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UFRRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DISSERTAÇÃO

Estudo Químico e Atividades Biológicas de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).

RENATA DUARTE FERNANDES

2008

Livros Grátis

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ii

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATA


ESTUDO QUÍMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE

Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).


Sob a Orientação do Professor

Dr. Mário Geraldo de Carvalho

Dissertação submetida como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências, no Programa de Pós-Graduação em Química, Área de Concentração em Química de Produtos Naturais

Seropédica, RJ Julho de 2008

iii

UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

547

F363e

T

Fernandes, Renata Duarte, 1977-

Estudo químico e atividades

biológicas de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl. (Ochnaceae) /

Renata Duarte Fernandes – 2008.

118f. : il.

Orientador: Mário Geraldo de

Carvalho.

Dissertação (Mestrado) –

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro, Programa de Pós-

Graduação em Química.

Bibliografia: f. 93-101.

1. Química orgânica - Teses. 2.

Ouratea - Análise – Teses. 3.

Ochnaceae – Análise - Teses. 4.

Produtos naturais – Teses. I.

Carvalho, Mário Geraldo de, 1952- .

II. Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro. Programa de Pós-

Graduação em Química. III. Título.

Bibliotecário: _______________________________ Data: ___/___/______

iv

v

Ao meu marido Cristiano de Deus Correa e À minha mãe Fátima Maria Duarte.

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus; Ao meu marido Cristiano pelo amor, compreensão, incentivo, paciência e carinho; À minha mãe Fátima por acreditar em meus sonhos e me incentivar sempre; Aos meus irmãos Rodrigo e Robson pelo incentivo e ajuda; À minha vovó Maria dos Anjos, aos meus tios pelo carinho e alegria em cada vitória

minha, aos meus primos e meu afilhado; À minha amiga de todas as horas Juliana Moura; Ao Professor Dr. Mário Geraldo de Carvalho pela orientação, ensinamentos, atenção e

paciência; Aos amigos do LQPN-UFRuralRJ: Eduardo (Ceará), Delcí, Marcelo, Maritza,

Virgínia, Luciano, Luiz Roberto (Pilha), Mário Sérgio, pela amizade e pelos momentos de descontração que passamos juntos e à nova integrante da equipe Roberta pelas palavras de incentivo;

Aos alunos de iniciação científica e estagiários do LQPN-UFRuralRJ: Luciane, Claudiana, Daniel, Letícia, Raquel, Tatiane, Verônica, Débora, Ana Paula, Aline e Aline’ pela amizade, convivência agradável e auxílio durante a realização deste trabalho.

A todos os colegas do PPGQO, sem exceção, pelo bom relacionamento durante este período; em especial aos amigos Ari, Cláudio, Janaína, Kênia, Ana Paula, Andréa Janaína, Andréa Rose, Willian, Camilla, Alessandra, André Vinícius, Letícia, Vinícius, Suzana e Raquel; e à Regina pela amizade, incentivo e apoio;

Aos professores do PPGQO pela formação e evolução profissional; À professora Dra. Rosane Nora Castro pelos ensinamentos e auxílio nas análises no

HPLC; Aos funcionários do ICE-UFRRJ, Maurício, Welisson, Carlão, Eli, Fábio, Francês,

Osmar, Rui, Aldir e André; À professora Dra. Maria de Fátima Agra (LTF-UFPB) pela coleta e identificação do

material vegetal; Ao Prof Dr. Edilberto Rocha Silveira do (CENAUREMN/UFC), pela obtenção dos

espectros a 500 MHz; À professora Dra. Alceni Augusta Werle (UFOP) pelas análises no CLAE-EM;

Aos professores Dra. Miliane Moreira Soares de Souza e Dr. Francisco de Assis Baroni (IV/UFRRJ) pelos ensaios de atividade antibacteriana e antifúngico;

Aos professores Dr. Fábio Fagundes Rocha e Frederico Argollo Vanderlinde do Departamento de Ciências Fisiológicas (IB/UFRRJ) pelo teste de toxicidade;

Ao mestrando Élio Barbieri Departamento de Parasitologia Animal-UFRRJ pelo ensaio de atividade inseticida;

À professora Denise Monte Braz do Departamento de Botânica da UFRRJ, pela atenção e auxílio na classificação botânica; Às meninas do alojamento da graduação F1-32 Tati, Marcele, Dailane, Camila, Wilma, Germana, Joyce e Geovana pela amizade, momentos de estudos e de descontração;

Às meninas do alojamento da Pós-graduação Janaína, Vanessa, Renata, Michelle, Daniele, Patrícia, Sabrina, Silvana, Eliane, Kênia, Fabiana, Fernanda, Daniela, Fabíola, Ana Luisa, e Veridiana pelo acolhimento, amizade e bons momentos;

Desde já, à banca examinadora, pelas sugestões e correções sugeridas a este trabalho; À UFRRJ, por mais uma oportunidade e acolhimento; A CNPQ pela concessão da bolsa de estudos; A todos que, de algum modo, me ajudaram na realização deste trabalho.

vii

Quando alguém encontra seu caminho, precisa ter coragem suficiente

para dar passos errados. As decepções, as derrotas, o desânimo

são ferramentas que Deus utiliza para mostrar a estrada.

Paulo Coelho

viii

RESUMO FERNANDES, Renata Duarte. Estudo Químico e Avaliação de Atividades

Biológicas de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. 2008 101f. Dissertação (Mestrado em Química Orgânica). Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

Os metabólitos especiais isolados de galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl., permitiram a comparação com os constituintes de O. hexasperma (St. Hil.) para confirmar a classificação botânica da mesma. Neste trabalho também foram avaliadas algumas atividades biológicas.

As analises das frações obtidas do fracionamento com partição com solventes e técnicas cromatográficas dos extratos preparados com diclorometano e metanol dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. conduziu à identificação de alguns constituintes químicos. Identificaram-se misturas de hidrocarbonetos alifáticos, ácidos alilfáticos, de esteróides (sitosterol, estigmasterol e campesterol), além de três triterpenos, lupeol, α e β amirina, e os flavonóides (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona) e sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosideo. As estruturas foram determinadas através de análise dos dados espectrométricos de IV, RMN de 1H e 13C uni e bidimensional e massas, além de comparação com dados da literatura. A técnica CLAE-EM foi utilizada na análise adicional de duas frações contendo dois biflavonóides e alguns constituintes adicionais. Esta análise permitiu propor a presença de metil-vitexina, orientina, metil-diidroxiflavona, glicopiranosil-flavonas, dimetilagatisflavona, glicopiranosil-prenil-flavonol além da confirmação das duas biflavonas identificadas inicialmente.

Os extratos dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. foram submetidos à avaliação de atividade antibacteriana, antifúngica, inseticida e de toxidez. O crescimento de Escherichia coli e Staphylococcus aureus reduziu com extrato metanólico. As frações contendo as biflavonas foram parcialmente ativas como inseticida contra Musca

domestica. Os extratos apresentaram baixa toxicidade em dose única.

Palavras–chave: Ouratea hexasperma, flavonóides, atividades biológicas.

ix

ABSTRACT FERNANDES, Renata Duarte. Phytochemical Study and Biological Activities

extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. 2008 103f. Dissertation (Magister Scientiae in Organic Chemistry), Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

The specials metabolites isolated from the branches of the Ouratea hexasperma var. planchonii Engl., allowing to the comparison with the chemical constituents from variety Ouratea hexasperma (St. Hil.) to confirm the botanical classification. Some biological activities were evaluated.

The analysis of the fractions from solvents and chromatographic fractionation of the dichloromethane and methanolic extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. led to the identification of some chemical constituents. This procedure led to identification of aliphatics compounds mixture, aliphatic alcohol mixture, steroids mixture (sitosterol, stigmasterol and campesterol), three triterpenes, lupeol e α-amiryn e β-amiryn, and the biflavonoids (7”-O-methylagathisflavone and agathisflavone) and sitosterol-3-O-β-D-glycopyranoside. The structures were determined by IR, de 1H (1D e 2D) e 13C (BBD e DEPT) NMR spectral data analysis and comparison with literature values. The HPLC-MS were used in the analysis of two fractions containing the these two biflavones and some additional compounds. This analysis led us to identify the presence of methyl-vitexin, orientin, methyl-dihydroxyflavone, glycopiranosil-flavones, dimethylagathisflavone and glycopyranosil-prenyl-dihydroxyflavonol besides the confirmation of these two biflavonoids.

The extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. were submitted on evaluations of the antibacterial, antifungal, insecticide and toxicity activities. The Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth was inhibited with methanolic extract. The fractions containing the biflavonoids were partially active as insecticide against Musca domestica. The extracts presented low toxicity on unique dose.

Key words: Ouratea hexasperma, flavonoids, biologicals activities.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Triflavonóides isolados no Gênero Ochna 3

Figura 2: Biflavonóides e dímeros de chalconas isolados dos Gêneros Ochna e Lophira. 4

Figura 3: Flavonóides e chalconas isolados do gênero Luxemburgia 5

Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea 7

Figura 5: Outras classes de substâncias isoladas nos gêneros Ouratea. 9

Figura 6: Diferenças morfológicas entre as folhas de Ouratea hexasperma. 10

Figura 7: Dímeros de flavonóides 11

Figura 8: Constituintes químicos isolados neste trabalho 17

Figura 9: Mecanismo proposto da reação de metilação com diazometano. 23

Figura 10: Espectro de IV do material alifático de O. hexasperma var. planchonii Engl.. 25

Figura 11: Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do material alifático. 26

Figura 12: Espectro de IV de 1 27

Figura 13: Espetro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) de 1. 28

Figura 14: Cromatograma de 1. 28

Figura 15: Espectro de massas de 1 29

Figura 16: RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) da mistura de esteróides, 2 (a, b e c) 30

Figura 17: Cromatograma da mistura dos esteróides 2 (a, b e c) 30

Figura 18a : Espetro de massas de 2 (a) comparado com a biblioteca do aparelho. 31

Figura 18b : Espetro de massas de 2 (b) comparado com a biblioteca do aparelho. 32

Figura 18c : Espetro de massas de 2 (c) comparado com a biblioteca do aparelho. 33

Figura 19: Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) de 3 (a, b e c). 34

Figura 20: Espetro de massas de 3 (a) comparado com a biblioteca do aparelho. 35

Figura 21: Espetro de massas de 3 (b e c) comparado com a biblioteca do aparelho 35


Figura 23: Espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) de 4 39

Figura 24: Espectro de 1H-1H-COSY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4. 40

Figura 25: Espectro de 1H-1H-NOESY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4. 41

xi

Figura 26: Ampliação do Espectro de 1H-1H-NOESY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4. 42


Figura 28: RMN de C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4 44

Figura 29: Ampliação(180-187 ppm) do Espectro de RMN de 13C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4

44

Figura 30: Ampliação (156-166 ppm) do Espectro de RMN de 13C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4

45

Figura 31: Espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4. 45

Figura 32: Ampliação do espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4. 46

Figura 33: Ampliação do espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4 46






Figura 39: Espectro de HSQC (D3CCOCD3) da substância 4 50

Figura 40: Espectro de IV de 5. 51

Figura 41: Espectro de RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da mistura dos biflavonóides 4 e 5.

53

Figura 42: Ampliação do espectro (6.0-8.5 ppm) de RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da mistura dos biflavonóides 4 e 5. 53

Figura 43: Espectro de RMN de 13C (50 MHz, D3CCOCD3) da mistura dos biflavonóides 4 e 5.

54

Figura 44: Ampliação do espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do derivado 4a.

54

Figura 45: Cromatograma obtido em CLAE de 4 55

Figura 46: Cromatograma obtido em CLAE da mistura 4 e 5. 55

Figura 47: Espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do derivado 4a. 58


59

Figura 49: Ampliação do espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do derivado 4a..

59

xii

Figura 50: Espectro de 1H-1H-COSY (500MHz, D3CCOD3) de 4a 60

Figura 51: Espectro de NOESY de 4a. 60

Figura 52: Ampliação do espectro de NOESY de 4a. 61

Figura 53: Espetro de 13C (125MHZ, D3CCOD3) de 4a. 61

Figura 54: Ampliação do espectro de 13C (125MHZ, D3CCOCD3)de 4a. 62

Figura 55: Espectro de HMBC (D3COD3) da substância 4. 63

Figura 56: Espectro de HSQC (D3COD3) da substância 4. 64

Figura 57: Espectro de IV da substância 6 66

Figura 58: RMN de 1H da substância 6 68

Figura 59: RMN de 13C da substância 6 69

Figura 60: Ampliação do RMN de 13C(125 Hz, DMSO-d6) da substância 6 70

Figura 61: CLAE da fração OSPGMC. 71

Figura 62: CLAE da fração OSPMC1-6p 72

Figura 63: RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da fração OSPGMC 73

Figura 64: RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da fração OSPGMC1.6p 73

Figura 65: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da fração OSPGMC

74

Figura 66: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGC. 76

Figura 67: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da fração OSPGMC1.6p

77

Figura 68: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGCM1.6p. 79

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Ocorrência de Agatisflavonas e derivados em espécies vegetais. 12

Tabela 2: Divisões Botânicas das espécies que onde há ocorrência de agatisflavonas e derivados. 15

Tabela 3: Registro dos resultados da prospecção química do extrato metanólico de O.

hexasperma var. planchonii Engl. 24

Tabela 4. Dados de RMN 1H e 13C (D3CCOCD3,1H e D3CSOCD3,

13C) da substâncias 4. 38

Tabela 5. Dados de RMN 1H (200 MHz) e 13C (50 MHz) em Metanol-D, (AGRAWAL, 1989) da substância 5 (agatisflavona).

52

Tabela 6: Dados de RMN 1H (200 MHz) e 13C (50 MHz) da substância 4 (MOREIRA et

al., 1999) com o derivado 4a. 57

Tabela 7: Dados de RMN de 1H e 13C da substância 6 67

Tabela 8 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre Musca domestica após 24 horas da aplicação.

90


90

xiv

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Marcha para o isolamento das substâncias dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii engl. 21

Esquema 2: Propostas de estruturas compatíveis com os valores de m/z detectados na análise de CLAE-EM

75


78

Esquema 4: Biossíntese de ácidos graxos (adaptado de DEWICK, 2002) 80

Esquema 5: Proposta de a-oxidações em aácidos graxos (HARWOOD, 1997). 81

Esquema 6: Proposta biogenética para os esteróides (Adaptado de MANN, 1994). 82

Esquema 7: Proposta biogenética para os terpenos lupeol e α-amirina. (Adaptado de MANN, 1994; DEWICK, 2002).

83

Esquema 8: Proposta biogenética para as flavonas (DEWICK, 2002) e biflavonas (MOREIRA, 1994)

84

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

1D Unidimensional 2D Bidimensional δΗ Deslocamento Químico de Hidrogênio (ppm) δC Deslocamento Químico de Carbono (ppm) ν Estiramento δ Deslocamento químico Acetona-D6 Acetona deuterada CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica CCF Cromatografia em Camada Fina CCP Cromatografia em Camada Preparativa CG-EM Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência cm Centímetro COSY COrrelation SpectroscopY d Dubleto dd Duplo Dubleto DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado EM Espectrometria de Massas HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz Hertz IV Infravermelho J Constante de acoplamento em hertz λ comprimento de onda µm micrômetro m multipleto M+. pico do íon molecular positivo MHz Mega Hertz m/z relação massa/carga nm nanómetro OspGD Extrato diclometano dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl. OspGM Extrato metanólico dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl. NOESY Nuclear Overhauser Experiment Spectroscopy P.F. ponto de fusão ppm parte por milhão q quarteto RF Fator de Retenção RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 s singleto sl singleto largo t tripleto TR Tempo de Retenção TMS tetrametilsilano

OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.

xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

Objetivos 2

2. REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1. Generalidades Sobre a Família Ochnaceae e o Gênero Ouratea 3

2.2 Classificação botânica de O. hexasperma (St. Hill) Bail var. hexasperma e O.


2.3. Estudo Químico Realizado com Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail 10

2.4. Biflavonóides 10

2.4.1. Agatisflavona e derivados 12

3. CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE O. hexasperma var. planchonii Engl. 16

4. PARTE EXPERIMENTAL 18

4.1. Equipamentos e Reagentes 18

4.2. Material vegetal 18

4.3. Obtenção dos extratos brutos 19

4.4. Prospecção Química do Extrato Metanólico 19

4.5. Isolamento e Purificação dos Constituintes dos Galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl.

19

4.5.1. Extrato com diclorometano 19

4.5.2. Extrato com metanol 20

4.6. Derivação 22

4.6.1. Metilação com diazometano 22

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 24

5.1. Prospecção Química do extrato metanólico 24

5.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Isolados de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl.

25

5.2.1. Alcanos 25

5.2.2 Substância 1 27

5.2.3. Substâncias 2 (a, b e c) 29

xvii


5.2.5. Substância 4 36


5.2.7 Derivado 4a 56


5.3. ANÁLISE COM CLAE DAS FRAÇÕES OSPGMC E OSPMC-16P. 71

5.4. Propostas Biossintéticas para os constituintes isolados de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl.

80

5.4.1. Ácidos graxos 80

5.4.2. Esteróides 82

5.4.3. Terpenos 83

5.4.4. Biflavonóides 84

5.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS 85

5.5.1. Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Extrato Metanólico de Ouratea


5.5.2. Verificação de atividade antifúngica do Extrato Metanólico de Ouratea


5.5.3. Avaliação da Atividade Inseticida contra Musca doméstica 88

5.5.4. Avaliação da toxidez do extrato metanólico em Mus musculus. 90

6. CONCLUSÕES 92

7. REFERÊNCIAS 93

1

1. INTRODUÇÃO

Os produtos naturais vêm sendo utilizados pela humanidade como remédio desde os primórdios. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais.

O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza, pelos povos primitivos e pelos indígenas, pode ser considerado fator fundamental para o descobrimento de substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. A convivência e o aprendizado com os mais diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento da pesquisa sobre utilização de substâncias naturais para a cura de doenças ou criar produtos em benefício do bem estar do homem. Há relatos, por exemplo, do uso de plantas com finalidades terapêuticas por volta de 3.000 a.C. na obra Pen Ts’ao do chinês Shen Nung (VEIGA JR. et al, 2005). As pesquisas na área da química de produtos naturais permitiram a descoberta de muitos modelos moleculares que fundamentaram estudos de relação estrutura-atividade (SAR) e inspiraram o desenvolvimento da síntese orgânica clássica. (VIEGAS JR. et al, 2006). No início, os químicos estudavam plantas consagradas pelo uso popular, geralmente incorporadas às farmacopéias da época, limitando-se ao isolamento e à determinação estrutural de substâncias ativas (YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Dada a importância das plantas para a medicina da época, a Química e a Medicina passaram a ter uma estreita relação, o que permitiu um rápido desenvolvimento de seus campos específicos (YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Desta forma, muitas substâncias ativas foram conhecidas e introduzidas na terapêutica, permanecendo até hoje como medicamentos. Um exemplo importante do desenvolvimento dos fármacos a partir de produtos naturais de plantas foi o descobrimento dos salicilatos obtidos de Salix alba.

