analises em alimentos origem animal

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  • ANEXO

    MTODOS ANALTICOS OFICIAIS PARA ANLISES MICROBIOLGICAS PARA CONTROLE DE PRODUTOS DE

    ORIGEM ANIMAL E GUA

    CAPTULO I

    CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIVEIS

    1. OBJETIVOS E ALCANCE

    Estabelecer procedimento para a contagem padro de microrganismos mesfilos aerbios estritos e facultativos viveis.

    Aplica-se a amostras de matrias-primas, gua e alimentos. 2. FUNDAMENTOS

    Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluies em gar padro para contagem seguida de incubao em temperatura de 36 1C por 48 horas. 3. REAGENTES E MATERIAIS

    Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos; Agar padro para contagem (PCA);

    Soluo salina peptonada 0,1%. 4. EQUIPAMENTOS

    Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS

    5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra, de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.

    Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta a diluio 10-1.

    5.2 Inoculao em placas: A partir da diluio inicial (10-1), efetuar as demais

    diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1%, de acordo com as instrues contidas no Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.

    Semear 1 mL de cada diluio selecionada em placas de Petri estreis. Adicionar cerca de 15 a 20 mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48C.

    Homogeneizar adequadamente o gar com o inculo. Deixar solidificar em superfcie plana.

    5.3 Incubao: Incubar as placas invertidas a 36 1C por 48 horas.

    5.4 Leitura: Segundo o tipo de amostra em anlise, realizar a leitura

    selecionando as placas de acordo com o seguinte critrio, contando todas as colnias presentes:

    Produtos em geral: Placas que contenham entre 25 e 250 colnias; Amostras de gua: Placas que contenham entre 30 e 300 colnias.

  • 6. RESULTADOS

    A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes na amostra em anlise, seguindo as instrues contidas no Anexo IV, Procedimentos para contagem de colnias, deste Manual.

    Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

    FRANK, J.F. Microbial spoilage of foods: Milk and dairy products. In: Food Microbiology Fundamentals and Frontiers. Michael

    P. Doyle, Beuchat, L.R.; Montville, T.J. (Eds.). ASM Press Washington D.C., p. 101-116.

    MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.

    CAPTULO II CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS

    1. OBJETIVOS E ALCANCE

    Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e leveduras em alimentos.

    Aplica-se a amostras de matrias-primas, alimentos e raes. 2. FUNDAMENTOS

    Baseia-se na verificao da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de cultura com pH prximo a 3,5 e temperatura de incubao de 25 1C.

    A utilizao de meios acidificados a pH 3,5 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactrias presentes no alimento. 3. REAGENTES E MATERIAIS

    Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos;

    gar batata glicose 2%; L(+) cido tartrico 10%; Soluo salina peptonada 0,1%.

    4. EQUIPAMENTOS

    Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS

    5.1 Preparo das placas Fundir o gar batata glicose. Resfriar em banho-maria at 46-48C. Acidificar o meio at pH 3,5 por meio da adio de 1,5 mL de soluo de cido

    tartrico 10% para cada 100 mL de meio. Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL. Deixar solidificar em superfcie plana. Identificar as placas. Antes da utilizao, secar as placas semi-abertas com o fundo voltado para

  • cima em estufa a 50C por cerca de 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfcie pelo tempo necessrio para a completa secagem. 5.2 Pesagem e preparo da amostra

    Pesar 25 0,2 g ou pipetar 25 0,2 mL da amostra de acordo com as instrues contidas no Anexo V, Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras, deste Manual.

    Adicionar 225 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e de leite condensado, utilizar como diluente soluo salina peptonada com 20% de glicose.

    A partir da diluio inicial 10-1, efetuar as diluies desejadas, de acordo com o Anexo II, Diluies e solues, deste Manual.

