,5%) e BotuSemen®.......................................................
39
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro1- Composição da água de coco em pó, por 100g, estabelecidos mediante
análises em laboratórios de referência certificados pela ANVISA e
INMETRO (ITAL e CQA, Campinas-SP, 2010)........................................
20
Quadro 2- Parâmetros de motilidade espermática obtidos pelo CASA....................... 23
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP Água de coco em pó
ACP-105 Meio diluente para sêmen equino à base de água de coco em pó
ACP-108 Meio diluente para sêmen de aves à base de água de coco em pó
ALH Amplitude do deslocamento lateral da cabeça
ATP Trifosfato de adenosina
CASA Sistema de análise de sêmen computadorizada
BCF Frequência do batimento da cauda
DNA Ácido desoxirribonucléico
DCF Diacetato de 6-carboxifluoresceína
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ER Espermatozoides rápidos
IP Iodeto de propídio
IMP Integridade da membrana plasmática
LIN Linearidade
MT Motilidade total
MP Motilidade progressiva
mOsm/Kg Miliosmol por quilograma
OSC Index de oscilação
STR Retilinearidade
VAP Velocidade média da trajetória
VCL Velocidade curvilinear
VSL Velocidade linear
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 14
2.1 QUALIDADE DO SÊMEN EQUINO .................................................................... 14
2.2 PRESERVAÇÃO DO SÊMEM EQUINO .............................................................. 14
2.3 PRINCIPAIS DILUENTE EMPREGADO NA REFRIGERAÇÃO DO SEMÊN
EQUINO ..................................................................................................................
16
2.4 DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO ....................................................... 17
2.5 FATORES QUE AFETAM A VIABILIDADE DO SÊMEN REFRIGERADO .... 21
2.6 SISTEMA DE ANÁLISE SEMINAL AUXILIADO POR COMPUTADOR ........ 22
2.7 INTEGRIDADE DE MEMBRANA PLASMATICA POR MICROSCOPIA DE
EPIFLUORESCÊNCIA ...........................................................................................
24
3 JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 25
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ..................................................................................... 26
5 OBJETIVO ............................................................................................................. 27
5.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 27
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 27
6 CAPITULO 1 ........................................................................................................... 28
7 CONCLUSÕES........................................................................................................ 48
8 PERSPECTIVA ...................................................................................................... 49
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 50
12
1 INTRODUÇÃO
A utilização de sêmen equino refrigerado tem sido objeto de interesse, por
permitir a manutenção do potencial fertilizante dos espermatozoides por períodos de 24 a 36
horas, proporcionando uma flexibilidade na coleta e envio do sêmen no momento mais
oportuno (BRISKO; VARNER, 1992). Atualmente, o Brasil é o segundo país que mais utiliza
sêmen refrigerado no mundo (PAPA et al., 2005) e possui o quarto maior rebanho equino do
mundo, com um plantel de aproximadamente 5,7 milhões de animais, segundo a Food and
Animal Organization (FAO, 2008).
O sêmen refrigerado possui muitas vantagens como a redução com gastos inerente
ao transporte e a hospedagem de animais, menor risco com acidentes e aquisição de doenças
sexualmente transmissíveis e diminuição do estresse provocado pelo transporte dos animais
(BRISKO; VARNER, 1992). O aumento no uso de sêmen refrigerado nos últimos anos
ocorreu após a liberação dessa biotécnica reprodutiva pela maioria das associações de
criadores, com exceção da associação do Puro Sangue Inglês, e também porque existe um
número alto de garanhões que respondem muito mal ao processo de congelação de sêmen
(VIDAMENT et al., 1997).
Na utilização do sêmen refrigerado vários fatores podem interferir no resultado
final da fertilização de éguas inseminadas, tais como: a temperatura e o tempo de
armazenamento do sêmen, o tipo de container, a curva de refrigeração, o momento da
inseminação, a qualidade individual do garanhão, além do tipo de diluente empregado
(PUGLIESI, 2009). Com relação aos diluentes, os mais utilizados na espécie equina para
refrigeração são aqueles à base de leite desnatado e quando se utiliza a biotécnica de
congelação adiciona-se gema de ovo. Hoje no mercado encontram-se vários produtos
comerciais, no entanto, vários diluentes alternativos estão sendo utilizados e testados in vitro e
in vivo, objetivando principalmente, aumentar a durabilidade e a qualidade dos
espermatozoides visando viabilizar ao máximo o material genético masculino (PUGLIESI,
2009).
Neste sentido, a água de coco tem se apresentado como uma alternativa, obtendo-
se bons resultados na conservação de células espermáticas de várias espécies. Apesar dos
resultados observados, existem poucos estudos utilizando a água de coco como diluente em
amostras de sêmen de equídeos. Com apresentação em forma de pó, semelhante aos diluentes
convencionais disponíveis no mercado, a água de coco é obtida por meio do processo de
13
desidratação a vácuo, proporcionando as mesmas vantagens quanto ao transporte e
acondicionamento como os diluentes comerciais já existentes (SOBREIRA NETO, 2008).
Testes in vitro utilizando ACP, demonstraram bons resultados em relação à motilidade
espermática para sêmen equino por um período de até seis horas armazenados a 5ºC
(SAMPAIO NETO et al., 2002).
O ACP-105® (com formulação específica para equino) pode ser utilizado na
biotecnologia da reprodução de equinos, e futuramente também pode ser empregado na
reprodução de outros equídeos ameaçados de extinção como o jumento nordestino
(SOBREIRA NETO, 2008). Considerando a importância de diluentes no processo de
preservação das células espermáticas em equinos, este estudo teve como objetivo avaliar a
eficiência do ACP®
-105 como diluente para sêmen equino acrescido de 2,5% gema de ovo.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 QUALIDADE DO SÊMEN EQUINO
O sêmen é o conjunto de secreções do aparelho genital masculino, caracterizando-
se pela presença dos espermatozoides liberados no momento da ejaculação (MIES FILHO,
1987). Para que o espermatozoide tenha a capacidade de fertilizar o oócito, deve possuir
algumas propriedades como membrana plasmática íntegra, motilidade progressiva, processo
metabólico de produção de energia, proteínas suficientes para que possa garantir sua
sobrevivência no trato genital feminino e também permitir que ocorra a reação do acrossoma
na hora de se ligar ao oócito e enzimas no acrossoma para permitir sua penetração (AMANN;
GRAHAM, 1993).
O porção do espermatozoide (SQUIRES et al., 1999).
Um garanhão destinado a reprodução o seu sêmen para ter a capacidade de
fertilizar um oócito, os espermatozoides deves possuir todas as suas partes e componentes
estruturais íntegros e em perfeito funcionamento para que o seu potencial de fertilidade seja
expresso ao máximo (SOBREIRA NETO, 2008).
A capacidade de fertilização de um espermatozoide deixa de existir devido a
problemas como a presença de membrana espermática lesionada, a função mitocondrial
reduzida, motilidade espermática progressiva reduzida ou ausente bem como um acrossoma
danificado. Desta forma, as alterações na estrutura do espermatozoide que ocorrem durante o
processo de refrigeração e/ou descongelação resultam na perda da capacidade fecundante in
vivo destas células (AMANN; GRAHAM, 1993).
2.2 PRESERVAÇÃO DO SÊMEN EQUINO
Os primeiros relatos a demonstrarem que a diminuição da temperatura promove
uma redução reversível da atividade metabólica dos espermatozoides permitindo o
armazenamento destas células foram realizados por Spallazani em 1776 (JOHNSTON, 2000).
A refrigeração do sêmen para uma posterior utilização na inseminação artificial produz um
menor dano aos espermatozoides, quando comparados a técnica de congelação,
proporcionando maiores taxas de prenhez (ENGLAND; PONZIO, 1996). De acordo com
Amann e Pickett (1987) para cada 10ºC que se reduz da temperatura, ocorre uma redução de
15
50% no metabolismo celular. Sendo assim, uma célula espermática armazenada a uma
temperatura de 5ºC possui apenas 10% do metabolismo celular ativo, elevando desta forma o
tempo de sobrevivência da célula, devido à baixa produção de produtos tóxicos, e a
peroxidação lipídica ocorre mais lentamente.
Os lipídios que compõe a membrana plasmática estão em fase líquida a uma
temperatura de 22ºC e em estado de gel a 4ºC. Com a queda da temperatura, os lipídios da
membrana passam de um estado fluído onde as cadeias de ácidos graxos estão
desorganizadas, para um estado de gel, onde as cadeias de ácidos graxos encontram-se rígidas
e paralelas (GLAZAR et al., 2009). Este evento é chamado de fase de transição lipídica
(PARKS; LYNCH, 1992).
O sêmen equino normalmente é armazenado entre temperaturas que variam entre
4ºC e 6ºC, pois nesta faixa de temperatura o espermatozoide mantém tanto a motilidade como
a fertilidade (MORAN et al., 1992). Um sistema de refrigeração de sêmen que reduz a
temperatura a 15ºC evita a fase de transição dos fosfolipídios da membrana plasmática, uma
vez que esta fase ocorre apenas em temperaturas inferiores a 15ºC (FREITAS-DELL`AQUA
et al., 2012). O armazenamento a 15ºC pode diminuir os danos causados à membrana
espermática pelo choque do frio, principalmente para o sêmen dos garanhões que não
refrigeram muito bem (BATELLIER et al., 2001).
Batellier et al. (1997) testando frações de leite na longevidade do sêmen equino,
demonstraram que diluentes à base de leite são mais eficientes a uma temperatura de
refrigeração de 4ºC quando comparada a temperatura de 15ºC.
O processo de refrigeração do sêmen pode ser de forma automatizada ou
convencional. A automatizada é realizada em um equipamento de refrigeração, onde a
temperatura decresce de forma controlada e não sofre influência da temperatura externa,
enquanto a convencional onde se utiliza uma caixa isotérmica, recebe influência do meio
externo onde a temperatura do ambiente e o volume da amostra influenciam a temperatura
dentro da caixa. Mesmo assim, a forma convencional é a mais difundida comercialmente
devido ao seu baixo custo (VALLE et al., 1999).
Dentre os sistemas convencionais de refrigeração, os mais conhecidos são os
Equitainer 1® e o Equitainer 2
® que foram desenvolvidos por Douglas Hamilton et al. (1984).
Entre os modelos nacionais existem uns modelos mais sofisticados, como a Botu-Box®
e a
Botutainer®, e os modelos mais simples e populares, como o Max-Sêmen Express
® e o
BotuFlex® (SOBREIRA NETO, 2008). O Equitainer
®, segundo o fabricante, armazena a 5ºC
16
por até três dias. Já o Botubox®e o Max-Sêmen Express
® armazenam a uma temperatura de
15ºC por até 24 horas. O Botutainer®
armazena a 5ºC por até 24 horas e a BotuFlex®
armazena
tanto a 5ºC,quando se utiliza duas barras de gelo,como a 15ºC, quando se utiliza uma barra de
gelo (SOBREIRA NETO, 2008).
A fertilidade do sêmen refrigerado é mantida no máximo por 72 horas pós-
ejaculação para a maioria dos garanhões (GUNZEL-APEL; KRAUSE, 1986; PIMENTEL;
CARNEIRO, 2008). No entanto, Feldman e Nelson (1996) em estudo com cães verificaram
que, se o sêmen for adequadamente diluído e refrigerado, os espermatozoides podem
permanecer viáveis por um período de até cinco dias. Com isso, o que determina a boa
qualidade do sêmen refrigerado é a qualidade do sêmen in natura, a qualidade do diluente, a
forma de refrigeração e o fator individual (SQUIRES et al., 1999).