A natureza sempre despertou no homem um fascínio encantador, não só pelos recursos oferecidos para sua alimentação e manutenção, mas por ser sua principal fonte de inspiração e aprendizado. A busca incessante pela compreensão das leis naturais e o desafio de transpor barreiras à sua sobrevivência, como o clima e as doenças, levaram o homem ao atual estágio de desenvolvimento científico, mesmo após o avanço tecnológico observado nos dias de hoje. (VIEGAS JR et al. 2006).

Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e biológicas (WALL & WANI, 1996). Diversos autores têm apontado a importância dos estudos químicos e farmacológicos de várias espécies vegetais pela intensa produção de metabólitos especiais, principalmente, nas espécies dos ecossistemas tropicais (BRITO & BRITO, 1993). Nesta perspectiva, a botânica, a química e a farmacologia abrangem conhecimentos indispensáveis para a utilização segura de plantas medicinais, mostrando que a busca sistemática de novos medicamentos tem sido realizada por inúmeras abordagens de estudo. Desta forma, uma abordagem interdisciplinar, na pesquisa de novos medicamentos, representa, de modo inegável, a alternativa mais eficaz e promissora para o alcance deste objetivo (Di STASI, 1996).

Nas últimas décadas o estudo de plantas medicinais evoluiu muito, principalmente, do ponto de vista químico. Esta evolução deve-se ao desenvolvimento de técnicas analíticas que corroboram para a determinação estrutural. Os produtos naturais vêm recuperando espaço e importância na indústria farmacêutica como fonte inspiradora de novos padrões moleculares bioativos (VIEGAS JR et al. 2006). Cerca de 25% das prescrições dispensadas nos Estados Unidos durante os últimos 25 anos estavam relacionadas a medicamentos que com princípios

2

ativos de origem natural ou semi-sintéticos, oriundos normalmente de plantas superiores. Além de cerca de 13% relativas a medicamentos de fontes microbianas e 2,7% de origem animal (CRAGG, et. al., 2003). Resultados de análise de novos fármacos aprovados pelo FDA (Food and Drug Administration) e por entidades reguladoras de outros países, no período de 1981 a 2006, indicaram que os medicamentos recomendados para tratamento de doenças infecciosas atingiram 230 novos medicamentos, dos quais 5,2% eram de produtos naturais e 32,3% eram de derivados de produtos naturais (NEWMAN & CRAGG, 2007). Para o tratamento do câncer cerca de 175 novos medicamentos tem sido aprovados, dos quais 14% são de produtos naturais e 28% de derivados de produtos naturais. (NEWMAN & CRAGG, 2007).

O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os produtos naturais. A Química de Produtos Naturais (QPN) é, dentro da Química brasileira, a área mais antiga e a que, talvez, congregue o maior número de pesquisadores (PINTO et al., 2002). O grupo de pesquisa em química de produtos naturais da UFRRJ tem registrado, dentre outros trabalhos, estudos com a família Ochnaceae, principalmente com espécies do gênero Ouratea e Luxemburgia, dando valiosas contribuições para o conhecimento da química dessa família, propiciando subsídios para avaliações quimiotaxonômicas, além de apresentar substâncias com importantes atividades biológicas contribuindo para busca de novos fármacos (SUZART, et. al.2007).

Objetivos Os objetivos do presente trabalho são:

• Isolar e identificar os principais metabólitos especiais dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.; • Verificar se há semelhanças químicas entre as variedades de Ouratea hexasperma (O.

hexasperma (A. St.-Hil.) Bail. var. hexasperma e O. hexasperma var. planchonii

Engl.); • Avaliar atividades biológicas de extratos e/ou frações dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl., como atividades antibacteriana, antifúngica, inseticida e de toxicidade;

• Preparar derivados dos constituintes isolados; • Fazer a atribuição de dados espectrométricos das substâncias naturais isoladas e

derivados; • Utilizar CLAE-EM para identificar componentes minoritários que são difíceis de

identificar pelas técnicas usuais; • Realizar um estudo de informações relacionadas aos biflavonóides considerados como

marcadores sistemáticos do gênero Ouratea.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Generalidades Sobre a Família Ochnaceae e o Gênero Ouratea

A família Ochnaceae pertence à ordem Theales e compreende cerca de 28 gêneros e 400 espécies, de ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. No Brasil ocorrem aproximadamente 9 gêneros com 105 espécies (BARROSO, 1986). Essas são plantas essencialmente arbóreas ou arbustivas, raramente herbáceas (Sauvagesia), folhas em geral inteiras, de distribuição alterna e com estípulas. Apresentam flores amarelas, alvas ou avermelhadas. (BARROSO et. al, 2002).

A família Ochnaceae é pouco conhecida do ponto de vista químico e biológico. Estudos químicos demonstram que são capazes de biossintetizar flavonóides e biflavonóides, sendo os gêneros Ochna, Lophira, Luxemburgia e Ouratea os mais estudados. Investigações sobre a composição química de espécies do gênero Ouratea, levaram ao isolamento de vários biflavonóides (SIMONI et al., 2002). A freqüência e a diversidade estrutural dos biflavonóides em espécies desses gêneros permitem que sejam utilizados como marcadores taxonômicos (SUZART et al., 2007).

O gênero Ochna consiste em mais de 85 espécies distribuídas por toda África (PEGNYEMB et al., 2003), principalmente na região de Camarões. O estudo de algumas espécies desse gênero forneceu triflavonóides: caloflavanas A e B (figura 1, pág. 3). (MESSANGA et al., 2002); biflavonóides (KAMIL et al., 1987): calodeninas A e B e lophironas K e C (figura 2, pág. 4). (MESSANGA et al., 1994; PEGNYEMB et al., 2001). Biflavonóides, isoflavona e flavona C-glicosilada foram isolados de O. squarrosa. Esta espécie é utilizada no tratamento de indigestão, complicações menstruais e contra asma (RAO & GUNASEKAR, 1989). O extrato etanólico e os biflavonóides isolados do caule de O. macrocalyx mostraram atividades citotóxicas e antibacterianas (TANG et al., 2003).

O gênero Lophira é comumente encontrado na região tropical da África, onde é conhecido pelos seus usos medicinais (GHOGOMU et al., 1987). As espécies mais estudadas são L. alata e L. lanceolata. Desses gêneros foram isolados flavonóides, biflavonóides e dímeros de chalconas (lophironas F, G e H) (figura 2, pág. 4). (TIH GHOGOMU et al., 1989a; TIH GHOGOMU et al., 1989b; TIH GHOGOMU et al., 1990; TIH et al., 1992a; TIH et al., 1992b; TIH et al., 2003).

Figura 1: Triflavonóides isolados no Gênero Ochna

OH

HO

HO

OH

HO

COOH

O OH

HO

HO

O OH

HO

OH

HO

CO

OH

OOH

HO

HO O

OHOH

OH

Caloflavana ACaloflavana B

4

O Gênero Luxemburgia ocorre somente no Brasil e suas espécies são encontradas

principalmente nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço, em Minas Gerais e na Bahia (FERES, 2006). Estas espécies são capazes de biossintetizar flavonóides e biflavonóides com esqueleto próximo a chalconas (OLIVEIRA et al., 2002; CARVALHO et al., 2004) e a bichalcona luxenchalcona (I-3-O-II-4”) (figura 3, pág. 5) (CARVALHO et al., 2004). A rutina (3-O-rutinosídeo-quercetina) foi isolada de Luxemburgia nobilis (OLIVEIRA et al., 2002) e das flores de Luxemburgia octandra foram isolados dois flavonóides 8-C-glicosilados (figura 3) (ALVES et al., 2003).

HO

OH O

O

OHCO

HO OH

OH

lophirona K

HO

OH

O

CO

CO(CH2)2

OH

HO OH

OH

Calodenina A

OH

lophirona C

HO

OH

OH

HO

lorophirona F e G

HOO OH

COCO

HO

OH O

O

O OH

OH

O

OOH

HO

O

OH

HO

OH

HO

Calodenina B

HO

OH O

O

OHCO

HO OH

OH

lophirona K

Figura 2: Biflavonóides e dímeros de chalconas isolados dos Gêneros Ochna e Lophira.

5

O gênero Ouratea ocorre em todo território Nacional, destacando-se no Rio de

Janeiro, Minas Gerais, Paraíba, Bahia e Pernambuco. Algumas espécies do gênero Ouratea incluindo a O. grandifolia, ocorrem na Restinga da Marambaia, Corcovado e Campo Grande (Limeirão)/RJ. (BARROSO, 1986).

As espécies de Ouratea são caracterizadas pelas flores geralmente vistosas, freqüentemente de coloração amarela. No Nordeste as espécies de Ouratea são conhecidas como batiputá, as sementes de batiputá fornecem a “Manteiga de batiputá”, óleo adocicado e aromático, utilizado em conservas e temperos, tornando-se rançoso com facilidade. As espécies de Ouratea espalhadas pelo país recebem designações específicas como Angelim

R

HO

OH

R1

O

R=R1=OH 3-hidroxiisoliquiritigeninaR= OH; R1=H isoliquiritigenina

1'

4'

1'"

4'"

O

OH

HO

OH

O

OH

OH

O

3

4"

I

II

Luxenchalcona

O

OH

HO

O

OH

OH

O

O

O

HO

OH

O OH

OHOH

OH

OH

1"

1"'

8

53

Rutina

8

R=H R=CH3

Flavonóides glicosilados

O

OH

RO

OH

OH

O

O

OH OH

OH

OH

1"

2"

3"

4"

5"

6"

O

O

OH

HO

OH

O

O

O

OH

OHocnaflaflova

Figura 3: Flavonóides e chalconas isolados do gênero Luxemburgia

6

(Ouratea vaccinoides), Caju Bravo (Ouratea floribunda e Ouratea salicifolia) e Coração de Bugre (Ouratea parviflora). As Ouratea floribunda e Ouratea castanaefolia são empregadas em ornamentação urbana (SUZART et al., 2007). São utilizadas na medicina popular como adstringentes, tônicas, estomáquicas, vermífugas (BRAGA, 1960), em distúrbios gástricos e reumatismo (MBING et al., 2003a) e útil na cura de paralisias, erisipela, feridas no útero e úlceras, distúrbios gástricos e na cicatrização de feridas (BARROSO, 1986).

Em estudos com espécies do gênero Ouratea, podemos destacar os que mostraram atividade antitumoral contra células do carcinoma Ehrlich (CARVALHO et al., 2002), inibição das DNA topoisomerases (GRYNBERG et al., 2002), efeitos antiproliferativos e ativação da apoptose em células de tumor Ehrlich (GRYNBERG et al., 1998). O extrato hidroetanólico e a fração acetato de etila de Ouratea semisserrata apresentaram efeito vasodilatador dependente do endotélio (CORTES et al., 2002) e atividade anti-hipertensiva, inibindo a conversão da enzima angiotensina I (ACE) (CASTRO et al., 2000). O extrato metanólico de Ouratea elongata, Ouratea flava e Ouratea sulcata, demostrou atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Enterococcus hirae e Candida

albicans (GANGOUE-PIEBOJI et al., 2006). Também apresentou atividade antimicrobiana o óleo da fruta de Ouratea parviflora Baill extraído com hexano (PAULO, et al., 1986). O extrato metanólico das folhas de Ouratea cuspidata revelou atividade antiparasitária frente a Leishmania braziliensis, biopoteção contra radicais livres e ação antiinflamatória. (SUZART,

2007). Estudos químicos realizados em espécies deste gênero revelaram que são

bioprodutores de flavonóides, flavonóides glicosilados (SUZART et al., 2007) e biflavonóides (SUZART et al., 2007; CARVALHO et al., 2008). Na figura 4, págs. 7 e 8, são mostradas estruturas químicas de substâncias deste gênero. De Ouratea sp. (MONACHE et al., 1967) foram isolados a protocianidina (1) e catequina (2); de O. affinis Engl. e O. calantha Gilg. (GARTLAN et al., 1980) foi isolado a cianidina (3); de O. spectabilis (Mart.) Engl. (FELÍCIO et al., 1995) foram isolados bigenkanina (4) e 7,7”- O-dimetilagatisflavona (5); de O. multiflora Pohl (FELÍCIO et al., 2001) foram isolados amentoflavona (6) e , 3-OH-4’,5,7-OMe-flavona-(6→8”)- 3”-OH -3’”,4’”,5”,7”-OMe flavona (7); de O. semisserata (Mart.) Engl. (VELANDIA et al., 2002) foram isolados 3',6,8-cloro-4’,5-OH-7-OMe isoflavona (8), 3',5',6,8-cloro-4’,5-OH-7-OMe isoflavona (9), 5,7-OH-flavona-(4’→O→8”)- 4′′′,5′′,7′′-OH flavona (10), 5-OH -7- OMe-flavona-(4′→O→8′′)- 4′′′, 5′′,7′′-OH flavona (11), 5-OH-7-OMe-flavona-(4′→O→8′′)-5′′,7′′-OH-4′′′-OMe flavona (12), amentoflavona (6), podocarpusflavona (13) e rutina, (14); De O. flava Schum e Thon (MBING et al., 2003a) foram isolados calodenina B (15), flavumona A (16), flavumona B (17), calodenina C (18), lophirona A (19) e 4′,5-OMe-6,7-metilenodioxi-isoflavona (20); de Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail. (MOREIRA et al., 1994; DANIEL et al., 2005) foram isolados Hexaspermona A (21), Hexaspermona B (22), Hexaspermona C (23), 5,7,4’-OMe-isoflavona (24), 7′′-O-metilagatisflavona (25), 7,7′′-O-dimetillanaraflavona (26), agastiflavona (27), epicatequina (28), 6-C-glicopiranosil-luteolina (29), 3-O-glicopiranosil-quercetina (30), 2′′-O-β-D- glicopiranosil-8-C-β-D-glicopiranosil luteolina (31); de O. microdonta (CARVALHO et al., 2008) foram isolados agatisflavona (27), 7”-O-metilagatisflavona (25) e amentoflavona (6). (Figura 4, págs. 7 e 8).

Além de flavonóides e biflavonóides, ocorrem no gênero outras classes de subsâncias como norisoprenóides (VELANDIA et al., 1998), diterpenos (VELANDIA et al., 1998; FELÍCIO et al., 2004), triterpenos, (MBING et al., 2003b; CARVALHO et al., 2008), esteróides (CARVALHO et al., 2008), lignanas (VELANDIA et al., 1998), hidrocarbonetos e ésteres alifáticos (MOREIRA et al., 1994; PAULO et al., 1986; ESTEVAM et al., 2005) além de derivado do ácido benzóico (CARVALHO et al., 2008). As estruturas químicas de alguns representantes desta classe são mostrados na figura 5, pág. 9.

7

OHO

OH

OMe

OH

OH

OH

2

OHO

OHOH

OH

OH

+

3

O MeO

OH

HO

OOMeO

OH

OH

O

4

ORO

OH

OH

O

O

OR1

O

OH

HO

5: R=R1=Me25: R=H, R1=Me27: R=R1=H

OHO

OH

OH

O

O

OR

O

HO

OH

OH

6: R=H13: R=Me

OMeO

OH

OMe

O

OH

O

O

MeO

HO

OMe

OMe

OH7

Cl

OH

R

OMeO

OH O

Cl

Cl

8: R=H9: R=Cl

O

OOR

RO

O

R1

OR

RO

OR

RO

15: R=R1=H16: R=OH, R1=H

O

OMeO

O

O

OMe

20

OH

O O

O

HO

HO

O

OHHO

17 Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea

OHO

OH

OH

OHO

OHOH

OH

OH

1

ORO

OH

O

O

O

O

HO OH

OR1

10: R=R1=H11: R=Me,R1=H 12: R=R1=Me

O

OH

HO

O

OH

OH

O

O

O

HO

OH

O OH

OHOH

OH

OH

14

8

OHO

O

O OH

OH

H

H

OHHO

19

O

O

MeO

OMeOMe

24

O

O

OMe

ORH

H

R1O

O

O

MeO

OHH

H

OMe21: R=H, R1=Me22: R=Me, R1=H 23: R=R1=H

O

O

MeO

OH

O

O

O

MeO OH

OH

26

O

OH

OH

HO

OH

28

OHO

OH

OH

O

OH

O

HO

HO

HOHO 29

OHO

OH

OH

O

OH

OO

OH

OH

OH

OH

30

OHO

OH

OH

O

OHO

O

HOHO

O

HOHO

OHHO

OH

31 Continuação da Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea.

O

H

HO

OH

OH

H

HO

H

HO

OH

OH OH

H

18

9


hexasperma var. planchonii Engl.

Ouratea hexaperma foi classificada pela primeira vez como Ghomphia hexasperma A. St. Hil. (Flora Brasiliae Meridionalis (quarto ed.) 1: 61. 1824), posteriormente a classificação botânica foi modificada para Ouratea hexasperma (A. St.-Hill.) Bail. (Histoire des Plantes 4: 366. 1873) e após verificar diferenças morfológicas dentro na prórpria espécie, classificou-se em duas variedades, a típica, O. hexasperma (A. St. Hill.) Bail var. hexasperma e uma nova variedade O. hexasperma var. planchonii Engl. (Flora Brasiliensis 12(2):321. 1876).

A variedade típica (A. St.-Hill.) Bail, apresenta folhas lanceoladas, provida de acúmem de 1 cm de comprimento e a variedade planchonii Engl. apresenta folhas oblongas ou oblonga-ovadas, raramente acuminada aguda. (Flora Brasiliensis). (Figura 6, pág. 10).

O

OHOH

Norisoprenóide

H

COOR

R1

R2

Diterpenos

HO

triterpeno

ROEsteróides

O

O

OCH3

CH3O

OCH3

OCH3

Lignana

CH3H3C( )n

Hidrocarboneto

( )n'O

O

( )n

Éster alifático

HO OH

O

OH

H3CO

Derivado da ácido benzóico Figura 5: Outras classes de substâncias isoladas nos gêneros Ouratea.

10

Atualmente estas variedades foram sinonimizadas, especialistas da família não consideram as variedades e apenas a espécie Ouratea hexasperma (A. St.-Hill.) Bail., devido à estas pequenas diferenças morfológicas.

Figura 6: Diferenças morfológicas marcantes entre as folhas de Ouratea hexasperma.

