slide 1 controle de qualidade microbiológico de

Controle de qualidade microbiológico de

produtos estéreis

Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos

Ribeirão Preto - 2020

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Diferentemente do que já foi abordado até o momento, agora vamos abordar o controle de qualidade microbiológico para produtos estéreis. Se antes era permitida a presença de alguns microrganismos, em certa quantidade, nos produtos farmacêuticos e cosméticos; agora a exigência é 0 UFC/g ou mL de produto analisado.

ESTERILIDADE

Total ausência de formas viáveis capazes de reprodução.

Esterilidade absoluta todas as frações do produto submetidas ao teste.

Teste de esterilidade destrutivo

Método estatístico de amostragem:

Depende do tamanho do lote e do tipo de produto



Inicialmente é necessário entendermos o conceito de esterilidade. Esterilidade refere-se à total ausência de formas viáveis, capazes de reprodução.

Segundo os compêndios oficiais, a condição de esterilidade de um produto somente deve ser considerada com base no fato que o mesmo tenha sido processado em condições ótimas e que o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste de esterilidade, indique a ausência de microrganismos viáveis.

A afirmação sobre a esterilidade absoluta de um produto exigiria que todas as suas frações fossem submetidas ao teste, o que não é aplicável. Outro fator a considerar é que o teste busca proporcionar condições ideais ao desenvolvimento de bactérias, bolores e leveduras. A metodologia não abrange condições que permitam o crescimento de vírus; entretanto, quando da ausência de bactérias e fungos, extrapola-se o resultado negativo também a estes organismos.

Tratando-se de teste do tipo destrutivo, evidentemente que o teste de esterilidade não pode ser aplicado a todo o lote. O método baseia-se, portanto, em método essencialmente estatístico de amostragem. Os resultados são determinados tanto pelo número de amostras testadas como pelo histórico de incidência de contaminação no lote. Sendo assim, o número de unidades a ser testado depende, em certo nível, do tamanho do lote e do tipo de produto.

USP XL



Nesta tabela, contida na USP XL, encontramos a quantidade a ser analisada, de cada produto. Essa quantidade depende do tipo de produto a ser analisado e também da quantidade/volume existente em cada recipiente. Dependendo da quantidade existente em cada recipiente, todo o conteúdo ou apenas uma porcentagem dele deve ser submetida ao teste.

Além disso, a quantidade de itens a serem submetidos ao teste de esterilidade dependerá do tipo de produto a ser analisado e da quantidade existente em cada lote. É evidente que a probabilidade de aprovar um lote contaminado é reduzida com o aumento do tamanho da amostra, porém existem limitações de ordem prática e econômica que impedem que a quantidade a ser testada seja demasiadamente grande.

PROBLEMAS INERENTES AO TESTE DE ESTERILIDADE

Escolha do meio de cultura

(Caldo Caseína Soja e Caldo Tioglicolato)

Natureza do produto

(produtos oleosos, com conservantes)

Evitar contaminação da amostra sob teste

(fluxo laminar, materiais e diluentes estéreis, pessoal

adequadamente treinado e paramentado)



Vamos considerar alguns problemas que são inerentes ao teste de esterilidade:

- Escolha do meio de cultura, uma vez que a identidade de todos os potenciais contaminantes é desconhecida. Na prática, apenas dois meios são recomendados, embora se saiba ser o caldo tioglicolato tóxico para as células fragilizadas. Entretanto, ele é utilizado para a detecção de microrganismos anaeróbicos e microaerófilos, caso estejam presentes.

- Natureza do produto pode se constituir em problema do ponto de vista da amostragem. No caso de produtos oleosos como as pomadas oftálmicas, as células microbianas podem estar na matriz do produto, tornando-se necessária a extração com solvente adequado. Por outro lado, o produto pode apresentar conservantes, necessitando de inativação por meio de diluição ou inativador específico. Pode-se, também, separar o microrganismo dos conservantes pela filtração (lavando com diluente estéril – ex. água peptonada ou salina).

- Evitar a contaminação da amostra analisada. Na prática, o teste deve ser feito em capela de fluxo laminar, usando materiais e diluentes estéreis. O pessoal responsável pelo teste deve ser adequadamente treinado, vestimenta adequada e não ser envolvido em esquemas rotacionais. Ainda assim, contaminação acidental do material-teste poderá ocasionalmente ocorrer e um reteste, ou mesmo um segundo reteste, devem ser considerados.

OBTENÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS

Avaliação da matéria-prima

Processo

Ambiente

Equipamento

Esterilização após envase

(térmica, química ou irradiação)

Esterilização (filtração) e envase

Manipulação asséptica



Como dito anteriormente, um produto somente poderá ser considerado estéril se ele for processado em condições ótimas e se o resultado de uma amostra representativa, submetida ao teste de esterilidade, indicar a ausência de microrganismos viáveis. Portanto, na obtenção de produtos estéreis, vários aspectos devem ser levados em consideração. Tem início com a avaliação das matérias-primas, passa pelo processo, ambiente e equipamento de forma a assegurar condições de reduzido potencial de falha. Neste momento, devem ser considerados os possíveis caminhos que conduzem aos produtos estéreis. Estes são definidos em função da característica termolábil dos princípios ativos ou mesmo da embalagem primária, da estabilidade química, custos, etc.

