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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS LIVIA BRUNETTI APOLLONI EFEITO DO HORMÔNIO ANDROSTENEDIONA SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS CAPRINOS ISOLADOS FORTALEZA – CEARÁ 2015

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

LIVIA BRUNETTI APOLLONI

EFEITO DO HORMÔNIO ANDROSTENEDIONA SOBRE O

DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS

CAPRINOS ISOLADOS

FORTALEZA – CEARÁ

2015

LIVIA BRUNETTI APOLLONI

EFEITO DO HORMÔNIO ANDROSTENEDIONA SOBRE O

DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS CAPRINOS

ISOLADOS

FORTALEZA – CEARÁ

2015

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.

A Deus, por sempre me colocar no lugar certo, na hora

certa!

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em

Ciências Veterinárias (PPGCV) por minha formação e capacitação profissional. Á

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo

incentivo concedido na forma de bolsa de estudo e ao Laboratório de Manipulação de

Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) por todo suporte oferecido para a

realização deste trabalho.

À Deus primeiramente, por ter me concedido a oportunidade de lutar para realizar meus

sonhos, por ter iluminado meus caminhos e meus passos e por ter colocado anjos

disfarçados de amigos nessa trajetória.

À minha mãe Marli Brunetti Apolloni e ao meu pai Luis Antônio Apolloni, por todo

amor dedicado a mim diariamente, mesmo nos dias em que eu não merecia tanto amor

assim. Por toda a paciência e dedicação concedida a minha pessoa, e principalmente

pelo exemplo de perceverança que levarei comigo por toda vida.

Àquela que chegou e se tornou minha segunda mãe. Àquela que encheu meu coração de

amor nos dias mais difíceis, que me deu a mão nos momentos em que eu mais precisava

e que me fez ter fé que tudo no final daria certo. Àquela que soube, com a maneira mais

doce e paciente que poderia existir, transmitir todo o seu conhecimento, me ajudando a

adquirir as ferramentas necessárias para concluir esta etapa da minha vida. Àquela que

foi minha co-orientadora mas, que acima de tudo, foi o melhor presente que eu poderia

ganhar. Àquela que foi o elemento chave para a conclusão deste trabalho, me dando

suporte emocional e científico. Àquela que foi essencial para essa trajetória, que será

sempre lembrada com o coração cheio de saudade. Àquela que eu não sei expressar com

palavras o quanto é especial para mim, mas que eu espero ter demonstrado isso á ela

todos os dias em que convivemos. Jamily Bezerra Bruno por todo o carinho dedicado a

mim, muito obrigada.

Aos meus amigos Lívia Miranda, Marcos Vinícius do Amaral, Matheus Neiva da Matta,

Gustavo Pontel, Jéssica Cilense de Andrade, Marina Mansur, Mariane Crespoline dos

Santos, Laís Simonetti, Milena Chales Pereira e Heloísa Pinotti que dividiram comigo

todas as alegrias e angústias presentes nesta trajetória. Que se fizeram presentes, mesmo

na ausência a cada momento. Dedico.

À minha equipe Anna Clara Accioly Ferreira, Victor Macêdo Paes, Jesus de los Reyes

Cadenas Moreno e Francisco Léo Nascimento de Aguiar, que foram

extremamente eficientes e dedicados para a realização deste trabalho, me oferecendo o

auxílio necessário para concluir o experimento proposto bem como a escrita do artigo

técnico.

Ao Benner Geraldo Alvez que chegou para deixar perfeitamente completo e finalizar a

realização deste trabalho com êxito, contribuindo com todo o seu conhecimento,

criatividade e paciência. À Kele Amaral Alves sua esposa, pelos conselhos e apoio.

Aos meus grandes amigos Franciele Lunardi e Francisco Léo Nascimento de Aguiar

pelas infinitas conversas, conselhos, amor, alegria e todos os bons sentimentos

recebidos e compartilhados. À minha amiga Marcela Pinheiro Paz, pelo

companheirismo, disposição e tranquilidade que sempre me dedicou em todos os dias

desta caminhada. À vocês três, que esse seja o começo de uma grande amizade para

toda a vida.

Aos funcionários do PPGCV, Adriana, Sr. João e Daniela, em especial ao Cesár que

desde o início me acolheu com carinho.

À todos os membros da equipe do LAMOFOPA que me deram apoio e contribuíram de

forma direta ou indireta para a execução deste trabalho.

Ao Dr. Felipe Zandonadi Brandão, Dr. Johan Smitz e ao Dr. Gary Apgar pela

contribuição na realização deste trabalho.

Aos membros da banca Dra. Jamily Bezerra Bruno, Dr. Felipe Zandonadi Brandão e Dr.

Luis Alberto Vieira, por gentilmente terem aceitado o convite de participar da minha

banca examinadora, contribuindo para a finalização desta dissertação.

Ao meu orientador José Ricardo de Figueiredo, pela confiança depositada em mim, por

ter aberto as portas do seu laboratório e ter me dado a oportunidade de crescer

profissionalmente e pessoalmente. Por ter dividido comigo todo seu conhecimento e ter

transmitido toda a sua calma e serenidade necessárias para minha permanência. Por

acreditar que eu poderia ir sempre além do esperado, fazendo assim com que eu

quebrasse minhas próprias barreiras. Por mesmo sem saber, ter sido um exemplo de

profissional a ser seguido por mim, sempre.

Enfim, a todos vocês, meu muito obrigada!

RESUMO

Este estudo investigou o efeito de androstenediona (A4) sozinha ou em associação com

diferentes formas de adição do hormônio folículo-estimulante recombinante bovino

(FSH) sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos isolados. Os folículos

foram mecanicamente isolados a partir de fragmentos do tecido ovariano e cultivados

durante 18 dias em α-MEM suplementado ou não com A4 (10 ng/ml) sozinha ou em

associação com uma concentração fixa (A4+FixFSH: 100 ng/ml) ou sequencial

(A4+SeqFSH: Dia 0: 100 ng/ml; Dia 6: 500 ng/ml; 12 Dia: 1000 ng/ml) de FSH. Após

18 dias, os oócitos foram recuperados para a maturação in vitro e posterior análise do

status meiótico através do microscópio de fluorescência. Ao final do cultivo in vitro,

somente o tratamento A4+SeqFSH apresentou menor (P < 0.05) taxa de folículos

intactos, probabilidade de sobrevivência e retomada da meiose, assim como maior (P <

0.05) percentagem de folículos degenerados e/ou extrusos após formação de antro. Os

resultados em geral mostraram também uma correlação positiva entre os folículos que

apresentaram crescimento rápido e os folículos que degeneraram e/ou extrusaram após a

formação do antro. Em relação a produção hormonal, a adição de A4 sozinha ou em

associação com o FSH não aumentou (P> 0.05) os níveis de estradiol ou de

androstenediona após o dia 6, quando comparados com o controle. No entanto, no dia

18 os níveis de androstenodiona foram menores (P < 0.05) no tratamento A4+SeqFSH

quando comparado com A4 sozinha ou ao tratamento A4+FixFSH, porém a produção

de estradiol não diferiu (P > 0.05). Em conclusão, este estudo demonstrou que o

crescimento folicular acelerado afetou negativamente a morfologia dos folículos pré-

antrais caprino cultivados in vitro. Além disso, a associação de androstenodiona com

concentrações crescentes de FSH foi prejudicial para o desenvolvimento folicular, uma

vez que esta associação acelerou o crescimento in vitro dos folículos cultivados.

Palavras-chave: cultivo in vitro, folículos secundários, cabra, FSH, andrógeno, taxa de

crescimento.

ABSTRACT

This study investigated the effect of androstenedione (A4) alone or in association with

different concentrations of bovine recombinant FSH on the in vitro culture of isolated

goat preantral follicles. Follicles were mechanically isolated from the ovarian tissue and

cultured for 18 days in 훼-MEM supplemented or not with A4 (10 ng/ml) alone or in

association with fixed (A4+FixFSH: 100 ng/ml) or sequential (A4+SeqFSH: Day 0: 100

ng/ml; Day 6: 500 ng/ml; Day 12: 1000 ng/ml) concentrations of FSH. After 18 days,

the oocytes were recovered for in vitro maturation and fluorescence analysis. At day 18

of culture, only A4+SeqFSH treatment showed a lower (P < 0.05) rate of intact follicles,

survival probability and meiotic resumption, as well as higher (P < 0.05) percentage of

degeneration and/or extrusion after antrum formation. Take together, these results

showed a positive correlation between fast-growing follicles and follicles that

degenerated and/or extruded after antrum formation. When compared to control, the

addition of A4 alone or in association of FSH did not increase (P > 0.05) the estradiol

production or androstenedione levels on Day 6. However on Day 18, the

androstenedione levels was significantly lower in A4+SeqFSH treatment when

compared to A4 alone or to A4+FixFSH treatments, while the estradiol production did

not differ (P > 0.05). In summary, this study demonstrated that accelerated follicle

growth negatively impacted the morphology of caprine preantral follicle cultured in

vitro. In addition, the association of androstenedione with increasing concentration of

FSH was detrimental to follicular survival and development.

Keywords: in vitro culture, secondary follicles, goat, FSH, androgens, growth rates

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1 - Representação esquemática da esteroidogênese nas células

ovarianas. Nas células da teca, os andrógenos (androstenediona e

testosterona) são produzidos em resposta ao estímulo do hormônio

luteinizante (LH) através da captação do colesterol circulante. Após

difundir-se para as células da granulosa, os andrógenos são

convertidos em estrógenos (estrona e estradiol) pela enzima

aromatase sob a ação do FSH..........................................................

30

Figura 2 - Ação genômica do receptor de andrógeno. (1) Ligação do

andrógeno ao seu receptor (AR) no citoplasma celular; (2)

Dissociação da proteína de choque término (HSP) do complexo e

recrutamento da importina-훼 e proteína 70 associada ao receptor de

andrógeno (ARA70) para translocação do complexo para o núcleo;

(3) Formação de um dímero de complexos ligantes-receptores; (4)

Ligação dos dímeros a sequência do DNA responsiva aos

andrógenos (ARE) e; (5) Início da transcrição gênica dos genes

alvos..................................................................................................

33

Figura 3 - Ação não-genômica do receptor de andrógeno. (1) Ativação do AR

e interação com moléculas sinalizadoras (PI3K e RTK) localizadas

na membrana plasmática; (2) Ativação das vias AKT e MAPK pela

PI3K e RTK, respectivamente. (3) Fosforilação dos AR pelas

moléculas sinalizadoras (independente da ligação de seus ligantes)

(4) Translocação nuclear dos AR. (5) Sinalização de cascatas

através vias AKT e MAPK que regulam receptores nucleares (RN) e

fatores de transcrição (FT) e/ou; (6) Eventos sinalizadores

citoplasmáticos, tais como a liberação de cálcio (Ca2+) intracelular

pelo reticulo endoplasmático e mitocôndria. .....................................

34

Capítulo 2

Figure 1 - Percentage of intact follicles during in vitro culture in medium

containing androstenedione associated or not with fixed and

sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+

plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione

and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus

11

androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. A,B Within day,

uncommon uppercase letters indicate difference (P < 0.05). a,b

Within treatment, uncommon lowercase letters indicate difference

(P < 0.05). ‡ Tended to differ from Day 18 (P < 0.08).

...........................................................................................................

73

Figure 2 - Follicle survival probability (Kaplan-Meier plot) during in vitro

culture in medium containing androstenedione associated or not

with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+;

A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. * Differed from control ( P < 0.05). ......

74

Figure 3 - Percentage of degenerated follicles during in vitro culture in

medium containing androstenedione associated or not with fixed

and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-

MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH.a,b Within treatment, uncommon lowercase

letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within the

same day (P > 0.05). ....................................................................

75

Figure 4 - Percentage of extruded follicles during in vitro culture in medium

containing androstenedione associated or not with fixed and

sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+

plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione

and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within

treatment, uncommon lowercase letters indicate difference (P <

0.05). Among treatments within the same day (P > 0.05). ............

76

Figure 5 - (A) Representation of follicles (n = 169) classified according to

growth rate in non-, slow-, and fast-growing. (B) Frequency

distributions of follicles in growing categories during in vitro

culture in medium containing androstenedione associated or not

with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+;

A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

12

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. a,b Within the same growing categories,

uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). # Tended

to differ from control (P < 0.06). † Tended to differ from control (P

< 0.07)…………………………………………………………….

