UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E BIOLOGIA

Doseamento Microbiológico de

Antibióticos

Profª. ANA FLÁVIA OLIVEIRA SANTOS

Dosagem Microbiológica de Antibióticos

Substâncias não quantificáveis por métodos físico-químicos;

1929 – Penicilina (Fleming);

1948 – Farmacopéia Britânica;

1955 – United States Pharmacopea (USP);

Procedimentos gerais

Padrão USP;

Cepas ATCC (American Type Culture Collection);

Dosagem Microbiológica de Antibióticos

Avaliação comparativa, frente a um padrão biológico de referência;

Padrão USP;

Cepas ATCC (American Type Culture Collection);

P2 - 5μg17 mm

P1 - 2,5 μg13,22 mm

P3 - 10μg19,11 mm

P4 - 20μg22,11 mm

Placa com os padrões de Ciprofloxacina e o microrganismo-teste Staphylococcus aureus

ATCC 25923.

Doseamento microbiológico de antibióticos

A quantificação microbiológica de substâncias ativas demanda sempre no emprego de uma avaliação comparativa frente a um padrão biológico de referência.

Métodos microbiológicos para determinação da potência dos antibióticos são indicados para substâncias ou preparações, em que o seu teor não poder ser determinado por métodos físico-químicos.

A atividade (potência) de antibióticos pode ser demonstrada sob condições adequadas através de seu efeito inibitório sobre o crescimento microbiano.

Uma redução na atividade antimicrobiana pode revelar alterações sutis não demonstráveis por métodos químicos.

Métodos biológicos para determinação de Potência de Antibióticos

Difusão em ágar

Ensaio de difusão em ágar ou cilindro em placas (este método fundamenta-se na determinação da potência do antibiótico em estudo, com relação a potência do seu padrão internacional de referência, através de halos de inibição do crescimento do microrganismo sensível a este antibiótico, em meio de cultura específico e condições adequadas.

Método Turbidimétrico

Método turbidimétrico (considera a relação entre a proporção de crescimento da população microbiana no meio líquido e a concentração da substância ensaiada, sendo mais empregado no doseamento de vitaminas e aminoácidos).

Difusão em Agar

É fundamentalmente um método físico, no qual um microrganismo é usado como Revelador.

Relaciona o tamanho da zona de exibição (fatores de crescimento) ou inibição (antibiótico) de crescimento com a dose da substância ensaiada.

Emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em sistema mono ou bicamadas, através do qual a substância teste se difunde.

A solução teste é aplicada sobre a superfície do meio, em área restrita, e as placas são então incubadas.

O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porém, áreas onde tenha ocorrido a difusão do antibiótico, gerando contraste e resultando a chamada zona de inibição de crescimento.

Solução teste nas placas Semeadas

Cilindros ou furos no gel;

Métodos dependentes da concentração da solução teste;

Disco de papel ou métodos nos quais a solução amostra é transferida na forma de micro gotas;

Métodos dependentes da quantidade testada em cada unidade de suporte.

Desvantagens do método de cilindro em placa

Não formação de halos nítidos;Ocasional deficiência de contato do cilindro com a superfície do ágar provocando o aparecimento de halos deformados.

Fatores que influenciam a Dosagem microbiológica

pH;Condições de incubação;Composição do meio;Espessura;Uniformidade do ágar;

Fatores que afetam o tamanho do halo de inibição de crescimento

Escolha do microrganismo e sua sensibilidade;Condição do microrganismo teste, se na forma vegetativa ou esporulada;Densidade de semeadura;Espessura do gel e tamanho do halo são inversamente proporcionais;Potência da solução-teste;Volume da solução teste no cilindro ou disco deve ser grande suficiente para ser considerado constante, ou ser padronizado;Tempo de aplicação da solução-teste;Temperatura de incubação, sendo importante a sua uniformidade.

Considerações para o ensaio por Difusão em Agar

Cada placa de 10 cm de diâmetro comporta até 6 cilindros ou igualmente 6 furos.

No caso dos cilindros a colocação pode ser manual com auxílio de pinça ou através de dispensadores que simultaneamente colocam todos os cilindros por placa.

Os solventes, diluentes, preparação da amostra e faixas de concentração devem seguir orientação da monografia específica.

Aplicar soluções nos cilindros (ou outro dispositivo) por meio de pipeta que libere volume uniforme da ordem de 0,2mL.

Cuidados dizem respeito a randomização das placas na distribuição de soluções-padrão e de amostras, dentro do menor tempo possível para transferência das soluções, a fim de que a difusão inicie ao mesmo tempo.