2.3 PRINCIPAIS DILUENTES EMPREGADOS NA REFRIGERAÇÃO DO SÊMEN
EQUINO
A grande maioria dos diluentes de sêmen equino que são empregados para a
refrigeração são a base de leite em pó desnatado, glicose e antibióticos (KENNEY;
BERGMAN; COOPER, 1975). Um bom diluente deve possuir algumas características básicas
como: osmolaridade compatível (300 a 400 mOsm/Kg), balanço entre os elementos minerais
(eletrolíticos e não-eletrolíticos), nutrientes, ausência ou neutralização de substâncias tóxicas,
promover proteção contra mudanças bruscas de temperatura, estabilização enzimática e
garantir integridade de membrana plasmática (AMANN; PICKETT, 1987; MELO, 2005).
Muitas vezes outras substâncias são adicionadas a esta fórmula básica para que se
possa preservar ou até mesmo melhorar as características espermáticas, como os quelantes
(EDTA) que amenizam as lesões causadas pelo choque térmico (AMANN; GRAHAM, 1993),
antioxidantes que possuem a função de preservar a motilidade e a integridade da membrana
plasmática, aumentando desta forma a longevidade dos espermatozoides (ALMEIDA; BALL,
2005; AURICH et al., 1997;BRUEMMERT et al., 2002), aminoácidos tais como a glicina e a
taurina que promovem a manutenção da motilidade e da viabilidade do sêmen refrigerado
(CARVALHO, 2003).
Estudos demonstram que os componentes ativos do leite que atuam na proteção
espermática são as micelas de caseína, o fosfocaseinato e a β-lactoglobulina (BATTELIER et
al., 2001; BEREGERON; MANJUNATH, 2006). Embora Leboeuf et al. (2003) tenham
17
atribuído essa proteção a uma possível ação antioxidante destas proteínas, os mecanismos de
ação envolvidos ainda não estão totalmente esclarecidos.
Recentes estudos in vitro sugerem que as micelas de caseína se associam com um
grupo de proteínas do plasma seminal, conhecidas como Binder of SPerm proteins ou BSP,
encontradas no plasma seminal de mamíferos (BERGERON et al., 2007; LUSIGNAN et al.,
2011). Estes autores sugerem que esta associação previne a perda de fosfolipídios da
membrana espermática mantendo a viabilidade celular durante a preservação dos
espermatozoides (BEREGERON; MANJUNATH, 2006; MANJUNATH, 2012).
Um estudo demonstrou que o fosfocaseinato e a β-lactoglobulina são os principais
componentes do leite que protege os espermatozoides, mantendo a viabilidade destas células
durante o resfriamento do sêmen a 5ºC (PAGL et al., 2006). Por outro lado outro estudo
demonstrou que a α-lactoalbumina foi prejudicial à sobrevivência dos espermatozoides
(BETELLIER et al., 1997).
A gema de ovo é utilizada basicamente para proteger as células espermáticas
contra o choque térmico, e provavelmente esta proteção se deve a presença das lipoproteínas
de baixa densidade (LDL). A estabilização da membrana plasmática se deve a associação das
lipoproteínas à membrana espermática, a formação de uma película protetora de fosfolipídios
na superfície da membrana, a reposição dos fosfolipídios da membrana e a competição pelos
sítios de ligação com peptídeos deletérios presentes no plasma seminal são algumas das
hipóteses para o mecanismo de proteção (BEREGERON; MANJUNATH, 2006).
A gema de ovo também contém substancias deletérias a célula espermática como
a progesterona, que pode induzir a capacitação espermática precoce, diminuindo a fertilidade
(LIPAR et al., 1999).Outro problema atribuído à gema de ovo seria a desestabilização da
membrana plasmática devido a hidrolise das lecitinas em lisolecitinas (RITAR; SALAMON,
1982).
Atualmente, vários diluentes são produzidos e comercializados no Brasil, e dentre
eles destacamos o Botu-Sêmen®, Botu-Turbo
®, Botu-Sêmen Especial
®, Max-sêmen
®, Max-
Sêmen Plus® e Equimix
®. A denominação “Turbo” é utilizada para o sêmen de garanhões
com baixa motilidade inicial, e as denominações “Especial” e “Plus” são indicadas para o
sêmen de garanhões com baixa resistência à refrigeração (SOBREIRA NETO, 2008).
2.4 DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO
18
A água de coco tem sido empregada na biotecnologia da reprodução animal
obtendo-se bons resultados com a utilização da mesma na preservação do sêmen de diversas
espécies como: os caprinos (FREITAS, 1988; SALLES, 1989; TONIOLLI, 1989a; ARAUJO,
1990; RODRIGUES et al., 1994; SALGUEIRO, 2003), ovinos (FREITAS, 1992;CRUZ,
1994; SOUSA et al., 1994; SALGUEIRO et al., 2004), suínos (TONIOLLI, 1989b;
TONIOLLI; MESQUITA, 1990), caninos (MONTEZUMA Jr. et al., 1994; UCHOA;
CARDOSO; SILVA, 2002), peixes de água doce como o Tambaqui (Colossoma
macropomum) (FARIAS et al., 1999), homem (NUNES; COMBARNOUS, 1995) e equino
(SAMPAIO NETO et al., 2002; SOBREIRA NETO, 2008).
Nunes (1986) realizou os primeiros trabalhos com a água de coco como diluente
seminal, e a primeira espécie a ser usada foi a caprina, na cidade de Maceió no Estado de
Alagoas, onde o sêmen dos caprinos eram avaliados após duas horas de incubação a 37ºC.
Foram observados que tanto a motilidade progressiva como a porcentagem de
espermatozoides móveis possuía valores superiores quando o sêmen era diluído em uma
solução de água de coco, quando comparados aos espermatozoides que eram diluídos em
solução à base de leite desnatado (NUNES; SALGUEIRO, 1999).
Resultados similares foram encontrados ao utilizar os mesmos diluentes na
refrigeração de sêmen a 4ºC e no uso para inseminação artificial de cabras que haviam sido
sincronizadas com tratamento hormonal (NUNES, 1986). Na inseminação artificial com o
sêmen de caprinos diluído em água de coco e refrigerado a 4ºC encontrou-se uma taxa de
parição superior a 60% (NUNES, 1986).
Araújo e Nunes (1991) avaliando o sêmen caprino diluído e congelado em água
de coco in natura com 10% de gema de ovo e sem gema de ovo verificaram que após a
descongelação o sêmen diluído em água de coco com 10% de gema conferiu uma maior
sobrevivência aos espermatozoides in vitro.
De acordo com Nunes (1986; 1987), o sêmen diluído em água de coco possuem
uma maior fertilidade quando comparado com o diluente à base de leite. O trabalho realizado
por Freitas (1988) obteve-se um nascimento de 55,6% de fêmeas e 44,4% de machos onde as
cabras foram inseminadas com diluente à base de água de coco. Este resultado sugere uma
possível influência da água de coco sobre a pré-seleção de espermatozoides “X”,
influenciando desta maneira, uma maior taxa de fecundação dos espermatozoides portadores
destes cromossomos.
19
Nunes, Combarnous e Priscila (1994), isolaram uma molécula que ativa o
metabolismo espermático; esta molécula é do grupo das auxinas o ácido 3-indol acético
(IAA), que possui ação hormonal estimuladora de crescimento em vegetais. Nunes e
Salgueiro (1999) verificaram que a presença do IAA encontrados na água de coco pode ter
variações de acordo com o estágio de maturação e com a espécie do fruto, onde isso pode
influenciar os resultados tanto in vitro como in vivo. A adição do IAA em diluentes
convencionais de sêmen de diferentes espécies aumentou a motilidade espermática e a taxa de
fertilidade, além de permitir a sua conservação durante períodos mais longos (NUNES;
COMBARNOUS; PRISCILA, 1994). Cruz (1994) obteve uma fertilidade significantemente
superior com o uso de sêmen ovino preservado por 48 horas a 4ºC em meio contendo IAA
(40,74%) quando comparado com o sêmen em meio à base de leite (14,81%).
No sêmen caprino diluído e congelado em meio de água de coco in natura com
10% de gema de ovo ou sem a gema, e avaliados pós-descongelação, observou-se que a gema
de ovo permitiu uma maior sobrevivência dos espermatozoides durante o teste in vitro
(ARAÚJO; NUNES, 1991).
Devido aos bons resultados observados nos primeiros estudos com a água de coco
in natura para conservação de células espermáticas realizadas por José Ferreira Nunes nos
anos das décadas de 80 e 90, foi elaborado um meio de conservação à base de água de coco
sob a forma de pó (ACP®), onde se caracterizou a padronização e estabilização da água de
coco in natura através do processo de desidratação (NUNES; SALGUEIRO, 2005).
A partir do ano de 1997, começaram-se os estudos que levaram a uma
padronização do fruto (coco) que se chamou de ideal para ser utilizado nos processos
biológicos. A estabilização da água de coco retirado do fruto ideal só foi conseguida no ano
de 2002. A água de coco processada possui estabilidade e longevidade, sem problemas de
acondicionamento mantendo todas as propriedades inerentes do produto original (NUNES;
SALGUEIRO, 2005).
20
Quadro 1 - Composição da água de coco em pó, por 100g, estabelecidos mediante
análises em laboratórios de referência certificados pela ANVISA e
INMETRO (ITAL e CQA, Campinas-SP, 2010)
Carboidrato, por
diferença (g) 76,00
Frutose (g) 7,80
Glicose (g) 6,20
Sacarose (g) 0,00
Proteína (g) 12,00
Umidade (g) 1,00
LIPÍDIOS
Gorduras totais (g) 4,00
Gorduras saturadas (g) 2,46
8:0 ácido caprílico (g) 0,02
10:0 ácido cáprico (g) 0,02
12:0 ácido láurico (g) 1,41
14:0 ácido mirístico (g) 0,60
16:0 ácido palmítico (g) 0,42
Gorduras
monoinsaturadas (g)
18:1 ácido oleico (g) 0,12
Gorduras poli saturadas
(g) 0,47
18:2 ácido linoleico (g) 0,54
Gorduras trans (g) 0,00
Colesterol (mg) 0,00
MINERAIS
Sódio, Na (mg) 2.240,00
Cálcio, Ca (mg) 492,00
Ferro, Fe (mg) 8,00
Cobre, Cu (mg) 0,38
Fósforo, P (mg) 430,00
Magnésio, Mg (mg) 510,00
Manganês, Mn (mg) 2,60
Potássio, K (mg) 5.170,00
Selênio, Se (mg) 0,03
Zinco, Zn (mg) 3,30
Fonte: Elaborado pelo autor.
