desenvolvimento de mÉtodos analÍticos para a …livros01.livrosgratis.com.br/cp036866.pdf ·...

Cristiani Lopes Capistrano Gonçalves de Oliveira

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS

ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE

GATIFLOXACINO EM COMPRIMIDOS

Dissertação para obtenção do título de mestre

Comissão examinadora

Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Marona

Profa. Dra. Simone Cardoso Gonçalves

Dra. Luciana Polese

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASCAMPUS - ARARAQUARA

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOSANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE



Orientadora: Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Marona

Araraquara – SP

Dissertação apresentada ao Programa dePós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,Área de Pesquisa de Desenvolvimento deFármacos e Medicamentos, da UNESP,como parte dos requisitos para obtenção doTítulo de Mestre em Ciências Farmacêuticas

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASCAMPUS - ARARAQUARA

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOSANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE



Araraquara-2003

AgradecimentosÀ minha avó (in memorian), mulher corajosa, nascida no interior do RN em 1902, com

uma percepção incomum às mulheres da sua época. Obrigada por sempre escutar minhas

preces e me confortar nos momentos difíceis.

Ao meu sogro, Francisco das Chagas e Silva, e à minha sogra, Maria Creusa, pela ajuda

emocional e apoio sempre constante, para que eu e Angelo realizássemos nosso sonho.

À minha tia Eunice, pelas orações em minha intenção, e pelo amor dedicado a mim e à

minha família

À minha Tia Aldeiza e ao Tio Laércio, pelo apoio oferecido, e por ter reunido a família

para me ajudar. Obrigado por tudo que vocês já fizeram por mim.

Aos meus amigos de mestrado, Rubiana, Fernando, Fátima, Tina, Inaiara, pelas angústias,

dúvidas, inseguranças, opiniões e aperreios compartilhados.

A todos os outros colegas de turma de mestrado que conviveram comigo durante esse

período de aprendizagem e crescimento.

Aos meus amigos Alexandra e Tadeu, que tornaram esses dois anos em Araraquara mais

agradáveis e felizes

À minha querida estagiária Maria Beatriz Bastos Luchessi, Bia, pela amizade e auxílio no

doseamento microbiológico.

Aos meus familiares que me ajudaram, financeiramente e emocionalmente, para que eu

pudesse realizar meu sonho, e viajar tranqüila para Araraquara.

À Luciene, pelos momentos agradáveis compartilhados no laboratório, e pela ajuda nos

experimentos realizados.

À Dona Maria, exemplo de dedicação e amor ao trabalho realizado no laboratório.

Obrigado por socorrer-me e ajudar-me no laboratório

Ao Prof. Dr. Luís Vitor Sacramento, pela amizade construída nesses anos que estive em

Araraquara.

À Profa. Dra. Chung Man Chin, pela disponibilidade em ajudar-me e pela amizade,

construída nesses anos.

Ao Prof. Dr. Manoel Lima de Menezes, do Instituto do Trabalhador e da Faculdade de

Ciências de Bauru, UNESP, por ter concedido o equipamento para realização das análises

em CLAE e a coluna phenomenex.

Ao Prof. Dr. Keiji Ukijawa, por disponibilizar o espectrofotômetro para análises no UV.

À Profa. Dra. Magali Benjamin de Araújo, EFOA-Alfenas, pelas sugestões e orientações,

fornecidas para a minha dissertação.

À Profa. Dra. Márcia da Silva, UNESP-Araraquara, pelas sugestões e orientações,

fornecidas para a minha dissertação.

Aos funcionários da biblioteca, em especial a Moacyr, Queila, Ana e Laura, pela amizade e

os bons momentos de convívio durante esses dois anos.

Às funcionárias da secretaria de pós-graduação, pela dedicação, paciência e simpatia no

atendimento e dúvidas solucionadas, durante este período.

A Bristol-Myerrs Squibb, pela doação da substância de referência e comprimidos de

gatifloxacino.

À CAPES, pelo apoio financeiro concedido.

A Deus.............

Os momentos difíceis foram tantos........... Mas a fé, a esperança e o otimismo de dias menos

angustiados, deram-me força para continuar e concluir minha dissertação. O Senhor foi meu

grande aliado, principalmente nos dias, que a vontade era de jogar tudo para cima.

Ao grande amor da minha vida, Nathan

A sua existência torna tudo mais objetivo

A sua presença era um motivo a mais para continuar

O seu olhar puro e ingênuo dava-me forças para não desistir

As decepções era menores ao seu lado

Desculpe-me pelos momentos ausentes, cansados, sonolentos,

que eu não pode estar com você

Ao meu amor, Angelo

Ao amigo e companheiro.

Esse anos não foram só flores, mas ao seu lado ficava fácil continuar

Com certeza não foi fácil agüentar meu temperamento difícil

Obrigado por sempre me apoiar e estar sempre ao meu lado nos momentos de alegrias e tristezas.

Amo você!

À minha mãe, pelo apoio, amor e compreensão dedicados a mim.

Sem a sua força ,incentivo e ajuda, eu não conseguiria.

A minha irmã, Christinni, por me apoiar e ajudar nos momentos que eu precisei.

Ao meu pai, por me apoiar, ajudar e incentivar.

À Profa. Dra. Hérida Regina Nunes Marona

Um dos melhores presentes nestes últimos dois anos foi ganhar você como orientadora. Além de me

orientar, mostrou-se uma pessoa amiga, determinada e amável, conquistando minha amizade e

confiança neste período. Você é maravilhosa!

“Se alguém lhe bloquear a porta, não gaste energia com o confronto: procure as janelas.Lembre-se da água: ela nunca discute com seus obstáculos, apenas os contorna.