A produção de estéreis pode subdividir-se em três grandes grupos:

Quando o produto é envasado e fechado em seu recipiente primário e em seguida esterilizado.

Quando o produto é esterilizado através de filtração e envasado, sob condições assépticas, em recipientes previamente esterilizados. Quando o produto não pode ser esterilizado por filtração nem por esterilização final e,

consequentemente, tenha que ser produzido a partir de matérias-primas estéreis e envasado, de forma asséptica, em recipientes previamente esterilizados.

A esterilização final, quando possível, deve ser o método de primeira escolha para todos os produtos estéreis.

PRODUTOS FARMACÊUTICOS ESTÉREIS

Produtos destinados à administração parenteral, contato com a

pele danificada, mucosas ou órgãos internos

Preparações oftálmicas: gotas, loções (para lavagem e banho dos olhos),

pomadas oftálmicas, soluções de lentes de contato, soluções de limpeza

Implantes: pequenos dispositivos contendo drogas, inseridos sob a pele ou

tecido muscular

Hemostáticos absorvíveis: celulose oxidada (gaze branca), espuma de gelatina,

espuma de fibrina humana

Suturas cirúrgicas

Injeções

Fluidos estéreis não injetáveis: água não injetável (água utilizada durante

cirurgia para irrigação da ferida), soluções de diálise peritoneal, soluções de

inalação



Os produtos farmacêuticos que devem ser estéreis são aqueles destinados à administração parenteral, contato com a pele danificada, mucosas ou órgãos internos. São eles:

Preparações oftálmicas: gotas, loções (para lavagem e banho dos olhos), pomadas oftálmicas, soluções de lentes de contato, soluções de limpeza;

Implantes: pequenos dispositivos contendo drogas, inseridos sob a pele ou tecido muscular;

Hemostáticos absorvíveis: celulose oxidada (gaze branca), espuma de gelatina, espuma de fibrina humana;

Suturas e materiais cirúrgicos;

Injeções;

Fluidos estéreis não injetáveis: água não injetável (água utilizada durante cirurgia para irrigação da ferida), soluções de diálise peritoneal, soluções de inalação;

Instrumentos e equipamentos de uso invasivo.

MICRORGANISMO É DEFINIDO COMO MORTO

- Não mais prolifera em meios de cultura

- Proliferação de poucas gerações

MORTE DOS MICRORGANISMOS NÃO OCORRE SIMULTANEAMENTE:

SEGUE A CINÉTICA DE PRIMEIRA ORDEM

MESMA FRAÇÃO É MORTA A CADA UNIDADE DE TEMPO



Antes de se começar a falar em métodos para avaliar a esterilidade de um determinado produto, é necessário definir o conceito de morte, associado aos microrganismos.

Um microrganismo é definido como morto quando ele não mais prolifera em meios de cultura, o que pode ser verificado através da turvação em meio líquido ou surgimento de colônias em meio sólido; ou é capaz de proliferar-se apenas por poucas gerações. Um organismo único (1 UFC) deve ser capaz de se proliferar através de muitas gerações para ser detectado; portanto, um microrganismo que não possa se reproduzir, ou possa fazê-lo apenas por poucas gerações pode, por este critério, ser considerado como morto.

Na prática não se dispõe de meio de cultura que seja ideal ao desenvolvimento de qualquer cepa microbiana. Além disto, organismos que sobreviveram a um potencial processo letal apresentam requisitos metabólicos específicos, podendo não ser recuperados em meios de cultura usuais. Como consequência direta de tais fatos é que a expressão livre de formas demonstráveis de vida tem sido empregada como sinônimo de estéril.

A morte dos microrganismos submetidos a um processo de esterilização não ocorre simultaneamente, ou seja, segue a cinética de primeira ordem onde a mesma fração de microrganismos é morta a cada unidade de tempo. Isto resulta numa linha reta quando o log do número de organismos sobreviventes é colocado em gráfico contra o tempo. Esterilidade é, portanto, um estado absoluto e que não pode ser garantido. Ainda assim, todo o esforço é feito no sentido de assegurar carga inicial extremamente baixa, de maneira que, na sequência dos tempos crescentes do processo esterilizante, níveis de potenciais negativos elevados correspondam à condição de probabilidade ínfima quanto à presença microbiana.

O processo de esterilização para inativação microbiana segue efetivamente o critério de redução logarítmica, embora não se possa dizer o mesmo do processo de filtração, onde todos os microrganismos são removidos ao mesmo tempo.

CINÉTICA DE INATIVAÇÃO MICROBIANA

Processo esterilizante:

- população inicial (biocarga)

- cinética de inativação desta população ao agente

Perda da viabilidade

- regular

- velocidade de inativação diretamente proporcional ao número da

população em cada tempo

Expressão de resistência

Valor D

- tempo de exposição necessário para redução de 90 % da

população microbiana

- tempo necessário para reduzir um ciclo logarítmico na curva

sobreviventes



O planejamento de um processo esterilizante, com uma probabilidade definida de ocorrência de sobreviventes, depende do conhecimento da população inicial de microrganismos no produto e da cinética de inativação, desta população, quando exposta ao efeito letal.