77

Figure 6 - Relationship between antrum formation and follicle diameter. Each

point of the graph is a follicle recorded during in vitro culture (n =

169). The follicles evaluated were defined by binary values (without

antrum formation = 0; presence of antrum formation = 1) to

dependent variable. A logistic regression (antrum predicted

probability) is represented by the equation and the black line [Logit

P = -1.916 + (0.0131 × follicle diameter); P < 0.05]………………..

78

Figure 7 - Mean (± SEM) daily growth rate of follicles according to their

ability to form antrum and maintain normal morphology. a,b,c

Uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). ...........

79

Figure 8 - Effect of the addition of androstenedione associated or not with

fixed and sequential concentrations of FSH on the antrum formation

and maintenance of normal morphology. Control: α-MEM+; A4: α-

MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. a,b Within the same antrum conditions,

uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). ............

80

Figure 9 - Relationship between antrum phenotypes conditions and follicular

growth. Each point of graph is a follicle recorded during in vitro

culture (n = 169). The follicles evaluated were defined by binary

values (absence of antrum formation = 1; antrum maintenance = 2;

follicles degenerated and/or extruded after antrum formation = 3) to

dependent variable. A linear regression is represented by the

equation and the black line [Antrum formation conditions = 1.955 +

(0.0162 × follicular growth); R2 = 0.08; r = 0.28; P < 0.001]. ..........

81 Figure 10 - Percentage of meiotic resumption, germinal vesicle (GV), germinal

vesicle breakdow (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II

(MII) of oocytes from preantral follicles cultured in vitro in

13

medium containing androstenedione associated or not with fixed

and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-

MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. a,b Within the same parameter, values with

different letters differ (P < 0.05). # Tended to differ from

A4+SeqFSH (P < 0.06). ………………………………………….

82 Figure 11 - Regression analysis of the chromatin configuration (GV, germinal

vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII,

metaphase II) and oocyte diameter. Each point of graph is a oocyte

evaluated after in vitro maturation (n = 68). The oocytes evaluated

were defined by values (GV = 2; GVBD = 3; MI = 4; and MII = 5)

to chromatin configuration (dependent variable). A linear

regression is represented by the equation and the black line

[chromatin configuration = 1.507 + (0.00791 × oocyte diameter);

R2 = 0.06; r = 0.24; P < 0.05]. ..........................................................

83 Figure 12 - Mean (± SEM) androstenedione levels from preantral follicles

cultured in vitro in medium containing androstenedione associated

or not with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-

MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+

plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. A,B,C Within day, uncommon uppercase

letters indicate difference (P < 0.05). † Tended to differ from A4 (P

< 0.07). Within treatment between days (P > 0.05). ....................

84

14

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Tabela 1 - Efeito dos andrógenos no desenvolvimento folicular in vitro ..................... 35

Capítulo 2

Table 1 - Mean (± SEM) diameter of normal follicles cultured in vitro for 18 days in

medium containing androstenedione associated or not with fixed and

sequential concentrations of FSH ................................................................. 71

Table 2 - Mean (± SEM) daily growth of normal follicles cultured in vitro for 18 days

in medium containing androstenedione associated or not with fixed and

sequential concentrations of FSH ................................................................. 72

15

LISTA DE ABREVIAÇÕES

A4 Androstenedione (Androstenediona)

AMH Anti-Mullerian Hormone (Hormônio Anti-Mulleriano)

AR Androgen receptor (receptor de andrógeno)

ARA70 Proteína 70 associada ao receptor de andrógeno

ARE Elementos responsivos aos andrógenos

AREG Anfiregulina

ARKO AR knockout (Nocaute para o receptor de andrógeno)

BSA Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)

°C Graus Celsius

Ca2+ Cálcio

Calceína - AM Calceína acetoximetil

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

cDNA Complementary DNA (DNA Complementar)

CG Células da granulosa

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CO2 Carbon dioxide (Dióxido de Carbono)

COX-2 Ciclooxigenase-2

CV

CYP17

Coefficient of variation (coeficiente de variação)

Cytochrome P450 17-alpha hydroxylase

CYP19 P450 aromatase

D6, D12, D18 Day 6, Day 12, Day 18 (Dia 6, Dia 12, Dia 18)

DHT Dihydrotestosterone (Dihidrotestosterona)

DNA Ácido desoxirribonulceico

Dr. Doctor (Doutor)

Dra. Doctor (Doutora)

E2 Estradiol

EGF Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal)

FGF Fibroblast growth factor (Fator de crescimento de fibroblastos)

FSH Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante)

Fig Figura

FIV Fertilização in vitro

FixFSH FSH em uma concentração fixa

FSHR FSH Receptor (Receptor para FSH)

FT Fator de transcrição

G Gauge

GH Growth Hormone (Hormônio do crescimento)

h Horas

HSP Proteína de choque término

IGF-I

IGF-II

Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à

insulina-I)

Insulin-like growth factor-II (Fator de crescimento semelhante à

insulina-II)

IVM In vitro maturation (maturação in vitro)

kg Quilograma

LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais

LH Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante)

LHR Luteinizing hormone receptor (Receptor do hormônio

luteinizante)

LRH-1 Receptor homólogo do fígado -1

M Molar

MEM Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)

mg Miligrama

min Minutos

miRNA microRNA

mL Mililitro

Mm mili-molar

mm milímetro

mRNA Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)

MOEPF Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles

MOIFOPA Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-

antrais

MI Metaphase I (Metáfase I)

MII Metaphase II (Metáfase II)

nM Nanomol

ng Nanograma

P4 Progesterona

P450scc Enzima da clivagem da cadeia lateral do colesterol

P < 0.05 Probabilidade de erro menor do que 5%

p. Página

PBS Phosphate buffered saline (Tampão fosfato-salino)

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)

pg Picograma

PH potencial hidrogeniônico

PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

qPCR Quantitative PCR

RIA Radioimmunoassay (radioimunoensaio)

rbFSH Recombinant bovine FSH (FSH recombinante bovino)

RN Receptor Nuclear

RT-PCR Real time PCR (PCR em tempo real)

SEM Standard error of means (Erro padrão da média)

SET Protein patient SE translocation

SeqFSH FSH em concentrações crescentes

SF-1 Fator esteroidogênico-1

StAR Proteína Reguladora Aguda da Esteroidogênese

T Testosterona

TC

TCM-199

Theca cell (célula da teca)

Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199)

TRL Trilostano

U Unidade

UECE Universidade Estadual do Ceará

UFF Universidade Federal Fluminense

USA United States of America

UZ Universitair Ziekenhuis

VG Germinal vesicle (Vesícula germinal)

VGBD Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal)

α-MEM Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)

μg Microgramas

μL Microlitro

μm Micrômetro

µM Micromolar

3β-HSD 3β-hydroxysteroid dehydrogenase

17β-HSD 17훽-hydroxisteroid dehydrogenase

% Porcentagem

< Menor

= Igual

> Maior

≥ Maior ou igual

≤ Menor ou igual

+ Mais

± Mais ou Menos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20

2. REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 22

2.1 CAPÍTULO 1 ........................................................................................................... 22

3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 50

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS ................................................................................. 52

5. OBJETIVOS ............................................................................................................ 53

5.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 53

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 53

6. CAPÍTULO 2 ........................................................................................................... 54

7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 90

8. PERSPECTIVAS .................................................................................................... 91

REFERÊNCIAS .................................................................................................. 92

20

1. INTRODUÇÃO

Biotécnicas de reprodução animal vêm sendo desenvolvidas visando aumentar o

potencial reprodutivo e a produtividade dos rebanhos, proporcionando uma grande

revolução na multiplicação de animais de elevado potencial econômico (ARAÚJO,

2013). Dentre estas biotécnicas destaca-se a Manipulação de Oócitos Inclusos em

Folículos Ovarianos Pré-Antrais (MOIFOPA) cujo objetivo é a recuperação de um

grande número de oócitos inclusos em folículos pré-antrais, visando seu cultivo in vitro

e sua completa maturação para uma posterior fecundação in vitro (FIV) (FIGUEIREDO

et al., 2008).

O desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro que garanta a ativação e o

crescimento folicular até o estádio antral, no qual os oócitos possam ser recuperados e

maturados in vitro é importante para o conhecimento dos fatores que controlam a

foliculogênese (ANDRADE et al., 2005). Sendo assim, a composição do meio é

essencial para a obtenção do sucesso no cultivo in vitro, uma vez que este deve prevenir

ao máximo o processo de atresia folicular.

Estudos vem sendo realizados testando a adição e associação de diferentes

substâncias (hormônios: LIMA-VERDE et al., 2010; SARAIVA et al., 2010;

MAGALHÃES et al., 2011; CHAVES et al., 2012; fatores de crescimento: MATOS et

al., 2007; BRUNO et al., 2009) ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais

visando maximizar o número de folículos viáveis após o cultivo, buscando completa

maturação oocitária. Dentre os hormônios destacam-se os andrógenos, os quais estão

diretamente relacionados com o processo de foliculogênese (LIMA-VERDE et al.,

2011). Pesquisas avaliando seus efeitos no cultivo in vitro de folículos pré-antrais vem

sendo realizadas em diferentes espécies a fim de melhorar o desenvolvimento folicular e

maturação oocitária in vitro (murinos: TARUMI et al., 2014; suínos: TASAKI et al.,

2013; caprinos: LIMA-VERDE et al., 2010; bovinos: YANG; FORTUNE, 2006;

primatas não humano: RODRIGUES et al., 2015).

De acordo com Lima-Verde et al. (2010) a adição de androstenediona (A4)

associada ao FSH no meio de cultivo de folículos pré-antrais inclusos em fragmentos de

tecido ovariano caprino, teve um papel importante na manutenção da percentagem de

folículos normais durante o cultivo. Já quando adicionada isoladamente (A4: 50 e 100

ng/ml) promoveu um aumento significativo no diâmetro oocitário após um curto

período de cultivo. Apesar destas informações, pouco se sabe sobre os reais efeitos

21

deste andrógeno associado ou não ao FSH (em diferentes concentrações) no cultivo in

vitro de folículos pré-antrais caprino isolados.

Assim, para um maior esclarecimento da importância deste projeto, a revisão de

literatura a seguir (Capítulo 1) abordará os aspectos relacionados à foliculogênese e a

biotécnica de MOIFOPA (“Ovário artificial”), a importância dos andrógenos no

desenvolvimento folicular, bem como sua síntese e expressão de seus receptores, além

do seu mecanismo de ação, dando ênfase nos principais resultados envolvendo a

utilização destes hormônios no meio de cultivo in vitro de células ovarianas. Vale

ressaltar que a presente revisão de literatura deu origem à um artigo de revisão

intitulado “Papel do andrógenos na foliculogênese em mamíferos” submetido no

periódico “Acta Scientiae Veterinariae”.

22

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CAPÍTULO 1

Papel dos Andrógenos na Foliculogênese em Mamíferos

The Role of Androgens in Mammals Folliculogenesis

Submetido no Periódico: Acta Scientiae Veterinariae

Em: Novembro de 2015

Qualis: B1

23

Acta Scientiae Veterinariae

Review Article

Papel dos Andrógenos na Foliculogênese em Mamíferos

The Role of Androgens in Mammals Folliculogenesis

Livia Brunetti Apolloni, Jamily Bezerra Bruno, Benner Geraldo Alves & José Ricardo

de Figueiredo

Laboratório de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Pré-Antrais

(LAMOFOPA), Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV),

Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, CE, Brasil. CORRESPONDENCE:

L.B. Apolloni [[email protected] – Fax: +55 (85) 31019840]. LAMOFOPA,

Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará (UECE). Av. Dr. Silas

Munguba, 1700, Campus do Itaperi. CEP 60.740-003 Fortaleza, CE, Brazil.

ABSTRACT

Background: The production of steroid hormones is a physiological process termed

steroidogenesis. An important stage of this process is the conversion of androgens into

estrogens through aromatase enzyme. Ovarian cells (i.e., granulosa and theca cells)

participate on the production of steroid hormones that are directly related with follicle

development. Furthermore, androgens are important in the process of folliculogenesis,

promoting follicular growth in different species. Thus, the aim of this review was to

present the process of synthesis, mechanism of action, and importance of androgens in

folliculogenesis. Additionally, the main results of in vitro culture of ovarian cells in the

presence of these hormones were emphasized.

Review: Folliculogenesis begins in prenatal life in most of species and can be defined as

the process of formation, follicular growth, and oocyte maturation. Preantral follicles

represent 95% of the follicular population and assisted reproductive technologies have

been developed (e.g., Manipulation of Oocytes Enclosed in Preantral Follicles -

MOEPF) in order to avoid the great follicle loss that occurs naturally in vivo by atresia.

The MOEPF aim to obtain a large number of competent oocytes from preantral follicles

and then subject to in vitro maturation, fertilization, and culture for embryo production.