Portanto, quando alguém lhe ofender ou frustrar, contorne-o sem discutir.”Desconhecido

SUMÁRIO

Lista de Abreviaturas

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de Quadros

Resumo

Abstract

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................3

2.1.Quinolonas e fluorquinolonas.............................................................................3

2.2. Gatifloxacino.........................................................................................................6

2.2.1. Descrição...........................................................................................................11

2.2.1.1. Substância de referência ......................................................................12

2.2.1.2. Forma farmacêutica .............................................................................12

2.3. Doseamento microbiológico ...............................................................................13

2.4. Espectrofotometria..............................................................................................20

2.5. Métodos cromatográficos .................................................................................20

2.5.1. Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................................20

2.5.2. Cromatografia líquida de alta eficiência ....................................................23

2.6. Método titrimétrico.............................................................................................26

2.7. Métodos analíticos para fluorquinolonas em formas farmacêuticas............. 28

2.8. Validação de métodos analíticos........................................................................33

3. OBJETIVOS .............................................................................................................40

4. MATERIAL E MÉTODO .........................................................................................41

4.1. MATERIAL...........................................................................................................41

1 Solventes, matérias-primas e reagentes.......................................................41

2. Equipamentos.................................................................................................42

4.2. MÉTODO.............................................................................................................44

4.2.1. Doseamento em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio com

ácido acético.........................................................................................................44

4.2.1.1. Exatidão do método.......................................................................................44

4.2.1.2. Precisão do método........................................................................................44

4.2.1.3. Determinação do teor de gatifloxacino na forma farmacêutica

comprimido..................................................................................................................44

4.2.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV........................45

4.2.2.1. Espectro de absorção de GATX-SR..............................................................45

4.2.2.2. Construção da curva de Ringbom.................................................................45

4.2.2.3. Construção da curva padrão para gatifloxacino.........................................46

4.2.2.4. Análise estatística ...........................................................................................47

4.2.2.5. Exatidão do método proposto. .......................................................................47

4.2.2.6. Precisão do método..........................................................................................48

4.2.2.7. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos ........................................48

4.2.2.7.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência.................48

4.2.2.7.2. Preparo das amostra de comprimidos........................................................49

4.2.3. Cromatografia líquida de alta eficiência..........................................................52

4.2.3.1. Construção da curva padrão..........................................................................52

4.2.3.2. Análise estatística............................................................................................53

4.2.3.3. Exatidão do método proposto........................................................................53

4.2.3.4. Precisão do método........................................................................................54

4.2.3.5. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos.......................................54

4.2.3.5.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência...............54

4.2.3.5.2. Preparo das amostra de comprimidos.......................................................55

4.2.4. Doseamento microbiológico..............................................................................56

4.2.4.1. Preparo das soluções-padrão..........................................................................57

4.2.4.2. Preparo das soluções de gatifloxacino na forma farmacêutica...................58

4.2.4.3. Preparo do inóculo..........................................................................................58

4.2.4.4. Ensaio...............................................................................................................58

4.2.4.5. Cálculo da potência do medicamento...........................................................60

4.2.4.6. Construção da curva padrão..........................................................................60

4.2.4.7. Exatidão do método.........................................................................................60

4.2.4.7.1. Preparo das soluções....................................................................................60

4.2.4.8. Precisão do método..........................................................................................62

4.2.5. Cromatografia de camada delgada ..................................................................62

4.2.5.1. Preparo das placas......................................................................................62

4.2.5.2. Preparo da solução-padrão de gatifloxacino............................................62

4.2.5.3. Preparo da solução amostra de gatifloxacino..............................................62

4.2.5.4. Preparo da solução de esparfloxacino..........................................................63

4.2.5.5. Preparo de solução de ciprofloxacino...........................................................63

4.2.5.6. Preparo de solução de lomefloxacino............................................................63

4.2.5.7. Preparo da solução de levofloxacino..............................................................63

4.2.5.8. Sistemas de fases móveis.................................................................................64

4.2.5.9. Ensaio..............................................................................................................64

4.2.5.10. Execução do ensaio com as cinco fluorquinolonas....................................64

4.2.6. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho.......................65

4.2.7. Análise térmica de gatifloxacino......................................................................65

5. RESULTADOS.........................................................................................................66

5.1. Doseamento de gatifloxacino em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M

em meio de ácido acético glacial......................................................................66

5.1.1. Teste de recuperação de gatifloxacino na análise titrimétrica......................66

5.1.2. Precisão do método em análise titrimétrica....................................................67

5.1.3.Teor de gatifloxacino nos comprimidos............................................................67

5.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV............................68

5.2.1. Espectro de absorção da substância de referência GATX ............................68

5.2.2. Curva de Ringbom de GATX utilizando água deionizada como solvente...69

5.2.3. Construção da curva padrão de GATX utilizando água deionizada como

solvente. ......................................................................................................................71

5.2.4. Análise estatística .............................................................................................73

5.2.5. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para

a curva padrão....................................................................................................78

5.2.6. Teste de recuperação para GATX ..................................................................79

5.2.7. Precisão do método...........................................................................................79

5.2.8.Valores experimentais obtidos na determinação do teor de gatifloxacino nos

comprimidos por espectrofotometria na região UV. ..............................................80

5.3. Cromatografia líquida de alta eficiência...........................................................80

5.3.1. Cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. ...............................................80

5.3.2. Curva padrão.....................................................................................................82

5.3.3. Análise estatística ..............................................................................................84


a curva padrão.....................................................................................................89

5.3.5. Teste de recuperação para GATX ...................................................................90

5.3.6. Precisão do método a partir dos valores experimentais obtidos na determinação

de gatifloxacino nos comprimidos por CLAE....................................91

5.3.7.Teor dos comprimidos em CLAE.......................................................................92

5.4. Doseamento microbiológico .................................................................................93

5.4.1. Doseamento microbiológico de gatifloxacino em delineamento 3 x 3............93

5.4.2. Análise estatística do doseamento microbiológico...........................................99

5.4.3. Curva padrão de GATX do no doseamento microbiológico .......................102

5.4.4. Construção da curva padrão de GATX-SR no doseamento microbiológico pelo

método de difusão em ágar, cilindros em placa ..............................................103

5.4.5. Teste de recuperação de gatifloxacino no doseamento

microbiológico.............................................................................................................104

5.4.6. Potência dos comprimidos de gatifloxacino no doseamento

microbiológico.............................................................................................................105

5.5. Identificação de gatifloxacino em cromatografia de camada delgada............105

5.6. Identificação de gatifloxacino utilizando a cromatografia em camada delgada e

diferenciação deste fármaco frente a outras fluorquinolonas............................112

5.7. Espectro de absorção na região do infravermelho..........................................119

5.8. Análise térmica de gatifloxacino.......................................................................121

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................126

6.1. Desenvolvimento de metodologia analítica por titrimetria em meio

não-aquoso..........................................................................................................................1

29

6.2. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em espectrofotometria

UV...............................................................................................................................130