2.3. Estudo Químico Realizado com Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail

Como citado anteriormente, estudos químicos com Ouratea hexasperma, coletada no cerrado da Amazônia, conduziu ao isolamento de hidrocarbonetos, de biisoflavonóides: hexaspermona A, B, C, estruturas 21, 22 e 23 da figura 4, pág. 7 e 8. e da biflavona 7’’-metilagatisflavona, estrutura 25 da figura 4, pág. 7 (MOREIRA et al., 1994; MOREIRA, et

al., 1999). Das folhas, inflorescência e caule de Ouratea hexasperma, coletadas no Município de João Pessoa na Paraíba, foram isolados hidrocarbonetos, esteróides, saponinas, triterpenos (figura 5, pág. 10), flavonóides, epicatequina, biflavonóides (7,7”-O-dimetillanaraflavona, 7”-O-metilagatisflavona e Agatisflavona) além de flavonóides glicosilados, figura 4, pág. 8 e 9 (DANIEL, 2005; SUZART, 2007).

O grupo de pesquisa em Química de Produtos Naturais da UFRRJ tem registrado, dentre outros trabalhos, estudos de espécies do gênero Ouratea e Luxemburgia (Ochnaceae) dando valiosas contribuições para o conhecimento da química dessa família, propiciando subsídios para avaliações quimiotaxonômicas, além de apresentar substâncias com importantes atividades biológicas contribuindo para busca de novos fármacos (SUZART, et al. 2007).

O levantamento na literatura sobre biflavonóides presentes na família Ochnaceae e em espécies do gênero Ouratea permitiu tirar deduções e fazer considerações sobre essa classe de substâncias, que são freqüentes no gênero, além de detectar alguns aspectos farmacológicos.

A quantidade de resultados obtidos até o momento com estudo das espécies Ouratea orientou-nos a fazer um estudo de informações relacionadas aos biflavonóides comumente presentes, entre eles os mais abundantes: Agatisflavona e 7”-O-metilagatisflavona, Pode-se aferir a estes possibilidades de marcadores quimiotaxonômicos. 2.4. Biflavonóides

Os biflavonóides constituem uma classe de flavonóides diméricos, diferenciando-se de outros oligômeros como as proantocianidinas, devido à origem biogenética das unidades

11

constituintes. A maioria dos representantes dessa classe de produtos naturais é formada pelos dímeros flavona-flavona, flavona-flavanona, flavanona-flavanona além de ocorrer, mais raramente, os dímeros de chalconas e de isoflavonas. Quando as duas unidades são iguais constituem os bisflavonóides e quando as duas unidades são diferentes são os biflavonóides. As ligações entre as unidades flavonoídicas podem ser C-C ou C-O-C envolvendo os anéis A, B ou C dos monômeros (Figura 7, pág. 11). (SUZART et al., 2007).

Segundo Suzart (2007) e colaboradores, seguindo a literatura (SIMÕES et al., 2001, CHARI, et. al., 1977, DORA, et. al., 1991), utiliza-se a numeração dos biflavonóides atribuindo números ordinários para os anéis A e C e primados (′) para o anel B de um dos monômeros. Para a segunda unidade empregam-se números ordinários duplamente primados (′′) para os núcleos A e C e números ordinários triplamente primados (′′′) para o núcleo B. De acordo com os átomos de carbonos envolvidos na ligação entre as unidades, os dímeros são classificados em grupos de biflavonóides (figura 7, pág. 13), além dos dímeros de chalconas: C-3→O-C-4''' (luxenchalconas), figura 3, pág. 5 (CARVALHO et al., 2004) e C-3'→C3'' (brackeninas), figura 7, pág. 11 (DREWES, et al., 1984) e dos dímeros de isoflavonas C-2→C-2'' (hexaspermonas), estruturas 21, 22 e 23 da figura 4, pág. 7 e 8 (MOREIRA et

al.,1994), sem destacar os dímeros com duas ligações entre as unidades. A ligação tipo C-O-C é característica das ochnaflavonas (C-3'→O-C-4’’’), figura 3, pág. 5 e das lanaraflavonas (C-4'-O→C-8’’), figura 7, pág. 11. Alguns dos grupos hidroxila podem apresentar-se metilados originando os respectivos éteres metílicos que, às vezes, recebem nomes especiais (MOREIRA, et. al., 1999; FELICIO et al., 1995; VELANDIA et al., 2002; DANIEL et al., 2005

O

R

O

O

O

R

O

2

34

56

7 89

10

2'3'

4'

5'6'

Flavonas/Flavanonas

C-6 C-8": agatisflavona

C-8": cupressuflavonaC-8

C-3 C-8" amentoflavona

C-3',5' C-6": robustoflavona

C-2 C-8": garcinias

C-4'-O C-8": lanaraflavona

C-3' C-3":chamejasmina

A

B

C

OO

O O

OO

O

O

O2

34

2'

3'

4'6'

4"

2"

Chalconas

OO

O

O O

O O

O

O

Ar

2

345

6

7

89

102'

3'

5'6'

2"

3" 4" 5"

7"9"

Isoflavonas Figura 7: Dímeros de flavonóides

12

Uma característica marcante dos metabólitos isolados do gênero Ouratea é a ligação entre seus monômeros, sendo as mais abundantes C-3→C-8’’ e C-6→C-8’’, acrescentando uma variação no padrão de metilação. No caso dos derivados da agatisflavona (C-6→C-8’’), estruturas 25 e 27 da figura 4, págs. 7 e 8, a metilação é mais freqüente na posição 7”, sendo esta a biflavona mais abundante no gênero Ouratea. Em 1929 foi isolada a primeira biflavona, a gingentina, do Ginkgo Biloba (LIN et al., 1997). A partir desse isolamento muitos biflavonóides foram isolados de plantas e várias atividades biológicas têm sido relacionadas a essa classe de substâncias (LIN et a.,l 1999).

Os biflavonóides são geralmente encontrados em grande quantidade em diferentes plantas e muitos tecidos vegetais. Apresentam várias propriedades, como proteção contra raios ultravioleta nas folhas, antifúngico e alimento para insetos (SIMÕES et al., 2001). As atividades farmacológicas conhecidas são: Estimulantes cardíacos, antivirais, antimicrobianas, antiinflamatórias e anti-hepatotóxicas (SIMÕES et al., 2001, LIN et al., 1999). Em estudos de atividades biológicas, os biflavonóides isolados de O. spectabilis, O. multiflora e O. parviflora mostraram inibição da produção de aflatoxina por Aspergillus flavus (GONÇALEZ

et al., 2001), Os biflavonóides isolados das partes aéreas de Ouratea sulcata exibiram significante atividade antimicrobiana in vitro contra Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Listonella anguillarum, Staphylococcus aureus (PEGNYEMB et al., 2005) Os dímeros de flavonas das folhas de O. multiflora mostraram atividade contra as bactérias Staphylococcus

aureus e Bacillus subtilis. (CARBONEZI et al., 2007), os biflavonóides isolados de O. spectabilis inibiram a enzima aldose redutase (FELICIO et al., 1995), além de atividade antitumoral detectadas para os biflavonóides isolados de O. hexasperma (St.Hil.) Bail (DANIEL et al. 2007). 2.4.1. Agatisflavona e derivados

Fazendo uma avaliação sobre os flavonóides que são mais freqüentes em espécies de

Ouratea percebeu-se que a agatisflavona e principalmente, seu derivado 7”-metil éter são os mais freqüentes. Resolvemos fazer um levantamento para verificar a ocorrência destes flavonóides em outras famílias, através deste levantamento observou-se que estas substâncias também ocorrem em outras famílias vegetais, como apresentado na tabela 1. Tabela 1: Ocorrência de Agatisflavonas e derivados em espécies vegetais.

BIFLAVONOIDES ESPÉCIES FAMÍLIAS REFERÊNCIAS 4”’,7-O-

dimetilagatisflavona; 7-O-metilagatisflavona

Agathis alba Araucariaceae (conífera)

MASHIMA et al.,1970

4”’,7-O-dimetilagatisflavona;

7-O-metilagatisflavona; 7,7"-O-

dimetilagatisflavona

Araucaria bidwillii and Agathis

alba Araucariaceae KHAN et al., 1972

7-O-metilagatisflavona Araucaria rulei Araucariaceae ILYAS et al., 1977 7,7"-O-

dimetilagatisflavona 7-O-metilagatisflavona

Agathis australis Araucariaceae OFMAN et al., 1995

7-O-metilagathisflavona

Araucaria araucana Araucariaceae PARVEEN et al., 1987

Agatisflavona 7,7"-O-


Araucaria angustifolia

Araucaria genus Araucariaceae ILYAS et al., 1994

13

Agatisflavona

Rhus succedanea e Garcinia

multiflora Araucariaceae LIN et al., 1997

Agatisflavona

Rhus succedanea Anacardiaceae CHEN, 1973

Agatisflavona

Rhus succedanea Anacardiaceae LIN et al., 1974

Agatisflavona Rhus punjabensis Anacardiaceae KAMIL et al., 1984 Agatisflavona

Rhus semialata Anacardiaceae BAGCHI et al., 1985

Agatisflavona

Picea morinda Linn Anacardiaceae AZAM et al., 1985

Agatisflavona

Rhus semialata Murr Anacardiaceae PARVEEN et al., 1988

Agatisflavona

Amphipterygium amplifolium;

Orthopterygium huaucui Anacardiaceae

WANNAN et al., 1988

Agatisflavona

Rhus coriaria Anacardiaceae VAN LOO et al., 1988

Agatisflavona

Anacardium occidentale Anacardiaceae ARYA et al., 1989

Agatisflavona

Schinus terebenthefolus Anacardiaceae KASSEM et al., 2004

Agatisflavona Rhus pyroides, Rhus dentata and

Rhus pentheri Anacardiaceae

SVENNINGSEN et al., 2006

Agatisflavona

Canarium manii Burseraceae ANAND et al., 1992

Agatisflavona Juniperus virginiana Cupressaceae

(coníferas) ROY et al., 1984

Agatisflavona Garcinia xanthochymus Clusiaceae PARVEEN et al., 1994

Agatisflavona

Bauhinia vahlii Linn Leguninoceae SULTANA et. al, 1985

Agatisflavona

Caesalpinia pyramidalis Leguminosae Fabaceae

MENDES et al., 2000

Agatisflavona Caesalpinia pyramidalis Leguminosae Fabaceae

BAHIA et al., 2005

7,7"-O-dimetilagatisflavona

Ouratea spectabilis Ochnaceae FELÍCIO et al. 1995

7"-O-metilagatisflavona

Ouratea hexasperma Ochnaceae MOREIRA et al., 1999


Ouratea parviflora Ochnaceae FELÍCIO et al., 2004

Agatisflavona 7"-O-metilagatisflavona

Ouratea hexasperma Ochnaceae DANIEL et al., 2005

Agatisflavona

Ouratea sulcata Ochnaceae PEGNYEMB et al., 2005

Agatisflavona Ouratea nigroviolacea Ochnaceae NGO MBING et al., 2006

Agatisflavona

Ouratea staudtii Ochnaceae ZINTCHEM et al., 2007

Agatisflavona; 7"-O-metilagatisflavona

Ouratea microdonta Ochnaceae CARVALHO, et al, 2008*

14

Através da observação da tabela 1 vemos que os biflavonóides Agatisflavona e derivados ocorrem em diferentes espécies de diferentes famílias, gêneros e espécies vegetais. Para verificar a ligação taxionômica desses gêneros com a ocorrência desses biflavonóides foi realizada uma avaliação através da divisão botânica da possível ligação entre as espécies onde foram encontradas essas substâncias. Na tabela 2, pág. 15, observam-se os dados de divisão, ordem, classe, família de cada espécie que foi isolado os biflavonóides Agatisflavona e derivados.

A partir desses dados observa-se que há relação entre algumas espécies, como as espécies da família Araucariaceae e Cupressaceae, que pertencem à mesma ordem, classe e divisão botânica. As famílias Anacardiaceae, Burseraceae, Leguminosae, Clusiaceae e Ochnaceae pertencem a ordens botânicas diferentes, mas pertencem a mesmas classes e divisões botânicas.

Nas famílias Araucariaceae e Ochnaceae encontram-se a maior variedade de derivados da agatisflavona, sendo que somente no gênero Ochnaceae, mas especificamente nas espécies de Ouratea que foi encontrado o biflavonóide 7"-O-metilagatisflavona. Isso demonstra que essa substância é um marcador quiotaxinômico da espécie Ouratea.

15

Tabela 2: Divisões Botânicas das espécies que onde há ocorrência de Agatisflavonas e derivados.

DIVISÃO CLASSE ORDEM FAMÍLIA ESPÉCIE BIFLAVONÓIDE

Pinophyta Pinopsida Pinales Araucariaceae (coníferas)

A. alba;

A. bidwillii;

A. rulei;

A. australis;

A. araucana;

A. angustifólia;

4”’,7-O-dimetillagatisflavona

7-O-

metilagatisflavona


Agatisflavona

Pinophyta Pinopsida Pinales Cupressaceae (coníferas)

J. virginiana Agatisflavona

Magnoliophyta Magnoliopsida Sapindales Anacardiaceae

R. succedanea;

R. punjabensis;

R. semialata;

P. morinda Linn;

R. semialata

Murr;

A. amplifolium;

O. huaucui;

R. coriaria;

A. occidentale;

S.terebenthefolus;

R. pyroides;

R. entata;

R. pentheri

Agatisflavona

Magnoliophyta Magnoliopsida Sapindales Burseraceae C. manii Agatisflavona

Magnoliophyta Magnoliopsida Fabales Leguminosae Fabaceae

B. vahlii Linn;

C. pyramidalis

Agatisflavona

Magnoliophyta Magnoliopsida Malphiales Clusiaceae G. xanthochymus Agatisflavona

Magnoliophyta Magnoliopsida Malphiales Ochnaceae

O. spectabilis;

O. hexasperma;

O. parviflora;

O. sulcata;

O. nigroviolacea;

O. staudtii;

O. microdonta


7"-O-

metilagatisflavona

Agatisflavona

16

3. CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE O. hexasperma var.

planchonii Engl. No presente trabalho, O. hexasperma (var. planchonii Engl.) foi submetida a estudo

fitoquímico para verificar a presença de marcadores taxonômicos e servir como argumento adicional para localização da mesma na espécie. Com esse estudo, foram isolados compostos alifáticos; ácido alifático (1); uma mistura de esteróides: sitoesterol (2a), estigmasterol (2b) e campesterol (2c); os triterpenos lupeol (3a) e α-amirina (3b) e β-amirina (3c); os biflavonóides 7”-O-metilagatisflavona (4) e agatisflavona (5) e sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosideo (6). Figura 8, pág. 17.

17

CH3H3C( )n

Compostos alifáticos

OH

O

( )n1

RO

1

2

3

4 65 7

9

1911

12

14 15

16

17

18

13

2022

23

21 24

2829

27

25

26

2a: 22,23-diidro2b: ∆ 22,23

1

2

3

4 65 7

9

1911

12

14 15

16

17

18

13

2021

HO

21

2223

24

25

2c

3a

2930

20

28

27

3

HO

HO3

24 23

56

10

251

13

RR1

28

22

2029

30

27

11

(3b) R = CH3, R1 = H (3c) R = H, R1 = CH3

5

6"'

5"'

4"'

3"'2"'

1"'

10"

9"8"

7"

6"

5"

4"

3"2"

1"

2'

10

6

5 4

3

2

B'

C'

A'

CA

O

O

OH

OH

HO

OH

HO

O

OH

O

6'5'

4'

3'

1'9

87

1 B

4

6"'

5"'

4"'

3"'2"'

1"'

10"

9"8"

7"

6"

5"

4"

3"2"

1"

2'

10

6

5 4

3

2

B'

C'

A'

CA

O

O

OH

OH

HO

OMe

HO

O

OH

O

6'5'

4'

3'

1'9

87

1 B

22

25

26

27

12

3

4 6 5

7

8

9 10

11

12

13

14 15

16 17

18

20

2324

1'

2'3'

4' 5' 6'

O

19

21

O

OH

OHHO

HO

6

Figura 8: Constituintes químicos isolados neste trabalho (O. hexasperma var. planchonii

Engl.)

18

4. PARTE EXPERIMENTAL 4.1. Equipamentos e Reagentes Os pontos de fusão foram determinados em placa de aquecimento MEL-TEMP II, Laboratory Devices USA, utilizando capilar, sem correção dos valores obtidos. Os espectros de infravermelho foram obtidos em espectrofotômetro Perkin-Elmer 1600/1605 FT-IR em pastilha de KBr. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C (incluindo experimentos em 2D), foram registrados em espectrômetros Bruker AC-200 Advance (1H: 200 e 13C: 50,3 MHz) e Bruker DRX-500 (1H: 500 MHz e 13C: 125 MHz). Como padrão interno foi usado tetrametilsilano ou resíduo do solvente CHCl3 (δH 7.24) e o pico central do tripleto em δC 77.00 do CDCl3. Os espectros de massas foram registrados em cromatógrafo com fase gasosa acoplado a espectrômetro de massas de analisador de íons quadrupolo e ionização por impacto de elétrons, 70 eV; marca Varian Saturn 2000 da UFRRJ. As análises com CLAE foram realizadas com aparelho Shimadzu bomba modelo 10AS Shimadzu 10AD/10AS com detector UV-Vis 10AD, injetor manual Rhoodune 1175 com loop de 20µL, integrador 6 CR, com coluna de fase reversa C18 (250mm x 4,6 mm x 5µm) Betasil, utilizando um sistema isocrático de metanol/H2O/acetonitrila/ácido acético (20:40:39:1) em duas bombas, na bomba A foi adicionada a fase orgânica (CH3OH/ CH3CN) e na Bomba B a fase aquosa (H2O/ácido acético). A fase móvel foi ajustada para A 62% e B 38% e velocidade de fluxo 1mL.min-1, os extratos foram monitorados a 270 nm. As análises em CLAE acoplado a espectômetro de massas foram feitas com o aparelho LCMS-IT_TOF Shimadzu, foram usados quatro solventes e duas bombas A (metanol/acetonitrila, 20:34) e B (água/ácido acético, 10:1), com sistema gradiente. As cromatografias em coluna foram realizadas tendo como suporte gel de sílica (230-400 e 70-230 mesh, Vetec) e Sephadex LH-20 (Sigma, USA). A cromatografia em camada preparativa (CCP) foi feita em placas de gel de sílica 60 PF254, Merck e Vetec, sobre suporte de vidro e espessura de 1mm.