However, the development of an efficient medium to ensure the follicular survival and

oocyte maturation is the major challenge of this biotechnology. To achieve the success

24

on in vitro culture, the effects of substances as androgens on follicular development

have been evaluated. Androgens are steroid hormones produced in theca cells (TC) that

are fundamental for follicular growth. These cells provide all the androgens required by

the developing follicles for conversion into estrogens by the granulosa cells (GC).

Androgens receptors (AR) are localized in cell cytoplasm of all follicular categories,

being more expressed in preantral follicles. The androgen pathway initiates through its

connection to its receptor, making a complex androgen-AR, that in the nucleus helps on

the process of gene transcription related with follicular survival. This mechanism is

androgen receptor genomic activity. In addition to genomic action, there is an androgen

receptor non-genomic activity. This occurs through activation of AR and its interaction

with different signaling molecules located on the cell membrane, triggering events that

aid in the follicular development. Regardless of the androgens actions, ovarian cells of

several species subjected to in vitro culture have shown the importance of these

hormones on the follicle development. Recent studies demonstrated that androgens

addition on the culture medium stimulated the activation of preantral follicles (bovine

and caprine), antrum formation (swine), survival (non-primate), and oocyte maturation

(antral follicles; bovine). Also, some studies suggest that the addition of these hormones

on in vitro culture is dose-dependent and species-specific.

Conclusion: This review shows the role of androgens in different stages of follicular

development and its action as a substrate for steroidogenesis and transcription of genes

related to follicular survival and oocyte maturation. However, when these hormones

should be added during in vitro follicular culture and which concentration is required

remains unclear, being necessary more studies to elucidate these aspects.

Keywords: follicles, in vitro culture, androgens, steroidogenesis.

Descritores: folículos, cultivo in vitro, andrógenos, esteroidogênese.

I. INTRODUÇÃO

II. FOLICULOGÊNESE E O “OVÁRIO ARTIFICIAL”

III. SÍNTESE E IMPORTÂNCIA DOS ANDRÓGENOS NA

FOLICULOGÊNESE OVARIANA

IV. RECEPTORES DE ANDRÓGENOS (AR)

V. MECANISMO DE AÇÃO DOS ANDRÓGENOS

VI. PRINCIPAIS RESULTADOS OBTIDOS NO CULTIVO IN VITRO DE

FOLÍCULOS COM ANDRÓGENOS

25

VII. CONCLUSÃO

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

I. INTRODUÇÃO

A foliculogênese é um evento fisiológico complexo e responsável pela

formação, crescimento e maturação folicular [95]. Durante este processo, diversos

hormônios e fatores de crescimento estão envolvidos, tais como as gonadotrofinas (LH

e FSH) e os hormônios esteróides (andrógenos e estrógenos) [45].

Estudos avaliando o cultivo folicular in vitro, demonstraram que a adição de

hormônios [46,77], fatores de crescimento [10,56] entre outras substâncias [73,82]

auxiliam no desenvolvimento de folículos pré-antrais nas espécies mamíferas. Dentre os

hormônios estudados, os andrógenos destacam-se por sua importância no ovário

mamífero e nos processos reprodutivos das fêmeas.

Apesar de existirem trabalhos relacionados com o estudo dos andrógenos em

diferentes espécies [74,91,107], alguns aspectos relativos à sua ação direta no

desenvolvimento folicular ainda permanecem pouco esclarecidos e contraditórios. Nesta

revisão serão abordados tópicos envolvendo a importância dos andrógenos no

desenvolvimento folicular, bem como sua síntese e expressão de seus receptores, além

do seu mecanismo de ação, dando ênfase nos principais resultados envolvendo a

utilização destes hormônios no meio de cultivo in vitro de células ovarianas.

II. FOLICULOGÊNESE E O “OVÁRIO ARTIFICIAL”

A foliculogênese é um evento iniciado na vida pré-natal na maioria das espécies

e pode ser definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular,

iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com o estádio de

folículo pré-ovulatório [95]. Durante este processo, a morfologia folicular é alterada,

uma vez que o oócito cresce e as células da granulosa e tecais circundantes se

diferenciam. De acordo com seu grau de evolução, os folículos podem ser divididos em

pré-antrais ou não cavitários (primordiais, primários e secundários) e antrais ou

cavitários (terciários e pré-ovulatórios) [7], sendo que os folículos pré-antrais

representam cerca de 90-95% de toda a população folicular [28].

Os folículos primordiais são constituídos por um oócito quiescente, esférico ou

oval, circundado por células da granulosa de formato pavimentoso ou pavimentoso e

cuboidais [71]. Seu núcleo é relativamente grande e ocupa uma posição central a

excêntrica mostrando um nucléolo evidente. A zona pelúcida nesse estádio ainda não é

26

observada, verificando-se apenas uma justaposição do oócito e células da granulosa,

sem nenhuma junção específica [49]. Acredita-se que a ativação dos folículos

primordiais seja regulada por um balanço entre fatores inibitórios e estimulatórios

originários tanto do ovário quanto de outras glândulas endócrinas [95]. Sendo assim,

uma vez ativado o folículo caracteriza-se como primário e apresenta uma única camada

de células da granulosa de formato cúbico circundando o oócito. A partir desse estádio o

oócito passa a manter um estreito contato com essas células mediado por endocitose [9].

Na continuação do desenvolvimento folicular, os folículos secundários são

caracterizados por possuírem um oócito circundado por duas camadas de células da

granulosa de formato cubóide. Com o desenvolvimento dos folículos, aumenta o

número de microvilos e inicia-se a formação da zona pelúcida, bem como das células da

teca externa, a partir do estroma intersticial [95]. A partir do crescimento destes

folículos e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação

de uma cavidade repleta de líquido denominada antro [9], sendo que a partir deste

estádio os folículos passam a ser chamados de terciários ou antrais, os quais evoluem

para folículos pré-ovulatórios ou De Graaf.

O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por uma fase de

crescimento, recrutamento, seleção e dominância [95] sendo a formação de folículos

pré-ovulatórios um pré-requisito para a ovulação e formação do corpo lúteo, bem como

da manutenção da fertilidade [23]. Porém, os sinais que interrompem a latência do

folículo primordial quiescente e induzem o início do seu crescimento em direção à

ovulação ou atresia ainda não são completamente conhecidos.

É sabido que o número de folículos por ovário varia entre espécies e indivíduos,

sendo aproximadamente 1.500 na camundonga [79], 235.000 na vaca [6], 35.000 na

cabra [48] e 2.000.000 na mulher [25]. Porém 99,9% desta grande população folicular

presente no ovário mamífero não chega à ovulação pois sofre um processo natural

denominado atresia [28], reduzindo significantemente o número de oócitos à serem

ovulados e diminuindo assim o potencial reprodutivo das fêmeas. Pesquisadores

propuseram a existência de formação de novas células germinativas em mulheres [11] e

camundongas [41] durante a vida adulta, sugerindo pela primeira vez a existência da

neogênese (formação de novos ovócitos), desafiando assim o “dogma” instituído pela

literatura sobre a existência finita de uma reserva de oócitos ao nascimento. Outros

estudos realizados por Zou et al. [110] e White et al. [105] comprovaram a existência de

células-tronco presentes na superfície do epitélio ovariano capazes de serem

transformadas em oócitos tanto em camundongas quanto em mulheres.

27

Visando evitar a enorme perda folicular que ocorre naturalmente in vivo pela

atresia, têm sido desenvolvidos sistemas de cultivo in vitro de folículos pré-antrais e

antrais que tem possibilitado o estudo dos fatores que controlam este processo, além de

auxiliarem na compreensão da foliculogênese in vitro. Dentre eeses sistemas de cultivo,

destaca-se a MOIFOPA (Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-

Antrais) também conhecida como “Ovário artificial”, uma biotécnica de reprodução

assistida que vem sendo desenvolvida como alternativa para a recuperação de folículos

pré-antrais, visando à obtenção de um grande número de oócitos competentes

maturados in vitro para a produção de embriões. Esta biotécnica encontra-se em

desenvolvimento e vem sendo aprimorada nos últimos anos, contribuindo

significativamente para a pesquisa fundamental [2,8,74,75,91,92,107] por meio da

elucidação da foliculogênese inicial, uma vez que permite acompanhar o

desenvolvimento folicular a partir da fase pré-antral.

A partir da MOIFOPA é possível a conservação de folículos isolados

[8,16,73,77] ou inclusos em tecido ovariano [46,72] visando à estocagem por curto [39]

ou longo período [26,50] e/ou descongelamento/aquecimento para posterior utilização

no cultivo folicular in vitro [51]. Associada à criopreservação e transplante de tecido

ovariano [3,20,80] pode auxiliar na preservação da fertilidade de mulheres que são

submetidas a tratamentos quimio/radioterápicos [27]. Na medicina veterinária, apesar da

mesma ainda não ter sido transferida para o sistema reprodutivo, no futuro poderá

contribuir para o aumento da produtividade de animais de alto valor genético, além de

auxiliar na preservação de animais ameaçados de extinção [81].

No tocante ao cultivo folicular, este pode ser realizado de duas maneiras, a

saber: o cultivo in situ, no qual os folículos são cultivados inclusos no tecido ovariano

[10] ou o cultivo de folículos isolados, nos quais os mesmos são isolados

enzimaticamente [96] e/ou mecanicamente [8] a partir de fragmentos do córtex

ovariano.

O cultivo in situ tem como vantagem preservar a integridade tridimensional dos

folículos, através da presença das células do estroma, assemelhando-se às condições in

vivo [4]. Já o cultivo de folículos isolados proporciona a obtenção de um grande número

de folículos primários e/ou secundários intactos, o acompanhamento individual dos

folículos, além de favorecer uma maior perfusão do meio durante o cultivo [1]. Vale

ressaltar que a eficiência do cultivo folicular in vitro pode ser avaliada através de

diferentes técnicas, tais como: (i) histologia clássica [72]; (ii) microscopia eletrônica de

28

transmissão [24]; (iii) microscopia de fluorescência [8]; (iv) produção hormonal [74] e

(v) biologia molecular [16].

O sistema de cultivo que apresenta melhores resultados é conhecido como

cultivo “em dois passos”, no qual foi relatado o nascimento de 53 camundongos a partir

de folículos primordiais desenvolvidos, maturados e fecundados in vitro [63]. Neste

modelo é efetuado inicialmente o cultivo in situ, com o objetivo de maximizar a

ativação folicular e o crescimento dos folículos primordiais até o estádio secundário,

sendo posteriormente realizado o isolamento dos mesmos para o cultivo in vitro dos

folículos isolados até a fase antral [93]. No entanto, apesar dos avanços observados, a

produção de nascimentos a partir de folículos pré-antrais cultivados in vitro ainda não

foi alcançada em espécies domésticas, se limitando apenas a produção de pequeno

número de embriões na espécie caprina [55] e ovina [52].

Nota-se que, nas espécies domésticas, a composição do meio é um importante

fator para obtenção de sucesso no cultivo folicular in vitro. Neste contexto, estudos têm

sido realizados com o objetivo de avaliar os efeitos da adição de diferentes substâncias

ao meio de cultivo, tais como hormônios [16,46,55,73] e fatores de crescimento [10,56]

que atuam regulando a ativação e o crescimento folicular, com a finalidade de

proporcionar um ambiente favorável para o completo desenvolvimento destes folículos

até a fase pré ovulatória.

Estudos demonstram ainda que a adição de piruvato, glutamina, hipoxantina e

ITS (insulina, transferrina e selênio), aumentam o percentual de folículos

morfologicamente normais e estimulam o crescimento folicular [19,83]. Além destes,

tem-se observado que o ácido ascórbico atua beneficamente sobre a foliculogênese, com

o papel de reduzir as taxas de apoptose de folículos pré-antrais em camundongos [61] e

estimular a manutenção da viabilidade em caprinos, após cultivo de longa duração [82].

Já a adição de andrógenos ao meio de cultivo têm apresentado resultados

contraditórios, uma vez que o hiperandrogenismo induz alterações na morfologia e

função de oócitos em desenvolvimento, bem como diminui as taxas de sobrevivência de

folículos secundários em roedores [91]. Porém Tasaki et al. [92] observaram que a

adição de um andrógeno (androstenediona) ao meio de cultivo de folículos porcinos,

proporcionou o aumento nas taxas de formação de antro. Além disso, Rodrigues et al.

[74] demonstraram que a adição de outro andrógeno (dihidrotestosterona) ao meio de

cultivo de folículos secundários de macacas, teve efeito benéfico sobre a taxa de

sobrevivência folicular após 40 dias de cultivo.