6.3. Doseamento de gatifloxacino de difusão em ágar cilindros em placa ..........132

6.4. Cromatografia em camada delgada..................................................................134

6.5. Cromatografia líquida de alta eficiência..........................................................137

6.5. Espectro de absorção na região de infravermelho e análise térmica.............139

7. CONCLUSÃO.........................................................................................................138

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................141

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA – Agência nacional de vigilância sanitária

BV – Balão volumétrico

CCD – Cromatografia em camada delgada

CIPX - Ciprofloxacino

CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência

DSC – Calorimetria exploratória diferencial

GATX-SR - Gatifloxacino substância de referência

GATXcomp - Gatifloxacino comprimidos

LEVX - Levofloxacino

LOME – Lomefloxacino

Rf – fator de resposta

THF - Tetrahidrofurano

UV- Ultravioleta

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura geral de quinolona ..........................................................................4

Figura 2. Estrutura química de norfloxacino..................................................................4

Figura 3. Estrutura química ciprofloxacino....................................................................5

Figura 4. Estrutura química lomefloxacino....................................................................5

Figura 5. Estrutura química de esparfloxacino...............................................................5

Figura 6. Estrutura química de levofloxacino.................................................................5

Figura 7. Estrutura química de ofloxacino .....................................................................5

Figura 8. Estrutura química de moxifloxacino................................................................5

Figura 9. Estrutura química de gatifloxacino..................................................................6

Figura 10. Estrutura química tridimensional de gatifloxacino......................................36

Figura 11. Representação do preparo das soluções da amostra utilizada no método

espectrofotométrico na região de ultravioleta a 287 nm................................................47

Figura 12. Delineamento 3 x 3, demonstrando a disposição das soluções padrão (P) e

amostra (A) na placa de Petri, onde P1 (4 µg/mL); P2 (8 µg/mL); P3 (16 µg/mL) e A1 (4

µg/mL); A2 (8 µg/mL); A3 (16 µg/mL)..........................................................................56

Figura 13. Espectro de absorção de solução de GATX-SR, na concentração de 24 g/mL,

por espectrofotometria na região do UV, utilizando água deionizada como

solvente...........................................................................................................................65

Figura 14. Curva de Ringbom para gatifloxacino substância de referência utilizando água

deionizada como solvente.....................................................................................67

Figura 15. Representação gráfica da curva padrão e o coeficiente de correlação das soluções

de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método espectrofotométrico na

região de ultravioleta a 287nm. ...............................................69

Figura 16. Cromatograma obtido por CLAE para solução aquosa de GATX-SR (A) e

comprimidos (B) (12 g/mL). Fase móvel: ácido acético 5%: metanol: acetonitrila

(70:15:15); coluna phenomenex C18 (250 x 4,6 mm); tempo de retenção 4,5 min......80

Figura 17. Representação gráfica da curva padrão e o coeficiente de correlação das soluções

de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método em CLAE, com

detecção à 287 nm. ..................................................................................83

Figura 18. Curva padrão do GATX-SR obtida no doseamento microbiológico em difusão em

ágar, cilindros em placa............................................................................103

Figura 19. Cromatogramas do sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de

amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V) analisado...................................................105

Figura 20. Cromatograma no sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido

acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V)........................................................................106

Figura 21. Cromatograma de diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5%

(6:4:2:2, V:V:V:V)...................................................................................................107

Figura 22. Cromatograma do sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,

V:V:V:V) analisado..................................................................................108

Figura 23. Cromatograma do sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V)

analisado.........................................................................................................109

Figura 24. Cromatograma do sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5,

V:V:V:V) analisado.................................................................................110

Figura 25. Cromatograma do sistema n-butanol: ácido acético: água (40:10:50, V:V:V)

analisado.......................................................................................................................111

Figura 26. Cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX)

em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,

V:V:V:V)......................................................................................................................112


em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1,

V:V:V)..........................................................................................................................113


em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V).

....................................................................................................................114


em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2,

V:V:V:V). .....................................................................................................115


em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2,

V:V:V:V). .....................................................................................................116


em sistema solvente butanol: ácido acético 5%:água (40:10:50, V:V:V).......117


em sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2,

V:V:V:V). .....................................................................................................118

Figura 33. Espectro na região do infravermelho para GATX-SR em pastilha de

KBr...............................................................................................................................119

Figura 34. Espectro de absorção na região do infravermelho de GATX-comp. em pastilha de

KBr.............................................................................................................120

Figura 35. Curva de DSC de gatifloxacino substância de referência sob atmosfera de

nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C...........................................................121

Figura 36. Curva de DSC de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos sob

atmosfera de nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C.....................................122

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Determinações requeridas para o processo de validação, seguindo diretrizes da

ICH...........................................................................................................................34

Tabela 2. Preparação das soluções para obtenção da curva padrão de gatifloxacino por meio

de espectrofotometria no UV a 287 nm, em água

deionizada......................................................................................................................44

Tabela 3. Preparação das soluções para o teste de recuperação aplicado à amostra de

gatifloxacino para o método espectrofotométrico na região UV a 287 nm, em água

deionizada. ....................................................................................................................45

Tabela 4. Condições cromatográficas utilizadas no método por CLAE........................49

Tabela 5. Soluções-padrão de gatifloxacino utilizadas na obtenção da curva padrão em

CLAE..............................................................................................................................50


gatifloxacino para método por CLAE............................................................................51

Tabela 7. Parâmetros utilizados para a avaliação de gatifloxacino por ensaio microbiológico -

método de difusão em ágar- cilindros em

placas..............................................................................................................................53

Tabela 8. Parâmetros estabelecidos na padronização de gatifloxacino no ensaio

microbiológico................................................................................................................54

Tabela 9. Preparação das soluções para análise do teste de recuperação para gatifloxacino no

doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em

placa...............................................................................................................................58

Tabela 10. Valores obtidos no doseamento de GATX-comp em meio não-aquoso utilizando

a titrimetria com ácido perclórico 0,1 M em ácido acético glacial................63

Tabela 11. Teste de recuperação de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos

obtidos pela titulação em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em ácido

acético glacial. ...............................................................................................................63

Tabela 12. Valores experimentais da amostra obtidos no doseamento titrimétrico.....64

Tabela 13. Valores obtidos para construção da curva de Ringbom para GATX-SR em água

deionizada..............................................................................................................66

Tabela 14. Valores experimentais obtidos na construção da curva padrão para GATX

........................................................................................................................................68

Tabela 15. Parâmetros estatísticos obtidos na construção da curva padrão para GATX-SR,

utilizando água deionizada. ....................................................................................70

Tabela 16. Desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na construção da curva

padrão para gatifloxacino.....................................................................................71

Tabela 17. Análise variância (ANOVA) dos valores experimentais utilizados para a obtenção

da curva padrão...............................................................................................72

Tabela 18. Valores experimentais utilizados para o cálculo do coeficiente de correlação da

curva de calibração do método espectrofotométrico de gatifloxacino na região UV.