    5.3 Procedimentos de controle Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

    5.4 Inoculao em placas Inocular 0,1 mL das diluies selecionadas sobre a superfcie seca de gar

    batata glicose 2% acidificado a pH 3,5. Com o auxlio de ala de Drigalski ou basto do tipo hockey, espalhar o

    inculo cuidadosamente por toda a superfcie do meio, at sua completa absoro. Utilizar no mnimo duas diluies decimais ou duplicata da mesma diluio. Nos casos em que a legislao exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL,

    distribuir em duplicata 1 mL da diluio 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos lquidos poder ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10), o que corresponder diluio 10-1.

    5.5 Incubao: Incubar as placas, sem inverter, a 25 1C, por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D.

    5.6 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colnias. OBSERVAO: No abrir, em hiptese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminao ambiental por meio da disperso dos seus esporos. 6. RESULTADOS

    A partir dos dados obtidos, calcular o nmero de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, Procedimentos para a contagem de colnias, deste Manual.

    Expressar o resultado em UFC/g ou mL. 7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

    TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R. Yeasts, molds and mycotoxins. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponvel em: http://www.cfsan.fda.gov

    CAPTULO III CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESFILOS AERBIOS

    VIVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAO EM PRODUTOS LCTEOS LQUIDOS UHT

    1. OBJETIVOS E ALCANCE

    Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesfilos

  • aerbios viveis em produtos UHT, com excluso daqueles comprovadamente no patognicos e no causadores de alteraes fsicas, qumicas e organolpticas do produto.

    Detectar a presena de Bacillus sporothermodurans para diferenci-lo dos demais microrganismos mesfilos aerbios viveis.

    Aplica-se a amostras de produtos lcteos lquidos, tratados pelo processo UHT. 2. FUNDAMENTOS

    2.1 Pr-incubao: Baseia-se na incubao das amostras em estufa a 36 1C por 7 dias e posterior verificao da ocorrncia de alteraes das caractersticas do produto.

    2.2 Contagem em placa: Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluies em gar crebro-corao e em gar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubao a 30 1C por 72 horas, e posterior identificao dos microrganismos presentes.

    2.3 Limitaes do Mtodo: Devido opacidade produzida pela homogeneizao do meio de cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colnias na diluio 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluies subseqentes, o que pode resultar em dados finais estimados. 3. REAGENTES E MATERIAIS

    Vidraria e demais insumos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos;

    gar crebro-corao (ABHI); gar nutriente isento de extrato de levedura; gar esculina; Caldo crebro-corao nitrato (BHI-NO3); Caldo vermelho de fenol com glicose; Soluo salina peptonada 0,1%; gar uria; Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de

    para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponveis);

    Perxido de hidrognio 3%; Alfa-naftilamina 0,5%; cido sulfanlico 0,8%; Corantes para colorao de Gram; Zinco em p; Etanol 70% ou Etanol 70 GL; Reagentes para colorao de Gram.

    4. EQUIPAMENTOS

    Equipamentos bsicos obrigatrios em laboratrios de microbiologia de alimentos. 5. PROCEDIMENTOS

    5.1 Preparo da amostra: Aps a pr-incubao, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes.

    Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com soluo desinfetante e aps com etanol 70% ou etanol 70 GL.

  • Deixar secar. Com auxlio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a

    embalagem. Caso se observe alterao evidente (coagulao, floculao, dessorao, odor no caracterstico ou outros), interromper a anlise e reportar como produto alterado aps incubao a 36 1C por 7 dias.

    As amostras que apresentarem qualquer alterao no devem ser analisadas. Reportar o resultado como amostra alterada, incluindo informaes sobre o tipo de alterao observada.

    5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle especficos estabelecidos pelo laboratrio.

    5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de soluo salina peptonada 0,1% at 10-2.

    Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluies preparadas (10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estreis, em duplicata.

    Adicionar cerca de 20 mL de gar crebro-corao (ABHI) a uma das placas de cada diluio. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de gar nutriente isento de extrato de levedura.

    Homogeneizar adequadamente os meios com os inculos. Deixar solidificar. Inverter as placas.

    5.4 Incubao: Incubar as placas a 3