29

Assim, a proposta desta revisão foi abordar a síntese e importância da adição dos

andrógenos ao meio de cultivo folicular, bem como os principais resultados obtidos nos

estudos realizados até o momento, para melhor esclarecimento do mecanismo de ação e

atuação na foliculogênese destes hormônios.

III. SÍNTESE E IMPORTÂNCIA DOS ANDRÓGENOS NA

FOLICULOGÊNESE OVARIANA

A ideia que os andrógenos podem regular o desenvolvimento folicular inicial

teve início em meados dos anos 90, com estudos que observaram a expressão de

receptores de andrógenos (AR) no ovário [70]. Estes estudos mostraram a expressão de

AR em células da teca (CT), células da granulosa (CG) e no oócito de folículos em

diferentes estádios de desenvolvimento nas mais variadas espécies

[12,15,34,42,43,103].

É sabido que, durante a foliculogênese, os andrógenos aromatizáveis

(androstenediona e testosterona) produzidos no ovário são sintetizados nas CT sob ação

do hormônio luteinizante (LH) em um processo chamado esteroidogênese [59], que tem

como resultado final a conversão de andrógenos em estrógenos (estrona e estradiol)

[89]. Este processo inicia-se com a captação do colesterol circulante para dentro da

mitocôndria da CT através da enzima StAR (proteína reguladora aguda da

esteroidogênese), onde encontra-se a desmolase (P450scc), que converte o colesterol em

pregnenolona sendo esta última convertida em progesterona (P4) por meio da enzima

3훽-hidroxidesidrogenase (3훽-HSD) [31,94]. A P4, por sua vez, poderá exercer suas

funções biológicas no organismo ou servir como substrato para a produção de outros

andrógenos. Seguindo pela esteroidogênese, a androstenediona (A4) é produzida a

partir da P4 pela ação da enzima CYP17 (citocromo P450-17훼-hidroxilase) que, assim

como a P4, poderá exercer suas funções no organismo ou ser convertida em testosterona

(T), sob ação da 17 훽 -hidroxidesidrogenase (17 훽 -HSD). A testosterona tem três

caminhos, a saber: atuar no organismo, converter-se em dihidrotestosterona através da

5훼-redutase ou ser convertida em estradiol (E2) pela P450 aromatase (CYP19), nos

quais ambas as conversões são realizadas na CG [45]. Outra via para a produção de E2

seria a aromatização da A4 em estrona nas CG pela CYP19, e esta em E2 pela 17훽-

HSD, finalizando assim este processo [99] (Figura 1).

30

Figura 1. Representação esquemática da esteroidogênese nas células ovarianas. Nas células da teca, os andrógenos (androstenediona e testosterona) são produzidos em resposta ao estímulo do hormônio luteinizante (LH) através da captação do colesterol circulante. Após difundir-se para as células da granulosa, os andrógenos são convertidos em estrógenos (estrona e estradiol) pela enzima aromatase sob a ação do FSH.

Os andrógenos são os esteroides predominantes produzidos durante o

desenvolvimento folicular inicial e estão presentes em altas concentrações no fluido

folicular [53], porém dependendo do estágio de desenvolvimento do folículo, a

esteroidogênese nas CG pode aumentar ou diminuir, devido a atividade da P450

aromatase [45]. A ligação andrógeno-receptor regula a produção e expressão de alguns

genes, como por exemplo o IGF-1 que, por sua vez, estimula a proliferação das CG e

aumenta os efeitos do FSH que induz a expressão da P450 aromatase [98].

Os hormônios esteróides estão envolvidos tanto na morte quanto na

sobrevivência celular [74,91]. Narkwichean et al. [62] administraram in vivo a

desidroepiandrostenediona (andrógeno oriundo das células adrenais) em ovelhas e

observaram que este pode ser útil no tratamento clínico do envelhecimento ovariano,

aumentando o número de folículos responsivos a gonadotrofinas e estimulando assim o

desenvolvimento folicular. Outro estudo demonstrou que a suplementação oral de

desidroepiandrostenediona aumenta os níveis de IGF-1, gerando um efeito positivo

sobre o desenvolvimento folicular e a qualidade oocitária em mulheres [13].

Em espécies poliovulatórias, estudos com camundongos knockout para

receptores de andrógenos (ARknockout) indicaram um papel estimulador dos

andrógenos sobre o crescimento e desenvolvimento folicular [100,102]. Otala et al. [66]

cultivaram fragmentos ovarianos humanos na presença de andrógenos, estradiol e uma

substância inibitória aos estímulos androgênicos (casodex) e observaram que na

31

presença dos andrógenos houve uma redução nas taxas de apoptose, o que não foi

alcançado com a adição de estradiol. Já na presença do casodex, este efeito positivo não

foi encontrado, o que confirma a importância dos andrógenos no cultivo folicular.

O cultivo folículos pré-antrais de camundongos na presença de um anticorpo

anti-andrógeno associado ou não a androstenediona demonstrou que, no tratamento com

o anti-andrógeno, o crescimento e diferenciação folicular foram inibidos, porém esses

efeitos foram restaurados com a adição da androstenediona [60]. Em ratas tratadas in

vivo com androstenediona no pós-parto, foi observada uma redução nos níveis de

apoptose folicular [33].

Apesar destes resultados, os andrógenos podem exercer efeitos antagonistas na

função folicular quando presentes em altas concentrações, inibindo o desenvolvimento

folicular e aumentando as taxas de apoptose [109]. O hiperandrogenismo está associado

a síndrome do ovário policístico [30], tendo como características a anovulação e

infertilidade, que também estão relacionadas a um aumento nas anormalidades

metabólicas, o que pode levar a obesidade, resistência à insulina, doenças

cardiovasculares e diabetes do tipo 2 [29,32,68].

IV. RECEPTORES DE ANDRÓGENOS (AR)

Receptores de andrógenos (AR) são proteínas, membros da superfamília de

receptores nucleares esteroidais que consistem em receptores de mineracorticóides,

glicocorticóides, estrogênios e progesterona [36,58]. Os AR estão agrupados dentro da

classe I, os quais incluem receptores do hormônio da tireóide, receptores de ácido

retinóico, receptores ativado por proliferador de peroxissoma e receptores de vitamina

D [21].

Quando não associados ao seu ligante, os AR estão localizados no citoplasma de

algumas células, onde se associam com as proteínas de choque térmico [35,47],

proteínas do citoesqueleto [97] e outras chaperonas [47,67]. A ligação específica

hormônio-receptor ocorre através da presença de um andrógeno, que difunde-se através

da membrana plasmática e liga-se ao seu receptor no citoplasma, podendo agir

localmente, mimetizando a ação de alguns fatores de crescimento, ou dirigir-se para o

núcleo das células. Para a realização desta translocação, o AR sofre uma alteração

conformacional e transloca-se para o núcleo, carregando o hormônio específico [14].

Dentro do núcleo, a ligação hormônio-receptor acopla-se ao DNA como um

homodímero e melhora a transcrição de genes relacionados à maturação oocitária e

ovulação, como por exemplo o gene anfiregulina (AREG) e o ciclooxigenase-2 (COX-

32

2) [108], agindo por interação direta com a maquinaria de transcrição basal ou através

de co-ativadores.

No ovário, as CG são altamente responsivas aos andrógenos, no entanto, apenas

a testosterona (T) e a dihidrotestosterona (DHT; andrógeno puro, não aromatizável) se

ligam diretamente aos AR enquanto que a androstenediona pode mediar sua ação

através da sua conversão intrácrina a um andrógeno mais potente (T ou DHT) que tem

maior afinidade aos AR, para então, exercer seus efeitos androgênicos [99]. Esta ligação

andrógeno-receptor está intimamente envolvida com a fertilidade feminina [108], sendo

que a conservação evolutiva da expressão destes receptores em ovários mamíferos

suporta a ideia que a ação dos andrógenos é mediada por AR e influencia o

desenvolvimento folicular ovariano [99]. No entanto, isso só foi confirmado na última

década, por meio de modelos de camundongos AR knockout (ARKO). Esses animais

apresentaram deficiência reprodutiva, com redução nas taxas de fertilidade,

desenvolvimento folicular anormal bem como redução nas taxas de ovulação [17,101].

Os AR foram localizados em folículos primordiais e primários de roedores [43],

ovinos [42], suínos [12] e bovinos [34]. Foram observados nas CG e CT de folículos

pré-antrais de ratos [43], bovinos [76], ovinos [42], equinos [57], primatas não humanos

[37] e humanos [38]. Em folículos antrais de ratas foi observada sua presença nas CG e

células do cúmulus [87]. Em ovinos [42], bovinos [76] e suínos [84] os AR foram

localizados em CG e CT, sendo mais predominante nas CG dos folículos antrais. A

imunocoloração para os AR também esteve presente em CG e CT humanas de folículos

antrais e pré-ovulatórios [86].

V. MECANISMO DE AÇÃO DOS ANDRÓGENOS

Os andrógenos podem agir de duas maneiras: via receptores intracelulares, que

estão localizados no citoplasma das células, ou através da modificação da atividade

gênica nuclear [22].

Inicialmente o AR encontra-se inativo e acoplado a uma proteína de choque

término (HSP) no citoplasma das células. Após a ligação do andrógeno ao AR, o

complexo é ativado e dissocia-se da HSP. Outras proteínas tais como a importina-훼 e a

proteína 70 associada ao AR (ARA70) são recrutadas para ajudar a estabilizar o AR e

promover sua translocação nuclear. Uma vez localizado no núcleo, este complexo forma

um dímero com uma segunda molécula de AR ativada, que se liga então a uma

sequência específica no DNA conhecida como ARE (elementos responsivos aos

andrógenos) [5]. Acredita-se que a ligação do AR ao ARE estabilize os fatores de

33

transcrição nos promotores dos genes alvo, induzindo assim um alto nível de iniciação

de transcrição [40,64]. Esta resposta clássica é denominada de genômica, uma vez que

envolve a transcrição de genes (Figura 2).

Figura 2. Ação genômica do receptor de andrógeno. (1) Ligação do andrógeno ao seu receptor (AR) no citoplasma celular; (2) Dissociação da proteína de choque término (HSP) do complexo e recrutamento da importina-훼 e proteína 70 associada ao receptor de andrógeno (ARA70) para translocação do complexo para o núcleo; (3) Formação de um dímero de complexos ligantes-receptores; (4) Ligação dos dímeros a sequência do DNA responsiva aos andrógenos (ARE) e; (5) Início da transcrição gênica dos genes alvos.

Wu et al. [104] relataram o aumento da expressão do receptor homólogo do

fígado -1 (LRH-1), que funciona como um fator de transcrição para a enzima CYP19,

na presença de testosterona em CG murina. Além deste estudo, tem-se relatos de alguns

fatores de transcrição que ativam as enzimas esteroidogênicas na presença de outros

hormônios, como o fator esteroidogênico-1 (SF-1), que se liga na região promotora da

proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR) bem como na mesma região da

CYP17, promovendo maior expressão dessas enzimas na presença de LH em CT

bovinas. Outro fator de transcrição que estimula a expressão das enzimas citadas

anteriormente é o GATA-6, representante da família de fatores de transcrição GATA

[59].

Estudos relataram que a proteína “patient SE translocation” (SET) pertencente a

uma família de proteínas de multitarefas, envolvida na apoptose e montagem do

nucleossoma, também funciona como um fator de transcrição para a CYP17 e 3훽-HSD,

promovendo uma super expressão das mesmas em CT de ratas transfectadas com a

proteína em questão [18,106]. Li et al. [44] demonstraram que o receptor nuclear órfão

34

(NR4A1) tem função transcricional sobre todas as enzimas esteroidogênicas

encontradas nas CT de camundongas.

Além da ação genômica clássica dos andrógenos via receptor intracelular, existe

ainda a atividade não genômica de receptores de andrógenos. O AR pode iniciar

respostas não genômicas através da sua ativação e interação com moléculas

sinalizadoras, tais como PI3K e RTK localizadas na membrana plasmática que ativam

as vias AKT e MAPK, respectivamente. Estas moléculas sinalizadoras também podem

fosforilar os AR, prevenindo a degradação dos mesmos (independente da ligação de

seus ligantes) e promovendo sua translocação nuclear. Além disso, uma vez ativadas,

essas vias também sinalizam cascatas que regulam outros receptores nucleares (RN) e

fatores de transcrição (FT) e/ou eventos sinalizadores citoplasmáticos, tais como a

liberação de cálcio (Ca2+) intracelular pelo reticulo endoplasmático e mitocôndria [5]

(Figura 3).