........................................................................................................................................73

Tabela 19. Análise de variância das absorvâncias determinadas na obtenção da curva padrão

de gatifloxacino em espectrofotometria UV......................................................74

Tabela 20. Parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores experimentais obtidos para

a curva padrão. ......................................................................................................75

Tabela 21. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação para GATX-SR utilizando

a espectrofotometria UV a 287 nm. .............................................................76

Tabela 22. Valores experimentais dos comprimidos, obtidos por espectrofotometria na

região UV e a precisão do método representado pelo coeficiente de

variação...........................................................................................................................77


região UV. .....................................................................................................................80

Tabela 25. Áreas absolutas obtidas para construção da curva padrão por CLAE........82


utilizando água deionizada, em CLAE....................................................................84


padrão para gatifloxacino em CLAE....................................................................85


da curva padrão em CLAE.............................................................................86


curva de calibração em CLAE...................................................................................87

Tabela 30. Análise de variância das absorvâncias determinadas na obtenção da curva padrão

de gatifloxacino em CLAE...............................................................................88


a curva padrão em CLAE. ....................................................................................89

Tabela 32. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação para GATX-SR em

CLAE. ..........................................................................................................................90

Tabela 33. Valores experimentais dos comprimidos, obtidos por CLAE...................91

Tabela 34. Teor de gatifloxacino nos comprimidos em CLAE. ................................92

Tabela 35. Valores correspondente ao ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino

(comprimido), difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3..

......................................................................................................................................93


comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3...95


comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3....97

Tabela 38.Valores resultante da análise estatística do ensaio da amostra 1 (Tabela 35), no

doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x

3....................................................................................................................................99

Tabela 39. Valores resultantes da análise estatística do ensaio da amostra 2 (Tabela 34), no

doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x

3..............................................................................................................................100

Tabela 40. Valores resultantes da análise estatística do ensaio da amostra 3 (Tabela 35), no

doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.

............................................................................................................................101

Tabela 41. Valores médios obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino, em

difusão em ágar cilindros em placa, para obtenção da curva de calibração...........102

Tabela 42. Valores experimentais obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino no

teste de recuperação para o ensaio das três amostras (R1, R2 e R3)...104

Tabela 43. Valores experimentais obtidos para o teste de recuperação de gatifloxacino no

doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa............................104

Tabela 44. Valores experimentais obtidos para o doseamento de comprimidos de

gatifloxacino, através do ensaio microbiológico difusão em ágar, cilindros em

placa..............................................................................................................................105

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no doseamento

microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.............................95





RESUMO

As quinolonas constituem um grupo de antimicrobianos de largo espectro de ação, sendo

utilizadas no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas, Gram-negativas

e contra microrganismos pouco sensíveis a muitos fármacos. O gatifloxacino é um

antimicrobiano da classe das fluorquinolonas, de geração avançada, com um amplo espectro

de ação, tanto para bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, anaeróbios, bactérias atípicas e

fastidiosas, bem como micobactérias. O uso abusivo de antimicrobianos, nos últimos anos,

favoreceu o aparecimento de várias cepas resistentes a antibióticos, fazendo com que a

indústria farmacêutica investisse no mercado de desenvolvimento de novas moléculas com

atividade antimicrobiana, as quais mostrassem um amplo espectro de ação contra várias

bactérias. O gatifloxacino, um novo agente antimicrobiano, é um promissor fármaco contra

várias patologias, inclusive tuberculose. O gatifloxacino, até o presente momento, não possui

monografia oficializada. A proposta deste trabalho consiste em desenvolver e validar

metodologias analíticas para matéria-prima e a forma farmacêutica comprimidos, utilizando:

(i) titrimetria em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio de ácido

acético glacial, em que obtivemos precisão e exatidão, com um coeficiente de variação médio

de 0,32% para os comprimidos e também um teor médio de 100,42% (ii) espectrofotometria

na região do UV a 287 nm, na faixa de concentração de 4,0 a 14,0 µg/mL, cuja análise

apresentou linearidade, precisão e exatidão, com teor médio nos comprimidos de 98,32 %;

(iii) CLAE, em que utilizamos como fase estacionária uma coluna de C18 de fase reversa, e

fase móvel com a seguinte composição, ácido acético 5%: metanol: acetonitrila (70:15:15,

V/V/V), onde obtivemos linearidade, precisão, exatidão e especificidade, com um teor médio

obtido nos comprimidos de 99,84 % (iv) determinação da potência microbiológica, pelo

método de difusão em ágar cilindros em placa, utilizando cepas de Bacillus subtilis ATCC

9372, em que obtivemos um teor médio nos comprimidos de 100,29%. Os resultados foram

analisados estatisticamente pela análise da variância (ANOVA), que permite a aplicação dos

métodos analíticos no controle de qualidade de preparações farmacêuticas. Para a

identificação do fármaco, foram utilizadas técnicas como espectrofotometria no

infravermelho, cromatografia em camada delgada e análise térmica.

ABSTRACT

The quinolones constitute a group of antibiotics of wide spectrum of action, being used in the

treatment of infections caused by Gram-Negative, Gram-Positive bacteria and against

microorganisms sensible to many drugs. Gatifloxacin is an antibiotic of the class of the

fluoroquinolones with a broad spectrum of action, as much for Gram-Negative,

Gram-Positive bacteria, anaerobic, atypical and fastidious bacteria, as well as mycobacteria.