Quando uma população homogênea de organismos é exposta a um processo letal, a perda da viabilidade ocorre de maneira regular, sendo a velocidade de inativação diretamente proporcional ao número da população, em cada tempo.

A resistência de uma determinada população de microrganismos a um processo de esterilização pode ser expressa como o valor D. O valor D pode ser definido como o tempo de exposição necessário para a redução de 90% da população microbiana, ou seja, é o tempo de exposição ao agente letal necessário para reduzir um ciclo logarítmico na curva de sobreviventes. Quanto menor o valor de D, mais sensível é o microrganismo ao processo. Normalmente, o planejamento dos protocolos de esterilização expressa a inativação microbiana em termos do valor de D.

CINÉTICA DE INATIVAÇÃO MICROBIANA

Menor D microrganismo mais sensível



O valor de D pode ser estimado graficamente. Para a determinação do valor D através da enumeração direta, uma população conhecida de microrganismos é exposta ao agente letal em questão, sendo as amostras retiradas após diferentes tempos de exposição ao processo. O número de sobreviventes é estimado por método de contagem validado (plaqueamento), em meio de recuperação adequado. Os dados de Unidades formadoras de Colônias (UFC) em função do tempo são considerados para gerar uma curva de sobreviventes, que permite a determinação do valor de D.

Quanto menor o valor de D, mais sensível é o microrganismo ao processo.

CONTROLE NA PRODUÇÃO DE ESTÉREIS

Validação do ambiente

- qualidade do ar

- procedimento de limpeza

Pessoal

Validação do processo

Validação do produto



Hoje é universalmente aceito que todos os produtos farmacêuticos devem ser produzidos com condições de higiene e limpeza, variáveis de acordo com suas particularidades. Para os produtos estéreis, submetidos à esterilização final, torna-se necessário o atendimento a baixos níveis de bioburden, apenas possíveis em ambiente limpos, para garantir confiabilidade no processo esterilizante, assim como, garantir baixa contaminação endotóxica no produto acabado.

Para a produção de produtos estéreis é preciso garantir que o procedimento de limpeza e de manutenção da qualidade do ar estejam validados. Além disso, o pessoal deve estar devidamente treinado e paramentado. Com relação à validação do processo esterilizante, vários aspectos devem ser considerados: qualificação do esterilizador, da instalação e da operação, sem esquecer da documentação (protocolos completos, relatórios de validação, etc), que é de fundamental importância. Para cada produto a ser esterilizado, devem haver cuidadosas considerações à adequação do método de esterilização proposto e validação do produto, após esterilização. Para produtos estáveis ao calor, o processamento em autoclave, no acondicionamento final, é usualmente o método de escolha. Para esterilização gasosa, deve ser dada atenção a possíveis reações do produto com o gás esterilizante. A principal consideração sobre o processo de filtração envolve velocidade do fluxo e alterações superficiais do filtro. Interações do produto com o filtro ou seus elementos também dever ser levados em consideração porque podem se constituir em problema.

SISTEMA DE CLASSIFICAÇÃO DO AR NA ÁREA LIMPA DESTINADA

À PRODUÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS (WHO)

http://apps.who.int/medicinedocs/pdf/h3009e/h3009e.pdf



Essas tabelas demonstram a classificação do ar, quanto ao limite de microrganismos e de partículas, na área limpa destinada à produção de produtos estéreis, de acordo com a Organização Mundial de Saúde. A classe da área limpa a ser utilizada dependerá do processo a ser utilizado e se a esterilização ocorrerá no final ou não do processo.

As áreas limpas para a fabricação de produtos estéreis são classificadas de acordo com as características exigidas do ambiente. Cada operação de fabricação requer um nível de limpeza ambiental adequado no estado operacional, a fim de minimizar os riscos de contaminação microbiológica ou particulada do produto ou materiais sendo manipulados. O saneamento de áreas limpas é particularmente importante. Eles devem ser limpos com frequência, de acordo com um programa escrito aprovado. O monitoramento deve ser realizado regularmente, a fim de detectar o surgimento de cepas resistentes de microrganismos. Tendo em vista à sua eficácia limitada, a luz ultravioleta não deve ser usada como substituto à desinfecção química.

SISTEMA DE CLASSIFICAÇÃO DO AR NA ÁREA LIMPA DESTINADA

À PRODUÇÃO DE PRODUTOS ESTÉREIS



Nessa tabela podemos verificar a comparação entre diferentes classificações quanto ao material particulado encontrado nas áreas limpas, destinadas à produção de produtos estéreis.

Abaixo estão as referências de 1 a 4, citadas na legenda da figura. 1. Good manufacturing practices for pharmaceutical products. In: WHO Expert Committee

on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-second report. Geneva, World Health Organization, 1992, Annex 1 (WHO Technical Report Series, No. 823).

2. Airborne particulate cleanliness classes in cleanrooms and clean zones. Federal Standard 209E. Mount Prospect, IL, Institute of Environmental Sciences, 1992.

3. Cleanrooms and associated controlled environments. Part 1: classification of airborne particulates. Geneva, International Organization for Standardization, 1999.

4. The rules governing medicinal products in the European Union. Vol. 4. Good manufacturing practices: medicinal products for human and veterinary use. Brussels, European Commission, 1998.