VITAMINAS
Vitamina B1 (mg), tiamina 4,55
Vitamina B2 (mg),
riboflavina 0,07
Vitamina B3 (mg), niacina
(ácido nicotínico e
vitamina PP 3,56
Vitamina B6 (mg),
piridoxina 0,13
Vitamina C (mg), ácido
ascórbico 16,51
AMINOÁCIDOS
Ácido Aspártico (mg) 4,73
Ácido Glutâmico (mg) 12,41
Alanina (mg) 7,63
Arginina (mg) 1,88
Cistina (mg) Traços
Fenilalanina (mg) 4,93
Glicina (mg) 3,98
Histidina (mg) 2,36
Isoleucina (mg) 2,65
Leucina (mg) 5,15
Lisina (mg) 2,61
Metionina (mg) 1,58
Prolina (mg) 5,34
Serina (mg) 2,54
Tirosina (mg) 0,82
Treonina (mg) 1,84
Triptofano (mg) Traços
Valina (mg) 5,23
OUTROS
Ômega 3 (g) 0,02
Ômega 6 (g) 0,02
21
Salgueiro (2003) avaliando sêmen de caprino diluído e congelado com ACP®
-101
e 2,5% de gema de ovo e 7% de glicerol obteve, após cinco minutos de descongelação,
valores de 33% e 2,48% de motilidade total e motilidade individual progressiva,
respectivamente.
Rondon (2006) utilizando espermatozoides de capote (Numida Meleagris)
conservados em ACP®
-108 ou Ovodyl®
(diluente comercial) conservados a 4ºC ou a 15ºC
durante um período de 24 horas onde observou que o diluente ACP®
-108 mostrou uma
porcentagem de espermatozoides móveis a 4ºC de 74% e os conservados a 15ºC de 53% e,
após 24 horas de refrigeração superou o diluente comercial Ovodyl® que obteve 60%.
Sampaio Neto et al. (2002), foi quem realizou o primeiro estudo do uso da água
de coco (ACP®
-105) para refrigeração na espécie equina, onde obteve-se motilidade
espermática a 4ºC por seis horas de 77,5% e motilidade progressiva de 67,5% em amostras in
vitro, demonstrando desta forma que o ACP® pode ser uma opção para a reprodução equina.
Sobreira Neto (2008) utilizando ACP®
-105 em sêmen equino por um período de
24 e 36 horas a uma temperatura de 5ºC mostrou uma relação custo-beneficio superior ao
diluente Equimix®, tendo em vista que os resultados tanto in vitro como in vivo foram
semelhantes. Os resultados in vitro observados por este autor demonstrou que a motilidade
total do sêmen equino após 24 h de refrigeração foi de 65,8 ± 7,42 para o diluente ACP®
-105
e 49,5 ± 7,97 na avaliação com o diluente Equimix®. Após 36h de armazenamento do sêmen,
os resultados para o diluente ACP®
-105 foram de 38,6 ± 8,08 enquanto para o Equimix®
foi
de 35,7 ± 9,02. Neste mesmo estudo, a taxa de prenhez na inseminação artificial com sêmen
refrigerado em ACP®
-105 a 5ºC por 24h foi de 57,14% e 35,71% após 36 h de
armazenamento.
2.5 FATORES QUE AFETAM A VIABILIDADE DO SÊMEN REFRIGERADO
Segundo Moran et al. (1992), o processo de refrigeração do sêmen da temperatura
de 37ºC para uma temperatura de aproximadamente 20ºC aparentemente não causa danos aos
espermatozoides. No entanto, no processo de refrigeração há uma faixa crítica de temperatura
entre 19ºC e 8ºC, em que os espermatozoides podem ser lesionados. Isto se deve ao fato da
membrana plasmática se comportar como um mosaico fluido, onde as proteínas e lipídios se
apresentam em constante movimento, mantendo sua função na temperatura ambiente
(JASKO, 1994). Desta forma, com a redução da temperatura, os lipídios ficam em estado de
22
gel e as cadeias de ácidos graxos vão se apresentar de forma rígida, ficando assim com a sua
função alterada devido à perda de mobilidade das proteínas (AMANN; GRAHAM, 1993).
Moran et al. (1992)sugerem que o processo de refrigeração do sêmen realizado em
taxas decrescentes de temperatura, onde a temperatura caia 0,3ºC por minuto, principalmente
no intervalo critico de temperatura entre 19ºC e 8ºC, onde o espermatozoide pode sofrer
lesões severas e irreversíveis.
A refrigeração de 37ºC a 8ºC onde se utiliza temperatura superior a 0,3ºC/min. o
resultado é choque térmico, onde os resultados são movimentos anormais, rápida perda de
motilidade e danos a membrana do acrossoma, induzindo a perda de enzimas e conteúdo
intracelular (MORAN et al., 1992).
Quando o processo de refrigeração ocorre de forma inadequada, os
espermatozoides são expostos ao choque térmico, e o resultado é o enrolamento da cauda, e
assim, ocorrência de movimentos circulares, redução do metabolismo, danos a membrana
plasmática e ao acrossoma (PICKETT et al., 1999).
Colesterol adicionado ao sêmen equino aumentou a porcentagem de células
móveis e com membrana intacta, isto se deve provavelmente porque o colesterol manteve o
estado de fluidez da membrana durante a fase de transição (PARKS; GRAHAM, 1992). Outro
fator importante que se deve levar em consideração, é o fator individual de cada garanhão no
sucesso do processo de refrigeração do sêmen equino (PICKETT, 1993).
Bons resultados no uso de sêmen refrigerado e armazenado dependem de muitos
fatores como: temperatura de armazenamento, composição do diluente, dose inseminante,
número de inseminações, qualidade do sêmen fresco e manuseio do sêmen (BATELLIER et
al., 2001).
2.6 SISTEMA DE ANÁLISE SEMINAL AUXILIADO POR COMPUTADOR
Por muito tempo a análise da qualidade seminal se baseou em uma avaliação
subjetiva de parâmetros como, motilidade total e individual progressiva, sendo estes
parâmetros considerados fundamentais, pois podem ser relacionados a viabilidade e
integridade dos espermatozoides (VERSTEGEN; IGUER-OUADA; ONCLIN, 2002). Mack,
Wolf e Tash (1988) relatam que à necessidade de se desenvolver uma metodologia mais
objetiva estimulou a elaboração e desenvolvimento de um instrumento automatizado que
fosse capaz de analisar as trajetórias dos espermatozoides.
23
O sistema computadorizado possui a capacidade de fornecer informações importantes
sobre função espermática e fertilidade através da análise de parâmetros adicionais da
motilidade, podendo determinar hiperativação e potencial de fertilização (DAVIS; KATZ,
1993). Fatores como volume e concentração do sêmen, qualidade do diluente utilizado,
patologias espermáticas, iluminação do microscópio, temperatura de análise e valores do
setup do programa são alguns dos principais fatores que podem afetar os resultados
(VERSTEGEN; IGUER-OUADA; ONCLIN, 2002).
A análise do sêmen auxiliada por computador (CASA) é um sistema automatizado
que visualiza, digitaliza e analisa as imagens sucessivas dos espermatozoides, fornecendo
desta forma informações acuradas, precisas e significativas do movimento individual de cada
espermatozoide e também resumos estatísticos das subpopulações espermáticas. Os principais
parâmetros analisados pelo CASA podem ser vistos no quadro abaixo segundo Verstegen,
Iguer-Ouada e Onclin (2002).
Quadro2 – Parâmetros de motilidade espermática obtidos pelo CASA
Parâmetros Sigla Unidade Descrição
Velocidade curvilinear VCL µm/s Velocidade da trajetória real do
espermatozoide
Velocidade média da
Trajetória VAP µm/s
Velocidade da trajetória média do
espermatozoide
Velocidade linear VSL µm/s
Velocidade em função da linha reta
estabelecida entre o primeiro e último
ponto da trajetória do espermatozoide
Linearidade LIN % Relação percentual entre VSL e VCL
Retilinearidade STR % Relação percentual entre VSL e VAP
Index de oscilação OSC % Relação percentual entre VAP e VCL
Amplitude do
deslocamentolateral da cabeça ALH µm
Deslocamento médio da cabeça do
espermatozoide em sua trajetória real
em relação à trajetória média ou
linear
Frequência do batimento
cruzado BCF Hz
Frequência com que a cabeça do
espermatozoide atravessa a trajetória
média.
Fonte: Verstegen, Iguer-Ouada e Onclin (2002).
A temperatura, o processamento seminal (diluição, refrigeração, congelação-
descongelação), viscosidade do meio e a concentração espermática são alguns fatores que
podem de alguma forma afetar a avaliação pelo sistema CASA (FUJIMURA; OKUMO,
2006; VERSTENGEN; IGUER-OUADA; ONCLIN, 2002). A avaliação seminal auxiliada
por computador não se pode ter como base apenas o desenvolvimento do sistema CASA mais
24
refinados, mas também se deve ter a atenção direcionada para a qualidade de treinamento dos
avaliadores de sêmen (KRAUSE; VIETHEN, 1999).
2.7 INTEGRIDADE DA MEMBRANA PLASMÁTICA POR MICROSCOPIA DE
EPIFLUORESCÊNCIA
A fluorescência é a propriedade de certas substâncias que quando excitas por luz
de comprimento de onda curta, emitem luz com comprimento de onda maior. Para isso
utiliza-se a luz ultravioleta com comprimento de onda inferior a 350 nm, de forma a se obter
radiações emitidas na faixa de 400 a 700nm, onde esta faixa de espectro de luz se torna visível
(MAIA, 2010).
A vantagem do uso das sondas fluorescentes seria o contraste, ocorrendo uma
menor variabilidade e uma maior especificidade, quando comparado a métodos clássicos de
coloração (NEIL, 2005). A ação se dá pela interação com a célula espermática, mostrando
uma coloração que indica lesão na estrutura analisada (NEIL, 2005).
Magistrini et al. (1997) relataram que a integridade da membrana plasmática do
espermatozoide é um importante indicador de viabilidade celular.Sondas fluorescentes como
o iodeto de propídio (IP) e o diacetato de 6-carboxifluoresceína (DCF) podem ser usadas na
avaliação da integridade de membrana em microscópio de fluorescência (SMITH;MURRAY,
1997).
O iodeto de propídio é uma sonda fluorescente que tem afinidade para DNA e
cora o núcleo em vermelho quando a membrana plasmática está danificada (RODRIGUEZ,
2013).Possui algumas vantagens, como facilidade de preparação, estabilidade e eficiência na
avaliação. Desta forma, pode ser utilizado tanto isoladamente como em associação a outros
corantes (ARRUDA, 2000).
O DCF é um composto hidrofóbico e quando sofre hidrólise por ação de enzimas
se torna hidrofílico com capacidade de penetrar pela membrana espermática. Desta forma se
acumula no interior da célula, quando exposto a luz azul, se excita e emite coloração verde,
caracterizando a membrana plasmática como integra (GARNER; JONHSON, 1995).
A associação do DCF com IP na avaliação de sêmen equino diluído em meio
Kenney e refrigerado em Equitainer® por um período de 24 horas, observou-se uma variação
de 50-56% de espermatozoides considerados íntegros(KARESKOSKI; KATILA, 2008).
25
3 JUSTIFICATIVA
A conservação do sêmen equino durante o transporte apresenta diversas
limitações, entre elas a baixa qualidade seminal inerente aos garanhões. Como alternativa,
propomos a água de coco em pó (ACP®
), que tem sido utilizada com sucesso como meio de
preservação seminal em diversas espécies, sendo um produto natural de origem vegetal e de
baixo custo. O ACP-105 acidionado de gema de ovo tem mostrado bons resultados na
preservação do sêmen equino por periodos de ate 24 horas sem causar maiores danos as
celulas espermaticas. Diante disso, o trabalho se justifica pela necessidade de testar o ACP®
-
105 com gema de ovo como meio alternativo, e de baixo custo para a preservação do sêmen
equino.