In the last years, the abusive use of antibiotics favored the appearance of several resistant

strains to antibiotics, making with that the pharmaceutical industry invested in the market of

development new molecule with antimicrobial activity, which showed a broad spectrum of

action against some bacteria. Gatifloxacin, an advanced generation of fluoroquinolones, is an

excellent drug useful in several pathologies, inclusive tuberculosis. This fluoroquinolone, until

the present moment, does not possess officially established monograph. The proposal of this

work consists of developing and validation of analytical methods for raw material and tablets,

using: (i) Nonaqueous titration of gatifloxacin in pharmaceutical formulations using perchloric

acid 0.1 M in glacial acetic environment of acid, in that we obtain precision and accuracy,

with a coefficient of variation of 0.32%; (ii) spectrophotometric procedure at 287 nm was

developed for raw material and tablets. The Lambert-Beer law was obeyed in the

concentration range of 4.0 to 14.0 µg/mL. The UV-analysis describes a precise and accurate

method, with medium content compressed of 98.32%; (iii) HPLC, in that we utilize like

stationary phase a C18 column, and mobile phase with the following composition, acetic acid

5%: methanol: acetonitrile (70:15:15, V/V/V), where do we obtain linearity, precision,

accuracy and specificity, with a 99.84% medium content. Method validation included range,

linearity, precision, accuracy, specificity and recovery; (iv) determination from the

microbiological assay, for the method of diffusion in agar cylinders in plate, using strains of

Bacillus subtilis ATCC 9372. The results were analyzed statistically by the analysis of the

variance (ANOVA), that it allows the application of the analytical methods in the quality

control of pharmaceutical preparations. A prospective validation showed that the method was

linear, precise and accurate. For the identification of gatifloxacin, infrared spectrometry, thin

layer chromatography and thermal analysis were utilized. The proposed qualitative and

quantitative methods are simple and adequate to be used in pharmaceutical laboratory routine

analysis.

1. Introdução

De acordo com a literatura, o gatifloxacino é uma fármaco com um amplo espectro de

ação contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, anaeróbias e bactérias que se

mostraram resistentes a vários fármacos contra doenças comumente conhecidas pela

comunidade médica, como pneumonia e tuberculose. A excelente biodisponibilidade oferece

maior segurança no tratamento e a facilidade na posologia (administração 1 vez ao dia),

conferindo maior adesão ao tratamento pelo paciente. O gatifloxacino é classificado como

uma fluorquinolona, de amplo espectro de ação, e por alguns autores, como sendo de quarta

geração. O gatifloxacino é um fármaco bastante estudado farmacologicamente e quanto aos

aspectos de ação microbiológica, mas existem poucos resultados na literatura em relação ao

desenvolvimento de metodologia analítica para esta substância, e até o momento, não há

monografia oficial deste fármaco.

Trabalhos científicos envolvendo este fármaco começaram a ser publicados em 1990, e

os resultados positivos, levaram este fármaco rapidamente ao mercado farmacêutico mundial.

O controle de qualidade na indústria farmacêutica para identificação do teor de principio

ativo, é de fundamental importância para garantir a qualidade do produto final, e

consequentemente confirmar a qualidade do medicamento comercializado ao

consumidor/paciente.

Esta dissertação teve por objetivo desenvolver metodologias analíticas para o

gatifloxacino, incluindo análises físico-químicas e microbiológicas, bem como dispor de

técnicas de identificação qualitativa para forma farmacêutica comprimido e matéria-prima.

O gatifloxacino é comercializado no Brasil, na forma farmacêutica comprimidos e

solução injetável, com o nome de Tequin®, pelo laboratório Bristol-Myers Squibb. Esse

medicamento ainda se encontra sobre patente e o seu registro foi aprovado e liberado para

comercialização pelo FDA em 17 de dezembro de 1999 (FDA, 2003). Recentemente, em 28

de março de 2003, foi aprovado e liberado para comercialização pelo FDA o Zymar®, colírio

contendo como substância ativa o gatifloxacino, e comercializado pela indústria farmacêutica

Allergan produtos farmacêuticos LTDA. Apesar da comprovada eficácia e segurança no seu

tratamento, este fármaco, até então, não possui uma metodologia de análise padronizada em

compêndios oficiais. Este fato justifica novas pesquisas nessa área para desenvolvimento de

metodologia analítica para esta fluorquinolona.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Quinolonas e Fluorquinolonas

As quinolonas representam uma classe de antimicrobianos composta por fármacos

estruturalmente semelhantes, sintéticos e altamente eficazes, utilizadas no tratamento de

várias infecções, causadas por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

O desenvolvimento das quinolonas teve início com o ácido nalidíxico (LESHER et al.,

1962), fármaco utilizado somente no tratamento de infecção urinária, devido às suas limitadas

propriedades farmacocinéticas. Desde a síntese do ácido nalidíxico, numerosas pesquisas têm

sido realizadas, a fim de melhorar a potência e o espectro de atividade antimicrobiana

(ASAHINA et al., 1992), uma vez que esse precursor possui utilidade terapêutica limitada e

facilidade no desenvolvimento de resistência bacteriana (MANDELL e PETRI Jr., 1996). O

núcleo quinolônico e o grupo carboxila (Figura 1) na posição 3 são comuns a esta classe de

compostos, sendo, freqüentemente, chamadas de quinolonas. Os derivados diferem entre si

nos substituintes do anel e da cadeia lateral. A introdução do grupo piperazínico, além de

reduzir a neurotoxicidade e melhorar a estabilidade de metabólitos, confere atividade contra

Pseudomonas aeruginosa (APPELBAUM e HUNTER, 2000; BERTINO e FISH, 2000).

Com este objetivo surgiu, em 1978, o norfloxacino (Figura 2), que possui um átomo de

flúor na posição 6 e um grupamento piperazínico na posição 7 do anel quinolônico. As

quinolonas que possuem um átomo de flúor na posição 6 são designadas por fluorquinolonas.

Estes substituintes aumentaram a potência e o espectro de atividade (GOLDSTEIN,

1987), dando início à nova era de derivados quinolônicos (KOGA et al., 1980). Em vários

trabalhos verifica-se que este grupo de fluorquinolonas possui baixa potência contra

Streptococcus pneumoniae (GORDON e KAUFFMAN, 1990; BARTLETT e MUNDY,

1995; ZHANNEL et al., 1999), constituindo um importante obstáculo para a sua maior

utilização em infecções respiratórias, especialmente as formas adquiridas na comunidade, em

que o pneumococo representa o agente etiológico mais freqüente (MUNDY et al., 1995;

RUIZ et al., 1999). O ciprofloxacino (Figura 3) é uma fluorquinolona especialmente eficaz

contra Pseudomonas aeruginosa. Após a introdução no mercado de antimicrobianos, como

Figura

Figura 2. Estrutura química de norfloxacinoFigura 1. Estrutura geral das

norfloxacino e ciprofloxacino (Figura 3), surgiram várias fluorquinolonas, como:

lomefloxacino (Figura 4), esparfloxacino (Figura 5), levofloxacino (Figura 6), ofloxacino

(Figura 7), moxifloxacino (Figura 8) entre outras, todas comercializadas no Brasil, exceto o

esparfloxacino.