Baixa concentração partículas 0,5 m

Ausência de partículas de 5 m

Redução de partículas de 0,1-0,3 m – FILTRAÇÃO

RETENÇÃO DAS PARTÍCULAS PELO FILTRO DEPENDE:

- tamanho da partícula

- velocidade de passagem do ar pelo filtro

ULPA – filtros de ar ultra baixo particulado (99,99996% -

partículas de 0,12 m)

HEPA – filtros de alta eficiência (99,9997% - partículas de 0,3

m)

QUALIDADE DO AR



A qualidade do ar utilizado nas indústrias farmacêuticas, para permitir obediência aos padrões descritos, necessita atender a exigências rígidas, com baixas concentrações de

partículas de 0,5 m, além da ausência daquelas com 5 m. A redução das partículas entre 0,1

e 0,3 m é conseguida pelo processo de filtração. A capacidade de retenção das partículas, pelo filtro, irá depender do tamanho das partículas e da velocidade de passagem do ar, pelo filtro.

A tecnologia atual permite a produção comercial de filtros de ar ultra-baixo particulados

(ULPA) que tem eficiência de reter 99,99996% das partículas com 0,12 m. Entretanto, mesmo para as finalidades mais rígidas da área farmacêutica, filtros apresentando 99,9997% de

eficiência partículas de 0,3 m mostram-se inteiramente adequados. Esta especificação corresponde aos filtros classificados genericamente como HEPA, também conhecidos como filtros absolutos, constituídos de micro partículas de vidro, repelentes à água, com diâmetro

de fibra de cerca de 0,1 m.

Contador de partículas totais

Monitorização microbiológica (bactérias e fungos)

Amostragem passiva (exposição de placas ou frascos)

Amostragem ativa (por impacto do ar através de fenda ou por

filtração)

VERIFICAÇÃO

- Limpeza da sala

- Falhas no sistema de filtração do ar

- Possível contaminação por intermédio pessoal produção

CONTROLE DA QUALIDADE DO AR



O número de partículas no ar pode ser facilmente verificado empregando-se contadores de partículas, usualmente com sistema a laser, portátil ou não, com ou sem impressoras, e tem como vantagem a leitura imediata dos resultados.

Tratando-se de área farmacêutica limpa, deve-se realizar a monitorização microbiológica, que poderá ser realizada por meio de amostragem passiva ou ativa. A contaminação por bactérias e fungos é verificada utilizando-se meios de cultura adequados, assim como temperaturas e tempos de incubação. Agar caseína soja, 35°C por 72h e Sabouraud Dextrose Agar, 22°C por 96h são os meios oficialmente empregados para a contagem de bactérias e fungos, respectivamente. A amostragem passiva deve ocorrer em posições definidas durante período de atividade normal na área, podendo ser por processo gravitacional usando meios de cultura (placas ou frascos de boca larga) abertos por período mínimo de 60 minutos, uma vez que a sedimentação de partículas estará sujeita à turbulência do ar. O tempo máximo de exposição das placas deve ser de 4 horas para impedir que a desidratação do meio possa prejudicar na recuperação dos microrganismos. A amostragem por exposição das placas abertas é considerada qualitativa.

A amostragem ativa do ar pode ser considerada quantitativa quando um volume conhecido de ar é amostrado por um período de tempo definido, e o resultado é expresso como o número de UFC/m3 de ar amostrado. Essa amostragem pode ser realizada colocando-se placas com meio de cultura, em câmaras fechadas, com o fluxo de ar atingindo-as diretamente. Neste caso, uma desvantagem seria a agressão a estas células, levando ao risco de dificultar ou impedir a proliferação dos microrganismos, nas condições usuais. Além disso, pode-se utilizar membranas para filtrar uma quantidade definida de ar e, a seguir, transferir essas membranas para a superfície de meios de cultivo sólidos.

O controle da qualidade do ar serve para verificar: - A limpeza da sala

- Possíveis falhas no sistema de filtração do ar

- Possível contaminação ocorrida por intermédio do pessoal da produção

Paredes, pisos, equipamentos

Métodos utilizados:

. Swabs – solução fisiológica contagem por plaqueamento ou

filtração

. Placas de contato.

VALORES MÁXIMOS SUGERIDOS PELA USP

Superfícies e equipamentos:

Classe 100 - 3 UFC (inclusive piso)

Classe 10.000 – 5 UFC (geral)

10 UFC (piso)

CONTROLE DE QUALIDADE DE SUPERFÍCIE



O monitoramento da qualidade das superfícies (paredes, pisos, equipamentos) fornece informações a respeito da biocarga presente nesses locais, podendo ser utilizado para avaliar os procedimentos de limpeza e desinfecção, bem como o potencial de contaminação cruzada.

Dois métodos são rotineiramente utilizados no monitoramento das superfícies: . Swabs, que permitem amostrar ângulos, fendas e superfícies irregulares onde seria

impraticável o uso da placa de contato. O swab é umedecido em diluente estéril (ex. solução salina), friccionado sobre a área amostrada e transferido diretamente (deve ser levemente girado sobre a superfície do Agar) para a placa contendo meio nutriente ou para diluente estéril que será, posteriormente, submetido a contagem (plaqueamento em profundidade ou filtração).