26
4 HIPÓTESE CIENTÍFICA
O meio de conservação a base de água de coco em pó (ACP®
-105) adicionado de
gema de ovo pode ser eficaz na preservação da qualidade do sêmen equino no processo de
refrigeração por um período de 24 horas tanto quanto o diluente comercial BotuSêmen®.
27
5 OBJETIVOS
5.1 GERAL
a) Avaliar o meio de conservação para sêmen equino à base de água de coco em
pó (ACP®
-105) sobre a qualidade seminal por 24 horas de refrigeração.
5.2 ESPECÍFICOS
a) Analisar os parâmetros cinéticos do sêmen equino conservado em meio à base
de água de coco em pó (ACP®
-105) com e sem gema de ovo e no diluente
comercial à base de leite desnatado (BotuSêmen®);
b) Avaliar a integridade de membrana espermática do sêmen equino conservado
em meio à base de água de coco em pó (ACP®
-105) com e sem gema de ovo e
no diluente comercial a base de leite desnatado (BotuSêmen®).
28
6 CAPÍTULO ÚNICO
Efeito de diluentes de sêmen sobre parâmetros seminais de espermatozoides equino resfriados
(Effect of semen extenders on sperm parameters of cooled-preserved stallion spermatozoa)
Periódico – Journal of Equine Veterinary Science
(submetido para publicação)
Efeito de diluentes de sêmen sobre parâmetros seminais de espermatozoides equino resfriados
(Effect of semen extenders on sperm parameters of cooled-preserved stallion spermatozoa)
29
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a eficiência de espermatozoides equino refrigerados em
diluentes Água de Coco em Pó (ACP®
-105) e Botu-Semen®. Durante a estação reprodutiva,
ejaculados de quatorze equinos foram colheitados e os ejaculados foram diluidos em ACP®
-
105, ACP®105 + 2,5% de gema de ovo (ACP-105 2,5%) e Botu-sêmen
® com intuito de obter
uma concentração de 50 × 106 espermatozoides/mL. Amostras de sêmen diluido foram
submetidas à refrigeração em container de transporte e refrigeração Botu-Flex® a 15ºC e 5ºC.
Os parâmetros cinéticos foram avaliados em sistema de análise de sêmen auxiliada por
computador após 24 h de resfriamento. A integridade da membrana foi avaliada por meio de
sondas fluorescentes. Os dados não paramétricos foram avaliados pelo teste de Kruskal-
Wallis seguido por comparações múltiplas de Dunn. As variáveis com distribuição normal
foram avaliadas por ANOVA seguido pelo teste de Tukey. As diferenças foram consideradas
estatisticamente significativas quando P<0,05. Os resultados demonstraram que MT, MP,
VSL e VCL foram similar na analise do sêmen fresco. No entanto, houve diferenças no VAP
e RAP entre ACP-105® 2,5% e Botu-sêmen
®. Após 24 h de incubação, diferenças
significativas foram observadas no VAP, RAP, VSL e VCL entre os diluentes Botu-sêmen e
ACP-105®. A motilidade total e progressiva foi maior nos diluentes ACP-105
® 2,5% and
Botu-sêmen®. Não houveram diferenças nos parêmntros cinéticos MT, MP, VCL e RAP
obtidas no sêmen resfriado a 15ºC e 5ºC por 24h nos diluentes ACP 2,5% e Botu-sêmen.Não
houveram diferenças significativas na análise da integridade de membrana plasmática entre os
diluentes ACP-105 2,5% e Botu-sêmen®. Em resumo, nosso estudo demonstrou que o
diluidor ACP-105®
associada a baixa concentração de gema de ovo (2.5%) foi efetivo na
preservação de espermatozoides de equino por 24 h. Estes resultados são úteis para melhorias
no processo de preservação de espermatozoides equino e estabelecer bases para o
30
desenvolvimento de novos diluentes para outras espécies de equideos bem como espécies em
risco de extinção.
31
Abstract
The objective of this study was to evaluate the efficacy of equine sperm cooled in ACP-105®
and Botu-semen®. During the breeding season, ejaculates from fourteen stallions were
collected and ejaculates were diluted to 50 × 106 sperm/mL in extenders including ACP-105
®,
ACP105® + 2,5% egg yolk (ACP-105 2,5% EY), Botu-Sêmen
®. Extended semen were then
cooled in cooling device at 15ºC and 5ºC. Sperm kinetics was evaluated by computer assisted
sperm analyser after 24h of cooling. The integrity of sperm membrane was assessed by
fluorescence staining. Kruskal-Wallis test followed by Dunn test were used to evaluate sperm
parameters of non-parametric data. Variables of normally distributed populations were
examined through one way ANOVA followed by Tukey's test. The level of statistical
significance was set at P < 0.05.Results showed that MT, MP, VSL and VCL were similar in
fresh semen. However, there were differences in VAP and RAP between ACP-105 2.5% EY
and Botu-sêmen®. After 24h of incubation, significant differences were observed in VAP,
RAP, VSL and VCL between Botu-sêmen and ACP-105®. Total and progressive motility
were found greater in ACP 2.5% EY and Botu-sêmen. There were no differences in the sperm
kinetics including MT, MP, VCL and RAP obtained from cooled semen samples at 15ºC and
5ºC for 24h in ACP 2.5% EY and Botu-sêmen. No significant differences were observed in
PMI between ACP-105 2.5% EY and Botu-sêmen® extenders. In summary, we demonstrate
that a ACP-105® associated with low concentration (2.5%) egg yolk was effective for
preservation of stallion spermatozoa for 24 h. These findings are useful for the improvement
of sperm preservation procedures and set a foundation for the development of novel extenders
for the preservation of semen from other equine species as well as endangered species.
32
Effect of semen extenders on sperm parameters of cooled-preserved stallion
spermatozoa
Lucas S. G.Brasileiroa,Erika S. B. deMenezes
a,Cristiane C. M.Salgueiro
b,c,Lorenzo G. T.
M.Segabinazzid,Marco A.Alvarenga
d,José F.Nunes
a,*
aDepartmentof Veterinary Medicine, State University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.
bACP Biotecnologia, Fortaleza, Brazil.
cFaculdade Terra Nordeste, Caucaia, Brazil.
dDepartment of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, School of Veterinary
Medicine and Animal Science, São Paulo State University, Botucatu, Brazil.
*To whom correspondence should be addressed: José Ferreira Nunes, Department of
Veterinary Medicine, State University of Ceará, Rua Doctor Silas Munguba, 1700, Campus
do Itaperi, Fortaleza CE, CEP 60.740-000, Fortaleza, Ceará, Brazil.
Phone/ Fax: +55–85–3101–9851. Email address: [email protected]
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the efficacy of equine sperm cooled in ACP-105®
and Botu-semen®. During the breeding season, ejaculates from fourteen stallions were
collected and ejaculates were diluted to 50 × 106 sperm/mL in extenders including ACP-105
®,
ACP105®
+ 2,5% egg yolk (ACP-105 2,5% EY), Botu-sêmen®. Extended semen were then
cooled in cooling device at 15ºC and 5ºC. Sperm kinetics was evaluated by computer assisted
sperm analyser after 24h of cooling. The integrity of sperm membrane was assessed by
fluorescence staining. Results showed that MT, MP, VSL and VCL were similar in fresh
33
semen. However, there were differences in VAP and RAP between ACP-105 2.5% EY and
Botu-sêmen®. After 24h of incubation, significant differences were observed in VAP, RAP,
VSL and VCL between Botu-sêmen and ACP-105®. Total and progressive motility were
found greater in ACP 2.5% EY and Botu-sêmen. There were no differences in the sperm
kinetics including MT, MP, VCL and RAP obtained from cooled semen samples at 15ºC and
5ºC for 24h in ACP 2.5% EY and Botu-sêmen. No significant differences were observed in
PMI between ACP-105 2.5% EY and Botu-sêmen® extenders. In summary, we demonstrate
that a ACP-105® associated with low concentration (2.5%) egg yolk was effective for
preservation of stallion spermatozoa for 24 hours. These findings are useful for the
improvement of sperm preservation procedures and set a foundation for the development of
novel extenders for the preservation of semen from other equine species as well as
endangered species.
Key words: Stallion; Sperm; Motility; Membrane integrity; Extenders
1. Introduction
Cooling of stallion sperm for artificial insemination has become a widespread
biotechnology in the horse industry for decades [1].The use of liquid sperm plays an
important role in reproductive biotechnology since it maintains fertility rate as efficient as
fresh sperm [2]. Despite such premise, sperm processing involves a number of factors that
may damage the sperm plasma membrane. During the course of cooling, spermatozoa are
exposed to a rapid change in temperature and undergo cold shock damage [3].Cold shock
damage had been proposed to occur during the phase transition temperatures of spermatozoa,
including the integration of lipids, alteration of the degree of saturation of fatty acids and a
34
loss of cholesterol that results in a pronounced decrease in the cholesterol/phospholipid ratio
in stallions [4].
Sperm extenders routinely used for cooled-stored stallion are mostly based on skim
milk and egg yolk[1].Milk is one of the most efficient extenders for storage of stallion sperm
because it contains fundamental components that have the ability to protect sperm against
cellular damage[5-7]. The active components involved in sperm protection by milk are casein
micelles[5], which interact with membrane proteins and protect against the lipid loss from the
sperm membrane [8].
In tropical regions, coconut water is a natural and abundant resource and studies have
shown that coconut water-based extender is an alternative extender for sperm
preservation[9].Coconut water is a solution composed of salts, proteins, sugars, vitamins,
neutral fats, inducers of cell division and various electrolytes[10], which provides the
nutrients necessary for cell preservation [11,12]. However, the use of this coconut water as
extender has some disadvantages such as the inability to store the coconut water for long
periods and limited availability of fruits in some regions of the world. Furthermore, the
biochemical constitution of coconut may differ between fruits, and this can directly affect the
ability of the extender to preserve spermatozoa. Thus, studies were conducted to develop a
powdered coconut water (ACP®, ACP Biotecnologia, Fortaleza, Brazil), which has been
successfully used for sperm preservation including goat [13,14], boar [15], dog [16,17],
stallion [18].Although powered coconut extender had been successfully used for sperm
preservation of several species, experiment with stallion sperm has been limited. Therefore,
the aim of this study was to evaluate the efficacy of equine sperm diluted and cooled in ACP-
105® and Botu-Semen
®.
2. Material and Methods
2.1. Reagents
35
Powdered coconut water extender (ACP-105®) was obtained from ACP Biotecnologia
(Ceará, Brazil). Botu-semen®
extender was purchased from Botu-Farma® (Sao Paulo, Brazil).
2.2. Ethics
All experimental procedures were performed in accordance with the ethical guidelines
specified by the ethical committee of the State University of Ceará.
2.3. Animals and sperm collection
Fourteen stallions of different breeds (10Quarter Horse, 04Thoroughbred, and 03
crossbred) aged from nine to 20 years old were used in the experiment. Four stallions were
housed atDepartment of Animal Reproduction and Veterinary Radiology at São Paulo State
University, São Paulo, and 10animals were kept on the facility of the LUB Breeding, São
Paulo. All horses were in good body condition and with proved fertility. Animals were fed
with concentrates and hay according to the national standard praxis for breeding horses. In the
beginning of the reproductive season, sperm was collected from the stallions for several days
to stabilize output collection and ejaculate was then collected every two day interval.