As substâncias foram detectadas por irradiação na região do ultravioleta (254 e 366 nm). Foram usadas placas em folha de alumínio de gel de sílica 60 PF254 Merck para cromatografia em camada fina (CCF) e como reveladores foram utilizados, detecção por irradiação ultravioleta (254 e 366 nm), e/ou reagentes cromogênicos:

• Dragendorff (solução de nitrato básico de bismuto II em ácido acético diluído com iodeto de potássio), reagente para alcalóides (MATOS, 1997).

• Liebermann Burchard (20mL de anidrido acético e 20 mL de ácido sulfúrico diluídos em 200 mL de etanol, em banho de gelo), seguido de aquecimento, reagente para terpenos e esteróides (MATOS, 1997).

• Soluções de AlCl3-EtOH (1%), seguido de aquecimento, reagente para flavonóides. (VENNAT, B. et al, 1992).

• Godin A: Solução I: vanilina etanólica 1% Solução II: ácido perclorico 3%

Godin B: Acido sulfúrico10 % v/v Misturar as soluções I e II em partes iguais e borrifar sobre a placa cromatográfica, revelar com Godin B e colocar em estufa. Para identificação de esteróides, triterpenos e flavonóides. (MARTINS, 2006).

• Vapores de iodo revelam a maioria das substâncias orgânicas.

4.2. Material vegetal O material vegetal, galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl., (Ochnaceae), coletado na época de frutificação, em área de restinga, no município de Conde, praia de Jacunã, em área de restinga e identificados pela Profa. Dra. Maria de Fátima Agra.

19

Uma excicata desta espécie (Nº6747) está depositada no herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB), Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil. 4.3. Obtenção dos extratos brutos

O material foi seco à temperatura ambiente, logo após a coleta e moídas em moinho de facas. O pó dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. (1900g) foi submetido à extração através de maceração contínua com diclorometano e metanol. Os extratos foram concentrados em evaporador rotatório a 40°C sob pressão reduzida e, após o uso de ar quente para retirar o resíduo de solventes, obtiveram-se os extratos de diclorometano (OspGD, 206,5 g) e o extrato metanólico (OspGM, 190,0 g). 4.4. Prospecção Química do Extrato Metanólico Do extrato metanólico, aproximadamente 1,0 g, fez-se prospecção química que permitiu o conhecimento preliminar das principais classes de substâncias naturais presentes. Esta avaliação é freqüentemente usada para direcionar trabalhos posteriores de fracionamento e isolamento das substâncias (MATOS, 1988). Esta abordagem foi elaborada com testes para detectar os metabólitos especiais dos galhos da espécie, conforme metodologias descritas na literatura. As classes de substâncias avaliadas: alcalóides, saponinas, esteróides e triterpenóides, depsídio e depsidonas, flavonóides, catequinas, quinonas, sesquiterpenos e outras lactonas, carotenóides e xantofilas, glicosídios cardíacos, açúcares redutores, sacarídios, ácidos orgânicos e taninos. 4.5. Isolamento e Purificação dos Constituintes Químicos dos Extratos de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl. 4.5.1. Extrato com diclorometano:

O extrato OspGD foi filtrado em funil de separação de gel de sílica usando hexano, clorofórmio e metanol e obtiveram-se as frações: hexano (OspGDH, 11,06g); Clorofórmio (OspGDC, 5,43g) e metanol (OspGDM, 116,9g).

A partição em hexano (OspGDH), foi cromatografada em coluna de gel de sílica, usando eluentes diclorometano, diclorometano : metanol, aumentando gradativamente a polaridade até 100% de metanol, fornecendo 15 frações, que através da análise dos dados espetrométricos foram identificadas como uma mistura de alcanos alifáticos, ácido alifático, (substância 1, 57 mg) e uma mistura de esteóides (sitoesterol, estigmasterol e campesterol), que foi denominada substância 2 (a, b e c, PF.: 120-122ºC, 84 mg).

A partição clorofórmio (OspGDC) foi cromatografada em coluna de gel de sílica, usando eluentes diclorometano OspGDCD (26 frações), acetato de etila OspGDCA (11 frações) e metanol OspGDCM (26 frações), que forneceram uma mistura de alcanos alifáticos e álcoois alifáticos, o triterpeno lupeol (substância 3, PF.: 179-180ºC, 50 mg) e a mistura de esteróides sitoesterol, estigmasterol.

A fração obtida com metanol (OspGDM, 95g), foi fracionada através de cromatografia em coluna de sílica gel utilizando os eluentes clorofórmio e metanol 9:1 e aumentando gradativamente a polaridade. As frações 5-7 forneceram um material amarelo de ponto de fusão 226/228ºC , solúvel em acetona, que após análise dos dados espectrométricos foi identificado como o biflavonóide 7’’-O-metilagatisflavona (substância 4, PF.: 226-228ºC, 74 mg).

Os procedimentos relatados acima estão representados no Esquema 1, pág. 21.

20

4.5.2. Extrato com metanol: O extrato metanólico (OspGM, 160,0g) foi submetido à partição com metanol:água

(8:2) e clorofórmio, no qual o extrato foi diluído em metanol/água 8:2 e extraído com clorofórmio, obtendo-se as partições clorofórmio (OspGMC, 67,0 g) e metanol (OspGMM, 58,8 g). A partição clorofórmio foi dividida em duas frações, a primeira de cor esverdeada (OspGMC1, 23,2 g) e outra de cor marrom (OspGMC2, 22,0 g), da segunda fração retirou-se um precipitado (OspGMC2p, 20,8 g), o qual uma parte (18,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel com a mistura diclorometano/metanol com aumento gradual de polaridade até metanol 100%. Foram coletadas 20 frações, as frações 2-4 foram recristalizadas em metanol e forneceram um material amarelo que, apresentava 2 manchas em cromatografia de camada fina (CCF) com o eluente CH2Cl2/CH3OH, 8:2. Após análise dos dados espectrométricos, e comparação em cromatografia de camada fina com os padrões 7’’-O-metilagatisflavona e agatisflavona, usando os eluentes CH2Cl2/CH3OH, 8:2; CHCl3/CH3COCH3, 7:3 e AcOEt/CH3OH, 9,5:0,5, foram identificados como os biflavonóides, em mistura, 4 (7’’-O-metilagatisflavona), e 5 (agatisflavona), 103 mg, solúveis em acetona.

A mistura dos biflavonóides 4 e 5 foi metilado com diazometano (40,0 mg). Após a metilação foi feita a purificação do produto através de cromatrografia em camada preparativa(CHCl3/CH3COCH3, 7:3), fornecendo o derivado permetilado 4a (28,0 mg).

A fração (OspGMC1, 20,0g) foi cromatografada em coluna de sílica gel com a mistura diclorometano/metanol com aumento gradual de polaridade até metanol 100%. Sendo coletadas 30 frações. As frações 5 e 6 forneceram um material amarelo, que após a purificação e análises dos dados do RMN de hidrogênio e carbono-13, concluiu-se que também é a 7”-O-metilagatisflavona (32,0 mg) e a fração 17, que foi recristalizada em metanol forneceu um material (9,0 mg) insolúvel em acetona e metanol, e através das análises dos dados do RMN de hidrogênio e carbono, verificou-se que que a fração contém o sitosterol glicosilado (6).

Os procedimentos relatados acima também estão representados no Esquema 1, pág. 21.

21

Esquema 1: Fluxograma da marcha para o isolamento das substâncias dos galhos de Ouratea


Ouratea hexasperma

(Galho 1900,0 g)

1) CH2Cl22) MeOH-Evaporação

Ext. metanólicoOspGM(190,0 g)

-Partição funil sílica gel

-CHCl3

OspGDC (5,43 g)

Ext. diclorometanoOspGD(206,5 g)

OspGMCp

Coluna1) dicloro2) acetato de etila3) metanol

-Hexano

OspGDH(11,06 g)

ColunaCHCl3 / MeOH

OspGDCD26 frações

OspGDCA11 frações

OspGDCM26 frações

- MeOH

OspGDM116,9 g

- Partição Líq./Líq1) MeOH/H2O 8:22) CHCl3

OspGMC OspGMM

OspGMC-1

OspGMC2

1) verde

2)H2O mãe 3) precip.

Coluna

Coluna

(OspGMCp-2p) 125 mg

Frações 2 e 3Coluna

OspGMC2A

2)

metilação

4a

Coluna

substância 5

biflavonoidesalcanos

1 2 (a,b e c)

1

4

4

5 4

2 (a,b e c) 3(a, b e c) 5

6

22

4.6. Derivação A preparação do derivado metilado da agatisflavona serviu para facilitar a análise dos dados espectrométricos, devido ao aumento da solubilidade em clorofórmio e, fazer análises com algumas técnicas especiais de RMN. 4.6.1. Metilação com diazometano

A solução de diazometano foi preparada de acordo com a metodologia experimental descrita na literatura (VOGEL, 1989 e CARVALHO et al. 2006). A mistura das substâncias (agatisflavona e 7”-O-metilagatisflavona) foi completamente dissolvida em MeOH, adicionou-se a solução etérea do diazometano em excesso, observando desprendimento gasoso, a solução foi deixada em repouso para a evaporação natural dos solventes. A ocorrência da reação foi monitorada através de comparações em CCF com as substâncias puras, após repetições do procedimento de adição da solução de Diazometano, realizou-se cromatografia em camada preparativa, fornecendo a substância metilada. A figura 9, pág. 23 apresenta um esquema da reação e o mecanismo proposto para a mesma.

23

OH

O

H3C N NN2

O

OH

O

OHOH

O

OH

O

OH

O H

H2C N N

H2C N NH2C N N

OH

O

H3C N N

O

O

OCH3

OCH3

H3CO

O

H3CO

O

OCH3

O

H3CN2 N2

R

O

O

OH

OH

HO

O

HO

O

OH

OO

O

OCH3

OCH3

H3CO

O

H3CO

O

OCH3

O

H3C

CH2N2

MeOH

Figura 9: Mecanismo proposto da reação de metilação com diazometano.

24

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Prospecção Química do extrato metanólico:

Parte do extrato metanólico foi utilizado para a realização da avaliação da classe dos constituintes presentes, através da prospecção química, e posterior isolamento e purificação dos principais metabólitos especiais. A tabela 3 demonstra os resultados da prospecção química do extrato metanólico, que revelou testes positivos para as classes de metabólitos especiais: alcalóides, saponinas, esteróides e triterpenóides, depsídio e depsidonas, flavonóides, catequinas, quinonas, açúcares redutores, sacarídeos e taninos. Os testes realizados seguiram as metodologias segundo as literaturas: Alcalóides, esteróides, triterpenos e flavonóides (WALL et al., 1954); saponinas, depsídios e depsidonas, quinonas e sacarídios (MATOS, 1988); catequinas, derivados de cumarinas e açúcares redutores (COSTA, 1972); Ácidos orgânicos (MERK, 1980); Taninos (MATOS, 1997).



Classes de metabólitos especiais Extrato metanólico Alcalóides +++

Saponinas +++

Esteróides e triterpenóides +++

Depsídio e depsidonas +++

Flavonóides +++

Catequinas +++

Quinonas +

Sesquiterpenos e outras lactonas -

Derivados de cumarinas -

Glicosídios cardíacos -

Açúcares redutores ++

Sacarídios +

Ácidos orgânicos -

Taninos +++

- ausente + fraco ++ médio +++ forte

25

5.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Isolados de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl. O fracionamento dos extratos dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl.

forneceu uma mistura de hidrocarbonetos, ácidos alifáticos, os esteróides sitoesterol, estigmasterol e campesterol, os triterpenos α-amirina e β-amirina, os biflavonóides 7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona e sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosideo. A identificação através de métodos físicos desses materiais foi feita através das análises de espectros de IV, RMN de 1H e 13C, massas e comparação com padrões isolados das espécies de Ouratea em estudos anteriores.

5.2.1. Alcanos O espectro de IV da mistura de alcanos (Figura 10, pág. 25) revela bandas de absorção em 2918 e 2848 cm-1 relativas a estiramentos de grupos CH3 e CH2, sugerindo a presença de uma longa cadeia carbônica. As bandas em 1466 cm-1 (deformação angular da ligação C-H), e 723 cm-1 confirmam esta atribuição. O espectro de RMN 1H (Figura 11, pág. 26) apresenta sinais em δH 0,90 e 1,27ppm de cadeia normal hidrocarbônica.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumber (cm-1)

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

%T

rans

mitt

ance

2917.822848.39

1467.59

725.12

Figura 10: Espectro de IV do material alifático de O. hexasperma var. planchonii Engl.

26

8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Inte

nsity

7.27

1.27

0.90

Figura 11: Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do material alifático.

27

5.2.2 Substância 1 O ácido alifático 1, foi identificado através da análise dos espectros de IV, RMN 1H e CG-EM. O espectro de IV (Figura 12, pág. 27) revela bandas de absorção em 2918 e 2848 cm-1 relativas a estiramentos de grupos CH3 e CH2, sugerindo a presença de uma longa cadeia carbônica. As bandas em 1473 cm-1 (deformação angular da ligação C-H), 723 cm-1 e o sinal em 1724 cm-1 compatível com carbonila de ácido, confirmam esta atribuição. O espectro de RMN 1H (Figura 13, pág. 28) apresenta sinais em δH 0,89 e 1,26 de cadeia alifática, e 2,35 indicando a presença e de hidrogênio de carbono alfa ao grupo carbonila. O cromatograma da amostra (figura 14, pág 28), demonstra os picos indicando a mistura das substâncias, tendo a substância majoritária em TR=5,74, o CG-EM apresentou picos em m/z 57 [C4H9]

+, m/z 87 [C4H7O2]

+, m/z 129 [C7H13O2]+, m/z 185 [C11H21O2]

+, m/z 213 [C13H25O2]+, os picos em m/z

257 (M+. +1) e 242 (M+.) (Figura 15, pág. 29), permitiu identificar os ácidos hexadecanóico e pentadecanóico presentes na mistura.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumber (cm-1)

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

%T

rans

mitt

ance

3461.65

2954.462917.82

2848.39

2728.82

1724.081645.011619.94

1473.371411.66

1386.59

1170.6

889.04

728.97719.33

366.41

Figura 12: Espectro de IV de 1.

28

Figura 13: Espetro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) de 1.

Figura 14: Cromatograma de 1.

29

Figura 15: Espectro de massas de 1. 5.2.3. Substância 2 (a, b e c)

Os esteróides 2 (a, b e c) foram identificados respectivamente, como sitosterol,

estigmasterol e campesterol, com base na comparação com amostra autêntica, envolvendo espectros de RMN de 1H (Figura 16, pág. 30), CG-EM, além de P.F. e CCF.

O espectro de RMN de 1H da mistura 2 (a, b e c) mostrou sinais entre δH 0,65 e δH

1,23 correspondentes as metilas, multipleto em δH 3,53 atribuído ao hidrogênio carbinólico H-3, um singleto largo em δH 5,31 atribuído ao hidrogênio olefínico H-6 e o multipleto em δH 5,07 correspondentes aos hidrogênios H-22 e H-23 para o estigmasterol. Através do CG-EM que se detectou a presença do terceiro componente (campesterol), através do cromatograma (Figura 17, pág. 30), indicando os picos dos esteróides e comparação com padrões da biblioteca do equipamento (Figuras 18 a, b e c, págs. 31, 32 e 33) permitiu confirmar a proposta da mistura dos esteróides sitosterol (2 a), estigmasterol (2 b) e campesterol(2 c).

30

Figura 16: RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) da mistura de esteróides 2 (a, b e c)

Figura 17: Cromatograma da mistura dos esteróides 2 (a, b e c)

31

Figura 18a : Espetro de massas de 2 (a) comparado com a biblioteca do aparelho.

32

Figura 18b: Espetro de massas de 2 (b) comparado com a biblioteca do aparelho.

33

Figura 18c : Espetro de massas de 2 (c) comparado com a biblioteca do aparelho.

5.2.4. Substâncias 3: Lupeol, α-amirina e β-amirina A mistura dos triterpenos 3 (a, b e c) foram identificados como lupeol, α-amirina e β-

amirina, através da interprtação dos espectros de RMN de 1H , CG-EM e CCF. O espectro de RMN 1H (Figura 19, pág. 34) mostra os sinais de metilas: δH 1,26, 0,95,

0,80 e 0,77 e um sinal em δH 1,69 (s) correspondente à freqüência de metila ligada a carbono sp2. Os sinais referentes aos hidrogênios vinílicos estão representados por dois singletos largos em δH 4,57 e 4,70, o sinal em δH 3,19 representa o hidrogênio do carbono metínico oxigendo (H-3) o sinal em δH 5,1 representa os hidrogênios (H-12) de α e β-amirina. Através do CG-EM e comparação com padrões da biblioteca do equipamento (Figuras 20 e 21, pág. 35) e comparação com amostra padrão da mistura, permitiu identificar os três isômeros triterpênicos lupeol (3a), α-amirina (3b) e β-amirina (3c).

34

Figura 19: Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do Lupeol (3a), α-amirina (3b) e β-amirina (3c).

.

35

Figura 20: Espetro de massas de 2 (a) comparado com a biblioteca do aparelho.

Figura 21: Espetro de massas de 2 (b e c).

36

5.2.5. Substância 4 O biflavonóide 4 foi identificado como um derivado da agatisflavona, devido a

semelhança do espectro de RMN 1H com da substância com a isolada anteriormente (MOREIRA et al., 1999; DANIEL et. al., 2005), além do sinal de um grupo metoxila cuja posição foi definida através de análises com técnicas especiais de RMN.

O espectro de IV de 4 (Figura 22, pág. 37) revela bandas de absorção para grupo hidroxila (3392 cm-1, estiramento O-H), grupamentos C=O (1648 cm-1) de carbonila conjugada e C=C (1604 cm-1, 1504 cm-1, 1442 cm-1) de anel benzenóide. O espectro de RMN 1H (Figura, 23, pág. 39) mostra sinais de átomos de hidrogênios atribuídos a dois sistemas AA’BB’ dos anéis C e C” δH 7,98 (d, 2H, J= 8Hz), 7,65 (d, 2H, J= 8 Hz), 7,05 (d, 2H, J= 8 Hz) e 6,84 (d, 2H, J= 8 Hz), quatro singletos atribuídos a H-3, 8, 3” e 6” com δH 6,70, 6,78, 6,65 e 6,56, respectivamente e uma metoxila (δH 3,89, s, 3H). Os sinais em δH 9,37 para hidroxila livre e δH 13,26 e 13,41 para os dois grupos hidroxilas em ligação de hidrogênio com carbonila. O espectro de 1H,1H-COSY (Figuras 24, pág. 40) apresentou sinais de interação de acoplamento entre H-2’,6’ (δH 7,65) com H-3’,5’ (δH 6,84) e H-2’”,6’” (δH 7,98) com H-3’”,5’” (δH 7,50). Confirmando os pares de dubletos de cada sistema para substituído.