. Placas de contato: opção de escolha para superfícies planas devido à facilidade de utilização. As placas devem ser pressionadas por, pelo menos 10 segundos, no local da amostragem, tampadas e incubadas. A eficiência de recuperação dos microrganismos pode ser influenciada pela natureza do acabamento da superfície.

Valores máximos sugeridos pela USP para superfícies e equipamentos: Classe 100 - 3 UFC (inclusive piso) Classe 10.000 – 5 UFC (geral) 10 UFC (piso)

meio cultura sólido - pessoa coloca a mão após a

higienização

número e tipo de bactérias desenvolvidas

ausência de coliformes

CONTROLE DE QUALIDADE DO PESSOAL

Importantes características: qualificação,

treinamento e motivação



Com relação ao monitoramento do pessoal, as mais importantes características envolvendo os operários em uma área limpa são: qualificação, treinamento e motivação. Ainda assim, alguns controles microbiológicos são desejáveis e outros imprescindíveis. Pelo fato das pessoas serem a principal fonte de contaminação em uma sala limpa, é necessário monitorar a “superfície” das pessoas, ou seja, monitorar a contaminação das luvas e da paramentação. O monitoramento das luvas pode dar-se pela pressão da mão com a luva sobre a superfície do meio de cultura, em uma placa. A placa é incubada e as UFC contadas. O monitoramento da paramentação inclui áreas de maior risco potencial de contaminação como antebraço e peito. O número e tipo de microrganismos desenvolvidos irá indicar a possível fonte de contaminação. A ausência de coliformes é universal, pois são indicadores de maus hábitos de higiene. Para que os resultados sejam satisfatórios, todos os locais testados devem atender aos critérios de aceitação estabelecidos para cada tipo de área.

ENCHIMENTO SIMULADO (MEDIA FILL)

- Feito após qualificação do equipamento e validação do

processo de esterilização, treinamento do pessoal e após

monitoração ambiental

- Worst case

. Uso de materiais e componentes que tenham

permanecido na área de processamento asséptico por períodos

extensos;

. Alterar o tempo de enchimento das unidades;

. Empregar meio com capacidade promotora de

crescimento (ao invés de conservantes).

. Tamanho e tempo da corrida devem mimetizar a

condição de produção comercial

CONTROLE DO PROCESSO – Produtos envasados

assepticamente



Para uma nova planta ou processo de produção para produtos assepticamente envasados, o teste de enchimento simulado (Media Fill) é efetuado como parte da validação. A condução dos testes de simulação do processo para produtos assepticamente envasados abrange do ponto de esterilização do produto e recipiente, até o término do enchimento. Geralmente 3 simulações consecutivas do processo são efetuadas para qualificar uma nova planta ou linha de enchimento. Os testes iniciais devem ser conduzidos após ter sido feita a qualificação do equipamento e validação do processo de esterilização, treinamento do pessoal e após a monitoração ambiental evidenciar condições adequadas. Em plantas pré-existentes, esse teste deverá ser efetuado no mínimo duas vezes ao ano.

Uma das técnicas mais prevalentes utilizadas na validação de processos farmacêuticos adota o cenário de pior caso. Estas situações visam proporcionar o maior desafio ao processo, sistema ou equipamento sob validação. Sendo assim, utilizam-se materiais e componentes que tenham permanecido na área de processamento asséptico por períodos extensos; altera-se o tempo de enchimento das unidades, enchendo-se as unidades menores a uma velocidade maior (dificuldade de manuseio) e as maiores a uma velocidade menor (maximizando a exposição); emprega-se meio de cultura, com capacidade promotora de crescimento, ao invés da formulação com conservantes; ainda, o tamanho e tempo da corrida devem mimetizar a condição de produção industrial.

INTERPRETAÇAO DOS RESULTADOS

NÚMERO MENOR QUE 5000

UNIDADES

Nenhuma unidade

contaminada

5000 A 10000

UNIDADES

Uma unidade contaminada deveria

resultar em uma investigação,

incluindo repetir o media fill

Duas unidades contaminadas

revalidação da linha, seguido por

investigação

Processo confiável



Independente do número de unidades enchidas ou de positivos aceitos, o objetivo será sempre zero de positivos. Se um produto, submetido ao Media Fill, não apresenta organismos viáveis, o sistema possui elevado nível de confiabilidade. Porém há numerosos problemas técnicos para se atingir este objetivo. Meio e produto simulado não correspondem exatamente ao produto real em termos de características de processamento e de propriedades que permitam o crescimento. Conforme estabelecido pelo FDA, qualquer unidade contaminada deve ser investigada. A identificação do microrganismo permite investigar as possíveis causas, bem como a avaliação de seu impacto sobre medicamentos comercializados, enchidos na mesma linha, desde o Media Fill anterior bem sucedido.

Baixo nível de contaminação

- Confiabilidade no processo esterilizante (validação do

processo)

- Garantir baixa contaminação endotóxica no produto

CONTROLE DO PROCESSO – Produtos obtidos por

processo de esterilização final



Como dito anteriormente, a esterilização final deve ser o método de escolha para a obtenção de todos os produtos estéreis, sempre que for possível. Entretanto, alguns requisitos que se fazem necessários serem cumpridos para que o método seja confiável são: - Baixo nível de contaminação inicial; - Confiabilidade no processo esterilizante a ser utilizado e; - Garantia de baixa contaminação endotóxica no produto, o que é conseguido através de um baixo nível de contaminação inicial.