As Figuras 3 a 8 apresentam as estruturas químicas das fluorquinolonas

Figura 3. Estrutura química Figura 4. Estrutura química

2.2. Gatifloxacino

Recentemente surgiu um novo grupo de quinolonas, classificadas como de terceira

geração, ou quinolonas de geração avançada. O gatifloxacino é a 1-ciclopropil-

6-flúor-7-piperazina-8-metóxi-fluorquinolona (Figura 9), que possui um amplo espectro de

ação contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas (HOSAKA et al., 1992;

BAUERNFEIND, 1997; WISE et al., 1997; JONES e PFALLER, 1998; DIEKEMA et al.,

Figura 5.Estrutura química de

Figura 6. Estrutura química de

Figura 8. Estrutura química deFigura 7. Estrutura químicade ofloxacino

1999; BLONDEAU et al., 2000) e também contra muitos organismos atípicos

(BLONDEAU, 1999), bem como micobactérias (DONG et al., 1998).

Este fármaco tem três importantes substituições estruturais: uma metil-piperazina no

carbono 7, um grupamento metóxi na posição 8 e um grupamento ciclopropila no anel N-1.

E s t a s mudanças estruturais têm

expandido o espectro de ação,

incluindo organismos Gram-positivos e alguns anaeróbios, melhorando a eficácia in vivo,

aumentando a potência, a meia-vida e a biodisponibilidade oral e reduzindo significativamente

o risco de fototoxicidade e reações adversas no sistema nervoso central (DOMAGALA,

1994).

Lu e col. (1999) verificaram que o grupo metoxila no carbono 8 (C-8) contribuía para o

aumento da atividade do gatifloxacino contra DNA-girase de cepas mutantes e resistentes a

outras quinolonas. Além disto, este substituinte aumentou a letalidade nas infecções causadas

por Staphylococcus aureus (ZHAO et al., 1998). Em 2001, Yamamoto e col., demonstraram

em estudo in vitro, comparativo com outras fluorquinolonas, que, todas possuíam potencial

fototóxico. No entanto, o gatifloxacino demonstrou um potencial não fototóxico para

nenhum dos três métodos in vitro analisados (citotoxicidade contra células mamárias, lise de

Figura 9. Estrutura química de gatifloxacino

eritrócitos e quebra do DNA). Estes resultados correspondem às observações relatadas por

Matsumoto et al. (1992), Marutani et al. (1993) e Rosen et al. (1997) de que fluorquinolonas

com um grupo metoxila na posição 8 do anel quinolônico são resistentes à fotoirradiação e

não induzem à fototoxicidade.

Em estudos farmacocinéticos verificou-se uma excelente biodisponibilidade, com

meia-vida de 7-8 horas e a concentração sérica máxima de 3,35 a 5,41 g/mL em doses de

400 mg e 600 mg, respectivamente; apenas uma pequena proporção (20%) do fármaco

apresenta ligação protéica (NAKASHIMA et al., 1995). Em muitos tecidos, a concentração

de gatifloxacino é mais alta do que no soro. Níveis até duas vezes à concentração encontrada

no soro são detectáveis na mucosa brônquica, no parênquima pulmonar, na mucosa sinusal

(GRASELA, 2000) e na próstata (NABER et al., 2001).

O gatifloxacino penetra adequadamente no líquor, mesmo na ausência de inflamação

meníngea, e é efetivo como simples agente na terapia experimental de meningite, causada por

Streptococcus pneumoniae resistente à cefalosporina (LUTSAR et al., 1998), e igualmente

eficaz na terapia experimental de meningite causada por Escherichia coli (LUTSAR et al.,

1999).

Em estudos farmacodinâmicos com o gatifloxacino, verificou-se que o fármaco,

encontrava-se em altas concentrações intracelulares nas células infectadas por um patógeno.

Esta característica é muito importante na eficácia clínica contra patógenos intracelulares

facultativos ou obrigatórios como Staphylococcus aureus, Legionella spp e Mycobacterium

spp. Yamamoto e col., em 1996, verificaram que a concentração intracelular do gatifloxacino,

em células fagocitárias, foi maior que a concentração extracelular, sugerindo que este

fármaco pode ser utilizado, com sucesso, no tratamento de infecções causadas por patógenos

intracelulares, como o Mycobacterium tuberculosis.

A tuberculose é uma doença endêmica, que até o final dos anos 80, parecia estar

controlada. Nos últimos anos, a tuberculose passou a ser um problema mundial, devido a

vários fatores epidemiológicos, como: debilitação imunológica provocada pelo vírus da AIDS

(GARCÍA et al., 1994), desenvolvimento e disseminação de cepas multi-resistentes aos

fármacos utilizados na terapia, e a elevada imigração no mundo têm contribuído para a

disseminação mais rápida da doença (CROFTON, 1997; DUNCAN, 1997).

Estima-se que 2 bilhões de pessoas estejam infectadas com M. tuberculosis e com

outras espécies de Mycobacterium, e que 3 milhões morram anualmente por complicações da

doença em todo mundo (SHINNICK et al., 1995).

Quinolonas de geração avançada são recomendadas como fármacos de segunda escolha

para o tratamento de cepas multi-resistentes a antimicrobianos, apresentando potente

atividade contra o Mycobacterium tuberculosis (ZHAO et al., 1999; SINDELAR et al.,

2000).

Em estudos comparativos de gatifloxacino com quinolonas de geração avançada

verificou-se que este fármaco exibiu uma atividade muito potente contra M. tuberculosis, e

foi 8 vezes mais ativo contra cepas de M. tuberculosis multi-resistentes a fármacos

(MDR-TB), sugerindo que esta fluorquinolona poderia ser utilizada em controle clínico da

MDR-TB (TOMIOKA et al., 1999). É necessário solidificar no mercado mundial,

antimicrobianos potentes e que tenham comprovada eficácia clínica para combater as

micobactérias.