Figura 3. Ação não-genômica do receptor de andrógeno. (1) Ativação do AR e interação com moléculas sinalizadoras (PI3K e RTK) localizadas na membrana plasmática; (2) Ativação das vias AKT e MAPK pela PI3K e RTK, respectivamente. (3) Fosforilação dos AR pelas moléculas sinalizadoras (independente da ligação de seus ligantes) (4) Translocação nuclear dos AR. (5) Sinalização de cascatas através vias AKT e MAPK que regulam receptores nucleares (RN) e fatores de transcrição (FT) e/ou; (6) Eventos sinalizadores citoplasmáticos, tais como a liberação de cálcio (Ca2+) intracelular pelo reticulo endoplasmático e mitocôndria.

Machelon et al. [54] demonstraram que a adição de androstenediona causou um

aumento rápido de cálcio citosólico em CG luteinizadas humanas, envolvendo os canais

de cálcio dependentes da voltagem e fosfolipase C. A mobilização do cálcio intracelular

é seguida por um influxo de cálcio do meio extracelular, sendo que o mesmo funciona

como um segundo mensageiro intracelular proporcionando proliferação e diferenciação

35

das células. Outro estudo demonstrou que a adição de andrógenos no meio de cultivo de

CG promoveu a ativação da via MAPK, que por sua vez fosforilou uma proteína

sinalizadora de vias intra e extranucleares (paxilina), promovendo a expressão de um

microRNA antiapoptótico (miRNA-125b) [78]. Apesar desses estudos, a base molecular

dos efeitos AR não-genômicas ainda não foi totalmente esclarecida.

VI. PRINCIPAIS RESULTADOS OBTIDOS NO CULTIVO IN VITRO DE

FOLÍCULOS COM ANDRÓGENOS

Os efeitos dos andrógenos sobre a foliculogênese estão sendo avaliados com o

auxílio da biotécnica de MOIFOPA, a partir de diferentes sistemas de cultivo in vitro

em diferentes espécies mamíferas (Tabela 1).

Tabela 1. Efeito dos andrógenos no desenvolvimento folicular in vitro.

Referência Animal Metodologia Principais resultados

MURRAY et al. [60] Roedor

Cultivo de 6 dias de folículos pré-antrais na presença de: (i) um anticorpo anti-andrógeno em

associação ou não com 1μg/ml A4; (ii) um antagonista do AR

(casodex) em associação ou não com 1μg/ml DHT

Adição do anticorpo anti-andrógeno inibiu o crescimento folicular, efeito

este que foi revertido com a adição de A4. No tratamento com o casodex, o

crescimento folicular também foi inibido e revertido posteriormente

com a adição de DHT

SPEARS et al. [85] Roedor

Cultivo de 6 dias de folículos pré-antrais na presença de FSH em

associação ou não com 1μg/ml de A4

O tratamento com FSH promoveu o crescimento folicular o qual foi melhorado na presença de A4

ROMERO & SMITZ. [75] Roedor

Cultivo de 13 dias de folículos pré-antrais na presença de: (i) 20 ou 200 nM de A4 associada ou

não ao FSH; (ii) 20, 200 nM ou 2 μM de T associada ou não ao FSH

As concentrações superiores a 200 nM de ambos os andrógenos

prejudicaram a maturação oocitária

OKUTSU et al. [65] Roedor

Cultivo de 10 dias de folículos pré-antrais na presença de 10-5 M

de A4

A4 promoveu uma luteinização precoce nas células da granulosa

TARUMI et al. [90] Roedor

Cultivo de 12 dias de folículos pré-antrais na presença de 10-10,

10-8 e 10 -6 M de DHT e E2

O tratamento com DHT (10 -6 M) apresentou maior diâmetro folicular. Uma redução na produção de P4 e

danos na retomada da meiose foram observados nos folículos cultivados

com 10 -6 M de E2

36

SEN et al. [78] Roedor

Expressão do microRNA-125b, sobrevivência folicular e formação

de antro foram analisadas no cultivo de ovário inteiro e

folículos pré-antrais na presença de DHT e FSH em diferentes

concentrações

Na presença de DHT a expressão do microRNA-125b, o diâmetro folicular e a formação de antro apresentaram

um aumento

TAKETSURU et al. [88] Bovino

Folículos antrais iniciais foram cultivados por 14 dias na presença de 0,10 e 100 ng/ml de A4 ou E2

Na presença de A4 as taxas de maturação foram similares ao

controle in vivo

YANG & FORTUNE et al.

[107] Bovino

Fragmentos do córtex ovariano foram cultivados por 10 dias na

presença de: 10-7 e 10-6 M de T ou 10-6 M de E2; (ii) 10-7 M de T em

associação flutamida

T promoveu um aumento na transição de folículos primários para

secundários, a qual foi inibida na presença de flutamida e não ocorreu

no tratamento com E2

LIMA-VERDE et al. [46] Caprino

Fragmentos do córtex ovariano foram cultivados por 7 dias na

presença de 1, 10, 50, 100 ng/ml de A4 associada ou não com FSH

A4 (50 ng/ml) promoveu um aumento nos diâmetros folicular e oocitário.

As concentrações 50 ou 100 ng/ml de A4 associadas ao FSH apresentaram

93.3% de folículos viáveis

RODRIGUES et al. [74]

Primata não

humano

Cultivo de 40 dias de folículos pré-antrais encapsulados na

presença de: (i) 50 ng/ml de DHT associada ou não ao TRL; (ii) 10 ou 50 ng/ml de T associadas ao

TRL

O tratamento com DHT aumentou a sobrevivência folicular em mais de

80% quando comparado ao controle. Entretanto, uma diminuição na produção de E2 foi observada

A4: androstenediona; DHT: dihidrotestosterona; E2: estradiol; P4: progesterona; T: testosterona; TRL:

trilostano.

O cultivo de folículos secundários isolados de primatas não humanos, com a

adição de dihidrotestosterona (50 ng/ml) mostrou um aumento na produção de estradiol,

mesmo na presença de um inibidor da síntese de esteróides, e uma taxa de sobrevivência

folicular significativamente superior ao controle após 40 dias de cultivo [74]. Outro

estudo avaliou o efeito deste mesmo hormônio no cultivo in vitro de folículos pré

antrais isolados de camundongas, revelando um aumento significativo no diâmetro

folicular bem como maiores taxas de formação de antro no tratamento com 10-6 M de

dihidrotestosterona, quando comparado ao controle. Além dos resultados de

desenvolvimento folicular, esses autores obtiveram altas taxas de maturação oocitária

(75-80%) em todos os tratamentos na presença do andrógeno [90].

Sen et al. [78] avaliaram a ação da dihidrotestosterona no ovário de

camundongos e observaram que a mesma aumenta a expressão de um microRNA

responsável por reduzir as taxas de apoptose, além de proporcionar um aumento

37

significativo no diâmetro folicular e proporcionar maiores taxas de folículos antrais na

associação desse andrógeno ao FSH.

Yang & Fortune [107] observaram que o cultivo de fragmentos ovarianos

bovinos com adição de 10-7 e 10-10 M de testosterona promoveu maior transição de

folículos primários para secundários após 10 dias. Considerando que Hampton et al.

[34] detectaram a expressão do mRNA para AR em folículos primários bovinos,

conlcuiu-se que a testosterona exerce um papel estimulatório na foliculogênese inicial.

O cultivo in vitro de fragmentos do córtex ovariano caprino com a adição de

androstenediona (10 ng/ml) e FSH manteve o desenvolvimento folicular entre os dias 1

e 7 de cultivo. Além disso, 50 e 100 ng/ml de androstenediona associada ao FSH

apresentaram uma percentagem de 93,3% de folículos viáveis ao longo de 7 dias de

cultivo [46].

Taketsuru et al. [88] observaram que a adição de 10 e 100 ng/ml de

androstenediona no cultivo de folículos antrais bovinos, resultou em taxas de maturação

de 67% e 65%, respectivamente, sendo similares ao controle in vivo (86%). Porém a

adição de androstenediona e testosterona (em concentrações de 200 nM) no cultivo de

folículos pré-antrais de roedores reduziram as taxas de extrusão do primeiro corpúsculo

polar em 32% e 48%, respectivamente [75]. Este achado sugere que altas concentrações

de andrógenos durante a foliculogênese podem prejudicar a formação do fuso meiótico

durante a retomada da meiose.

Trabalhos têm mostrado que a exposição de folículos pré-antrais a altas

concentrações de andrógenos induz a luteinização precoce nas células da granulosa [65]

e reduz o crescimento e a viabilidade folicular [91], o que pode ser comparado a

síndrome do ovário policístico em mulheres.

Além destes efeitos, o hiperandrogenismo pode levar a uma secreção prematura

de estradiol, aumentando a responsividade dos folículos em desenvolvimento ao FSH,

levando à inibição da secreção deste hormônio e consequente parada no

desenvolvimento folicular [69], o que reforça o fato da adição de andrógenos ser

concentração hormônio-dependente.

VII. CONCLUSÃO

A presente revisão mostra o relevante papel dos andrógenos nos diferentes

estádios de desenvolvimento folicular, atuando através de seus receptores em CG e CT,

servindo como um substrato para a esteroidogênese ou agindo na transcrição de genes

relacionados a sobrevivência folicular, além de auxiliarem na maturação oocitária. Estes

38

hormônios são essenciais no processo reprodutivo das fêmeas, regulando a

foliculogênese e modulando os efeitos de outros hormônios, como por exemplo, o FSH.

No entanto, apesar dos estudos já realizados enfocando a ação dos andrógenos nos

folículos ovarianos, a forma como estes hormônios devem ser adicionados no cultivo

folicular in vitro, bem como a concentração a ser utilizada, ainda permanecem pouco

esclarecidas, sendo indispensáveis mais estudos para elucidar estes aspectos.

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50

3. JUSTIFICATIVA

A execução de um projeto de pesquisa se justifica pela contribuição original

dos resultados à ciência. Dessa forma, serão abordados a seguir três aspectos que

justificaram a execução deste trabalho: importância do modelo animal, da biotécnica de

MOIFOPA e originalidade do protocolo utilizado.

a. Escolha da espécie:

O rebanho nacional da espécie caprina está concentrado em mais de 90% na

região nordeste e desempenha extrema importância socioeconômica para esta região.

Além disso, pode ser utilizada como modelo experimental por apresentar semelhanças

morfofisiológicas com o ovário humano, contribuindo para o aperfeiçoamento de

biotécnicas reprodutivas, visando maximizar o potencial reprodutivo de animais

domésticos de alto valor zootécnico ou ameaçados de extinção, bem como auxiliar no

tratamento de mulheres com problemas de infertilidade.

b. Importância da biotécnica de MOIFOPA:

Como já mencionado anteriormente, os folículos pré-antrais representam a quase

totalidade da população folicular ovariana (cerca de 90-95%), armazenando assim a

maioria dos oócitos presentes em ovários mamíferos. Porém a grande maioria dos

folículos não chegam à fase ovulatória, sendo eliminados pelo processo de atresia,

reduzindo significativamente o potencial reprodutivo das fêmeas. Neste contexto, a

biotécnica de MOIFOPA tem como objetivo resgatar estes folículos do ovário antes que

os mesmos se tornem atrésicos e cultivá-los in vitro até a completa maturação oocitária.

Diante disso, o desenvolvimento de um sistema de cultivo eficiente poderá fornecer

subsídios para uma melhor compreensão sobre os fatores que regulam o crescimento

folicular e maturação oocitária in vitro.

c. Originalidade do protocolo:

No que se refere à espécie caprina, os fatores que regulam a foliculogênese in

vitro ainda são limitantes para o sucesso da biotécnica de MOIFOPA, devido aos

resultados inconstantes em relação aos meios de bases utilizados. Na tentativa de

melhorar os meios de desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro, o Laboratório

de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA) vem

testando o efeito de diferentes de hormônios (FSH: RODRIGUES et al., 2010; GH:

51

MAGALHÃES et al., 2011; insulina e FSH: CHAVES et al., 2012; A4: LIMA-VERDE

et al., 2010) e fatores de crescimento (IGF-1: YUAN e GIUDICE, 1999; FGF: MATOS

et al., 2007; VEGF: BRUNO et al., 2009). Dentre os hormônios estudados, destacam-se

a A4 e o FSH, que desempenham um papel importante na regulação do

desenvolvimento folicular.