O espectro de RMN 13C da substância 4 (Figuras 28-30, pág. 44 e 45) mostra os valores de deslocamentos dos carbonos metínicos CH-8 (δC 94,7) e CH-6” (δC 96,4), e para os carbonos quaternários 6 e 8” (δC 104,3 e 104,0 ppm). Os valores dos deslocamentos químicos indicam que os carbonos 6 e 8” estão envolvidos na ligação interflavonoídica, a comparação dos deslocamentos químicos dos carbonos de 4 (Tabela 4, pág. 40) com agatisflavona (CHARI et al., 1977; AGRAWAL, 1989) e 7”-O-metilagatisflavona (MOREIRA, et al., 1999) confirmam a proposta de estrutura semelhante desta biflavona como 4′,5,7-OH-flavona-(6→8′′)-5′′,4′′′-OH-7′′-OMe flavona.

Como citado anteriormente, o grupo metoxila poderia estar localizado em outra posição sem causar alteração significativa nos espectros e, assim não garante a identificação entre 4 como 7”-O-metilagatisflavona registrada na literatura. Fez-se experimentos de NOESY (Figuras 25, 26 e 27, págs. 41-43), HMBC (figuras 31-38, págs. 45-49) e HSQC (figura 39, pág. 50) e observou-se que a metoxila está próxima do singleto em δH 6,57 (H-6”), este hidrogênio está ligado ao carbono com δC = 95,7 e acopla a longa distância com H-O-5”(J3

H-C) Tabela 4, pág. 38. Ficando, então definida sua estrutura como o previsto: 4’,5,7-OH-flavona (6→8) 5”,4’”-OH-7”-OMe flavona (7”-O-metilagatisflavona).

37

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumber (cm-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75%

Tra

nsm

ittan

ce

3392.23

3172.38

2929.392850.32

1648.871604.51

1564.011504.23 1442.52

1363.451282.45

1214.951174.46

1108.89

1018.25

833.11

572.76


38

Tabela 4. Dados de RMN 1H e 13C (D3CCOCD3 ,1H e D3CSOCD3,

13C).da substâncias 4.

2

34

56

7 89

10

1'2'

3'

4'5'6'

2"

3"

4"

5"

6"7"

8"

9"

10"1"'

2"'

3"'

4"'5"'

6"'

O

O

OH

OH

HO

O

HO

O

OH

O

H3C

7”-o-metil agatisflavona

Substância 4

1H-13C-COSY C

δC

δC

δH CH 1JCH 2,3JCH

Noe

2 165,03 165,3 H-2’, H-3 3 103,22 104,4 6,70 H-2’,6’ 4 183,5 183,7 5 161,3 161,6 6 104,1 104,3 H-8 7 163,1 163,3 H-8 8 94,5 94,7 6,78 (s) 9 158,2 158,5 H-8

10 105,1 105,5 H-O-5, H-3 1’ 123,2 123,6 H-3’,5’, H-3

2’,6’ 129,3 129,3 7,98 (d,8Hz) 3’,5’ 116,8 117,1 7,05 (d, 8Hz)

4’ 161,8 162,0 2” 165,2 165,5 H-2’”,6’”, H-3” 3” 103,4 103,9 6,65 (s) H-2’”,6’” 4” 183,3 183,4 5” 163,4 163,8 H-O-5”, H-6” 6” 96,0 96,4 6,57 (s) H-O-5” H3CO-7” 7” 164,8 165,1 H3C-O 8” 101,0 104,0 H-6” 9” 155,5 156,0

10” 105,6 105,9 H-O-5”, H-6”, H-3” 1’” 123,2 123,6 H-3’”,5’”, H-3”

2’”,6’” 129,1 129,5 7,65 (d,8Hz) 3’’,5’” 116,8 116,9 6,84 (d,8Hz)

4’” 161,8 162,1 H-2’”,5’”, H-3”’,5’” OCH3 56,7 56,9 3,89(s,3H) H-O 5 13,4 H-O 5” 13,3

39

Figura 23: Espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do biflavonóide 4 (7”-O-metilagatisflavona)

40

Figura 24: Espectro de 1H-1H-COSY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4.

41

Figura 25: Espectro de 1H-1H-NOESY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4.

42

Figura 26: Ampliação do Espectro de 1H-1H-NOESY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4.

43


44

Figura 28: RMN de C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4

Figura 29: Ampliação(180-187 ppm) do Espectro de RMN de C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4

45

Figura 30: Ampliação (156-166 ppm) do Espectro de RMN de 13C (125 MHz , D3CCOCD3 ) da substância 4

Figura 31: Espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4.

46

Figura 32: Ampliação do espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4.


47



48

Figura 36: Ampliação do espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4


49

Figura 38: Ampliação do espectro de HMBC (D3CCOCD3 ) da substância 4

50

Figura 39: Espectro de HSQC (D3CCOCD3) da substância 4

51

5.2.6. Substância 5 O espectro no IV de 5 (Figura 40, pág. 51) evidencia bandas de absorção em 3425

cm-1 (estiramento O-H), 1651 cm-1 (estiramento de carbonila conjugada) e 1605 cm-1 (estiramento C=C de anel aromático) e 1367 cm-1 (estiramento C-O).

O espectro de RMN 1H (Figuras 41 e 42, pág. 53) possui sinais típicos de biflavonóide, sinais de dois sistemas AA’BB’ {(δH 7,88 (2H, J= 7,9 Hz), 7,56 (2H, J= 7,9 Hz), 6,93 (2H, J= 7,9 Hz) e 6,72 (2H, J= 7,9 Hz)}, quatro singletos em δH 6,38, 6,57, 6,62 (2x), atribuídos aos hidrogênios H-6”, 8, 3 e 3”. O sinal de δC=O (183,74 e 184,26) verificado no espectro de 13C (Figuras 43 e 44, pág. 54) estão compatíveis com os carbonos carbinólicos em ligação de hidrogênio (Tabela 5, pág. 52). A análise em CCDA revelou duas manchas próximas com R.F. 0,35 e 0,19 (CH3Cl/CH3COCH3 7:3). O espectro de RMN 1H apresenta sinais com menor intensidade em δH 3,89. Isso permitiu propor a mistura de Agatisflavona 5 com 7”-O-metilagatisflavona 4.

Para confirmar essa dedução fez-se a análise em CCDA, comparando com os padrões isolados anteriormente e a análise revelou que as substâncias possuíam o mesmo RF dos padrões. Utilizou-se também análise em CLAE utilizando sistema isocrático de metanol/água/acetonitrila/ácido acético (20:40:39:1) como fase móvel e velocidade de fluxo 1mL.min-1 , no comprimento de onda 270nm, da fração contendo 4 e 5, comparando-a com o padrão (7”-O-metilagatisflavona) e obteve-se os cromatogramas (figuras 45 e 46, pág. 55). O T.R=6,79 da 7”-O-metilagatisflavona permitiu confirmar a presença de 4 e o pico em T.R. = 3,93 foi atribuída a agatisflavona.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumber (cm-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

%T

rans

mitt

ance

3392.23

3172.38

2929.392850.32

1648.871604.51

1564.011504.23 1442.52

1363.451282.45

1214.951174.46

1108.891018.25

833.11

572.76


52

Tabela 5. Dados de RMN 1H (200 MHz) e 13C (50 MHz) em Acetona-D6, comparando com os dados de RMN de 13C da literatura (AGRAWAL, 1989) da substância 5 (agatisflavona).

C δC (Metanol-

D4)

δC (literatura-DMSO-D6)

δH(mult, Hz)

2 167,5 164,1 - 4 184,3 182,3 - 5 162,5 160,0 - 6 103,1 103,6 - 7 165,9 162,9 - 9 160,9 157,0 -

10 103,5 103,8 - 1’ 123,4 121,5 - 4’ 162,7 161,3 - 2” 166,3 163,9 - 4” 183,7 182,0 - 5” 162,5 160,9 - 7” 166,3 162,7 - 8” 101,1 99,4 - 9” 159,0 155,1 -

10” 103,5 104,0 - 1”’ 121,4 121,7 - 4”’ 162,5 161,2 - 3 103,1 103,1 6,70 (s) 8 95,9 93,7 6,81 (s)

2’,6’ 129,6 128,6 7,96 (d, 7,9) 3’,5’ 117,2 116,2 7,66 (d, 7,9) 3” 103,5 102,8 6,67 (s) 6” 101,1 98,9 6,57 (s)

2”’,6”’ 129,6 128,2 7,03 (d, 7,9) 3”’,5”’ 117,2 116,2 6,85 (d, 7,9)

6"'

5"'

4"'

3"'2"'

1"'

10"

9"

8"

7"

6"

5"

4"

3"2"

1"

2'

10

6

5 4

3

2

B'

C'

A'

CA

O

O

OH

OH

HO

OH

HO

O

OH

O

6'5'

4'

3'

1'9

87

1 B

53


8.0 7.5 7.0 6.5Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Inte

nsity

7.99 7.

95 7.68 7.

64

7.06

7.02

6.87

6.81

6.70 6.

65

6.57

Figura 42: Ampliação do espectro (6.0-8.5 ppm) de RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da mistura dos biflavonóides 4 e 5.

54

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0Chemical Shift (ppm)

-0.05

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65In

tens

ity

182.

36 164.

5116

2.54

161.

2715

7.42

154.

82

128.

41

122.

23

116.

04

104.

7010

2.68

95.2

593

.64

55.8

7


184 176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96Chemical Shift (ppm)

-0.05

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Inte

nsity

182.

36 164.

5116

2.54

161.

2716

0.40

157.

42

154.

82

128.

41

122.

23

116.

04

104.

7010

4.23

103.

1110

2.68

99.9

8

95.2

593

.64

Figura 44: Ampliação do espectro de RMN de 13C (50 MHz, D3CCOCD3) da mistura dos biflavonóides 4 e 5.

55

Figura 45: Cromatograma obtido em CLAE de 7”-O-metilagatisflavona (4).

Figura 46: Cromatograma obtido em CLAE da mistura 4 e 5.

56

5.2.7. Derivado 4a (hexametilagatisflavona).

A reação de metilação de 7”-O-metilagatisflavona com diazometano forneceu o derivado hexametilado 4a, através da substituição dos hidrogênios das hidroxilas por grupos metilas nas posições 7, 5, 5”, 4’, 4”’. A mudança significativa no espectro de RMN 1H de 4a, quando comparada com o biflavonóide natural 4 (7”-O-metilagatisflavona), foi o aparecimento de 5 sinais adicionais de metoxilas.

Os espectros de RMN 1H (1D e 2D 1H-1H-COSY) revelam sinais para os átomos de hidrogênios H-3”’,5”’ (δH 6,94, d, J=8,5) acoplando com H-2”’,6”’ (δH 7,69, d, J=8,5) e H-3’,5’ (δH 7,16, d, J=8,5) acoplando com H-2’,6’ (δH 8,11, d, J=8,5), correspondentes a dois sistemas AA’BB’. Os hidrogênios H-6”,3”,3 e 8 estão representados pelos sinais simples de δH 6,57, δH 6,69, δH 6,81 e δH 6,99, respectivamente. Os sinais das metoxilas 7, 7”, 5, 5”, 4’ e 4” aparecem no espectro em δH 4,07, 3,94, 3,61, 3,93, 3,88 e 3,77 ppm.

O espectro de RMN 1H (Figuras 47-49, pág. 58 e 59) de 4a mostra o desaparecimento dos sinais dos hidrogênios em ligação de hidrogênio em torno de 13 ppm e o revelando que ambas foram substituídas por grupos metilas. Os espectros obtidos com 1Hx1H COSY (Figura 50, pág. 60) e NOESY (Figuras 51 e 52, págs. 60 e 61), permitiram fazer a completa atribuição dos deslocamentos químicos dos hidrogênios de 4a (Tabela 6, pág. 57). Os sinais de interações espaciais detectados no espectro NOESY permitiram confirmar as localizações e os respectivos deslocamentos químicos: MeO-4’ com interação espacial com H-3’,5’ (δH 7,05), MeO-4”’ com interação espacial com H-3”’,5”’ (δH 6,84), MeO-7 com interação espacial com H-8 (δH 7,01) e MeO-7”, pela interação espacial com H-6” (δH 6,73).

O espectro de RMN 13C de 4a (Figura 53 e 54, págs. 61 e 62) foi comparado com a literatura (MOREIRA et al,, 1999). O espectro de HMQC (Figura 55, pág. 63) permitiu estabelecer as correlações diretas (1

JCH) enquanto que os deslocamentos químicos dos carbonos não hidrogenados deste derivado foram estabelecidos pelos espectros de HMBC através (2,3

JCH). (Figura 56, pág. 64).

57

2

34

56

7 89

10

1'2'

3'

4'5'6'

2"

3"

4"

5"

6"7"

8"

9"

10"1"'

2"'

3"'

4"'5"'

6"'

O

O

OCH3

OCH3

H3CO

O

H3CO

O

OCH3

O

H3C

Tabela 6: Dados de RMN 1H (200 MHz) e 13C (50 MHz) da substância 4 (MOREIRA et al., 1999) com o derivado 4a.

Substância 4 Derivado 4a HMBC

C δC

δC

δH CH 1JCH 2,3JCH

Noe

2 165,03 161,8 H-3;H-2’,6’ 3 103,22 107,6 6,91(s,1H) 4 183,5 177,1 H-3 5 161,3 159,7 CH3O- 6 6 104,1 113,8 H-8 7 163,1 163,2 H3CO- 7; H-8 8 94,5 95,8 7,0(s,1H) OCH3-7 9 158,2 160,5 H-8

10 105,1 105,9 1’ 123,2 123,7 H-3’,5’

2’,6’ 129,3 128,1 7,96(d,8Hz,2H) 3’,5’ 116,8 114,8 7,1(d,8Hz,2H) OCH3-4’

4’ 161,8 163,4 H3CO- 4’;H-2’,6’;H-3’,5’ 2” 165,2 161,2 H-3”;H-2’”,6’” 3” 103,4 106,0 7,26(s,1H) 4” 183,3 178,3 5” 163,4 162,0 H3CO- 7”;H-6” 6” 96,0 92,4 6,6(s,1H) H-6” OCH3-5”,H3CO-7” 7” 164,8 162,8 8” 101,0 103,1 H-6”;H-3” 9” 155,5 157,3 H-3’’,5’”

10” 105,6 107,0 1’” 123,2 124,0

2’”,6’” 129,1 128,1 7,50(d,8Hz,2H) H-2’”,6’”;H-3’”,5’” 3’’,5’” 116,8 114,9 6,86(d,8Hz) OCH3-4’”

4’” 161,8 163,1 OCH3-5 62,4 3,62 OCH3-7 56,5 3,88 H-8 OCH3-4’ 55,9 3,93 H-3’,5’ OCH3-5” 56,8 4,03 H-6” OCH3-7” 56,7 56,4 3,95 H-6” OCH3-4’” 55,7 3,82 H-3’”,5’”

58

Figura 47: Espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do derivado 4a.

59



60

Figura 50: Espectro de 1H-1H-COSY (500MHz, D3CCOCD3) de 4a.

Figura 51: Espectro de NOESY de 4a.

61

Figura 52: Ampliação do espectro de NOESY de 4a.

Figura 53: Espectro de 13C (125MHZ, D3CCOCD3)de 4a.

62

Figura 54: Ampliação do espectro de 13C (125MHZ, D3CCOCD3) de 4a.

63

Figura 55: Espectro e ampliação (3-5 ppm) de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4a.

64

Figura 56: Espectro e ampliação (3,7-4,1 ppm) de HSQC (D3CCOCD3) da substância 4a.

65

5.2.8. Substância 6

Uma fração do extrato metanólico partição clorofórmio, foi analisada em CCDA e revelou a presença de um componente terpênico e biflavonóide.

O espectro de IV desse material (Figura 57, pág. 66) revelou bandas de absorção em 3408 cm-1 de estiramento axial de O-H, bandas em 2959 e 2934 e 2870 cm-1 de νC-H (CH2 e

CH3), 1633 (νC=C); 1460,1380 (νC-C); 1164-1023 (νC-O); 1648 (νC=O); 1604,01504 e 1442 νC=C

(aromático); 1214 e 1174 (νC-O); 833 δ=C-H (2 H vizinhos). Compatíveis com o revelado em placa.

O espectro de RMN 1H deste material (Figura, 58, pág. 68) apresenta sinais de metilas entre δH 0,63 e δH 0,94, de hidrogênio alifático e em δH 5,34, típico de H-6 de fitosteróides. Além dos sinais da parte da aglicona aparecem sinais em δH 3,10 (m, H-5´), 4,22 (d, H-1’), 2,91 (m, H-2’), 3,02 (m, H-4’) e 3,15 (m, H-3’) que podem ser atribuídos aos hidrogênios do carboidrato. Esta unidade de açúcar pode ser atribuída como β-glicosídeo devido à presença do dubleto em δ 4,23 (J=8 Hz) que representa o hidrogênio anomérico (H-1’) acoplando com o hidrogênio H-2’ trans-diaxial. Os demais valores dos sinais de H-3’, 4’, 5’ e 6’ estão assinalados na Tabela 7, pág. 67.

Os espectros de RMN 13C (Figuras, 59 e 60, pág. 69 e 70) de 6 apresentam 4xCH e um CH2 do açúcar, sendo um com δ 103,4 do CH anomérico. A comparação dos deslocamentos químicos dos carbonos metínicos de 6 com valores da literatura, permitiu propor a glicose como representante da unidade de açúcar ligado no C-3 do esteróide. A comparação dos dados de 6 com valores atribuídos para o sitoesterol glicosilado permiiu identificar como 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol. Na parte da aglicona temos δC 70,1 do CH-3. Os sinais dos carbonos sp2 em δC-5 140,4 e δC-6 121,0, são compatíveis com os dois carbonos sp2 (C-5 e C-6) do sitosterol de acordo com comparação dos valores de 13C com os da literatura (VELANDIA, 2002). Os sinais de H em anel aromático no espectro de RMN 1H, confirmam a presença do biflavonóide agatisflavona como impureza na fração.

66

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500Wavenumber (cm-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75%

Tra

nsm

ittan

ce

3392.23

3172.38

2929.392850.32

1648.871604.51

1564.011504.23 1442.52

1363.451282.45

1214.951174.46

1108.89

1018.25

833.11

572.76

Figura 57: Espectro de IV da substância 6.