O gatifloxacino também demonstrou comprovado resultado clínico na pneumonia

adquirida na comunidade (PAC), que constitui um sério problema de saúde entre adultos,

mundialmente. Os organismos mais comumente responsáveis pela PAC são Streptococcus

pneumoniae, Haemophilus influenzae e Moraxella catarrhalis (THORNSBERRY et al.,

2002). Também são importantes os agentes atípicos, particularmente Mycoplasma

pneumoniae, Chlamydia pneumoniae e Legionella spp (HONEYBOURNE, 2001; MARRIE

et al., 1996). Recentemente, a prevalência mundial de cepas de S. pneumoniae resistentes à

penicilina (JONES e PFALLER, 1998; MOSS e FINCH, 2000), continua sendo um sério

problema no ambiente clínico.

A resistência a outros agentes antimicrobianos, como cefalosporinas, macrolídeos e

sulfametoxazol-trimetoprima também tem aumentado (HOBAN et al., 2001;

THORNSBERRY et al., 2002). A emergência de cepas multi-resistentes a certos fármacos

tem proporcionado a necessidade de alternativas terapêuticas para tratar a PAC (COYLE et

al., 2001; FUNG-TOMC et al., 2001). Em estudos, verificou-se que o gatifloxacino possui

uma potente atividade antipneumonoccal (HOELLMAN et al., 1999; ODLAND et al., 1999)

e a seleção de cepas mutantes é menos freqüente do que outras fluorquinolonas (FUKUDA et

al., 2001).

Este fármaco possui excelente atividade contra todas as espécies de estreptococos

(JONES et al., 1999), bem como para H. influenzae e M. catarrhalis (JONES et al., 1999;

LODE e ALLEWETT, 2002), sendo também uma alternativa de tratamento para infecções

por Streptococcus pneumoniae penicilina resistente (TOMIZAWA et al., 1998), que são

associados com uma alta concentração inibitória mínima (CIM) para beta-lactâmicos

(inclusive cefalosporinas) e macrolídeos (FILE , 1999).

Para êxito no combate às doenças causadas por bactérias anaeróbias, é necessária a

seleção de agentes antimicrobianos adequados ao tratamento. As bactérias anaeróbias que

devem ser analisadas e estudadas são aquelas que apresentam, freqüentemente, resistência a

certos agentes antimicrobianos e alta virulência (HECHT et al., 1999; ODOU et al., 2001;

PESTANA et al., 1999). A atividade do gatifloxacino foi avaliada em vários microrganismos

anaeróbios patogênicos, em diferentes estudos na literatura, verificando-se que o fármaco

possui excelente atividade para vários anaeróbios (ALEXANDER et al., 2000; EDNIE et al.,

1998; SCHAUMANN et al., 1999; WEXLER et al., 2001).

Apesar deste fármaco ser altamente estudado e pesquisado no que concerne à atividade

antimicrobiana, farmacocinética, farmacodinâmica, toxicidade e relação estrutura atividade,

há poucos estudos na literatura em relação ao desenvolvimento de metodologia analítica para

esta fluorquinolona, e pesquisas envolvendo métodos analíticos, são de fundamental

importância e altamente relevante para otimizar sua análise na indústria farmacêutica e

garantir a qualidade do produto a ser comercializado.

2.3. Doseamento microbiológico

O doseamento microbiológico pode empregar meio de cultura sólido inoculado,

distribuído em placas, em sistema de mono ou bicamada, através do qual a substância-teste se

difunde. A substância–teste é aplicada sobre a superfície deste meio, em cilindros de aço,

vidro ou porcelana, em orifícios ou discos de papel, e as placas são, então, incubadas.

O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porém, áreas onde tenha ocorrido

a difusão do antibiótico, gerando contraste e resultando a chamada zona de inibição de

crescimento. Tal fenômeno origina toda teoria que embasa o método de difusão. O emprego

de bicamada de meio de cultura, em que a camada basal busca uniformização, enquanto a de

superfície contém o inóculo, surgiu com o trabalho de Reilly e Sobers, em 1952, onde estes

pesquisadores estudaram a possibilidade do uso de ágar simples para camada basal. Para isso,

empregaram 15 mL de meio basal e após sua solidificação, 10 mL de meio nutriente

inoculado com microrganismo adequado para cada antibiótico.

O diâmetro das zonas de inibição produzido pela estreptomicina, metotrexato e

antibiótico 1377, colocados nas placas por meio de discos de papel, foi medido e comparado.

As zonas de inibição produzidas nas placas com ágar simples mostraram-se mais claras e

definidas.

Loo e colaboradores (1945) relataram que somente as substâncias hidrossolúveis

poderiam ser testadas pelo método de difusão em ágar. Entretanto, Stanly, em 1952, realizou

trabalho consistindo de tratamento de discos de papel de filtro com volume padronizado do

agente antimicrobiano em solvente orgânico de baixa solubilidade em água. Após evaporação

do solvente, os discos de papel foram colocados sobre o ágar para a incubação.

A Farmacopéia Brasileira 4a edição descreve a metodologia em difusão em ágar, assim

como procedimentos estatísticos aplicáveis aos ensaios biológicos. O ensaio por difusão,

desenvolvido para antibióticos, é fundamentalmente um método físico, no qual um

microrganismo é usado como revelador. O doseamento de difusão em ágar cilindros em placa

considera algumas variáveis quanto ao desenvolvimento do método, como: meio utilizado,

microrganismo, difusão da substância, temperatura de incubação, solução tampão, leitura e

cálculo dos resultados (COOPER, 1963; ANDREWS, 1999).

A difusão da substância no ágar é um fator fundamental para o desenvolvimento do

método. A substância analisada deve difundir no ágar, e a combinação de diferentes

condições técnicas permite evidenciar o fenômeno da difusão de substância de uma região

para outra, até que no tempo infinitamente longo haverá concentração constante da mesma.

Os estudos envolvendo ensaios de difusão para antibióticos eram inicialmente restritos, não

permitindo extrapolações abrangentes aos novos antimicrobianos que surgiam.

Assim, justificava a investigação dos fatores de interferência sobre zonas de inibição e

tratamento teórico quanto à inclinação das curvas dose-resposta. Este enfoque iniciou-se com

Cooper e Woodman, em 1946, que estudando a teoria de difusão em ágar utilizaram solução

de cristal violeta em tubos. Os autores pesquisaram a difusão de anti-sépticos e da penicilina

através do ágar e, quando utilizado o cilindro como reservatório da solução-teste

encontraram boa correlação entre o diâmetro da zona de inibição de crescimento estabelecido

teoricamente e àquele obtido na prática. Contudo, a fórmula derivada para o estudo

considerou a difusão linear e não radial.