Baseado em estudos in vitro no cultivo de folículos pré-antrais caprinos

isolados, a utilização do FSH, adicionado em momentos específicos do cultivo e de

maneira crescente (SeqFSH: Dia 0: 100 ng/ml; Dia 6: 500 ng/ml; 12 Dia: 1000 ng/ml)

combinado à insulina na concentração 10 ng/ml promoveu melhores taxas de

sobrevivência folicular e retomada da meiose (CHAVES et al., 2012). Outro estudo

avaliou o efeito de concentrações fixas de FSH (100 e 1000 ng/ml) no cultivo de

folículos pré-antrais caprinos e observou que ambas as concentrações aumentaram a

taxa de crescimento diário durante o cultivo (RODRIGUES et al., 2010). Entretanto,

Saraiva et al. (2010) demonstraram que a adição de concentrações crescentes de FSH

promoveu melhores taxas de sobrevivência, formação de antro, crescimento, bem como

retomada da meiose, quando comparado à utilização do FSH em uma concentração fixa

(100 ng/ml) no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos isolados.

Em relação aos andrógenos, a adição de androstenediona tem apresentado

resultados controversos, demonstrando ser concentração dependente e espécie

específica. O cultivo de folículos pré-antrais isolados de roedores demonstrou que a

adição de androstenediona reduziu a taxa de sobrevivência folicular, de maneira dose

dependente (TARUMI et al., 2012). Por outro lado, o cultivo de folículos pré-antrais

suínos em meio contendo androstenediona aumentou as taxas de formação de antro

(TASAKI et al., 2013). Na espécie caprina, o cultivo de folículos pré-antrais inclusos

em fragmentos do córtex ovariano na presença de androstenediona (10 ng/ml) associada

ao FSH em uma concentração fixa (50 ng/ml) manteve a percentagem de folículos

normais durante o cultivo in vitro (LIMA-VERDE et al., 2010).

Embora a importância do FSH no controle da foliculogênese tenha sido bem

estabelecida, a associação da androstenediona ao FSH (seja em concentrações

crescentes ou fixa) ainda não foi testada no cultivo in vitro de folículos pré-antrais

isolados caprinos. Sendo assim, o presente estudo demonstra pela primeira vez a

influência da androstenediona associada ou não ao FSH, em diferentes concentrações,

no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos e os seus efeitos sobre a produção de

estradiol.

52

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

Diante do exposto, foram formuladas as seguintes hipóteses científicas:

A androstenediona associada ou não ao FSH, em diferentes formas de adição,

influenciam positivamente na manutenção da sobrevivência folicular e no

crescimento de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro,

permitindo que seus oócitos se tornem meioticamente competentes.

A androstenediona associada ou não ao FSH, em diferentes concentrações,

estimula a produção de estradiol a partir de folículos pré-antrais caprinos

isolados cultivados in vitro.

53

5. OBJETIVOS

5.1 GERAL

Avaliar os efeitos da adição da androstenediona associada ou não a

concentrações crescentes ou fixa do FSH sobre o cultivo in vitro de folículos

secundários isolados a partir de ovários caprinos.

5.2 ESPECÍFICOS

Investigar o efeito da adição de androstenediona (10 ng/ml) associada ou não a

concentrações crescentes de FSH (dia 0 ao dia 6= 100 ng/ml; dia 6 ao dia 12=

500 ng/ml; dia 12 ao dia 18= 1000 ng/ml) ou fixa (100 ng/ml), sobre as taxas de

sobrevivência folicular, formação de antro e maturação oocitária a partir de

folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro.

Avaliar se a adição de androstenediona, associada ou não ao FSH, afeta as

concentrações de estradiol e androstenediona durante o cultivo in vitro de

folículos pré-antrais caprinos isolados.

54

6. CAPÍTULO 2

Accelerated follicle growth during the culture of isolated caprine preantral follicles

is detrimental to follicular survival and oocyte meiotic resumption

Crescimento folicular acelerado durante o cultivo de folículos pré-antrais caprinos

isolados é prejudicial na sobrevivência folicular e retomada da meiose

Artigo submetido ao periódico: Theriogenology

Em: Novembro de 2015

Qualis: A2

55

Accelerated follicle growth during the culture of isolated caprine preantral follicles

is detrimental to follicular survival and oocyte meiotic

Livia Brunetti Apollonia, Jamily Bezerra Brunoa, Benner Geraldo Alvesa, Anna Clara

Accioly Ferreiraa, Victor Macêdo Paesa, Jesus de los Reyes Cadenas Morenoa,

Francisco Léo Nascimento de Aguiara, Felipe Zandonadi Brandãob, Johan Smitzc, Gary

Apgard, José Ricardo de Figueiredoa

a Laboratory of Manipulation of Oocyte Enclosed in Preantral Follicles – LAMOFOPA,

Faculty of Veterinary, University of Ceará, Fortaleza, Brazil

b Department of Animal Reproduction, Faculty of Veterinary, Federal University

Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil

c Follicles Biology Laboratory, Center for Reproductive Medicine, UZ Brussel,

Laarbeeklaan 101, B-1090 Brussels, Belgium

d Department of Animal Science, Food and Nutrition, Southern Illinois University-

Carbondale, USA.

* Corresponding author. Tel: +55 85 3101 9852; Fax: + 55 85 3101-9840.

E-mail address: [email protected] (José Ricardo de Figueiredo).

56

ABSTRACT

This study investigated the effect of androstenedione (A4) alone or in association with

different concentrations of bovine recombinant FSH on the in vitro culture of isolated

goat preantral follicles. Follicles were mechanically isolated from the ovarian tissue and

cultured for 18 days in 훼-MEM supplemented or not with A4 (10 ng/ml) alone or in

association with fixed (A4+FixFSH: 100 ng/ml) or sequential (A4+SeqFSH: Day 0: 100

ng/ml; Day 6: 500 ng/ml; Day 12: 1000 ng/ml) concentrations of FSH. After 18 days,

the oocytes were recovered for in vitro maturation and fluorescence analysis. At day 18

of culture, only A4+SeqFSH treatment showed a lower (P < 0.05) rate of intact follicles,

survival probability and meiotic resumption, as well as higher (P < 0.05) percentage of

degeneration and/or extrusion after antrum formation. Take together, these results

showed a positive correlation between fast-growing follicles and follicles that

degenerated and/or extruded after antrum formation. When compared to control, the

addition of A4 alone or in association of FSH did not increase (P > 0.05) the estradiol

production or androstenedione levels on Day 6. However on Day 18, the

androstenedione levels was significantly lower in A4+SeqFSH treatment when

compared to A4 alone or to A4+FixFSH treatments, while the estradiol production did

not differ (P > 0.05). In summary, this study demonstrated that accelerated follicle

growth negatively impacted the morphology of caprine preantral follicle cultured in

vitro. In addition, the association of androstenedione with increasing concentration of

FSH was detrimental to follicular survival and development.

Keywords: secondary follicles, goat, FSH, androgens, growth rates.

57

1. Introduction

Ovarian function depends on multiple integrated processes that culminate in the

production of competent oocytes during folliculogenesis. FSH plays an important role in

folliculogenesis [1]. Regardless the FSH addition in in vitro culture media (i.e., fixed or

increased concentrations) [2,3] it provides for the maintenance of follicular growth and

survival as well as stimulates steroidogenesis [4]. Among the steroidal hormones, addition

of androgens (androstenedione, dihidroandrostenediona, dihydrotestosterone and

testosterone) promotes follicular growth in different species [5-7] through the stimulation

of their receptors. Androgen receptors are located in the cytoplasm of granulosa cells

(GC), theca cells (TC) and oocytes [8] of preantral follicles [9-11]; and antral [9, 10, 12],

being the GC more responsive to androgens [13].

An important tool to investigate in vitro folliculogenesis, including the effect of

different substances, is the media culture of preantral follicles [14]. Studies evaluating the

role of androstenedione on in vitro follicule culture have been shown controversial with

findings being both concentration-dependent and species specific. For example, addition

of androstenedione in a dose dependent manner reduced the survival rate of isolated mice

preantral follicles [15]. On the other hand, culture of isolated swine preantral follicles in

medium containing androstenedione improved antrum formation rates [16]. In another

study, after in vitro culture of goat preantral follicles (primordial and primary) enclosed in

ovarian tissue, androstenedione associated with FSH maintained the percentage of normal

follicles during the culture [17]. However, the effect of androstenedione and FSH on in

vitro culture of isolated secondary preantral follicles has not been investigated in caprines.

It is well known that goats are spread worldwide having social and economic importance

in many countries. In addition, the goat has been proposed as an important animal model

for women [18].

58

Therefore, the objective of this study was to investigate the effect of

androstenedione addition, associated or not with FSH (fixed or sequencial concentration)

to the culture medium, evaluating the following endpoints: (i) folicular survival and

growth, (ii) antrum formation, (iii) hormonal production (androstenedione and estradiol),

and (iv) meiotic resumption of caprine isolated secondary follicles.

2. Material and Methods

2.1 Chemicals

Unless stated otherwise, all the chemicals and culture media used for this study

were purchased from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA).

2.2 Source of ovaries

Ovaries (n= 60) from 30 adults (between 1 and 3 years old), non-pregnant,

mixed-breed goats (Capra hircus) were collected at a slaughterhouse. Immediately

postmortem, pairs of ovaries were washed in 70% alcohol for 10 seconds and then twice

in minimum essential medium plus HEPES (MEM-HEPES) supplemented with 100

µg/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin. After which, the ovaries were

transported within 4 h to the laboratory in MEM-HEPES at 4°C [19].

2.3 Isolation and selection of preantral follicles

In the laboratory, the surrounding fatty tissue and ligaments were stripped from

the ovaries. Ovarian cortical slices (1–2 mm thick) were excised from the ovarian

surface using a surgical blade under sterile conditions and subsequently placed in

holding medium consisting of MEM-HEPES with antibiotics. Preantral follicles,

approximately 150-200 µm in diameter without antral cavities (secondary follicles),

59

were visualized under a stereomicroscope (model SMZ 645; Nikon, Tokyo, Japan) and

mechanically isolated by using 26-gauge (26 G) needles. Approximately 10 secondary

follicles were isolated from each ovarian pair. These follicles were then transferred to

100 µL droplets containing basic culture medium for the evaluation of quality. Only

secondary follicles that displayed the following characteristics were selected for culture:

an intact basement membrane, two or more layers of granulosa cells and a visible

oocyte that was round and centrally located within the follicle, without any dark

cytoplasm. Then, isolated follicles were pooled and randomly allocated to the

treatments [20].

2.4 In vitro culture of preantral follicles

After selection, the follicles were individually cultured (one follicle per droplet)

in 100 µL droplets of culture medium under mineral oil in Petri dishes (60x15 mm;

Corning, Sarstedt, Newton, NC, USA). The medium used was α-MEM (pH 7.2– 7.4;

Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) supplemented with 3.0 mg/mL bovine serum

albumin (BSA), 10 ng/mL insulin, 5.5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL selenium, 2 mM

glutamine, 2 mM hypoxanthine and 50 μg/mL ascorbic acid, here in after referred as α-

MEM+ [20]. Incubation was conducted at 39°C and 5% CO2 in air for 18 days. Fresh

media were prepared and incubated for 1 h prior to use, with 60 μL medium being

changed in each drop every 2 days. The experimental conditions were replicated four

times and at least 40 follicles were used per treatment.

2.5 Experimental design

Follicles were randomly assigned to four different treatments as follows: 1) α-

MEM+ alone (control group); 2) 훼-MEM+ supplemented with androstenedione (A4: 10

ng/ml); 3) α-MEM+ plus A4 (10 ng/ml) associated with recombinant bovine FSH -

60

rbFSH (Nanocore, São Paulo, Brazil) in increasing concentrations (Sequential FSH:

from day 0 to day 6 = 100 ng/mL; from day 6 to day 12 = 500 ng/mL; from day 12 to

day 18 = 1000 ng/mL; A4+SeqFSH); 4) α-MEM+ plus A4 (10 ng/ml) associated with a

fixed concentration of rbFSH (FixFSH: 100 ng/ml; A4+FixFSH). Concentrations of A4

and rbFSH were chosen based on previous work performed by our group (A4: [17];

SeqFSH: [3]; FixFSH: [2]).

2.6 Morphological evaluation of follicle development

Follicles were evaluated during culture (days 0, 6, 12 and 18) to the following

end-points: integrity of the basement membrane, morphology of the oocyte and

surrounding granulosa cells, and morphological signs of degeneration such as darkness.

The percentage of morphologically intact follicles was calculated by excluding the

follicles which experienced rupture of the basement membrane and had degenerated .