67

Tabela 7: Dados de RMN de 1H e 13C da substância 6

2120 22

2324

2526

27

28

29

1

2

34

56

7

8

9

10

11

12

13

14 15

16

17

18

19

1'2'

3'

4' 5'

6'O

OH

OHHO

HOO

6

Substância 6 Literatura (VELANDIA, 2002)

C δC δH δC 1 36,7 37,3 2 32,2 31,6 3 70,1 3,47 71,8 4 41,8 42,9 5 140,4 140,7 6 121,0 5,34 121,7 7 31,2 31,9 8 31,3 31,9 9 49,5 50,1

10 36,1 36,4 11 22,6 21,1 12 39,2 39,8 13 41,7 42,9 14 56,1 56,7 15 25,5 24,3 16 27,6 28,24 17 55,4 56,0 18 11,5 0,63 11,9 19 19,5 0,94 19,4 20 35,3 32,2 21 18,8 14,0 22 33,3 33,9 23 38,2 39,1 24 45,1 45,8 25 28,7 26,0 26 18,8 0,89 18,8 27 18,9 0,78 19,0 28 23,7 0,87 23,0 29 117,7 0,82 12,0 1’ 103,4 4,23 101,4 2’ 74,8 2,91 73,3 3’ 77,8 3,15 76,5 4’ 71,9 3,02 70,3 5’ 75,4 3,10 73,7 6’ 65,0 3,71 64,4

68

Figura 58: RMN de 1H (400MHz, DMSO-d6) da fração contendo a substância 6.

69

Figura 59: RMN de 13C (125MHz, DMSO-d6) da fração contendo a substância 6.

70

Figura 60: Ampliação do RMN de 13C (125 MHz, DMSO-d6) da fração contendo a substância 6.

71

5.3. ANÁLISE COM CLAE DAS FRAÇÕES OSPGMC E OSPMC-16P. Considerando que estas frações continham mistura de flavonóides resolveu-se fazer

análise cromatográfica. O cromatograma obtido com CLAE utilizando sistema isocrático de metanol/água/acetonitrila/ácido acético (20:40:39:1) como fase móvel e velocidade de fluxo 1mL.min-1 e detecção UV (λmáx=270nm), confirmaram a presença de outros componentes na fração OSPMC (figura 61, pág. 71) além de agatisflavona e 7”-O-metil-agatisflavona e na fração OSPMC-1-6P (figura 62, pág. 72) que continha como componente majoritário a 7”-O-metil-agatisflavona.

Figura 61: CLAE da fração OSPGMC.

72

Figura 62: CLAE da fração OSPMC1-6p.

A análise CLAE-EM dessas frações, “ricas em flavonóides”, permitiu detectar os valores de m/z de várias faixas de tempo de retenção reveladas pelos picos representantes dos componentes da mistura. A análise desses valores, aliada às possibilidades de substituição com grupos freqüentes em flavonóides isolados de Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail. em trabalhos anteriores (Suzart, 2007; Suzart et al., 2007; Daniel, 2005), a análise do espectro de RMN de 1H (figuras 63 e 64, pág. 73) e considerando a possibilidade de formação de “adutos” com traços dos solventes utilizados, pôde-se propor estruturas que certamente estão presentes no material analisado. Os sinais no espectro de RMN de 1H na região entre δH 4,22ppm e δH 3,10ppm podem ser atribuídos aos hidrogênios do carboidrato. Possui também sinais típicos de biflavonóide, como os dubletos na região entre δH 7,93ppm e 6,60 ppm e singletos em δH 6,57ppm e 6,39ppm. Os esquemas 2 e 3 foram utilizados para facilitar esta interpretação. Nesses são apresentadas as estruturas dos flavonóides que incorporadas aos substituintes (R e/ou R’) ou resíduos de solventes chega-se aos valores de m/z detectados. Estas propostas dependem de análises adicionais como EM/EM dos íons detectados, o que confirmaria a formação de “adutos” e, assim, as estruturas propostas poderão ser aceitas com maior segurança. A análise da fração OSPMC permitiu a identificação dos valores de m/z

para os picos detectados no CLAE-EM e estão representados na Figura 65, pág. 74 e Esquema 2, pág. 75, foi possível propor a metil-vitexina e orientina (B), ramnosil-triidroxiflavona (K), agatisflavona (F), metil-agatisflavona (H) e dimetil-agatisflavona (G) cujas estruturas estão representadas na Figura 66, pág. 76. A análise da fração OSPMC1-6P (Figura 67, pág. 77 e Esquema 3, pág. 78) permitiu confirmar a metil-agatisflavona (A1) como componente majoritário, além das metil-diidroxiflavonas (B1 e D1), a ramnosil-triidroxiflavona (C2) e a glicopiranosil-prenil-diidroxi-flavonol (D2) (Figura 68, pág. 79).

73

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0Chemical Shift (ppm)

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0.11

Inte

nsity

7.93

7.58 6.97

6.78

6.71

6.58

6.39

5.95

4.91

4.54

4.20

3.87

3.80

3.53

3.45

3.32

3.18

2.31

2.08 1.

58

1.28

Figura 63: Espectro de RMN 1H (200MHz, D3CCOCD3) da fração OSPGMC.


-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

Inte

nsity

2.16

2.63

3.32

3.87

4.61

6.586.68

6.78

6.98

7.58

7.89

Figura 64: Espectro de RMN 1H (200MHz, D3CCOCD3) da fração OSPGMC1-6p.

74

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90

0.95

1.00

1.05

(x1,000,000)

2:362.9385 (1.00)2:538.0868 (1.00)2:537.5871 (1.00)2:537.0852 (1.00)2:625.1173 (1.00)2:601.1201 (1.00)2:487.1238 (1.00)2:617.1128 (1.00)2:498.9165 (1.00)2:378.9185 (1.00)1:553.1105 (1.00)1:417.2701 (1.00)1:318.3065 (1.00)1:411.0863 (1.00)1:569.1177 (1.00)1:404.0743 (1.00)1:539.1052 (1.00)1:359.0735 (1.00)1:489.1444 (1.00)1:505.1434 (1.00)1:477.1416 (1.00)1:447.1322 (1.00)1:349.1897 (1.00)1:260.0457 (1.00)1:241.0522 (1.00)

A-Raw Spectrum[0.687->1.273]Event1 (Modo +)m/z

241.0522260.0457349.1897Event2 (Modo -)m/z378.9185498.9165

C-Raw Spectrum[5.540->6.813]Event1 (Modo +)m/z

505.1434Event2 (Modo -)m/z617.1128

B-Raw Spectrum[3.887->4.987]Event1 (Modo +)m/z447.1322477.1416

D-Raw Spectrum[6.813->8.013]Event1 (Modo +)m/z489.1444Event2 (Modo -)m/z487.1238601.1201625.1173

E-Raw Spectrum[8.013->9.047]Event1 (Modo +)m/z

359.0735

F-Raw Spectrum[10.427->12.113]Event1 (Modo +)m/z539.1052Event2 (Modo -)537.0852538.0868

G-Raw Spectrum[12.180->13.280]Event1 (Modo +)m/z

404.0743569.1177

H-Raw Spectrum[13.313->14.487]Event1 (Modo +)m/z553.1105

I-Raw Spectrum[14.487->15.620]Event1 (Modo +)m/z411.0863

J-Raw Spectrum[19.407->20.267]Event1 (Modo +)m/z

318.3065

K-Raw Spectrum[21.367->22.400]Event1 (Modo +)m/z

417.2701

AB

CD E

FH

GI J K

A’

A”

B

C’D’

F’F”

D”D’”

F’”

G

241260349447

477505489359

539404569411 318

417553

A

Exp 1(modo +)

Exp 2(modo -)

OSPMC

Figura 65: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da fração OSPGMC.

75

ORO

OH O

OH

R'

C15H9O5

(269)

R ou R'

OOH

OHOH

HO(163)

SolventesH2O (18)H3CCN(41)H3C-OH (32)

OH

O(60)Grupo

CH3

+ 163 + 41 + 32 505 (C)

+ 163 446 (B)

+ 163 + 41 489 (D)

+ 163

C5H9

(69)

+ 4 H 505 (C)O OH

OHHO

(147)

+ H+417 (K)

+ 69

+ 147

O

R'

RO

OH O

O

O

O

C15H9O6(285)

+ 163 448 (B)

+ 32 + 18

+ H+318 (J)

+ 14 349 (A)

+ 32

+ 60+ 14 359 (E)

+

ou

569 (G)+ 14 + 14 + 3 H++ 269

553 (H)b+ H++ 269

539 (F)b+ H++ 269

ORO

OH O

O

+ 14

+269

+ 269

+269

269

+14

m/z [RS]a

a m/z [RS] ="Raw Spectrum", faixa do(s) picos do CLAE; bDetectadas na análise dos espectros de RMN na fração deste material.

Esquema 2: Propostas de estruturas compatíveis com os valores de m/z detectados na análise de CLAE-EM (Figura 65)

76

O

OH O

OH

MeO

O

OHOH

OH

OH

O

OH O

OH

HO

O

OH

OH

OH

BB

O

OH O

OH

HOOH

O

OHOH

OH

OH

K

O

O

OH

OH

HO

HO

O

OH

O

O

O

OH

OH

HO

HO

O

OH

O

HO

F

H

O

O

OH

OH

MeO

HO

O

OH

O

MeOMeO

G Figura 66: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGMC.

77

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6(x1,000,000)

2:665.0944 (1.00)2:551.1005 (1.00)1:571.1379 (10.00)1:561.4056 (1.00)1:517.3749 (1.00)1:473.3534 (1.00)1:429.3240 (1.00)1:385.2992 (1.00)1:341.2723 (1.00)1:417.2693 (1.00)1:284.3329 (1.00)1:553.1206 (1.00)

A. Raw Spectrum [13.060->15.233]Event 1 (Modo +)m/z Abs. Inten. Rel. Inten.A1: 553.1206 159599 100.00

[metil-agatisflavona]Event 2 (Modo -)551.1005 52936 38.45 (M-2H)665.0944 7293 5.30

[M+AcAcetico+MeOH+H2O]B- Raw Spectrum [19.393->20.180]

[25->26]Event 1 (Modo +)m/z Abs. Inten. Rel. Inten.

B1: 284.3329 3113 5.20[269 + 14 (metil)]

C. Raw Spectrum [21.460->22.280]Event 1 (Modo +)m/z Abs. Inten. Rel. Inten.413.2763 2900 6.01C2: 417.2693 8432 17.47[269 + 147(ramnose) + H]D. Raw Spectrum [22.527->23.347]Event 1 (Modo +)m/z Abs. Inten. Rel. Inten.D1. 284.33774973 5.64

[269 + 14 (metil)]341.2723 21998 24.95385.2992 88164 100.00429.3240 72304 82.01473.3534 38277 43.42D2. 517.374917511 19.86[516 + H = Gic-Prenil-Flavonol]561.4056 4613 5.23

AB

C

D

Figura 67: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da fração OSPGMC1.6p .

78

ORO

O

OH

OH

C15H9O5

(269)

R ou R'

OOH

OHOH

HO(163)

SolventeH2O (18)H3CCN(41)H3C-OH (32)

OH

O

(60)

Grupo

CH3C5H9

(69)

ORO

OH O

OH

OHR

C15H9O6(285)

+ 163 517 (D2)

(269)

* Detectado na análise dos espectros de RMN na fração deste material.

+ 69

ORO

OH O

OH

+14 284 (B1,D1)+H+

+18+32+60551 (A2)

553 (A1)*+ H++ 269 + 14+ 269

+ 2H++ 269 + 269


79

O

OH O

OH

HO

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

HO

HO

O

OH

O

MeO

A1

O

OH

OH

MeO

O

B1D1

C2

O

OH O

OH

O

OH

O

HO

HO

HO

OH

D2 Figura 68: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGCM1.6p.

80

5.4. Propostas Biossintéticas para os constituintes isolados de Ouratea hexasperma var.

planchonii Engl. Uma das principais considerações em determinação estrutural é o conhecimento da

biossíntese das diferentes classes dos metabólitos especiais, por isso incluímos este capítulo para auxiliar na determinação das estruturas das substâncias isoladas de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl.

As substâncias isoladas da espécie estudada neste trabalho, pertencem a classe dos ácidos alifáticos, dos esteróides (β-sitosterol, estigmasterol, campesterol e 3-O-β-D-glucopiranosil sitosterol); dos triterpenos (lupeol e α e β-amirina) e dos biflavonóides (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona). A seguir apresenta-se algumas propostas biossintéticas.

5.4.1. Ácidos graxos Os ácidos graxos são formados pela ligação de unidades de ácido acético (C2) via reação de condensação. A biossíntese envolve a conversão do acetil-CoA em malonil-CoA, que são convertidos em acetil-ACP e malonil-ACP, ocorrendo então a condensação de Claisen e formação do β-ceto acil-ACP que, após reduções, formam os ácidos graxos com um número par de átomos de carbono, esquema 4 (DEWICK, 2002). Através de oxidações α ocorre a perda de um átomo de carbono, fornando ácidos graxos de cadeias com número ímpar de carbonos, esquema 5 (HARWOOD, 1997).

Esquema 4: Biossíntese de ácidos graxos (adaptado de DEWICK, 2002)

Biotina + ATP+CO2

Acetil-CoAcarboxilase

ACP

CO2H

CH2CO-SCoA

malonil-CoA

CH3CO-SCoA acetil-CoA

RCH2CO-S-ACP acetil-ACP

CO2H

CH2CO-S-ACP

malonil-ACP

RCH2COCH2CO-S-ACP β-ceto acil-ACP

Reação de Claisen

NADPHCH2CO-S-ACP

H OH

R

β-hidroxil acil-ACP

E2

eliminação de H2O

- H2O

RCH2

CO-S-ACP

α−β-insaturado acil-ACP

Redução de carbonila

NADPH

Redução da ligação dupla

RCH2CH2CH2CO-S-ACP Acil-ACP graxo

Cada volta extendea cadeia dogrupo acil

HSCoA

R(CH2CH2)nCH2CO-S-CoA Acil-CoA graxo

R(CH2CH2)nCH2CO2H Ácido graxo

H2O

[malonil]n

81

Esquema 5: Proposta de a-oxidações em aácidos graxos (HARWOOD, 1997).

2H+ + 2e H2OOOH

OH

CO O

C

R

HL HD

CO O

C

R

HL

-XH

XH2

-

CO

C

R

HL

O

XH2O2

-

CO O

C

R

HL

OH

CO2

C

R

H O

NAD+

OH

R

Cpróximo ciclo

CO O

C

R

HL

-

82

5.4.2. Esteróides As substâncias sitosterol, estigmasterol, campesterol e 3-O-β-glicosilpiranosil

sitosterol se caracterizam por ter um esqueleto básico de 27 carbonos dispostos num sistema tetracíclico. Biogeneticamente formam-se via pirofosfato de isopentenila originando o esqualeno, estrutura que contém duas unidades de farnesil pirofosfato ligadas cauda-cauda. O esqualeno epoxi (óxido de esqualeno), em sua forma cadeira-bote-cadeira–bote, cicliza após vários rearranjos do tipo 1,2 formando o cicloartenol, estrutura que contém 24 carbonos. O cicloartenol após clivagem oxidativa de três metilas forma os esteróides (Esquema 6).

Esquema 6: Proposta biogenética para os esteróides (Adaptado de MANN, 1994).

OPPR OPPR H+

OPPR

PPO

HHOPP

Esqualeno

O2

NADPH

HO

HH

HO

HH

HO

HH

OPP

H

NADPH

HO

HH

HO

HH

SITOSTEROL

ESTIGMASTEROL

HO

HH

H2C H

HOH

H

HH

OXIDO DE ESQUALENO

H+

HO

HHCH3

S

HO

HHH

CH3S

Gli-O

HH

3-O-β−GLICOSILPIRANOSILSITOSTEROL

GLICOSILAÇÃO

O

[O] dasmetilas

83

5.4.3. Terpenos Os terpenos constituem uma classe de substâncias provenientes da via pirofosfato de

isopentenila, que da mesma forma que os esteróides, da origem ao esqualeno pela fusão cauda-cauda de duas unidades de farnesil. No caso dos terpenos o óxido de esqualeno em sua forma cadeia-cadeira-cadeira-bote é ciclizado para gerar o cátion dammarenil e, conseqüentemente, o cátion lupenil que pode ser estabilizado pela formação de um novo anel de cinco membros gerando compostos do tipo lupeol. O cátion lupenil também pode ser estabilizado pela formação do anel de 6 membros, gerando o cátion oleanil. Esse é estabilizado com migração de uma metila e rearrango do tipo Wagner-Meerwein gerando o núcleo básico α-amirina (Esquema 7).


PPO

HHOPP

Esqualeno

O2

NADPH

OPP

H

HOH

H

H

OXIDO DE ESQUALENOH+

O

HO

H

H

H

HO

H

H-H+

LUPEOL

HO

H

H

HO

H

H

H

H

HO

H

H

HH

H

HOH

CATION LUPENIL

αααα - AMIRINA

CATIÓN TARAXASTERIL

W-M

REARANJO

a

a

H H

H H

HOH

H

H

ββββ -AMIRINAH

H

H H

84

5.4.4. Biflavonóides

Os flavonóides derivam seu esqueleto de 15 carbonos, de dois precursores básicos: malonil-CoA e p-coumaroil-CoA. Na reação biossintética ocorre condensação de três moléculas de malonil-CoA com a molécula de p-coumaroil-CoA formando uma chalcona intermediaria (1,3 difenilpropano-1-ona). Da chalcona são formadas estruturas de três anéis, as flavanonas, a partir das flavanonas formam-se todas as outras classes de flavonóides (HARBONE & BAXTER, 1999). Através da formação de dímetos da apigenina formam-se os biflavonóides, agtisflavona e 7”-O-metilagatisflavona (Esquema 8).