Immediately before collection, the penis was cleansed with warm water and dried
with a towel, individually. Ejaculates were collected during the breeding season using a
Botucatu® model artificial vagina (Botupharma
®, Botucatu – SP, Brazil). After collection,
sperm was filtered through nylon micromesh filter to separate the gel-free portion of the
ejaculate.
2.4. Sperm evaluation
The gel-free sperm from each ejaculate was placed in a water bath at 37ºC and
evaluated for volume, concentration, as well as sperm motility and vigor. Only ejaculates with
more than 70% motile sperm were used. After evaluation of initial sperm concentration, the
36
sample was diluted into three extenders [ACP-105®, ACP105
® + 2.5% egg yolk (ACP-105
2.5% EY), Botu-Semen®] to a final concentration of 50 × 10
6 sperm/mL. Sperm kinetics and
motility were evaluated within two hours of collection to the sperm analysis laboratory using
a CASA system (HTM-IVOS 12, Hamilton Thorne Research, Beverly, MA, USA).The
following motion characteristics were recorded in fresh as well as cooled sperm samples: total
motility (TM, %), progressive motility (PM, %), rapid motility (RM %), average path velocity
(VAP, μm/s), straight linear velocity (VSL, μm/s), and curvilinear velocity (VCL,
μm/s).Established setup parameters were carried out according to previously described [19].
The integrity of the sperm plasma membrane was assessed by fluorescence staining
with 6-carboxyfluorescein diacetate and propidium iodide following the protocol previously
described by Harrison and Vickers [20]. In brief, diluted samples were mixed with staining
medium (l.7 mM-formaldehyde, 7.3 μM-propidium iodide and 20 μM-carboxyfluorescein
diacetate) and incubated for 8min. in the dark at 30°C.Stained samples were placed on a glass
slide, covered and allowed to assess the plasma membrane integrity through an
epifluorescence microscopy (×400 magnification). At least 100 cells were counted per
sample.
2.5. Cooling process
The cooling procedure was carried out as previously described [19].Sperm samples
were cooled in a passive cooling device (BotuFlex; Botupharma, São Paulo, Brazil) and held
at approximately 15ºC for 24 h. In parallel, samples were also maintained at 5ºC for 24 h.
37
2.6. Statistical analysis
Statistical analyses were performed by using the GraphPad Prism software, version 5
(GraphPad, San Diego, CA, USA). The results are present as mean (SD, SEM).Sperm
parameters were submitted to D'Agostino-Pearson test (omnibus K2) to test normality.
Kruskal-Wallis test followed by Dunn test were used to evaluate sperm parameters of non-
parametric data. Variables of normally distributed populations were examined through one
way ANOVA followed by Tukey's test. The level of statistical significance was set at P <
0.05.
3. Results
The sperm kinetics and motility obtained of fresh as well as cooled sperm samples
are shown in Table 1.The sperm kinetics (MT, MP, VSL, and VCL) were similar in fresh
sperm of respective extenders (P < 0.05).However, there were difference observed in VAP
and RAP between ACP-105 2.5% EY and Botu-Semen® extenders (P < 0.05).
The results of the cooled sperm showed that there were differences observed in the
sperm kinetics (VAP, VSL, and VCL) between Botu-Semen® and ACP-105
® at the end of
incubation period (P < 0.05).Total and progressive motility were found greater in ACP
2.5%EY and Botu-Semen® in comparison with ACP-105
®(P < 0.05).Difference was observed
between ACP-105®andBotu-Semen
® with respect to rapid sperm motility(P < 0.05).
Total and rapid motility as well as the average path velocity were different among
extenders (P < 0.05). Botu-Semen ®
was superior than ACP-105® and ACP 2.5% EY (P <
0.05).In addition, there were differences (MP, VSL, and VCL) between ACP-105® and Botu-
Semen®
(P < 0.05).
Table 1.Sperm kinetics and motility parameters in fresh and cooled samples extended in ACP-
105®, ACP105
® + 2,5% de egg yolk (ACP-105 2,5%), Botu-sêmen
® extenders.
38
Extenders TM (%) PM (%) VAP (μm/s) VSL (μm/s) VCL (μm/s) RAP (μm/s)
ACP 74.71±12.57
a 25.35±10.48
a 113.00±19.68
ab 80.21±14.72
a 211.85±29.99
a 63.21±16.13
ab
Fresh ACP
2.5% 71.5±12.97
a 27.92±12.68
a 105.64±15.75
a 78.14±12.58
a 194.71±28.84
a 58.21±15.74
a
BS 79.35±8.80
a 29.21±10.8
a 123.14±18.21
b 87,42±13.39
a 228.23±29.23
a 70.5±12.42
b
Cooled ACP 10.57±11.25a 1.14±1.95
a 57.42±31.81
a 39.64±21.74
a 126.21±61.85
a 4.85±7.19
a
15ºC ACP
2.5% 40.85±27.36
b 9.57±9.97
b 78.42±26.26
a 56.57±15.54
b 157.42±50.85
a 26.14±24.43
ac
24 h BS 63.35±20.19b 17.21±10.36
b 112.85±28.77
b 75.85±15.55
c 218.5±48.52
b 51.35±23.45
bc
Cooled ACP 9.21±13.46a 2.78±5.05
a 54.00±29.65
a 40.57±20.64
a 106.28±59.64
a 4.78±11.15
a
5ºC ACP
2.5% 35.78±25.17
b 8.78±8.01
ac 79.42±27.42
b 59.42±16.51
ac 162.07±46.38
ac 23.14±22.6
b
24 h BS 66.21±21.08c 21.07±10.36
bc 107.78±21.8
c 77.00±15.36
bc 207.21±40.95
bc 53.92±22.81
c
Values (means ± SD) with different superscript letters (a–c) in a column differ significantly
(P < 0.05) between extenders (fresh and cooled semen compared separately).TM: Total motility;
PM: Progressive motility; VAP: average path velocity; VCL: curvilinear velocity; VSL: straight line
velocity; RAP: rapid sperm. ACP: ACP-105®; ACP 2.5%: ACP-105
® + 2.5% egg yolk; BS: Botu-
semen®.
As shown in Table 2, there were no differences observed in the sperm kinetics and
motility including MT, MP, VCL, and RAP obtained from cooled sperm samples at 15ºC and
5ºC at the end of incubation period (P < 0.05). Both ACP-105® 2.5% and Botu-Semen
®
extenders showed superior results at both temperatures as compared to other group (ACP-
105®)(P < 0.05).The average path and straight line velocity were different at 24 h of
incubation(P < 0.05).
Table 2. Sperm kinetics and motility parameters in fresh and cooled samples extended in ACP-
105®, ACP105
® + 2,5% de egg yolk (ACP-105 2,5%), Botu-sêmen
® extenders at 15ºC and 5ºC
for 24 hours.
15ºC/24 h 5ºC/24 h
ACP ACP 2,5% BS ACP ACP2.5% BS
MT (%) 10.57±11.25a 40.85±27.36
b 63.35±20.19
b 9.21±13.46
a 35.78±25.17
ab 66.21±21.08
b
MP (μm/s) 1.14±1.95a 9.57±9.97
b 17.21±10.36
c 2.78±5.05
ab 8.78±8.01
abc 21.07±10.36
bc
VAP(μm/s) 57.42±31.8 a 78.42±26.26
ab 112.85±28.77
b 54±29.65
a 79.42±27.42
a 107.78±21.8
b
VSL (μm/s) 39.64±21.74a 56.57±15.54
ab 75.85±15.55
bc 40.57±20.64
a 59.42±16.51
b 77±15.36
c
39
VCL (μm/s) 126.21±61.85a 157.42±50.85
ab 218.5±48.52
b 106.28±59.64
a 162.07±46.38
ab 207.21±40.95
b
RAP (μm/s) 4.85±7.19a 26.14±24.43
ab 51.35±23.45
b 4.78±11.15
a 23.14±22.6
ab 53.92±22.81
b
Values (means ± SD) with different superscript letters (a–b) in same row denote significant differences
(P < 0.05) between extenders at particular temperature (15ºC and 5ºC) for 24 hours. TM: Total
motility; PM: Progressive motility; VAP: average path velocity; VCL: curvilinear velocity; VSL:
straight line velocity; RAP: rapid sperm. ACP: ACP-105®; ACP 2.5%: ACP-105
® + 2.5% egg yolk;
BS: Botu-semen®.
No differences were observed in PMI between ACP-105 2.5% and Botu-Semen®
extenders (P < 0.05).Furthermore, the mean of the plasma membrane integrity was higher in
ACP-105 2.5 % EY and Botu-Semen®
as compared to ACP-105® (Table 3) at the end of both
incubation time (15ºC and 5ºC)(P < 0.05).
Table 3. Plasma membrane integrity of fresh and cooled samples extended in ACP-105®
,
ACP105®
+ 2,5% de egg yolk (ACP-105 2,5%), Botu-sêmen® extenders at 15ºC and 5ºC for 24
hours.
Parameter Plasma membrane integrity (%)
ACP ACP 2.5% BS
Fresh 83±9.46a 90.07±7.4
a 80±12.02
a
15ºC/24h 75.71±14.23a,A
88.28±8.94b,B
82.28±13.83ab,AB
5ºC/24h 70.71±19.92a,A
89±6.56b,AB
79.64±9.82ac,AB
Values (means ± SD) with different superscript letters (a–b) in same row denote significant differences
(P < 0.05) between extenders at particular temperature (15ºC and 5ºC) for 24 hours. Values
(means ± SD) with different superscripts letters (A–B) in same row differ significantly (P < 0.05)
between extenders at particular temperature (15ºC and 5ºC) for 24 hours. PMI: Plasma membrane
integrity. ACP: ACP-105®; ACP 2.5%: ACP-105
® + 2.5% egg yolk; BS: Botu-semen
®.
40
4. Discussion
The current study investigated the effectiveness of three sperm extender including
ACP-105®, ACP-105
® 2.5 % EY and Botu-semen
® for preserving stallion sperm function
during cooled-storage. For stallion sperm extended and cooled either in ACP-105®
2.5% EY
or Botu-semen®, there was no difference between extenders as well as storage temperature
(15ºC and 5ºC) at the end of incubation time (24h)for sperm kinetic parameters
(P < 0.05).Furthermore, there was no difference in plasma membrane integrity for
spermatozoa cooled in both extenders (P < 0.05).
Our results demonstrated that Botu-semen®, a milk-based extender, after cooling
seemed similar to studies earlier reported [21].Furthermore, it was also demonstrated that
ACP-105®added to 2.5% egg yolk could be efficiently used as an alternative extender for
cooled sperm from stallions. The biochemical composition of the ACP®
extender is very
similar to those of fresh coconut water [22].The chemical composition of coconut water
contains natural sugars, vitamins, minerals, amino acids and phytohormones [10]. Coconut
water is also rich in indole-3-acetic acid, an auxin able to replace cAMP and in restoring
specific pathways [23,24]. In regards to egg yolk concentration, 2.5% was the optimal
concentration to be added to ACP-105®
for stallion sperm preservation. Powdered coconut
water has been used for sperm preservation in several species [13-18]for several decades.