CONTROLE DE QUALIDADE DO PROCESSO DE

ESTERILIZAÇÃO FINAL - Autoclavação

- Verificar calibração dos sensores de temperatura e pressão

- Distribuir os sensores em diferentes pontos e verificar a

homogeneidade da temperatura e pressão

- Realizar esses testes com a autoclave vazia e com a sua

capacidade máxima – cumpre os critérios de aceitação?

- Utilizar indicadores físicos e biológicos adequados



Tomando-se como exemplo o método de esterilização por calor úmido, para validar o método é preciso:

- Verificar calibração dos sensores de temperatura e pressão;

- Distribuir os sensores em diferentes pontos e verificar a homogeneidade da temperatura e pressão;

- Realizar esses testes com a autoclave vazia e com a sua capacidade máxima – cumpre os critérios de aceitação?

- Utilizar indicadores físicos e biológicos adequados.

CONTROLE DA EFICIÊNCIA DO PROCESSO DE

ESTERILIZAÇÃO

INDICADORES

Indicadores físicos ou químicos: substância susceptível de

alterações irreversíveis ao método de esterilização

Indicadores biológicos: microrganismos específicos,

representados por cepas de elevada resistência ao processo,

na forma esporulada



O uso de indicadores (físicos, químicos ou biológicos) foi introduzido com o objetivo de assegurar cada vez mais a eficiência dos processos esterilizantes; visto que o próprio teste de esterilidade, numa amostra representativa, não tem condição absoluta de informação sobre a esterilidade do conjunto das unidades submetidas ao processo.

Os indicadores podem ser classificados em: - Indicadores físicos ou químicos: substâncias susceptíveis a alterações irreversíveis pelo

método de esterilização; - Indicadores biológicos: microrganismos específicos, representados por cepas de elevada

resistência ao processo esterilizante, na forma esporulada (forma mais resistente do microrganismo).

Monitoramento químico/físico do processo de

esterilização baseado na capacidade do agente

esterilizante alterar as características químicas e/ou

físicas de substâncias

Alteração das características químicas ou físicas –

indica que condições satisfatórias de esterilização foram

atingidas

INDICADOR FÍSICO OU QUÍMICO



O monitoramento químico/físico do processo de esterilização é baseado na capacidade do agente esterilizante em alterar as características químicas e/ou físicas das substâncias. A alteração das características químicas ou físicas indica que condições satisfatórias de esterilização foram atingidas.

Os indicadores podem ser colocados externamente ou internamente aos pacotes a serem esterilizados. Indicadores colocados no interior dos pacotes devem estar posicionados em locais de difícil acesso ao agente esterilizante; assim poderá se obter informações sobre falhas na esterilização com relação à penetração do vapor ou concentração de óxido de etileno. Para cada processo (autoclave, calor seco, radiação, óxido de etileno), existe um tipo de indicador apropriado.

fitas de papel impregnadas com tinta termocrômica que

mudam de cor quando expostas a temperaturas elevadas,

por certo tempo

indicadores específicos de temperatura

ponto de fusão – indica que a temperatura foi atingida

indicadores integradores: indicam a ação de diferentes

componentes como tempo, temperatura e umidade -

integram vários parâmetros de esterilização

INDICADOR FÍSICO OU QUÍMICO



Os indicadores químicos/físicos podem ser fitas de papel impregnadas com tinta termocrômica que mudam de cor quando expostas a temperaturas elevadas, por certo tempo. Eles podem indicar a exposição ou não a uma determinada temperatura (indicadores específicos de temperatura) ou podem indicar a ação integrada de diferentes componentes como tempo, temperatura e vapor (conhecidos como indicadores integradores).

No indicador integrador, o reagente químico é liberado gradativamente, na medida em que ocorre a combinação dos parâmetros de temperatura, umidade e tempo de exposição. Indicada a colocação em pacotes de difícil acesso do vapor.

VANTAGENS

Baixo custo

Indicação imediata (não é preciso cultivar o microrganismo)

DESVANTAGEM

Não é representativo das reais condições de esterilização

Alterações destes indicadores não necessariamente indicam

esterilidade microbiológica

IDEAL: associação indicador químico e biológico



Entretanto, as alterações nesses indicadores químicos/físicos não indicam, necessariamente, a esterilidade microbiológica. O ideal é a associação de um indicador químico a um biológico.

As vantagens da utilização de indicadores químicos/físicos é o baixo custo e a indicação imediata do resultados (não é preciso cultivar o microrganismo). Por outro lado, não é representativo das condições reais de esterilização, ou seja, não diz se o processo foi ou não capaz de matar o microrganismo.

INDICADOR BIOLÓGICO

Deve apresentar resistência ao método de esterilização em questão

Adição do indicador diretamente ao produto a ser utilizado

Uso de suportes (tiras ou discos de papel)

Utilização: Desenvolvimento, validação e monitoramento dos

processos de esterilização



O uso de indicadores biológicos permite comprovar a eficiência da esterilização, uma vez que o crescimento de microrganismos, após ser submetido ao processo de esterilização, é diretamente testado. Este indicador deve apresentar resistência ao método de esterilização em questão e, geralmente, são utilizados esporos, ao invés de células vegetativas, por serem a forma mais resistente do microrganismo. Os indicadores biológicos consistem em uma preparação padronizada de esporos bacterianos, em suspensões que contêm em torno de 10 a 6 esporos por mL ou unidade de papel.