O

CoAS

OH

3 Malonil CoA

SCoA

O

O

O O

OH

CLAISEN

Chalcona sinstase

O

O

HO

OH

OH

O

O

HO

OH

4-HIDROXICINAMOIL-CoA

NARINGENINAAPIGENINA

OOH

HO OH

OH

O

OOH

OH

H-OO

OOH

OH

O

O

O

O

HO

OH

O

OOH

OH

O

H

H

O

O

O

HO

OH

O

OOH

OH

OHHO

SAM

O

O

HO

OH

O

OOH

OH

OMeHO

O

OOH

OH

H-O

AGATISFLAVONA

7"-O-METILAGATISFLAVONA

85

5.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS

Os ensaios biológicos realizados foram de atividade antibacteriana, atividade antifúngica, atividade inseticida e de avaliação da toxicidade. O ensaio de atividade antibacteriana foi realizado no Laboratório de Bacteriologia Veterinária do Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, do Instituto de Veterinária – IV da UFRRJ sob orientação da Professora Dra. Miliane Moreira Soares de Souza. O ensaio de atividade antifúngica foi realizado no Laboratório de Leveduras Patogênicas e Ambientais do Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária – IV da UFRRJ sob orientação do Professor Dr. Francisco de Assis Baroni. A Avaliação da atividade inseticida foi realizada no Laboratório de Miíases Tropicais do Departamento de Parasitologia Animal-UFRRJ, sob orientação do Professor Dr. Gonzalo Efrain Moya Borja e colaboração do mestrando Élio Barbieri Junior. A avaliação da toxicidade do extrato metanólico foi realizado no laboratório de Farmacologia do Departamento de Fisiologia Animal IB/UFRRJ, sob orientação dos professores Fábio Fagundes Rocha e Frederico Argollo Vanderlinde. 5.5.1. Avaliação da Atividade Antibacteriana do Extrato Metanólico de Ouratea


A metodologia utilizada foi adaptada do teste de difusão em placas desenvolvido por Kirby-Bauer. Esta metodologia é amplamente utilizada no mundo como teste-padrão para ensaios biológicos, devido a simplicidade e eficiência na reprodução dos resultados obtidos e é regulamentado internacionalmente pelo Clinical Laboratory Standards Institute (WAYNE, 2005).

AS bactérias utilizadas para a realização deste experimento foram escolhidas por representar os dois grandes grupos bacterianos existentes: a espécie Gram-positiva Staphylococcus aureus, um isolado clínico sensível e outro resistente, e a espécie Gram-negativa Escherichia coli, ambas derivadas de isolados clínicos de mastite. (JAWETZ, 2000).

Staphylococcus aureus As bactérias da espécie Staphylococcus aureus são cocos gram-positivos, membro da

família Micrococcaceae, habitantes naturais da pele e membranas mucosas de humanos e animais (KONEMAN et. al, 2001). Estão envolvidas em uma série de processos infecciosos de grande importância na clínica médica humana e veterinária. Em humanos, S. aureus

é a principal causa das infecções hospitalares.

Escherichia coli A espécie Escherichia coli representa bactérias gram-negativas entéricas largamente

disseminadas no ambiente. Além do impacto sobre a saúde, a E. coli é um dos mais bem estudados modelos bacterianos, e nos últimos anos vem apresentando uma drástica mudança em seu perfil de sensibilidade aos antimicrobianos (JAWETZ, 2000).

Foram utilizadas 3 amostras de microrganismos, sendo duas de Staphylococcus

aureus, uma de Escherichia coli. Para S.aureus, foram utilizados isolados clínicos oriundos de quadros de mastite bovina, sendo um dos isolados resistente aos antibióticos usuais. O isolado clínico de E. coli, de mesma origem, foi classificado como sensível.

Os isolados bacterianos foram estocados em freezer a -200 C e repicados em caldo enriquecido. Posteriormente foram incubados em estufa a 37 ºC por 24 horas, para ativação de seu metabolismo. Após o crescimento, foi realizada uma bateria de identificação presuntiva consistindo na coloração de Gram, realizada após o período de incubação de 24 horas, para observação das características morfotintoriais, e no teste da catalase, para observação da

86

quebra do peróxido de hidrogênio (H2O2), pela enzima catalase (KONEMAN et. al, 2001). Como as amostras já haviam sido previamente identificadas, estes procedimentos foram realizados para garantir que não houve contaminação das amostras.

As amostras bacterianas foram inoculadas em caldo enriquecido, e incubadas em estufa a 37 ºC por 24 horas antes da realização dos ensaios, para que todas estivessem em fase exponencial de crescimento durante o experimento. Após o período de incubação, o crescimento deveria ser equivalente ao tubo 0,5 da escala de MacFarland, correspondendo a uma concentração de 1,5 x 108 UFC/mL, ideal para os ensaios de avaliação de antimicrobianos, obedecendo às recomendações do órgão responsável pela aceitação de testes como padrão, o Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).

O extrato metanólico de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. foi utilizado na concentração de 500mg/mL. Para realização do ensaio de difusão, 50µL de uma solução do material-teste na concentração de 500mg/mL foi inoculada em um poço feito no centro da placa contendo o ágar Mueller Hinton, como postulado pelo CLSI, semeado com 100µL de caldo de cultura do microorganismo previamente identificado. Na incubação, o extrato se difunde radialmente em todo o ágar em volta do poço enquanto o microorganismo está crescendo no ágar. Isto resulta em uma zona de inibição de crescimento ao redor de cada disco de aplicação (TRUJILLO, 2002).

O dimeltilsulfóxido (DMSO), veículo utilizado nas amostras-testes, foi testado separadamente para verificação de uma possível atividade antimicrobiana. Após realização dos ensaios com o veículo, foi comprovada sua inatividade sobre o crescimento bacteriano, permitindo o prosseguimento dos testes com as diluições do extrato. Foi possível detectar a formação de halo de inibição nos ensaios frente ao isolado testado de Escherichia coli e a um isolado de Staphylococcus aureus que já se mostrara resistente aos antibióticos de eleição. No entanto, o outro isolado testado de Staphylococcus aureus não apresentou halo de inibição nos ensaios realizados. Avaliações adicionais devem ser feitas para confirmar a atividade antibacteriana. 5.5.2. Verificação de atividade antifúngica do Extrato Metanólico de Ouratea


Para a verificação de atividade antifúngica, foram realizados dois experimentos, o primeiro com o extrato metanólico bruto de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. e o segundo com a fração clorofórmica do extrato metanólico. A metodologia utilizada para o primeiro experimento, com o extrato metanólico bruto, foi utilizando o meio Sabouraud dextrose a 3% acrescido do extrato da planta, em tubos de ensaios. Para o segundo experimento, utilizando a fração clorofórmica do extrato metanólico, em placas de Petri com o meio Sabouraud dextrose a 3% e discos de papel, a partir de círculos de pré-filtros semelhantes aos discos empregados nas provas de antibiograma, embebidos com a fração do extrato da palnta. A avaliação foi realizada com os seguintes microrganismos: Candida

albicans, Cryptococcus neoformans, Malassezia pachydermatis, Rhodotorula spp e Aspergillus niger. Candida albicans

Candida albicans está freqüentemente relacionada às micoses mais comuns que acometem os seres humanos, é um habitante normal do trato gastrointestinal e regiões mucocutâneas, incluindo boca e vagina. Milhares de células da levedura podem estar presentes em um indivíduo, sem qualquer efeito danoso, entretanto, C. albicans é também, dentre os fungos, o de maior patogenicidade aos humanos (SCHMID, 2003).

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Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans é um basidiomiceto, que se apresenta na forma tecidual

como levedura encapsulada, corresponde a duas variedades fúngicas, com quatro sorotipos: var. neoformans (sorotipos A e D) e var gattii (sorotipos B e C). É fungo que vive em solos contaminados com fezes de pombos (var. neoformans) e junto a eucaliptos (var. gattii). A infecção criptococócica mais freqüentemente ocorre em pacientes imunodeprimidos (var. neoformans, fungo oportunista), mas pode ocorrer no hospedeiro normal (var. gattii, patógeno primário) (KWON-CHUNG et al., 1992).

Malassezia pachydermatis Malassezia pachydermatis se apresenta de forma isolada ou em grupo, faz parte da microbiota da pele e quando ocorrem alterações no microambiente local como aumento da umidade, da temperatura e do substrato, estimulam o aumento do número de células desta levedura, fazendo-a passar da forma comensal para o parasitismo. (NOBRE et al., 1998). Rhodotorula spp

Leveduras do gênero Rhodotorula são produtoras de pigmentos carotenóides de pigmentação amarela ou vermelha, têm sido associados a alterações de cor dos alimentos. (FRANCO E LANDGRAF, 2004). Embora infecções sérias devido a Rhodotorula spp em humanos são raras, foram informados septicemia, endocarditis, meningites, ventriculitis, peritonitis, keratitis, endophthalmitis, dacryocystitis, e pneumonia. (RUSTHOVEN et al., 1984).

Aspergillus niger

Os aspergillus tem ampla distribuição geográfica, e encontram-se no solo, ar, plantas e matérias orgânicas em geral, sendo contaminantes comuns em laboratórios e hospitais (MINOMI, 2003). Aspergillus niger geralmente está associado nos casos de otomicose, aspergilomas e infecções dos seios nasais. (FISHER, 2001) Primeiro Experimento

Para o primeiro experimento utilizou-se o meio Sabouraud dextrose a 3%, acrescido do extrato da planta. A fórmula do Sabouraud, normalmente feita para 100mL foi preparada para 60mL e os 40mL restantes de H2O destilada que completariam o volume foram esterilizados em autoclave e usados para diluir 3g do extrato. Este após a diluição foi submetido a exposição a ultra-violeta em capela de segurança biológica nível II. O meio Sabouraud (60mL) foi esterilizado por autoclavação (120ºC por 20 minutos). Após esterilização o meio foi resfriado a 50ºC e misturado com o extrato diluído. Desta forma, foi obtida um meio com concentração de 3% de extrato.

Do frasco com a concentração 3%, foram retirados metade do volume que foi imediatamente distribuída em tubos de ensaio previamente esterilizados. Estes tubos foram dispostos de modo que o meio solidificasse no modo “inclinado”. A outra metade do meio Sabouraud contida em frasco de Erlenmeyer foi acrescida de mais 50mL de Sabouraud puro, tornando a concentração de 1,5%. O material foi homogeneizado, separando-se 50mL que foram imediatamente distribuídos em tubos de ensaio que também foram inclinados. Os 50mL restantes foram acrescidos de 50mL de Sabouraud puro fazendo com que a concentração ficasse a 0,75%. Este procedimento foi continuado, sempre se separando 50mL de meio para distribuir em tubos de ensaios adicionando-se 50mL de Sabouraud puro ao restante para reduzir a concentração à metade. Desta forma obtivemos cerca de 12 tubos de ensaio contendo meio Sabouraud de cada uma das concentrações do extrato (3%, 1,5%, 0,75%, 0,375%, 0,187% e 0,093%).

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As suspensões salinas (NaCl em água destilada, 0,9%, estéril) de Candida albicans, Cryptococcus neoformans (fungos unicelulares) foram padronizadas de acordo com o grau 3 da escala de Mc Farland e suspensão padronizada de Aspergillus niger (fungo filamentoso). Uma alíquota de 100µL de cada uma destas suspensões foi semeada nos tubos com as concentrações diferentes. Foram empregados quatro tubos de cada concentração para cada suspensão microbiana. Os tubos correspondentes às leveduras foram incubados em estufa microbiológica a 37ºC enquanto os tubos correspondentes ao fungo filamentoso foram incubados em temperatura ambiente. O tempo de observação foi de 5 dias. Todo o procedimento foi realizado em capela, em ambiente estéril. Segundo Experimento

O extrato da planta (1g) foi diluído em 25mL de etanol. Foram preparados discos de papel, a partir de círculos de pré-filtros semelhantes aos discos empregados nas provas de antibiograma. O diâmetro foi de 1cm.

Cada disco foi embebido várias vezes com 50µl do extrato em etanol. Grupos de 5 a 10 discos foram separados e receberam cargas diferentes de aplicações do extrato. Considerando que cada alíquota de 50µl corresponde a 2mg do extrato, os discos receberam desde 4 aplicações (correspondente a 8mg) até 30mg.

Numa segunda etapa, foram preparadas placas de Petri contendo meio Sabouraud dextrose (3%). As placas em quadruplicata foram semeadas com suspensões salinas preparadas como no experimento anterior para os seguintes microrganismos: Candida

albicans, Cryptococcus neoformans, Malassezia pachydermatis, Rhodotorula spp e Aspergillus niger. A suspensão de cada um destes microrganismos foi semeada na superfície das placas de Petri, utilizando-se um swab estéril para cada uma das amostras, embebido nas mesmas. Após esta etapa, os discos foram aplicados na superfície, utilizando-se uma pinça estéril. Todo o procedimento foi realizado em capela de segurança, na proximidade de bico de Bunsen.

As placas foram incubadas em temperatura de 37ºC (exceção para Aspergillus niger) por cinco dias com observações a partir das primeiras 24 horas.

Para o primeiro experimento, os crescimentos foram evidentes já nas primeiras horas. Observou-se o crescimento de todos os fungos submetidos ao teste em todos os tubos de todas as concentrações após o tempo de observação de cinco dias.

No segundo experimento ocorreu crescimento em todas as placas e em nenhuma delas foi observado qualquer halo que demonstrasse efeito inibitório do extrato aplicado nos discos sobre os microrganismos cultivados. Os resultados obtidos devem ser aprofundados através de diferentes métodos de avaliação. 5.5.3. Avaliação da Atividade Inseticida contra Musca domestica

Para este experimento utilizou-se a espécie Musca domestica (Diptera: Muscidae), que é uma espécie de grande importância médico sanitária, pois atua como vetor mecânico e/ou biológico de diversos agentes patogênicos, incluindo parasitos do homem e de animais domésticos (BERNARDI et al., 2006). Estes insetos, por manterem um alto grau de associação com o ambiente modificado pelo homem, são amplamente relacionados na literatura como causadores de diversos danos e graves prejuízos, principalmente na pecuária (GUIMARÃES et al., 1983). Estes dados têm motivado diversos grupos pela busca de novos métodos aplicáveis ao controle químico como alternativo aos inseticidas sintéticos comumente utilizados no controle destas pragas.

Os insetos utilizados neste experimento foram oriundos de colônia formada por moscas coletadas no Campus da UFRRJ, e seu desenvolvimento pré-embrionário ocorreu em um meio composto por ração concentrada contendo 23% de proteína bruta, farelo de arroz e

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água, na relação 1:1:2. Os insetos tratados representam o nível de resistência da comunidade a inseticidas comumente utilizados no controle desta mosca. Os insetos avaliados foram da geração F1 a espécie Musca domestica.

Após o nascimento os testes foram feitos em até 48 horas da emergência dos insetos. As frações e extratos foram diluídos em 1 ml de Acetona PA. Foram utilizados 20 mg da fração OSPGMCp-2a e aproximadamente 50mg dos demais extratos e frações. Os insetos foram retirados das gaiolas e anestesiados com CO2 para manipulação e separação de machos e fêmeas, e realização da aplicação de 0,5µl da solução estoque formada de cada amostra. A aplicação foi feita sobre o tórax com auxílio de uma micro-seringa automática de 25µl. Após a aplicação os insetos foram transferidos para frascos forrados com papel filtro, fechados com gaze estéril presa com liga elástica. Cada frasco recebeu 20 insetos, sendo cada amostra avaliada em 20 machos e 20 fêmeas. Também foram realizados testes controle com a aplicação somente do solvente. A leitura foi realizada em 24 horas (tabela 8, pág. 90) e 48 horas (tabela 9, pág. 90), e nestas são contados os insetos mortos. Durante as avaliações os insetos foram alimentados com solução de glicose a 20% através de algodão embebido sobre a gaze.

Considerando os resultados apresentados, observa-se que o extrato metanólico bruto (OspGM) e frações do extrato, OSPGMCp e OSPGMM apresentaram pouca atividade inseticida frente a Musca domestica. As frações OSPGMCp2a e OSPGMC apresentaram maior atividade inseticida. Estas frações são ricas em flavonóides, no qual foram isoladas a 7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona. Essas observações foram feitas em 24h (tabela 8) e 48h (tabela 9). De acordo com a maior atividade inseticida presente nas frações ricas em flavonóides, sugerimos que estas sejam as substâncias responsáveis por esta atividade.

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Mortalidade Substância ♀ ♂ ♀ + ♂

OSPGD 0% 0% 0% OSPGDH 0% 0% 0% OSPGDC 0% 0% 0% OSPGDM 0% 0% 0% OSPGM 0% 10% 5% OSPGMC

0% 20% 10% OSPGMCp 10% 0% 5% OSPGMCp2a 10% 20% 15% OSPGMM 0% 0% 0% OSPGMMp 10% 0% 5% CONTROLE 0% 0% 0%





a) Peso médio de machos e fêmeas de M. domestica: 0,0105 e 0,0158 gramas. b) OSPGD = Ouratea sp galhos dicloro; OSPGDH = Ouratea sp galhos dicloro hexano; OSPGDC=Ouratea sp galhos dicloro clorofórmio; OSPGDM = Ouratea sp galhos dicloro metanol; OSPGM = Ouratea sp galhos metanol; OSPGMC = Ouratea sp galhos metanol clorofórmio; OSPGMCp = Ouratea sp galhos metanol clorofórmio precipitado; OSPGMCp2a = Ouratea sp galhos metanol clorofórmio precipitado fração 2 a; OSPGMM = Ouratea sp galhos metanol metanol; OSPGMMp = Ouratea sp galhos metanol metanol precipitado. 5.5.4. Avaliação da toxidez do extrato metanólico em Mus musculus.

Foram utilizados camundongos (Mus musculus) albinos swiss machos e fêmeas pesando entre 30 e 35 g fornecidos pelo Biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas (IB) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (23 ± 2oC) e iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas) com livre acesso à água e ração.

Determinação da Dose Letal Aproximada (DLA)

Neste ensaio foi utilizado apenas um animal tratado com o extrato a cada dose conforme proposto por Kennedy et al em 1986. O extrato metanólico de O. hexasperma var. planchonii Engl. foi solubilizado em solução salina 0,9 % acrescido de 1% de Tween 80 e administrado nos camundongos pelas vias oral ou subcutânea. O teste se iniciou com uma

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dose bastante baixa (10 mg/kg) e a próxima dose foi adicionada de 50% do valor da anterior e assim sucessivamente (o que na prática corresponde a uma chance muita remota de que uma determinada dose mate um animal e sua subseqüente falhe em fazê-lo), até que a menor dose na seqüência considerada, induzisse a morte do animal. Os animais foram observados nos tempos de 15 min, 30 min, 60 min, 24 h e 1 semana após a administração do extrato.

A administração do extrato tanto pelas vias oral quanto subcutânea não gerou sinais de toxicidade aguda nos camundongos. Doses de até 5g/kg não ocasionaram a morte dos animais em até uma semana após a administração em dose única do extrato, demonstrando a baixa toxicidade aguda do extrato.

O extrato apresenta baixa toxicidade quando administrado em dose única. Estudos com doses repetidas, subcrônicos e crônicos são necessários para complementar a avaliação toxicológica em função do potencial antitumoral da planta e conseqüente necessidade de uso crônico. Estudos para avaliar a toxicidade in vivo da fração enriquecida com biflavonóides também são necessários em função dos relatos de toxicidade destas substâncias.

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CONCLUSÕES

A prospecção química do extrato metanólico de Ouratea hexasperma var. planchonii

Engl. revelou testes positivos para as classes de substâncias: alcalóides, saponinas, esteróides, depsídio e depsidonas, flavonóides, catequinas, quinonas, açúcares redutores, sacarídeos e taninos.