Although the use of egg yolk in sperm cooling extenders is not without
disadvantages including being a product of animal origin, its composition is not constant[25],
presence of high-density lipoproteins [26], and steroids hormones[27]and moreover, it
represents a potential risk of microbial contamination of sperm[28],our study shows that there
were no differences between Botu-Semen® and ACP-105
® supplemented with 2.5% egg yolk
in regards to sperm kinetic parameters evaluated (P < 0.05).The results indicated sperm
41
extender such as ACP-105® with a low inclusion rate of egg yolk (2.5%) to preserve the
sperm viability during liquid storage as efficiently as Botu-Semen® extender.
The protective properties of egg yolk are widely attributed to its Low Density
Lipoproteins (LDL), the main constituents of egg yolk [26, 29, 30]. The exact mechanism by
which egg yolk enhance the sperm quality remains elusive. Direct associations between the
lipids of the egg yolk and the sperm membrane have been reported [26,31,32], providing
protection to sperm by stabilizing the membrane [33-35].Furthermore, it is suggested that
these have a stabilising effect, minimising lateral phase separations involved in cold shock
deterioration [36]. It is hypothesized that phospholipids present in LDL protect sperm by
forming a protective film on the sperm surface [37] or by replacing sperm membrane
phospholipids that are lost or damaged during preservation process [38,39]. A third
hypothesis suggests that LDL compete with detrimental seminal plasma cationic peptides (<5
kDa) in binding to the sperm membrane and thus protect the sperm [40].
The storage temperature has become the standard approach for prolonging the
functional life of ejaculated spermatozoa. Our findings are in agreement with a previous study
that recommended stallion sperm storage temperature of 4°C for maintenance of sperm
motility [41].In the stallion, the temperature of about 5ºC has been determined as the optimal
storage temperature for maintenance of motility and fertility [1].
As temperature declines, there is an inevitable reduction in the proportion of sperm
that maintain normal membrane integrity [42]. The sperm plasma membrane is the primary
site of cold-induced damage [43] and it is likely that these membrane stresses are related to
phase changes in lipids and an altered functional state of the membrane [44]. It is well known
that a major phase change occurs at from 5 to 15 °C [45], resulting in a substantial loss of
sperm viability. Our results demonstrated evidences that sperm plasma membrane was not
affected during cooled-storage. This result suggests that ACP-105® 2.5% EY and Botu-
42
Semen®
were able to protect stallion spermatozoa against cold shock damages at 15ºC and
5ºC for 24 h.
5. Conclusions
In summary, we demonstrate that a powdered coconut water-based extender (ACP-
105®) associated with low concentration (2.5%) egg yolk was effective for preservation of
stallion spermatozoa at15ºC and 5ºC for 24 h. These findings are useful for the improvement
of sperm preservation procedures and set a foundation for the development of novel extenders
for the preservation of sperm (liquid or frozen) from other equine species as well as
endangered species for which protocols do not exist presently.
Acknowledgements
The authors thank the ACP Biotecnologia for providing the ACP-105® and the Botu-
Farma providing the Botu-Semen®
used in the present experiment. São Paulo State University
and the LUB Breeding for providing the animals. Lucas Brasileiro, Erika Menezes, and
Lorenzo Segabinazzi are recipients of scholarship from the Brazilian Research Councils
CNPq and CAPES foundation.
REFERENCES
[1] Aurich C. Recent advances in cooled-semen technology. Anim Reprod Sci 2008; 107:
268–275.
[2] Aurich C. Factors affecting the plasma membrane function of cooled-stored stallion
spermatozoa. Anim Reprod Sci 2005; 89:65–75.
[3] White IG. Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a
review. Reprod Fertil Dev 1993; 5:639–658.
43
[4] Leahy T, Gadella BM. Sperm surface changes and physiological consequences induced by
sperm handling and storage. Reproduction 2011; 142:759–778.
[5] Lagares MA, Martins HS, Carvalho IA, Oliveira CA Jr, Souza MR, Penna CF, Cruz BC,
Stahlberg R, Henry MR. Caseinate protects stallion sperm during semen cooling and freezing.
Cryo Letters 2012; 33:214-219.
[6] Batellier F, Gérard N, Courtens JL, Palmer E, Magistrini M. Preservation of stallion sperm
quality by native phosphocaseinate: a direct or indirect effect? J Reprod Fertil Suppl 2000;
56:69-77.
[7] Batellier F, Magistrini M, Fauquant J, Palmer E. Effect of milk fractions on survival of
equine spermatozoa. Theriogenology 1997: 48:391-410.
[8] Bergeron A, Manjunath P. New insights towards understanding the mechanisms of sperm
protection by egg yolk and milk. Mol Reprod Dev 2006; 73:1338-1344.
[9] Nunes JF, Combarnous Y, Oliveira LF, Teixeira MD. Utilização da água de coco e suas
frações ativas na conservação in vitro e avaliação in vivo do sêmen na espécie caprina.
Ciência Animal 1996; 2:34.
[10] Yong JWH, Ge L, Ng YF, Tan SN. The Chemical Composition and Biological Properties
of Coconut (Cocos nucifera L.) Water. Molecules 2009; 14:5144-5164.
[11] Nunes JF. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de animais domésticos e
do homem. Rev Bras Reprod Anim 1998; 22:109-112.
[12] Vasconcelos AB, Santos AMC, Oliveira JS, Lagares MA, Santoro MM. Purification and
partial characterization of proteinase inhibitors of equine seminal plasma. Reproductive Biol
2009; 9:151-160.
[13] Salgueiro CCM, Nunes JF, Oliveira KLP, Vieira VL, Gondim JM, Mateos-Rex E.
Utilização de diluentes à base de água de coco in natura e em pó na inseminação artificial
programada de cabras. Rev Bras Reprod Anim 2002; 5:96-98.
44
[14] Oliveira RV, Nunes JF, Salgueiro CCM, Cavalcante JMM, Brasil OO, Moura AAA.
Avaliação de espermatozóides caprinos congelados em meio à base de água de coco em pó
(ACP-101®) ou TRIS. Arq Bras Med Vet Zootec 2011; 6:1295-1302.
[15] Bottini-Luzardo M, Centurión-Castro F, Alfaro-Gamboa M, Aké-López R, Herrera-
Camacho J. Effect of addition of coconut water (Cocos nucifera) to the freezing media on
post-thaw viability of boar sperm. Trop Anim Health Prod 2013; 45:101-106.
[16] Cardoso RCS, Silva AR, Uchoa DC, Silva LDM. Cryopreservation of canine semen
using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations.
Theriogenology 2003; 59:743-751.
[17] Cardoso RCS, Silva AR, Silva LDM. Use of the powdered coconut water (ACP-106®
)
for cryopreservation of canine spermatozoa. Anim Reprod 2005; 2:257-262.
[18] Sampaio Neto JC, Salgueiro CCM, Mateos-Rex E, Nunes JF. Utilização do diluente
ACP-105® na refrigeração do semen eqüino. Rev Bras Reprod Anim Supl 2002; 5:137-139.
[19] Monteiro GA, Guasti PN, Hartwig FP, Dellaqua Jr JA, Alvarenga MA, Papa FO. Cooling
of ejaculated and epididymal stallion sperm. Arq Bras Med Vet Zootec 2013; 65:681-686.
[20] Harrison RAP, Vickers SE. Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in
mammalian spermatozoa. J Reprod Fertil 1990; 88:343-342.
[21] Neto CR, Monteiro GA, Soares RF, Pedrazzi C, Dell'aqua Jr JA, Papa FO, Alvarenga
MA. Effect of Removing Seminal Plasma Using a Sperm Filter on the Viability of
Refrigerated Stallion Semen. J Equine Vet Sci 2013; 33:40–43.
[22] Nunes JF, Salgueiro CCM. Strategies to improve the reproductive efficiency of goats in
Brazil. Small Ruminant Res 2011; 98:176-184.
[23] Toniolli R, Bussière J, Courot M. Effect of indole-3-acetic acid (plant auxin) on the
preservation at 15°C of boar semen for artificial insemination. Reprod Nutr Dev 1996;
36:503-511.
45
[24] Bianco C, Imperlini E, Calogero R, Senatore B, Pucci P, Defez R. Indole-3-acetic acid
regulates the central metabolic pathways in Escherichia coli. Microbiology 2006; 152:2421–
2431.
[25] Forouzanfar M, Sharafi M, Hosseini SM, Ostadhosseini S, Hajian M, Hosseini L, Abedi
P, Nili N, Rahmani HR, Nasr-Esfahani MH. In vitro comparison of egg yolk-based and
soybean lecithin-based extenders for cryopreservation of ram semen. Theriogenology 2010;
73: 480–487.
[26] Pace MM, Graham EF. Components in egg yolk which protect bovine spermatozoa
during freezing. J Anim Sci 1974; 39:1144–1149.
[27] Lipar JL, Ketterson ED, Nolan Jr V, Casto JM. Egg yolk layers vary in the concentration
of steroid hormones in two avian species. Gen Comp Endocrinol 1999; 115:220–227.
[28] Aires VA, Hinsch KD, Mueller-Schloesser F, Bogner K, Mueller-Schloesser S, Hinsch
E. In vitro and in vivo comparison of egg yolk-based and soybean lecithin-based extenders for
cryopreservation of bovine semen. Theriogenology 2003; 60: 269–279.
[29] Moussa M, Martinet V, Trimeche A, Tainturier D, Anton M. Low density lipoproteins
extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull
semen. Theriogenology 2002; 57:1695-1706.
[30] Pillet E, Duchamp G, Batellier F, Beaumal V, Anton M, Desherces S, Schmitt E,
Magistrini M. Egg yolk plasma can replace egg yolk in stallion freezing extenders.
Theriogenology 2011; 75:105-114.
[31] Ollero M, Bescos O, Cebrian-Perez JA, Muino-Blanco T. Loss of plasma membrane
proteins of bull spermatozoa through the freezing-thawing process. Theriogenology 1998;
49:547–555.
46
[32] Ricker JV, Linfor JJ, Delfino WJ, Kysar P, Scholtz EL, Tablin F, Crowe JH, Ball BA,
Meyers SA. Equine sperm membrane phase behavior: the effects of lipid-based
cryoprotectants. Biol Reprod 2006; 74:359–365.
[33] Watson PF. The interaction of egg yolk and ram spermatozoa studied with a fluorescent
probe. J Reprod Fertil 1975; 42:105–111.
[34] Foulkes JA. The separation of lipoproteins from egg yolk and their effect on the motility
and integrity of bovine spermatozoa. J Reprod Fertil 1977; 49:277–284.
[35] MacDonald BJ, Foulkes JA. A spectrofluorometric investigation, using 1-
anilinonaphthalen-sulphonate, of the interaction between washed bovine spermatozoa and
seminal plasma or egg-yolk lipoprotein. J Reprod Fertil 1981; 63:407–414.
[36] Pettitt MJ, Buhr MM. Extender components and surfactants affect boar sperm function
and membrane behavior during cryopreservation. J Androl 1998; 19:736-746.
[37] Quinn PJ, Chow PY, White IG. Evidence that phospholipid protects ram spermatozoa
from cold shock at a plasma membrane site. J Reprod Fertil 1980; 60:403–407.