Considerações para o ensaio por Difusão em Agar

Incubar as placas na temperatura indicada, com variação máxima de 0,5ºC durante o período de 16 a 18horas.

Medir o diâmetro das zonas de inibição do crescimento e calcular a potência da substância a partir dos resultados.

% A/P = Antilog [2 + F/E x log (rd)]

Onde:F = ( A total – P total) /3 E = [ (Total A3 – Total A1) + ( Total P3 – Total P1)] / 4Rd = razão das doses

ou% A/P= 102 (Rd F/E)

Antibiótico Microrganismo

Meio de cultura a ser usado (conforme 3. Meios de cultura).

Volume (mL) de meio a ser aplicado nas camadas.

Volume de

inóculo mL/100

ml

Temperatura de incubação das placas ºC

Base Superfície Base Superfície

Amoxilina Micrococcus luteus (ATCC- 9341)

11 11 21 4 0,5 32 a 35

Ampicílina Micrococcus luteus (ATCC - 9341)

11 11 21 4 0,5 32 a 35

Anfomicina Micrococcus flavus resistente à neomicina (ATCC - 14452)

2 1 21 4 0,5 36 a 38

Bacitracina Micrococcus luteus (ATCC - 7468)

2 1 21 4 0,3 32 a 35

Bacitracina Micrococcus luteus (ATCC - 10240)

2 1 21 4 0,3 32 a 35

Farmacopéia Brasileira

Produto em análise: Cefalexina.

Forma farmacêutica: Drágeas

Método empregado: Difusão em ágar

Microrganismo teste: Micrococcus luteus

Solução diluente: Tampão fosfato de potássio pH 6,0

Meios de cultura – Camada base - Ágar Muller Hinton Camada semeada - Ágar Muller Hinton

Volume do inóculo: 0,2 mL

Concentração inicial: 1000 l/mL

Concentrações finais: 10, 20 e 40 l/mL

Temperatura de incubação: 35-37 °C

Tempo de incubação: 18 horas

Condições para o ensaio de Cefalexina

Método Turbidimétrico

Caracteriza-se por séries de tubos contendo concentrações muito próximas do antibiótico, além do meio de cultura líquido e microrganismo teste.

O princípio do método é simples...A substância teste é adicionada a suspensão do organismo teste presente em meio nutriente, e após incubação da mistura procede-se a leitura da resposta.

Considerações para o ensaio por Turbidimetria

Empregar para cada antibiótico o microrganismo e caldo nutritivo indicado pela Farmacopéia;

Determinar experimentalmente o volume de inóculo a ser adicionado a 100mL de Caldo a partir da quantidade sugerida;

O meio inoculado deve ser preparado e utilizado imediatamente;

Distribuir em tubos idênticos, volumes igual de cada uma das soluções amostra e padrão;

Pelo menos 18 tubos são usados para o ensaio;Três tubos para cada concentração do padrão e da amostra;

Incubar em banho maria, à temperatura adequada, de 3 a 4 horas; Tomando a preocupação de assegurar temperatura uniforme e tempo de incubação idêntico para todos os tubos;

Após o período de incubação, interromper a multiplicação dos microrganismos pela adição de 0,5mL de solução de formaldeído, a 12% em cada tudo;

Determinar a absorvância para cada tubo em fotocolorímetro apropriado, no comprimento de onda de 530 nm;

A partir dos resultados, calcular a potência da amostra e seus limites de confiança.

Considerações para o ensaio por Turbidimetria

Difusão em Ágar

Método físico

Microrganismo revelador

Zona de Inibição de crescimento

Método Turbidimétrico

Inibição de crescimento

Solução uniforme do antibiótico

Caldo

Dosagem Microbiológica de Antibióticos

Referências

Farmacopéia brasileira 4ª ed., 1988.

Fröehlich, P. E.; Schapoval, E. E. S. Doseamento microbiológico do norfloxacino, método da difusão em ágar (cilindro em placas). Rev. Ciênc. farm. São Paulo. v.12, p.161-65, 1990.

Lachman, L.; Lieberman, H.A.; Kanig, J.L. Teoria e prática na

indústria farmacêutica. V.2, lisboa: fundação calustre gulberman,

2001.

Pinto, T. J.; Kaneko, T. M.; Ohara, M. T. Controle biológico de

qualidade de produtos farmacêuticos e correlatos. São paulo:

atheneu, 2000.

Cezaretto, d. C.; Controle da qualidade microbiológica de

medicamentos. São João da Boa Vista; São Paulo, 2005.