Com os extratos obtidos dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. foi realizado o fracionamento, a partir dessas frações foram isolados compostos alifáticos, ácidos alifáticos, esteróides (sitoesterol, estigmasterol e campesterol), terpenos (lupeol e α-amirina e β-amirina) e biflavonas (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona) e sitoesterol glicosilado.

Através de análise utilizando CLAE-EM permitiu-se detectar a presença de outros compostos presentes no extrato, como metil-vitexina, orientina, ramnosil-triidroxiflavona, agatisflavona, metil-agatisflavona, dimetil-agatisflavona, metil-diidroxiflavon, e glicopiranosil-prenil-diidroxi-flavonol, embora necessitem de confirmação.

Através dos resultados obtidos neste trabalho e levantamento de dados da literatura sobre as substãncias encontradas no gênero Ouratea, foi possível concluir que o biflavonóide 7”-O-metilagatisflavona serve como um marcador quimiossistemático do Gênero Ouratea e que as variedades de O. hexasperma (St. Hil.) Bail e O. hexasperma var. planchonii Engl. tem poucas diferenças morfológicas e quimicamente podem ser incluídas como uma única espécie.

Os testes de atividades biológicas realizados foram os de atividade antibacteriana, antifúngica, inseticida e de toxicidade utilizando os extratos e frações de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl. Com os ensaios de atividade antimicrobiana, o extrato metanólico inibiu o crescimento de Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Este extrato e a fração clorofórmica do extrato metanólico foi inativo para os fungos avaliados. Com os ensaios de atividade contra Musca doméstica, os extratos e frações não apresentaram atividade significativa, as frações que apresentaram maior atividade foi a fração que contém a mistura dos biflavonóides 7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona e as frações metanólicas que também contém essas substâncias. Ensaios adicionais deverão ser realizados afim de confirmar esses resultados.

Com os ensaios de toxicidade, o extrato apresentou baixa toxicidade quando administrado em dose única. Estudos para avaliar a toxicidade in vivo da fração enriquecida com biflavonóides também são necessários em função dos relatos de toxicidade destas substâncias.

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UFRRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS


DISSERTAÇÃO

Estudo Químico e Atividades Biológicas de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).


2008

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATA


ESTUDO QUÍMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE

Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).


Sob a Orientação do Professor

Dr. Mário Geraldo de Carvalho

Dissertação submetida como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências, no Programa de Pós-Graduação em Química, Área de Concentração em Química de Produtos Naturais

Seropédica, RJ Julho de 2008

iii

UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

547

F363e

T

Fernandes, Renata Duarte, 1977-

Estudo químico e atividades

biológicas de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl. (Ochnaceae) /

Renata Duarte Fernandes – 2008.

118f. : il.

Orientador: Mário Geraldo de

Carvalho.

Dissertação (Mestrado) –

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro, Programa de Pós-

Graduação em Química.

Bibliografia: f. 93-101.

1. Química orgânica - Teses. 2.

Ouratea - Análise – Teses. 3.

Ochnaceae – Análise - Teses. 4.

Produtos naturais – Teses. I.

Carvalho, Mário Geraldo de, 1952- .

II. Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro. Programa de Pós-

Graduação em Química. III. Título.

Bibliotecário: _______________________________ Data: ___/___/______

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Ao meu marido Cristiano de Deus Correa e À minha mãe Fátima Maria Duarte.

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AGRADECIMENTOS

A Deus; Ao meu marido Cristiano pelo amor, compreensão, incentivo, paciência e carinho; À minha mãe Fátima por acreditar em meus sonhos e me incentivar sempre; Aos meus irmãos Rodrigo e Robson pelo incentivo e ajuda; À minha vovó Maria dos Anjos, aos meus tios pelo carinho e alegria em cada vitória

minha, aos meus primos e meu afilhado; À minha amiga de todas as horas Juliana Moura; Ao Professor Dr. Mário Geraldo de Carvalho pela orientação, ensinamentos, atenção e

paciência; Aos amigos do LQPN-UFRuralRJ: Eduardo (Ceará), Delcí, Marcelo, Maritza,

Virgínia, Luciano, Luiz Roberto (Pilha), Mário Sérgio, pela amizade e pelos momentos de descontração que passamos juntos e à nova integrante da equipe Roberta pelas palavras de incentivo;

Aos alunos de iniciação científica e estagiários do LQPN-UFRuralRJ: Luciane, Claudiana, Daniel, Letícia, Raquel, Tatiane, Verônica, Débora, Ana Paula, Aline e Aline’ pela amizade, convivência agradável e auxílio durante a realização deste trabalho.

A todos os colegas do PPGQO, sem exceção, pelo bom relacionamento durante este período; em especial aos amigos Ari, Cláudio, Janaína, Kênia, Ana Paula, Andréa Janaína, Andréa Rose, Willian, Camilla, Alessandra, André Vinícius, Letícia, Vinícius, Suzana e Raquel; e à Regina pela amizade, incentivo e apoio;

Aos professores do PPGQO pela formação e evolução profissional; À professora Dra. Rosane Nora Castro pelos ensinamentos e auxílio nas análises no

HPLC; Aos funcionários do ICE-UFRRJ, Maurício, Welisson, Carlão, Eli, Fábio, Francês,

Osmar, Rui, Aldir e André; À professora Dra. Maria de Fátima Agra (LTF-UFPB) pela coleta e identificação do

material vegetal; Ao Prof Dr. Edilberto Rocha Silveira do (CENAUREMN/UFC), pela obtenção dos

espectros a 500 MHz; À professora Dra. Alceni Augusta Werle (UFOP) pelas análises no CLAE-EM;

Aos professores Dra. Miliane Moreira Soares de Souza e Dr. Francisco de Assis Baroni (IV/UFRRJ) pelos ensaios de atividade antibacteriana e antifúngico;

Aos professores Dr. Fábio Fagundes Rocha e Frederico Argollo Vanderlinde do Departamento de Ciências Fisiológicas (IB/UFRRJ) pelo teste de toxicidade;

Ao mestrando Élio Barbieri Departamento de Parasitologia Animal-UFRRJ pelo ensaio de atividade inseticida;

À professora Denise Monte Braz do Departamento de Botânica da UFRRJ, pela atenção e auxílio na classificação botânica; Às meninas do alojamento da graduação F1-32 Tati, Marcele, Dailane, Camila, Wilma, Germana, Joyce e Geovana pela amizade, momentos de estudos e de descontração;

Às meninas do alojamento da Pós-graduação Janaína, Vanessa, Renata, Michelle, Daniele, Patrícia, Sabrina, Silvana, Eliane, Kênia, Fabiana, Fernanda, Daniela, Fabíola, Ana Luisa, e Veridiana pelo acolhimento, amizade e bons momentos;

Desde já, à banca examinadora, pelas sugestões e correções sugeridas a este trabalho; À UFRRJ, por mais uma oportunidade e acolhimento; A CNPQ pela concessão da bolsa de estudos; A todos que, de algum modo, me ajudaram na realização deste trabalho.

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Quando alguém encontra seu caminho, precisa ter coragem suficiente

para dar passos errados. As decepções, as derrotas, o desânimo

são ferramentas que Deus utiliza para mostrar a estrada.

Paulo Coelho

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RESUMO FERNANDES, Renata Duarte. Estudo Químico e Avaliação de Atividades

Biológicas de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. 2008 101f. Dissertação (Mestrado em Química Orgânica). Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

Os metabólitos especiais isolados de galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl., permitiram a comparação com os constituintes de O. hexasperma (St. Hil.) para confirmar a classificação botânica da mesma. Neste trabalho também foram avaliadas algumas atividades biológicas.

As analises das frações obtidas do fracionamento com partição com solventes e técnicas cromatográficas dos extratos preparados com diclorometano e metanol dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. conduziu à identificação de alguns constituintes químicos. Identificaram-se misturas de hidrocarbonetos alifáticos, ácidos alilfáticos, de esteróides (sitosterol, estigmasterol e campesterol), além de três triterpenos, lupeol, α e β amirina, e os flavonóides (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona) e sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosideo. As estruturas foram determinadas através de análise dos dados espectrométricos de IV, RMN de 1H e 13C uni e bidimensional e massas, além de comparação com dados da literatura. A técnica CLAE-EM foi utilizada na análise adicional de duas frações contendo dois biflavonóides e alguns constituintes adicionais. Esta análise permitiu propor a presença de metil-vitexina, orientina, metil-diidroxiflavona, glicopiranosil-flavonas, dimetilagatisflavona, glicopiranosil-prenil-flavonol além da confirmação das duas biflavonas identificadas inicialmente.

Os extratos dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. foram submetidos à avaliação de atividade antibacteriana, antifúngica, inseticida e de toxidez. O crescimento de Escherichia coli e Staphylococcus aureus reduziu com extrato metanólico. As frações contendo as biflavonas foram parcialmente ativas como inseticida contra Musca

domestica. Os extratos apresentaram baixa toxicidade em dose única.

Palavras–chave: Ouratea hexasperma, flavonóides, atividades biológicas.

ix

ABSTRACT FERNANDES, Renata Duarte. Phytochemical Study and Biological Activities

extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. 2008 103f. Dissertation (Magister Scientiae in Organic Chemistry), Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

The specials metabolites isolated from the branches of the Ouratea hexasperma var. planchonii Engl., allowing to the comparison with the chemical constituents from variety Ouratea hexasperma (St. Hil.) to confirm the botanical classification. Some biological activities were evaluated.

The analysis of the fractions from solvents and chromatographic fractionation of the dichloromethane and methanolic extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. led to the identification of some chemical constituents. This procedure led to identification of aliphatics compounds mixture, aliphatic alcohol mixture, steroids mixture (sitosterol, stigmasterol and campesterol), three triterpenes, lupeol e α-amiryn e β-amiryn, and the biflavonoids (7”-O-methylagathisflavone and agathisflavone) and sitosterol-3-O-β-D-glycopyranoside. The structures were determined by IR, de 1H (1D e 2D) e 13C (BBD e DEPT) NMR spectral data analysis and comparison with literature values. The HPLC-MS were used in the analysis of two fractions containing the these two biflavones and some additional compounds. This analysis led us to identify the presence of methyl-vitexin, orientin, methyl-dihydroxyflavone, glycopiranosil-flavones, dimethylagathisflavone and glycopyranosil-prenyl-dihydroxyflavonol besides the confirmation of these two biflavonoids.

The extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. were submitted on evaluations of the antibacterial, antifungal, insecticide and toxicity activities. The Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth was inhibited with methanolic extract. The fractions containing the biflavonoids were partially active as insecticide against Musca domestica. The extracts presented low toxicity on unique dose.

Key words: Ouratea hexasperma, flavonoids, biologicals activities.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Triflavonóides isolados no Gênero Ochna 3

Figura 2: Biflavonóides e dímeros de chalconas isolados dos Gêneros Ochna e Lophira. 4

Figura 3: Flavonóides e chalconas isolados do gênero Luxemburgia 5

Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea 7

Figura 5: Outras classes de substâncias isoladas nos gêneros Ouratea. 9

Figura 6: Diferenças morfológicas entre as folhas de Ouratea hexasperma. 10

Figura 7: Dímeros de flavonóides 11

Figura 8: Constituintes químicos isolados neste trabalho 17

Figura 9: Mecanismo proposto da reação de metilação com diazometano. 23

Figura 10: Espectro de IV do material alifático de O. hexasperma var. planchonii Engl.. 25

Figura 11: Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do material alifático. 26


Figura 13: Espetro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) de 1. 28

Figura 14: Cromatograma de 1. 28

Figura 15: Espectro de massas de 1 29

Figura 16: RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) da mistura de esteróides, 2 (a, b e c) 30

Figura 17: Cromatograma da mistura dos esteróides 2 (a, b e c) 30

Figura 18a : Espetro de massas de 2 (a) comparado com a biblioteca do aparelho. 31

Figura 18b : Espetro de massas de 2 (b) comparado com a biblioteca do aparelho. 32

Figura 18c : Espetro de massas de 2 (c) comparado com a biblioteca do aparelho. 33

Figura 19: Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) de 3 (a, b e c). 34

Figura 20: Espetro de massas de 3 (a) comparado com a biblioteca do aparelho. 35

Figura 21: Espetro de massas de 3 (b e c) comparado com a biblioteca do aparelho 35


Figura 23: Espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) de 4 39

Figura 24: Espectro de 1H-1H-COSY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4. 40

Figura 25: Espectro de 1H-1H-NOESY - (500 MHz, D3CCOCD3) de 4. 41

xi



Figura 28: RMN de C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4 44

Figura 29: Ampliação(180-187 ppm) do Espectro de RMN de 13C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4

44

Figura 30: Ampliação (156-166 ppm) do Espectro de RMN de 13C (125 MHz, D3CCOCD3) da substância 4

45

Figura 31: Espectro de HMBC (D3CCOCD3) da substância 4. 45








Figura 39: Espectro de HSQC (D3CCOCD3) da substância 4 50

Figura 40: Espectro de IV de 5. 51


53

Figura 42: Ampliação do espectro (6.0-8.5 ppm) de RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da mistura dos biflavonóides 4 e 5. 53


54


54

Figura 45: Cromatograma obtido em CLAE de 4 55

Figura 46: Cromatograma obtido em CLAE da mistura 4 e 5. 55

Figura 47: Espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do derivado 4a. 58


59

Figura 49: Ampliação do espectro de RMN de 1H (500 MHz , D3CCOCD3) do derivado 4a..

59

xii

Figura 50: Espectro de 1H-1H-COSY (500MHz, D3CCOD3) de 4a 60

Figura 51: Espectro de NOESY de 4a. 60

Figura 52: Ampliação do espectro de NOESY de 4a. 61

Figura 53: Espetro de 13C (125MHZ, D3CCOD3) de 4a. 61

Figura 54: Ampliação do espectro de 13C (125MHZ, D3CCOCD3)de 4a. 62

Figura 55: Espectro de HMBC (D3COD3) da substância 4. 63

Figura 56: Espectro de HSQC (D3COD3) da substância 4. 64

Figura 57: Espectro de IV da substância 6 66

Figura 58: RMN de 1H da substância 6 68

Figura 59: RMN de 13C da substância 6 69

Figura 60: Ampliação do RMN de 13C(125 Hz, DMSO-d6) da substância 6 70

Figura 61: CLAE da fração OSPGMC. 71

Figura 62: CLAE da fração OSPMC1-6p 72

Figura 63: RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da fração OSPGMC 73

Figura 64: RMN de 1H (200MHz, D3CCOCD3) da fração OSPGMC1.6p 73

Figura 65: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da fração OSPGMC

74

Figura 66: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGC. 76

Figura 67: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da fração OSPGMC1.6p

77

Figura 68: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGCM1.6p. 79

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Ocorrência de Agatisflavonas e derivados em espécies vegetais. 12

Tabela 2: Divisões Botânicas das espécies que onde há ocorrência de agatisflavonas e derivados. 15



Tabela 4. Dados de RMN 1H e 13C (D3CCOCD3,1H e D3CSOCD3,

13C) da substâncias 4. 38

Tabela 5. Dados de RMN 1H (200 MHz) e 13C (50 MHz) em Metanol-D, (AGRAWAL, 1989) da substância 5 (agatisflavona).

52

Tabela 6: Dados de RMN 1H (200 MHz) e 13C (50 MHz) da substância 4 (MOREIRA et

al., 1999) com o derivado 4a. 57

Tabela 7: Dados de RMN de 1H e 13C da substância 6 67


90


90

xiv

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Marcha para o isolamento das substâncias dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii engl. 21


75


78

Esquema 4: Biossíntese de ácidos graxos (adaptado de DEWICK, 2002) 80

Esquema 5: Proposta de a-oxidações em aácidos graxos (HARWOOD, 1997). 81

Esquema 6: Proposta biogenética para os esteróides (Adaptado de MANN, 1994). 82


83


84

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

1D Unidimensional 2D Bidimensional δΗ Deslocamento Químico de Hidrogênio (ppm) δC Deslocamento Químico de Carbono (ppm) ν Estiramento δ Deslocamento químico Acetona-D6 Acetona deuterada CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica CCF Cromatografia em Camada Fina CCP Cromatografia em Camada Preparativa CG-EM Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência cm Centímetro COSY COrrelation SpectroscopY d Dubleto dd Duplo Dubleto DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado EM Espectrometria de Massas HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz Hertz IV Infravermelho J Constante de acoplamento em hertz λ comprimento de onda µm micrômetro m multipleto M+. pico do íon molecular positivo MHz Mega Hertz m/z relação massa/carga nm nanómetro OspGD Extrato diclometano dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl. OspGM Extrato metanólico dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl. NOESY Nuclear Overhauser Experiment Spectroscopy P.F. ponto de fusão ppm parte por milhão q quarteto RF Fator de Retenção RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 s singleto sl singleto largo t tripleto TR Tempo de Retenção TMS tetrametilsilano

OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.

xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

Objetivos 2

2. REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1. Generalidades Sobre a Família Ochnaceae e o Gênero Ouratea 3



2.3. Estudo Químico Realizado com Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail 10

2.4. Biflavonóides 10

2.4.1. Agatisflavona e derivados 12

3. CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE O. hexasperma var. planchonii Engl. 16

4. PARTE EXPERIMENTAL 18

4.1. Equipamentos e Reagentes 18

4.2. Material vegetal 18

4.3. Obtenção dos extratos brutos 19

4.4. Prospecção Química do Extrato Metanólico 19

4.5. Isolamento e Purificação dos Constituintes dos Galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl.

19

4.5.1. Extrato com diclorometano 19

4.5.2. Extrato com metanol 20

4.6. Derivação 22

4.6.1. Metilação com diazometano 22

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 24

5.1. Prospecção Química do extrato metanólico 24

5.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Isolados de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl.

25

5.2.1. Alcanos 25

5.2.2 Substância 1 27


xvii




5.2.7 Derivado 4a 56


5.3. ANÁLISE COM CLAE DAS FRAÇÕES OSPGMC E OSPMC-16P. 71

5.4. Propostas Biossintéticas para os constituintes isolados de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl.

80

5.4.1. Ácidos graxos 80

5.4.2. Esteróides 82

5.4.3. Terpenos 83

5.4.4. Biflavonóides 84

5.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS 85

5.5.1. Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Extrato Metanólico de Ouratea


5.5.2. Verificação de atividade antifúngica do Extrato Metanólico de Ouratea


5.5.3. Avaliação da Atividade Inseticida contra Musca doméstica 88

5.5.4. Avaliação da toxidez do extrato metanólico em Mus musculus. 90

6. CONCLUSÕES 92

7. REFERÊNCIAS 93