[38] Foulkes JA, Sweasey D, Goodey RG. Fertility of bull spermatozoa in egg-yolk diluents
of varied lipid fatty acid composition. J Reprod Fertil. 1980;60:165–169.
[39] Graham JK, Foote RH. Effect of several lipids fatty acyl chain length and degree of
unsaturation on the motility of bull spermatozoa after cold shock and freezing. Cryobiology
1987; 24:42–52.
[40] Vishwanath R. Shannon P, Curson B. Cationic extracts of egg yolk and their effects on
motility, survival and fertilizing ability of bull sperm. Anim Reprod Sci 1992; 29:185–194.
[41] Varner DD, Blanchard TL, Love CL. et al. Effects of semen fractionation and dilution
ratio on equine spermatozoal motility parameters. Theriogenology 1987; 28:709-723.
[42] Johnson LA, Weitze KF, Fiser P, Maxwell WMC. Storage of boar semen. Anim Reprod
Sci 2000; 62:143–172.
47
[43] Bailey JL, Lessard C, Jacques J, Breque C, Dobrinski I, Zeng WX, Galantino-Homer
HL, Cryopreservation of boar semen and its future importance to the industry.
Theriogenology 2008; 70: 1251–1259.
[44] Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci
2000; 60:481–492.
[45] Drobnis EZ, Crowe LM, Berger T, Anchordoguy TJ, Overstreet JW, Crowe JH. Cold
shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using
sperm as a model. J Exp Zool 1993; 265:432–437.
48
8 CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos conclui-se que o diluidor à base de água de coco
(ACP-105®) associado à gema de ovo (2,5%) foi eficaz para a preservação de
espermatozoides de garanhões a 15ºC e 5ºC durante 24 horas. Estes resultados são
importantes para o aperfeiçoamento de protocolos de preservação de espermatozoides equino.
Além disso, estabelece bases para elaboração de novos diluentes de outras espécies de
equídeos, bem como espécies em risco de extinção, os quais ainda não possuem protocolos
estabelecidos.
49
9 PERSPECTIVAS
Avaliar de novos protocolos utilizando-se ACP-105®
para a preservação do sêmen de
garanhões visando obtenção de resultados similares aos obtidos à diluentes comerciais
sem a adição do crioproteores de origem animal.
Compreensão dos mecanismo de ação do ACP-105®
na proteção das células
espermáticas durante o processo de resfriamento do sêmen.
Estudos complementares visando avaliar a adição de substâncias antioxidantes,
crioprotetores ao diluidor ACP-105 durante o processo de resfriamento do sêmen.
Determinar a fertilidade de éguas inseminadas com espermatozoides diluidos e
resfriados no diluidor ACP-105.
50
REFERÊNCIAS
ALMEIDA, J.; BALL, B.A. Effects of α-tocopherol and tocopherol succinate on lipid
peroxidation in equine spermatozoa, Animal reproduction Science, p. 321-337, 2005.
AMANN, R.P.; GRAHAM, J.K. Spermatozoal function. In: McKINNON, A.O.; VOSS, J.L.
Equine Reproduction. 1 ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993.
AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principles of cryopreservation and review of
cryopreservation on stallion spermatozoa, Journal of Equine Veterinary Science, v.7, p.
145-173, 1987.
ARAUJO, I.S. Utilização da água de coco e do leite glicosado como diluidor do sêmen
ovino. Fortaleza, 1990. 35p. Monografia (Especialização em Produção e reprodução de
Pequenos Ruminantes da Universidade Estadual do Ceará – UECE, 1990).
ARAUJO, A.A.; NUNES, J.F. Utilização da água de coco “in natura” adicionada de gema de
ovo como diluente do sêmen caprino. Ciência Animal, Fortaleza, v. 1, p. 39-49, 1991.
ARRUDA, R. P. Avaliação dos efeitos de diluentes e crioprotetores para o
espermatozoide equino pelo uso de microscopia de epifluorescência, citometria de fluxo,
analise computadorizada da motilidade (CASA) e da morfometria (ASMA). 2000. 121 f.
Tese (Livre Docência) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, Pirassununga, 2000.
AURICH, J.E.; SCHONHERR, U.; HOPPE, H.; AURICH, C. Effect of antioxidants on
motility and membrane integrity of chilled-storage stallion semen. Theriogenology, v.48, p.
185-192, 1997.
BATELLIER, F.; MAGISTRINI, M.; FAUQUANTZ, J.; PALMER, E. Effect of Milk
fractions on survival of equine spermatozoa. Theriogenology, v. 48, p. 391-410, 1997.
BATELLIER, F.; VIDAMENT, M.; FAUQUANT, J.; DUCHAMP, G. Advances in cooled
semen technology. Animal Reproduction Science, v.68, p.181-190, 2001.
BAUMGARTL,C.; BADER, H.; DROMMER, W.; LUNING, I. Ultrastructural alterations of
stallion spermatozoa due to semen conservation. Proc. 9th
Intern. Congr. Animal. Al., vol. 5,
pg. 134-137, 1980.
BERGERON, A.; MANJUNATH, P. New insights towards understanding the machanisms of
sperm protection by egg yolk and milk. Molecular, reproduction and Development, v. 73,
p. 1338-1344, 2006.
BERGERON, A.; BRINDLE, Y.; BLONDIN, P.; MANJUNATH, P. Milk caseins decrease
the binding of the major bovine seminal plasma proteins to sperm and prevent lipid loss from
the sperm membrane during sperm storage. Biol Reprod, v. 77, p.120-126, 2007.
BRISKO, S. P.; VARNER, D. D. Artificial insemination. In: McKinnon, A. O.; Voss, J. L.
(Eds.). Equine Reproduction. Philadelphia: Lea e Febiger, p. 790-797, 1992.
51
BRUEMMERT, J.E.; COY, R.C.; SQUIRES, E.L.; GRAHAN, J.K. Effect of pyruvate on the
function of stallion spermatozoa storage for up to 48 hours. Journal of Animal Science, v.80,
p. 12-18, 2002.
CARVALHO, G.A. Efeito de diferentes diluentes sobre viabilidade espermática,
utilizando-se diversas formas de refrigeração com sêmen equino. Botucatu, 2003. 138p.
Dissertação (Mestrado da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista “Julio de mesquita Filho”, 2003).
CRUZ, J.F. Conservação e fertilidade do sêmen ovino mantido a temperatura de 4º C
por um período de 48 horas diluído em frações ativas da água de coco. Fortaleza, 1994.
Dissertação (Mestrado em produção e Reprodução de Pequenos Ruminantes da Universidade
Estadual do Ceara – UECE, 1994).
DAVIS, R. O.; KATZ, D. F. Operational standards for CASA Instruments. Journal of
Andrology, v.14, n.5, p.385-394, 1993.
DOUGLAS-HAMILTON, D. D.; OSOL, R.; OSOL, G.; DRISCOLL, D.; NOBLE, H. A field
study of fertility of transported equine semen. Theriogenology, v.22, p.291-304, 1984.
ENGLAND, G. C. W.; PONZIO, P. Comparison of the quality of fronzen-thawed and cooled-
rewarmed dog semen. Theriogenology, v. 46, p. 165-171, 1996.
FARIAS, J. O.; NUNES, J. F.; CARVALHO, M. A. M. et al. Avaliação “in vitro” e “in vivo”
do sêmen de Tambaqui (Colossoma macropomum CUVIER) conservado à temperatura
ambiente e criopreservado em água de coco. Revista Cientifica de Produção Animal, v.1,
n.1, p.44-58, 1999.
FELDMAN, E. C.; NELSON, R. W. artificial insemination, fresh extended semen, and frozen
semen. In: ____ (eds), canine and feline endocrinology and reproduction. Philadelphia; W.
B. Saunders, 1996, p. 734-739.
Food and agriculture Organization - FAO. United Nations. Disponível em:
http://faostat.fao.org/site/604/default.aspx#ancor
FREITAS-DELL’AQUA, C. D. P.; MONTEIRO, G. A.; DELL’AQUA JÚNIOR, J. A.;
PAPA, F. O. The effects of refrigeration temperature and storage time on apoptotic markers in
equine semen. Journal of Equine Veterinary Science, p.1-5, 2012. In press
FREITAS, V.J.F. Sincronização do ciclo estral e fertilidade de cabras submetidas a dois
níveis de gonadotrofina coriônica humana (HCG), inseminadas artificialmente.
Fortaleza, 1988. Monografia (Especialização em Produção e Reprodução de Pequenos
Ruminantes da Universidade Estadual do Ceará - UECE, 1988).
FREITAS, V.J.F. Parâmetros andrológicos a avaliação “in vitro” do sêmen de ovinos
deslanados criados na região litorânea do Nordeste Brasileiro em estações seca e
chuvosa. Fortaleza, 1992. Dissertação (Mestrado em Produção e Reprodução de Pequenos
Ruminantes da Universidade Estadual do Ceará – UECE, 1992).
52
FUJIMURA, M.; OKUNO, M. Requirements of fixed and for spontaneous beating in flagela.
The Journal of Experimental Biology, v. 209, p. 1336-1343, 2006.
GARNER, D. L.; JOHNSON, L. A. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-
14 and propidium iodide. Biology of reproduction, v.53, p.276-284, 1995.
GLAZAR, A. I.; MULLEN, S. F.; LIU, J.; BENSON, J. D.; CRITSER, J. K.; SQUIRES, E.
L.; JAMES, K.; GRAHAM, J. K. Osmotic tolerance limits and membrane permeability
characteristics of stallion spermatozoa treated with cholesterol. Cryobiology, v. 59, n.2,
p.201-206, 2009.
GÜNZEL-APEL, A.R.; KRAUSE, D. Laufigkeitsuberwachung und Samenubertragung beim
hund. Hannover Tierärztliche Hochshule, v. 8, p. 564-570, 1986 (abstract).
JASKO, D. J. Procedures for cooling and freezing of equine semen. ARS Veterinaria. V. 10,
p. 156-170, 1994.
JOHNSTON, S. canine reproduction: lessons in reproductive biology. Annual Conference of
Society for Theriogenology, 17, Illinois, 2000. Disponível em:
http://www.hilltopanimalhospital.com/therio%20history.htm.Acesso em 20 de março de
2010.
KARESKOSKI, M.; KATILA, T. Components of stallion seminal plasma and the effects of
seminal plasma on sperm longevity. Animal Reproduction Science, v.107, n.3-4, p.249-256,
2008.
KENNEY, R.M.; BERGMAN, R.V.; COOPER, W.L. Minimal contamination techniques and
preliminary finding. In: AMERICAN ASSCIATION OF EQUINE PRACTIONERS, 21,
1975, Lexington. Proceedings… Lexington, p. 327-336, 1975.
KRAUSE, W.; VIETHEN, G. Quality assessment of computer assisted semen analysis
(CASA) in the andrology laboratory. Andrologia, v. 31, p. 125-129, 1999.
LEBOEUF, B.; GUILLOUET, P.; BATTELIER, F.; BERNELAS, D.; BONNE, J. L.;
FORGERIT, Y.; RENAUD, G.; MAGISTRINI, M. Effect of native phosphocaseinate on the
in vitro preservation of fresh semen. Theriogenology, v.60, p.867-877, 2003.