The percentage of degenerated follicles was calculated using the number of follicles that

exhibited dark and/or misshapen cytoplasm of the oocyte and surrounding cumulus

cells. Then, the percentage of extruded follicles was calculated using the number of

follicles that showed rupture of the basement membrane. The follicular diameter was

measured only in morphologically intact follicles every 6 days with the aid of an ocular

micrometer attached to a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan;

magnification: X 100). Two perpendicular diameters were recorded for each follicle and

the average of these two values was reported as the follicular diameter. To evaluate

daily follicular growth, the mean increase in follicular diameter was calculated as

follows: the diameter of morphologically intact follicles at day 18 minus their diameter

at day 0, divided by 18 days. In vitro cultured follicles were divided into three growing

categories: (i) non-growing: follicles that didn’t grow during the culture; (ii) slow-

growing: follicles with a daily growth between 0.1 - 7.0 휇m/day; and (iii) fast-growing:

61

follicles with a daily growth between 7.1 - 34 휇m/day. Also, antral cavity formation was

defined as a visible translucent cavity within the granulosa cell layers.

2.7 In vitro maturation

At the end of the culture period, all the morphologically intact follicles were

carefully and mechanically opened with 26 G needles under a stereomicroscope for

oocyte recovery. Only oocytes (≥ 110 μm) with homogeneous cytoplasm and

surrounded by at least one compact layer of cumulus cells were selected for in vitro

maturation (IVM). The oocyte recovery rate was calculated by the ratio between the

number of oocytes ≥ 110 μm (including zona pellucida) and the total number of normal

and degenerated oocytes (smaller and larger than 110 휇 m). The cumulus-oocyte

complexes were selected and washed three times in maturation medium consisting of

TCM-199 supplemented with 1% BSA, 5 μg/ml of luteinizing hormone (LH), 0.5

μ g/mL of rbFSH, 10 ng/mL of epidermal growth factor (EGF), 50 ng/mL of

recombinant insuline-like growth factor (IGF), 100 μM of cysteamine, 1 mM of

pyruvate, and 1μg/mL of estradiol [21]. After washing, oocytes were transferred to 100

µL drops of maturation medium under mineral oil and then incubated for 32 hours at

39oC with 5% CO2 in air.

2.8 Assessment of oocyte viability and chromatin configuration

Fluorescence microscopy was used to analyze the viability of the oocytes from

the caprine follicles classified as morphologically normal under the stereomicroscope,

after culture. Briefly, the oocytes were incubated in 5.5 μL calcein-AM, 88.5 μ l

ethidium homodimer-1 (Molecular Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 5.0 μL

Hoechst 33342 and 1.0 μL glutaraldehyde (Sigma, Deisenhofen, Germany) at 37◦C, for

30 min.

62

After the incubation, oocytes were washed three times in TCM 199 HEPES and

placed in 3 μL droplets of mounting medium (6.25 mL of PBS, 6.25 mL of glycerol and

6.25 휇L Hoechst), covered with cover slip on slide and evaluated under a fluorescence

microscope (Nikon, Eclipse 80i, Tokyo, Japan). Oocytes with cytoplasm stained by

calcein-AM (green) were classified as viable and those that had chromatin marked with

ethidium homodimer-1 (red) were considered to be degenerated. Hoechst was used to

analyze the oocyte chromatin configuration for intact germinal vesicles (GV), meiotic

resumption (germinal-vesicle breakdown (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II

(MII).

2.9 Androstenedione and Estradiol Assay

To evaluate the relationship between follicle development and hormone

production, 60 μL of culture medium from all the follicles were collected every 6 days

(Days 6, 12 and 18) to quantify androstenedione (A4) and estradiol (E2) production.

Androstenedione was measured by direct radioimmunoassay from DIAsource

Immunoassay (androstenedione-RIA-CT, DIASource Europe, Nivelles, Belgium) with a

sensitivity of 70 ng/l and a total imprecision profile (CV = 10%) for concentrations

between 100 and 7,000 ng/l. Hormone Assay for E2 (DSL4800) secretion was

determined by double antibody radioimmunoassay (RIA) using a commercial kit

Immunotech (catalog No: DSL4800, IMMUNOTECH s.r.o. - Radiová 1 - 102 27

Prague 10 - Czech Republic). The analytical sensitivity of the assay was 2.2 pg/mL

(assay range, 2.2-750 pg/ml). Intra-assay: samples were assayed 12 times in the same

run. The coefficients of variation were ≤ 8.9%. Inter-assay: samples were assayed in

duplicate in 8 different runs. The coefficients of variation were ≤ 12.2%. All samples

were assayed in the same RIA to eliminate inter- assay variability.

63

2.10 Statistical analysis

All statistical analyses were performed using Sigma Plot 11 (Systat Software

Inc., USA). Data that were not normally distributed (Shapiro-Wilk test) were submitted

to logarithmic transformation. Follicle and oocyte diameter, and follicular growth

among treatments were compared by Kruskal-Wallis test, while the Wilcoxon signed

test was used to analyze the effect of treatment within days of culture. The proportion of

follicular variables (intact, degenerated, extruded, antrum formation, and meiotic

resumption) among treatments and days of culture were analyzed by Fisher’s exact test.

A linear regression analysis was performed to evaluate the association of oocyte

diameter with chromatin configuration and the relationship of follicular growth and

antrum phenotype, while the logistic regression analyzed the association between

follicle diameter and antrum formation. The follicle survival probability throughout the

culture was plotted using Kaplan-Meier method and the difference among survival

curves (treatments) was evaluated using log rank test. Data are presented as mean

(±SEM) and percentage and the results were considered different when P < 0.05.

Probability values > 0.05 and ≤ 0.1 indicated that a difference approached significance.

3. Results

3.1 Follicular morphology

A total of 169 follicles were selected for in vitro culture with a mean of 42.2 ±

0.6 follicles analyzed per treatment. The effect of A4 (10 ng/mL) associated or not with

different concentrations of FSH on the percentage of intact follicles was assessed over

18 days of culture (Fig. 1). Except for the control, the percentage of intact follicle

decreased (P < 0.05) from day 0 to day 18 and tended to decrease (P < 0.08) only in the

A4+SeqFSH treatment from day 12 to day 18. In addition, this treatment was lower on

64

day 18 compared to the control (P < 0.05). The effect of treatments on follicle survival

probability was evaluated by Kaplan Meier method (Fig. 2). The only treatment that

showed a reduction (73.8%; P < 0.05) in the follicle survival on Day 18 was the

A4+SeqFSH when compared to the control group.

The rate of degenerated follicles was similar (P > 0.05) among the treatments

(Fig. 3). However, from Day 12 to Day 18 the A4+SeqFSH treatment showed an

increase (P < 0.05) in the percentage (11.9%) of degenerated follicles. The percentage

of follicular extrusion is shown (Fig. 4). No difference was observed among treatments

(P > 0.05). However, treatments containing FSH increased (P < 0.05) the percentage of

extruded follicles from day 0 to day 18.

3.2 Follicular diameter and growth rate

The average values of follicular diameter during in vitro culture of isolated

preantral follicles is shown (Table 1). Regardless of the treatment, a progressive

increase (P < 0.05) in follicular diameter throughout the culture period was observed.

However, the follicle diameter was similar (P > 0.05) among treatments irrespective of

the culture period. The daily growth rate is shown (Table 2), and the A4+SeqFSH

treatment tended (P < 0.09) to be higher than control group in the second third of

culture perdiod (D6-D12). Moreover, only A4+SeqFSH treatment the growth rate

tended to be higher (P < 0.07) in the second third compared to the first third of culture.

The frequency distributions of follicles classified according to growing rates is shown

(Fig. 5A,B). We observed that the A4+SeqFSH treatment presented a reduction (P <

0.05) in the percentage of slow-growing follicles compared to control and A4

treatments. Additionally, FSH treatments showed a higher (P > 0.05) percentage of fast

growing follicles compared to control (Fig. 5B).

65

3.3 Antrum formation

Regardless of treatment, the percentage of antrum formation increased (P <

0.05) from Day 0 until Day 12 of culture and remained constant until the end of the

culture period (data not shown). A positive correlation between antrum formation and

follicular diameter during in vitro culture was observed by logistic regression analysis

(Fig. 6). When taken together, the mean growth rate of follicles that formed antrum

followed by degeneration and extrusion was 1.8-fold superior than follicles that

maintained the antrum (Fig. 7). When the treatments were compared to each other using

this end points (Fig. 8), the A4+SeqFSH had a decrease (P < 0.05) in the percentage of

follicles that maintained the antrum but an increase (P < 0.05) in the percentage of

follicles that degenerated or extruded after antrum formation compared control group.

These results could be confirmed by the positive association between antrum formation

phenotypes and follicular growth rates (Fig. 9).

3.4 Oocyte parameters and chromatin configuration

No difference in the oocyte recovery rate (≥ 110 µm), oocyte diameter (µm) and

oocyte viability (%) were observed among the treatments (P > 0.05) after 18 days of

culture (data not shown). The A4+SeqFSH treatment had a percentage of meiotic

resumption lower (P < 0.05) than the control group and, this treatment tended to differ

(P < 0.06) from A4+FixFSH treatment. Metaphase II (MII) was observed only in the

control and A4+FixFSH treatments (Fig. 10). Finally, as expected a positive

relationship between chromatin configuration and oocyte diameter was observed using

a regression analysis (Fig. 11).

3.5 Hormonal production

66

Regardless of treatment, androstenedione concentrations were similar (P > 0.05)

between 6 and 18 days of culture. However, at 18 days there was a decrease in

androstenedione levels of A4+SeqFSH compared with A4 (tended to differ; P < 0.07)

and A4+FixFSH treatments (P < 0.05; Fig. 12). No difference (P > 0.05) was observed

among treatments on the estradiol concentration during the in vitro culture (data not

shown).

4. Discussion

This study demonstrated for the first time the effect of androstenedione, in

association or not with FSH (different concentrations), on the in vitro culture of isolated

caprine secondary follicles. In general, we observed that androstenedione, associated

with increasing concentrations of FSH (A4+SeqFSH) hampered the follicular

development and survival in vitro.

Previous studies in caprines, have shown that the presence of increasing

concentrations of FSH the addition of others substances such as activin A [22]

epidermal growth factor [23] and IGF-II [24] did not impair follicular development and

improved meiosis resumption of the oocytes recovered from in vitro growth of preantral

follicles. Unlike the positive effects of those substances associated with increasing FSH

concentrations, in our study the androstenedione caused a deleterious effect on the in

vitro culture of preantral follicles, when associated with increasing concentrations of

FSH and no effects when associated with fixed FSH concentration. Even though we

expected positive results, these findings clearly show the timeliness of this study.

In our study, we observed that the percentage of morphologically intact follicles,

as well as the follicular survival probability decreased, whereas the rate of degenerated

follicles increased at the end of culture in the A4+SeqFSH treatment. Several authors

67

have described that during the in vitro culture of preantral follicles, the addition of FSH

either in increasing concentrations [3] or in decreasing concentrations associated to

dihydrotestosterone [7] increased follicle survival. It is well known that follicular

growth and atresia depends on a delicate balance between gonadotropin and paracrine

factors [25]. Therefore, we suggest that increasing concentrations of FSH associated

with androstenedione may cause a toxic effect, compromising the follicular physiology

through the inappropriate proliferation of GC [26].

In relation to extrusion rates, FSH treatments (fixed and sequential) presented an

increase of the rate of extruded follicles between Day 0 and Day18. It is known that

androgens increase the expression of FSH receptor (FSHR) in the GC [27,28]. Thus, we

propose that the association of androstenedione with FSH may have potentiated the

action of this hormone in the intrafollicular environment, hyperstimulating the

proliferation of GC [26] and consequently, causing the rupture of basal membrane and

releasing the cumulus-oocyte complexes. These findings are supported by the fact that

FSH treatments presented higher proportion of follicles in fast-growing category than

control group. Additionally, using the linear regression analysis it was possible to

observe a correlation between fast-growing follicles and follicles that degenerated

and/or extruded after antrum formation, implying that follicles require a slow growth

rate to maintain follicular viability.

In the present study, the A4+SeqFSH treatment was the only one that had lower

percentage of follicles that formed antrum and remained intact until the end of the

culture when compared to control. This fact can be explained by the high rates of

degeneration and/or extrusion after antrum formation observed in this treatment. Other

study tested the effect of different concentrations of androstenedione (10 and 100

ng/ml) in medium FSH-free on the in vitro culture of bovine early antral follicles and

68

demonstrated that both concentrations were able to maintain the antrum intact until the

end of culture [29].