A utilização de indicadores biológicos deve ser criteriosa e, sempre que possível, o indicador deve ser inoculado no próprio produto, de modo a assemelhar-se ao máximo à condição em que se encontra o contaminante natural, frente ao processo.

Quando não existe a possibilidade de inocular o bioindicador no produto em questão, estes microrganismos podem ser veiculados em suportes como tiras ou discos de papel, e colocados em recipientes de vidro, metal ou plástico (envelopes contendo tiras de papel impregnada com esporos ou ampolas contendo os esporos em meio cultura líquido). Este recurso deve ser evitado sempre que possível, visto que as condições são diferentes daquelas em que se encontra o produto, quando da esterilização, podendo oferecer maior ou menor resistência ao tratamento.

Após o processo de esterilização, os indicadores biológicos são incubados nas condições adequadas para o crescimento dos mesmos. A ausência de crescimento é indicação de que o processo foi eficiente sobre esses microrganismos, podendo-se considerar tal fato abrangente aos possíveis contaminantes do produto (mais sensíveis ao método de esterilização). Sendo assim, houve eficiência esterilizante do processo empregado.

PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS DE UM INDICADOR

BIOLÓGICO

O indicador deve ser em número e resistência superior ao

viável natural

Resistência estável e reprodutível, manutenção das

características bioquímicas e genéticas da espécie (constatação

periódica da manutenção da viabilidade)

Crescimento ótimo quando colocado em condições

fisiológicas da espécie

Não ser patogênico, não produzir endotoxinas



As principais características de um indicador biológico são:

- Deve ser em número e resistência superior ao contaminante natural;

- Resistência estável e reprodutível, relacionada com a manutenção das características bioquímicas e genéticas da espécie. É necessária a constatação periódica da manutenção da viabilidade desses indicadores;

- Crescimento ótimo quando colocado em condições fisiológicas da espécie;

- Não ser patogênico e não produzir endotoxinas, pois, embora os métodos de esterilização sejam capazes de matar os microrganismos, poucos métodos são capazes de eliminar as endotoxinas. Sendo assim, não queremos microrganismos produtores de endotoxinas em uma planta destinada à produção de produtos estéreis.

MONITORIZAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO

conhecer o produto a ser esterilizado

conhecer o estado de contaminação em que se encontra

o produto

tipo e número de microrganismos que normalmente

contaminam o produto

número de esporos recomendado para cada unidade de

produto varia de 105 a 107 – quanto maior o inóculo, maior a

segurança do resultado



Para a monitorização do processo de esterilização, utilizando-se indicadores biológicos, é necessário:

conhecer o produto a ser esterilizado;

conhecer o estado de contaminação em que se encontra o produto;

conhecer o tipo e número de microrganismos que normalmente contaminam o produto, de modo que o indicador seja em número e resistência superior ao natural.

O número de esporos recomendado para cada unidade de produto varia de 105 a 107 – quanto maior o inóculo, maior a segurança do resultado obtido.

CRITÉRIOS NA UTILIZAÇÃO DE INDICADORES

BIOLÓGICOS

Inocular o microrganismo no próprio produto

Veicular o microrganismo em suportes como tiras ou

discos de papel

Localização das amostras inoculadas ou dos suportes

dentro do esterilizador

- densidade dos materiais

- estratificação de gases

- umidade do esterilizador



Alguns critérios que devem ser definidos quando da utilização dos indicadores biológicos:

- Inocular o microrganismo no próprio produto ou em suportes como tiras ou discos de papel;

- Definir a localização das amostras inoculadas ou dos suportes dentro do esterilizador;

- A localização das amostras inoculadas ou dos suportes dentro do esterilizador é bastante crítica, devendo-se lembrar de fatos como densidades maiores de materiais, estratificação de gases ou na umidade do esterilizador, que podem oferecer condição inadequada de esterilização.

Após o processamento dos indicadores, eles devem ser incubados para se verificar se as cepas ainda são viáveis. As condições de incubação e o meio em que os indicadores devem ser incubados devem ser fornecidos pelo fabricante do indicador biológico. O indicador que foi submetido ao processo de esterilização é incubado nas mesmas condições e juntamente com outro indicador que não tenha passado pelo processo, a fim de se verificar a viabilidade das cepas e se as condições de incubação utilizadas foram adequadas para o crescimento bacteriano. A realização dos testes biológicos deve ser, no mínimo, semanalmente e após cada manutenção ou suspeita de mau funcionamento. No processo de esterilização a óxido de etileno o teste deve ser realizado em cada ciclo de esterilização devido à complexidade do processo e à maior probabilidade de falhas.

INDICADORES BIOLÓGICOS: MAIS ACONSELHADOS

Utilização do indicador durante o processo industrial –

provas seguras da eficácia do tratamento

Oferecer aos indicadores condições adequadas de

crescimento

Ausência de crescimento: processo esterilizante eficiente



A utilização de indicadores biológicos é mais aconselhada porque, durante o processo industrial, consiste em provas seguras da eficiência do processo esterilizante. Entretanto, é importante oferecer aos indicadores as condições adequadas de crescimento, após serem submetidos ao processo de esterilização. As condições ideais são fornecidas pelos fornecedores dos mesmos. A ausência de crescimento desses microrganismos indica que o processo esterilizante foi eficiente.