LIPAR, J.L.; KETTERSON, E.D.; NOLAN, V.J.R.; CASTRO, J.M. Egg yolk, layers vary in
the concentration of steroid hormones in two avian species. Genetic compendium of
Endocrinology, v. 115, p. 220-227, 1999.
LUSIGNAN, M. F.; BERGERON, A.; LAFLEUR, M.; MANJUNATH, P. The major proteins
of bovine seminal plasma interact with caseins and whey proteins of milk extender. Biology
of reproduction, v. 85, n. 3, p. 457- 464, 2011.
MACK, S.; WOLF, D.; TASH, J. Quantization of specific parameters of motility in large
numbers of human sperm by digital image processing. Biology of Reproduction, v. 38, p.
270-281, 1988.
53
MAGISTRINI, M.; GUITTON, E.; LEVERN, Y. et al. New staining methods for sperm
evaluation estimated by microscopy and flow cytometry. Theriogenology, v. 48, n.7, p.1229-
1235, 1997.
MAIA, V. N.; CARNEIRO, G. F.; SILVA, S. V.; GOMES NETO, O. C.; ALMEIDA, F. C.;
SALGUEIRO, C. C. M.; NUNES, J. F.; DELL’AQUA JR., J. A.; GUERRA, M. M. P. Equine
semen extender without animal derived ingredients: preliminary results. Acta Scientia
Veterinariae. 38 (supl 2); s675-s821. P. s730, abstract 85. Anais, SBTE, 2010.
MANJUNATH, P. new insights into the understanding of the mechanism of sperm protection
by extender components. Animal Reproduction, v.9, n.4, p.809-815, 2012.
McKINNON, A. O.; VOSS, J. L. Equine Reproduction, 1 ed.; Pennsylvania: Lea &
Febinger, Malvern, 1993.
MELO, N.S.S. Efeitos de diferentes concentrações de crioprotetores na congelação de
sêmen equino. Brasilia, 2005. 71p. Dissertação (Mestrado da faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, 2005).
MIES FILHO, A. Reprodução dos Animais Domésticos. 6. ed. Porto Alegre: Sulina, p. 115-
119, 1987.
MONTEZUMA Jr, P.; VIANNA NETO, C.; NUNES, J.F. Agua de coco como diluidor de
sêmen de cães. In: ENCONTRO DE PESQUISADORES DA UECE, Anais... 1994.
MORAN, D. M.; JASKO, D. J.; SQUIRES, E.L. et al. Determination of temperature and
cooling rate which induce cold shock in stallion spermatozoa. Theriogenology, v. 38, p. 999-
1012, 1992.
NEIL, D. M. Evaluation of equine sperm membrane function: effects of
cryopreservation. 2005. 11of. Tese (Doutorado em 2004) – Faculty of Veterinary Sciences.
Utrecht University, Utrecht. 2005.
NUNES, J.F. A inseminação artificial como método alternativo para o melhoramento da
caprinocultura leiteira. In: SIMPOSIO DA CAPRINOCULTURA DO ESTADO DO RIO,
1986, Niterói. Anais...Niterói, 1986.
NUNES, J. F. Coconut water as diluent for goat semen. In: IV CONFERENCIA
INTERNACIONAL SOBRE CAPRINOS, 1987, Brasília. Anais... Brasília, 1987.
NUNES, J.F.; COMBARNOUS, Y.; PRISCILA, L. Utilisation d’une substance ativa “JYP”
presents dans l’eau de coco pour la conservation in vitro et La fertilité dês spermatozoïdes de
mammifers. S.I: Sn., 1994.
NUNES, J.F.; COMBARNOUS, Y. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen dos
mamíferos domésticos. In: I SIMPOSIO DE BIOTECNOLOGIA DA REPRODUÇÃO DE
ANIMAIS DOMESTICOS, 1995, Fortaleza. Anais... Fortaleza, 1995, p. 53-63.
NUNES, J.F.; SALGUEIRO, C.C.M. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de
caprinos e ovinos. Rev. Cient. Prod. Animal, v.1, p. 17-26, 1999.
54
NUNES, J.F.; SALGUEIRO, C.C.M. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de
animais domésticos. Revista Ciencias Agrárias, Belem, n.43, sulp., 5p. 2005.
PAGL, R,; AURICH, E. J.; MULLER-CHOSSER, F.; KANKOFER, M.; AURICH, C.
Comparison of an extender containing defined milk protein fractions with a skim milk-based
extender for storage of equine semen at 5C.Theriogenology, v.66, p. 1115-1122, 2006.
PAPA, F. O.; MELO, C. M.; DELL’AQUA, J. A.; MACEDO, L. P.; CARVALHO, A. G.;
ALVARENGA, M. A.; MEDEIROS, A. S. L. Inovações metodológicas na biotecnologia de
refrigeração e congelação de sêmen eqüino. Acta Scientiae Veterinariae, (Suppl.) v.33, p.19-
27, 2005.
PARKS, J.E.; GRAHAM, J.K. Effects of cryopreservation on sperm membranes.
Theriogenology, v. 38, p. 210-222, 1992.
PARKS, E. J.; LYNCH, V. D. Lipid composition and thermotropic phase behavior stallion,
and rooster sperm membranes of boar, bull. Cryobiology, v.266, p.255-266, 1992.
PICKETT, B. W. seminal extenders and cooled semen. In; Equine Reproduction.
McKINNON, A. O.; VOSS, J. L. Philadelphia: Lea & Febiger, p.746-754, 1993.
PICKETT, B. W.; GRAHAM, J. K.; VANDERVALL, D. K.; SQUIRES, E. L.; McCUE, P.
M.; BRUEMMER, J. E. Cooled and frozen stallion semen. Animal Reproduction and
Biotechnology Laboratory, p.3-37, 1999.
PIMENTEL, C. A.; CARNEIRO, G. F. Biotecnias aplicada à Reprodução de Equinos. In:
Gonçalves BDG, Figueiredo RF, Freitas VJF. 2ª Ed. Biotécnicas aplicada à Reprodução
Animal, São Paulo: Roca, 2008, p. 145-159.
PUGLIESI, G. Viabilidade e fertilidade do sêmen equino resfriado a 5 ºC por 24 horas
com dois diluentes. Dissertação de Mestrado. Universidade federal de Viçosa, Viçosa/MG,
103p, 2009.
RITAR, A. J.; SALOMON, S. Effects of centrifugation and seminal plasma andof its removal
and of egg yolk in the diluents on the survival of fresh and frozen-thawed spermatozoa of the
Angora goat. Australian Journal of Biology Science, v.35, p.305-312, 1982.
RODRIGUES, A.P.R.; TORRES, M.Z.G.;OLIVEIRA, L.F.; NUNES, J.F.; Água de coco sob
a forma estabilizada de gel e sua fração ativa adicionada ou não de gema de ovo como
diluentes do sêmen caprino. In: XXIII CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA
VETERINÁRIA, 1994, Olinda. Anais... Olinda, 1994, p. 540.
RODRIGUEZ, S. A. F. Efeitos de diferentes diluentes sobre a cinética, membranas,
morfologia e cromatina espermática durante a refrigeração do sêmen equino. São Paulo,
2013. Dissertação (Mestrado da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, 2013).
RONDON, R.M.M. Sobrevivência “in vitro” dos espermatozoides de capotes (Numida
meleagris) conservados em água de coco em pó (ACP-108) e Ovodyl em diferentes
55
temperaturas. Fortaleza, 2006. Dissertação (Mestrado Profissional em Ciências Avícolas da
Universidade Estadual do Ceará – UECE, 2006).
SALGUEIRO, C.C.M. Evaluación de diferentes diluyentes en la congelación del semen
caprino. Madrid, 2003. Tese (Doutorado em Ciencias Veterinarias da Universidad
Complutense de Madrid – UCM, Espanha, 2003).
SALGUEIRO, C.C.M.; GONDIM, J.M.; NUNES, J.F.; CORDEIRO, M.A.; CAVALCANTE,
J.M.M.; MACHADO, V.P.; PINHEIRO, J.H.T. Artificial insemination of ewes with semen
diluted in powdered coconut water (ACP-102), cooled and stored at 4ºC. In: 15h
INTERNATIONAL CONGRESS OF ANIMAL REPRODUCTION, 2004, Porto Seguro.
Proceedings… Porto Seguro: Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, p.374, 2004.
SALLES, M.G.F. Água de coco (Cocus Nucifera L.) in natura, sob a forma de gel e
estabilizada como diluidor do sêmen caprino. Porto alegre, 1989. Dissertação (Mestrado da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1989).
SAMPAIO-NETO, J.C.; SALGUEIRO, C.C.M.; MATEOS-REX, E.; NUNES, J.F.
Utilization of ACP-105 extender in the refrigeration of stallion semen. Revista Brasileira de
reprodução Animal, v. 5, p. 137-139, 2002.
SMITH, J. F.; MURRAY, G. R. Evalution of different techniques for determination of
membrane status in spermatozoa. Proceedings of the New Zealand Society of Animal
Production, v.57, p.246-250, 1997.
SOBREIRA NETO, J. A. Avaliação in vitro e in vivo do sêmen equino diluído em água de
coco em pó (ACP-105) e refrigerado a 5 ºC. Dissertação (mestrado) - Universidade de
Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008.
SOUSA, N.M.; TEIXEIRA, M.D.A.; OLIVEIRA, L.F. Agua de coco sob a forma de fração
ativa liofilizada adicionada ou não de gema de ovo e gel, como diluidor do sêmen ovino. In:
XXIII CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINARIA, 1994, Olinda.
Anais... Olinda, 1994, p.583.
SQUIRES, E. L.; PICKETT, B. W.; GRAHAM, D. K. et al. cooled and frozen stallion semen.
Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory, n. 9, p. 3-36, 1999.
TONIOLLI, R. Estudo das características “in vitro” do sêmen caprino de raças nativas do
Nordeste Brasileiro diluído em água de coco sob a forma “in natura” estabilizada e de gel.
Ver. Bras. Reprodução Animal, v.13, p. 209-220, 1989a.
TONIOLLI, R. Conservação do sêmen suíno em água de coco. In;. VIII CONGRESSO
BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 1989b, Belo Horizonte. Anais... Belo
Horizonte, 1989b, p. 138-142.
TONIOLLI, R.; MESQUITA, D.S.M. fertilidade de porcas inseminadas com sêmen diluído
em água de coco estabilizada e com BTS. Rev. Bras. Reprod. Animal, v.14, p. 249-254,
1990.
56
UCHOA, D.C.; CARDOSO, R.C.S.; SILVA, L.D.M. Inseminação artificial a fresco em
cadelas da raça Boxer com diferentes diluentes de sêmen. Revista Brasileira de Reprodução
Animal, supl., n.5, p. 150-152, 2002
VALLE, G. R.; SILVA FILHO, J. M.; PALHARES, M. S. et al. Utilização de um container
modelo CELLE modificado para resfriamento e transporte de sêmen equino. Arquivo
brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 51, p. 505-514, 1999.
VERSTENGEN, J.; IGUER-OUADA, M.; ONCLIN, K. Computer assisted semen analyzers
in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, v. 57, p.149-179, 2002.
VIDAMENT, M.; DUPERE, A. M.; JULIENNE, P.; EVAIN, A.; NOUE, P.; PALMER, E.
equine frozen semen: freezability and fertility field results. Theriogenology, v. 48, p. 907-
917, 1997.