This is the first study that evaluated the production of androstenedione during

the in vitro culture of goat preantral follicles. Despite the difference in androstenedione

concentrations at the onset of culture (0 ng/ml-control vs 10 ng/ml-A4 treatments), the

androstenedione levels on Day 6 were equivalent between control and A4 treatments. In

other words, the concentration of androstenedione was reduced at least 66 times in A4

treatments indicating a high rate of metabolization of androstenedione by cultured

follicles in these treatments. In addition, follicles cultured in the medium containing low

insulin were able to reduce adequate levels of androstenedione, resulting in equivalent

production of estradiol both on Day 6 and 18 of culture. This clearly shows that the

excessive metabolization of androstenedione was not used for estradiol production.

During the steroidogenesis process, androstenedione can be converted either to: (i)

testosterone by 17훽-HSD (17훽-hydroxisteroid dehydrogenase) which itself can then be

aromatised into estradiol by P450arom (CYP19) in CG (A4TE2), (ii) estrone by

P450arom (CYP19) for subsequent conversion in estradiol by 17훽-HSD in CG (A4

E1 E2), or (iii) testosterone by 17훽-HSD in TC which itself can then be converted

into dihydrotestosterone by 5훼-reductase in GC (A4 T DHT) [8]. Therefore, in our

study, we suggest that the major pathway used by the follicles cultured in A4 treatments

was A4DHT since the estradiol production did not differ among treatments regardless

the culture period. This assumption can be support by Bogovish and Richards [30]

which demonstrated the ability of GC from rodents to generate dihydrotestosterone

when treated with androstenedione. Moreover, WU et al. [31] demonstrated that the

addition of testosterone in medium containing FSH or not, promoted a stimulatory

effect of CYP19 in mice GC, which correlated with estradiol production.

69

Similar to the other studied end points the A4+SeqFSH treatment also showed

lower rates of meiosis resumption than control after oocyte in vitro maturation. The

control medium used in our experiment was previously developed by our team [20] that

defined the appropriated insulin concentration (10 ng/ml). Insulin is a major factor

related to follicular survival, growth and production of steroids hormones [20]. Like

androgens [27], studies have reported that insulin increases the expression of FSHR

[32,33]. We believe that androstenedione associated with insulin enhanced the action of

FSH on the in vitro culture of preantral follicles. The high FSH concentrations used in

the A4+SeqFSH treatment caused a deleterious effect on the meiosis resumption. This

result is in agreement with Sánchez et al. [26] that reported that higher concentrations of

FSH increased the levels of LH receptors (LHR) in mice cumulus cells, compromising

oocyte competence, since the upregulation of LHR is related to low oocyte quality [34].

In our study, surviving follicles were divided into three categories (non-, slow-

and fast-growing follicles), according to their growth rates. The growth rates are an

important parameter to evaluate the efficiency of follicular development in culture.

However, in our study, accelerated follicle growth was correlated with degeneration

and/or extrusion which may allow it to be used as a tool to predict follicular fate in

vitro. On the other hand, Xu et al. [35] demonstrated that in the culture of monkeys

preantral follicles, the production of anti-mullerian hormone (AMH) was correlated

with follicular growth, wherein early AMH production can predict further development

of cultured preantral follicles. Other studies using activin A in the culture medium of

isolated caprine preantral follicles showed that the treatment with the highest percentage

of fast-growing follicles also presented high meiotic resumption rates [23]. Differences

in the species, in the medium composition as well as in the classification on the follicle

growth categories may explain this controversial finding. For instance, in the culture of

isolated caprine preantral follicles, Silva et al. [23] classified fast-growing follicles as

70

those which showed growth rate higher than 10휇m/day, while in our study the follicles

that had a daily growth between 7.1 - 34 휇m/day were classified as fast-growing

follicles. Besides the presence of androstenedione in the majority of our treatments,

Silva et al. [23] used higher insulin concentration in the basic medium. This correlation

indicates that in the presence of androstenedione and increasing concentrations of FSH

the acceleration of follicular development was detrimental for efficiency of caprine

preantral follicles cultured in vitro.

In summary, the addition of androstenedione alone or associated with fixed

concentrations of FSH did not improve either follicular survival, development or steroidal

levels after in vitro culture. Moreover, increasing FSH concentrations associated with

androstenedione had a detrimental effect on follicle survival and oocyte meiotic

resumption. Finally, this study demonstrated that accelerated follicle growth negatively

affected the morphology of caprine preantral follicle cultured in vitro.

Acknowledgments

This work was carried out at the Laboratory of Manipulation of Oocytes and

Ovarian Preantral Follicles (LAMOFOPA), Faculty of Veterinary Medicine of Ceará

State University, Fortaleza, CE, Brazil, and supported by CNPq (407594/2013-2). Livia

Brunetti Apolloni is recipient of a grant from CAPES Brazil and José Ricardo de

Figueiredo is recipient of a grant from CNPq Brazil.

Disclosures

Conflict of interest: None of the authors declared having any conflict of interest.

71

Tables

Table 1.

Mean (± SEM) diameter of normal follicles cultured in vitro for 18 days in medium

containing androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations

of FSH.

Follicular diameter (µm)

Treatments Day 0 Day 6 Day 12 Day 18

Control 202.1 ± 7.4 a 238.7 ± 12.1 b 258.2 ± 13.9 c 289.3 ± 18.8 d

A4 213.4 ± 7.5 a 240.4 ± 11.1 b 271.6 ± 14.0 c 311.5 ± 21.3 d

A4+SeqFSH 202.1 ± 9.4 a 224.8 ± 12.8 b 278.9 ± 18.6 c 317.9 ± 29.9 d

A4+FixFSH 208.5 ± 7.9 a 240.9 ± 11.1 b 293.3 ± 18.4 c 325.9 ± 26.3 d

Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and fixed concentrations of rbFSH.. a,b,c,d Within treatment, uncommon

lowercase letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within the same day

(P > 0.05).

72

Table 2.

Mean (± SEM) daily growth of normal follicles cultured in vitro for 18 days in medium

containing androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations

of FSH.

Follicular growth (µm/day) on different intervals of culture

Treatments D0-D6 D6-D12 D12-D18 Overall (D0-D18)

Control 6.1 ± 1.4 Aa 3.2 ± 1.6 Aa 5.2 ± 1.5 Aa 4.8 ± 0.8 A

A4 4.5 ± 1.4 Aa 5.2 ± 2.0 ABa 6.6 ± 1.6 Aa 5.4 ± 1.1 A

A4+SeqFSH 3.8 ± 2.0 Aa 9.0 ± 2.2 B†b# 6.5 ± 2.7 Aab 6.4 ± 1.5 A

A4+FixFSH 5.4 ± 1.4 Aa 8.7 ± 2.1 ABa 5.4 ± 1.8 Aa 6.5 ± 1.2 A

Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. A,B Within interval time,

uncommon uppercase letters indicate difference (P < 0.05). † Tended to differ from

control group within the same interval of culture (P < 0.09). a,b Within treatment,

uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). # Tended to differ from D0-

D6 interval (P < 0.07).

73

Figures and legends

Figure 1. Percentage of intact follicles during in vitro culture in medium containing

androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations of FSH.

Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. A,B Within day, uncommon

uppercase letters indicate difference (P < 0.05). a,b Within treatment, uncommon

lowercase letters indicate difference (P < 0.05). ‡ Tended to differ from Day 18 (P <

0.08).

74

Figure 2. Follicle survival probability (Kaplan-Meier plot) during in vitro culture in

medium containing androstenedione associated or not with fixed and sequential

concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione;

A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH;

A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. *

Differed from control ( P < 0.05).

75

Figure 3. Percentage of degenerated follicles during in vitro culture in medium

containing androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations

of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+

plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+

plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH.a,b Within treatment,

uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within

the same day (P > 0.05).

76

Figure 4. Percentage of extruded follicles during in vitro culture in medium containing

androstenedione associated or not with fixed and sequential concentrations of FSH.

Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within treatment, uncommon

lowercase letters indicate difference (P < 0.05). Among treatments within the same day

(P > 0.05).

77

Figure 5. (A) Representation of follicles (n = 169) classified according to growth rate in

non-, slow-, and fast-growing. (B) Frequency distributions of follicles in growing

categories during in vitro culture in medium containing androstenedione associated or

not with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+

plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione and sequential

concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. a,b Within the same growing categories, uncommon lowercase

letters indicate difference (P < 0.05). # Tended to differ from control (P < 0.06). †

Tended to differ from control (P < 0.07).

78

Figure 6. Relationship between antrum formation and follicle diameter. Each point of

the graph is a follicle recorded during in vitro culture (n = 169). The follicles evaluated

were defined by binary values (without antrum formation = 0; presence of antrum

formation = 1) to dependent variable. A logistic regression (antrum predicted

probability) is represented by the equation and the black line [Logit P = -1.916 +

(0.0131 × follicle diameter); P < 0.05].

79

Figure 7. Mean (± SEM) daily growth rate of follicles according to their ability to form

antrum and maintain normal morphology. a,b,c Uncommon lowercase letters indicate

difference (P < 0.05).

80

Figure 8. Effect of the addition of androstenedione associated or not with fixed and

sequential concentrations of FSH on the antrum formation and maintenance of normal

morphology. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-

MEM+ plus androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-

MEM+ plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within the same

antrum conditions, uncommon lowercase letters indicate difference (P < 0.05).

81

Figure 9. Relationship between antrum phenotypes conditions and follicular growth.

Each point of graph is a follicle recorded during in vitro culture (n = 169). The follicles

evaluated were defined by binary values (absence of antrum formation = 1; antrum

maintenance = 2; follicles degenerated and/or extruded after antrum formation = 3) to

dependent variable. A linear regression is represented by the equation and the black line

[Antrum formation conditions = 1.955 + (0.0162 × follicular growth); R2 = 0.08; r =

0.28; P < 0.001].

82

Figure 10. Percentage of meiotic resumption, germinal vesicle (GV), germinal

vesicle breakdow (GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II (MII) of oocytes

from preantral follicles cultured in vitro in medium containing androstenedione

associated or not with fixed and sequential concentrations of FSH. Control: α-

MEM+; A4: α-MEM+ plus androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus

androstenedione and sequential concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+

plus androstenedione and fixed concentrations of rbFSH. a,b Within the same

parameter, values with different letters differ (P < 0.05). # Tended to differ from

A4+SeqFSH (P < 0.06).

83

Figure 11. Regression analysis of the chromatin configuration (GV, germinal

vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II)

and oocyte diameter. Each point of graph is a oocyte evaluated after in vitro

maturation (n = 68). The oocytes evaluated were defined by values (GV = 2;

GVBD = 3; MI = 4; and MII = 5) to chromatin configuration (dependent variable).

A linear regression is represented by the equation and the black line [chromatin

configuration = 1.507 + (0.00791 × oocyte diameter); R2 = 0.06; r = 0.24; P < 0.05].

84

Figure 12. Mean (± SEM) androstenedione levels from preantral follicles cultured

in vitro in medium containing androstenedione associated or not with fixed and

sequential concentrations of FSH. Control: α-MEM+; A4: α-MEM+ plus

androstenedione; A4+SeqFSH: α-MEM+ plus androstenedione and sequential

concentrations of rbFSH; A4+FixFSH: α-MEM+ plus androstenedione and fixed

concentrations of rbFSH. A,B,C Within day, uncommon uppercase letters indicate

difference (P < 0.05). † Tended to differ from A4 (P < 0.07). Within treatment

between days (P > 0.05).

85

5. References

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90

7. CONCLUSÕES

Em conclusão, a suplementação do meio base com 10 ng/ml de androstenediona

ou sua associação com uma concentração fixa de FSH (100 ng/ml) não melhorou o

desenvolvimento de folículos pré-antrais isolados caprino, bem como a taxa de

retomada da meiose durante cultivo in vitro. Adicionalmente, associação de

androstenediona a concentrações crescentes de FSH prejudicou as taxas de

sobrevivência, formação de antro e retomada da meiose, além de aumentar a

percentagem de folículos degenerados e/ou extrusos após formação de antro. Além

disso, esta associação demonstrou-se prejudicial ao desenvolvimento folicular, uma vez

que acelerou o crescimento dos folículos pré-antrais cultivados in vitro nas condições

estudadas.

91

8. PERSPECTIVAS

O presente trabalho demonstrou que a adição de 10 ng/ml de androstenediona

associada a concentrações crescentes de FSH foi prejudicial para o desenvolvimento

folicular e maturação oocitária dos folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro.

Assim a etapa seguinte será testar outras concentrações de androstenediona

isoladamente ou em associação a diferentes concentrações fixas de FSH visando o

estabelecimento de um meio de cultivo eficiente para folículos pré-antrais isolados

caprino.

92

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