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO

Indicador biológico

Bacillus subtilis (inóculo inicial > 105 , valor D = 5 - 10 min)

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR CALOR ÚMIDO


Bacillus stearothermophillus (inóculo inicial > 105 , valor D = 1,5 min)

Clostridium sporogenes (inóculo inicial > 105 , valor D = 0,8 min)



Alguns microrganismos são indicados para a monitorização dos processos esterilizantes. No caso de esterilização por calor seco, embora não exista um microrganismo ideal, Bacillus

subtilis é o mais indicado. Quando o calor seco for utilizado para despirogenização do material, não há necessidade de usar o indicador biológico porque as elevadas temperaturas requeridas são suficientes para esterilizar o material.

No caso de esterilização por calor úmido (autoclave), os microrganismos indicados são Bacillus stearothermophillus e Clostridium sporogenes, ambos utilizados na forma esporulada. Ambas as cepas apresentam comportamento logarítmico regular e reprodutível, além de maior resistência aos respectivos processos que os constituintes usualmente isolados no bioburden ou biocarga.

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR ÓXIDO DE

ETILENO


Bacillus subtilis (inóculo inicial > 106-107 , valor D = 9 min)

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR RADIAÇÃO

IONIZANTE


Bacillus pumillus (inóculo inicial 107-108)



No caso da esterilização por óxido de etileno e radiação ionizante, os microrganismos mais indicados são Bacillus subtilis e Bacillus pumillus, respectivamente.

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

Teste de integridade (não destrutivo): teste de ponto de bolha,

visualização de bolhas a uma determinada pressão aplicada

Teste de desafio bacteriológico (destrutivo): avalia a retenção do

microrganismo Brevundimonas diminuta (ATCC 19146) - 107 células

por cm2)

FILTRO É ESTERILIZANTE - FDA



Para o controle do processo de esterilização por filtração, existem dois métodos para garantir a eficiência do processo. Um deles é um teste não destrutivo (ponto de bolha), enquanto o outro trata-se de um teste destrutivo (filtração de microrganismo). O teste de ponto de bolha será discutido no próximo slide.

O teste de desafio bacteriológico irá avaliar a capacidade de retenção do microrganismo Brevundimonas diminuta na membrana a ser avaliada. A escolha de B. diminuta decorre de sua característica de crescimento, mantendo células isoladas, da sua dimensão reduzida (0,3 a 0,6 µm), de fácil manutenção e crescimento rápido, atingindo densidade óptica elevada rapidamente. O teste é realizado filtrando-se uma suspensão com grande quantidade de células desse microrganismo e avaliando-se a qualidade microbiológica do filtrado. Caso não ocorra crescimento microbiano no filtrado, considera-se o filtro esterilizante.

CONTROLE DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO

Teste de integridade (não destrutivo): teste de ponto de bolha,

visualização de bolhas a uma determinada pressão aplicada

A teoria da pressão do ponto de bolha é frequentemente usada em um teste chamado "teste de ponto de bolha". Esse teste é realizado para determinar a que pressão um fluxo contínuo de bolhas é inicialmente visto a jusante de um filtro molhado, sob pressão de gás. É realizado umedecendo, primeiramente, o filtro a ser testado com o solvente apropriado (água para filtros hidrófilos, álcool para filtros hidrofóbicos). A seguir, o filtro molhado é colocado no local apropriado e a saída do regulador de pressão de ar comprimido é ligada à entrada do filtro de teste. Além disso, um pedaço de tubo flexível conecta a saída do filtro de teste a um copo cheio de água. A partir da pressão zero, a pressão do filtro é aumentada gradualmente utilizando um regulador de pressão. A extremidade submersa do tubo flexível é analisada quanto à produção de bolhas, à medida que a pressão é aumentada, lentamente, em incrementos de 0,03 bar. O ponto de bolha do filtro sob teste é alcançado quando as bolhas são produzidas a uma taxa constante.

Esse teste é usado para estimar o tamanho dos poros dos filtros microporosos e para confirmar a integridade dos filtros de membrana de esterilização e sistemas de filtração. O teste do ponto de bolha determina a pressão mínima necessária para forçar o líquido para fora dos poros, que é a medida do diâmetro do poro. Realizado o teste, se a pressão for superior ou igual ao ponto de bolha mínimo esperado, indica resistência do material filtrante e o filtro passa no teste de integridade. Se a pressão registrada for inferior ao ponto de bolha mínimo, o filtro falhou no teste de integridade.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Pinto, T.J.A.; Kaneko, T.M.; Pinto, A.F. Controle biológico de

qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e

cosméticos. 3ª Ed. Ateneu Editora, São Paulo, 2010.

- Farmacopéia Brasileira, 6ª Ed., ANVISA, 2019.

- United States Pharmacopoeia. 40th Ed. Rockville: United

States Pharmacopoeia Convention, 2017.

- www.anvisa.gov.br



slide 1 controle de qualidade microbiológico de

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