No estudo de Humphrey e Lightbown (1952), considerou-se a difusão radial do

antibiótico em placas de Petri a partir de recipientes colocados na superfície do meio de

cultura, bem como a espessura da camada de ágar. A concentração do antibiótico ao redor da

fonte, onde colocado, pode ser expressa teoricamente por equação envolvendo a

concentração inicial e a uma dada distância, a espessura da camada de ágar, a constante de

difusão e o tempo envolvido. Os autores mostraram que a distância de difusão ao quadrado

estava relacionada com o logaritmo da espessura do ágar. Quando camadas do meio com

espessura menor que 1 cm foram utilizadas, o tamanho das zonas de inibição de crescimento

apresentava menor sensibilidade a variações deste elemento. Foram determinados também os

valores do tamanho do halo de inibição de crescimento após variar o período de difusão. O

fator determinante na inclinação da curva dose-resposta é a constante de difusão do

antibiótico, bem como o tempo, pois quando prolongado, poderia aumentar a inclinação.

A constante de difusão do antibiótico no meio de cultura foi estabelecida por Friedman

e Kraemer (1930) através de dados obtidos experimentalmente. No trabalho de Humphrey e

Lightbown (1952), foi verificado que a expressão teórica daqueles autores estava incorreta,

pois a validade da equação foi testada pelo estudo da distância de difusão esperada para

vários antibióticos, com diferentes períodos de pré-difusão.

Com a equação proposta para estudo da difusão, Cooper e Woodman (1946)

relacionaram o diâmetro da zona de inibição a certos parâmetros usados para avaliar a

influência das variações técnicas dos ensaios. Analisaram o tempo de pré-difusão, densidade

do inóculo em relação à sua influência sobre o tamanho dos halos, composição e espessura do

meio de cultura.

Num estudo similar, Brady e Katz (1990), consideraram a constituição do meio, volume

do cilindro, espessura de ágar e temperatura de incubação como sendo fatores que

determinam a otimização do ensaio. Os autores verificaram que ao diminuir a temperatura de

incubação e nível de nutrientes normalmente utilizados, as zonas de inibição foram maiores,

utilizando clortetraciclina e Bacillus cereus. A espessura do ágar foi o fator que mais

influenciou a variabilidade da resposta, pois quanto mais fina a camada, maior o efeito do

volume contido no cilindro sobre a distância de difusão. O conteúdo dos cilindros, desde que

integralmente preenchidos com a solução, pouco influenciou a inclinação da curva

dose-resposta.

A concentração crítica e população crítica são decisivas na definição da posição do

limite da zona de inibição de crescimento. A concentração crítica corresponde à concentração

mínima capaz de inibir o crescimento da população microbiana em questão. Segundo Hewitt

(1977), a concentração crítica é 4 vezes maior em relação à concentração inibitória mínima. O

tempo crítico, isto é, o tempo de incubação no qual o tamanho dos halos são definidos, é

dependente da fase “lag” de crescimento e do tempo de geração do microrganismo, sendo,

portanto, dependente também da temperatura e do tamanho do inóculo inicial. Por outro

lado, a concentração do antibiótico não interfere no tempo crítico (HEWITT, 1977). Assim,

concentração crítica e população crítica são decisivas na definição da posição do limite da

zona de inibição de crescimento.

Gavin (1956) estudou diferentes aspectos da difusão de substâncias no ágar e as

interferências físicas sobre o fenômeno. Portanto, a espessura e a uniformidade do ágar para

uma série de placas é fundamental, sendo conseguido através da seleção de placas com fundo

plano, tamanho uniforme, mesmo diâmetro e controle rigoroso do volume de ágar transferido

para cada placa.

O crescimento adequado do microrganismo tem como exigência básica o pH da

solução-teste, cujo valor da faixa adequada é favorável, também, para atividade e estabilidade

das substâncias testadas. Assim, foi recomendada a utilização de solução-teste com pH

próximo àquele de crescimento ótimo do microrganismo como condição ideal, embora o

tamanho das zonas de inibição de crescimento variem com o pH.

Abraham e Duthie (1946) estudaram o efeito do pH do meio na atividade da

estreptomicina e penicilina através dos métodos de diluição seriada e cilindros em placa.Foi

verificado que o aumento de acidez do meio diminuía a atividade antibacteriana de

substâncias básicas como estreptomicina; por outro lado, provocava aumento da atividade

das substâncias ácidas como a penicilina.

Sendo a velocidade de difusão da substância no ágar determinante do tamanho da zona

de inibição, Gavin (1956) considerou que somente após a difusão da substância testada, antes

da multiplicação microbiana, ocorre a formação do halo de inibição de crescimento. Assim,

zonas de inibição maiores podem ser obtidas alterando a fase “lag” do microrganismo através

da refrigeração das placas ou mantendo as placas à temperatura ambiente após a colocação

das soluções-teste.

Um dos aspectos problemáticos relacionado ao contraste entre halo de inibição de

crescimento e o restante do meio onde existe a massa celular resultante da incubação é o

aparecimento de halos duplos devido a diferentes fatores. Hewitt esclareceu este problema

através da teoria de difusão. Devido ao restrito volume da solução-teste no reservatório, a

concentração do antibiótico cai rapidamente ao valor abaixo do original não ocorrendo

gradiente, o que possibilita a formação de halos duplos. Entre outros casos, a influência da

anaerobiose no meio de cultura em profundidade provoca o aparecimento de halo duplo uma

vez que na superfície a distância de difusão revelada pela população microbiana é maior que

da profundidade. Em todos os casos, o aparecimento do halo duplo não invalida o ensaio,

desde que a leitura seja padronizada para a medida de um dos halos formados e este

fenômeno, seja comum para padrão e amostra.

Harris, em 1955, publicou uma revisão de trabalhos exaltando o emprego de métodos

de ensaio microbiológico de antibióticos, vitaminas e aminoácidos em vários tipos de

materiais, com a indicação das vantagens e desvantagens dos métodos de diluição seriada, de

turbidimétrica e de difusão em placas. Alertou para possíveis alterações na precisão dos

resultados dos ensaios quando a curva dose-resposta traçada visualmente desviasse da

verdadeira relação dose-resposta.

Um estudo mais preciso foi realizado por Deutschberger e Kirshbaum, em 1959,

empregando cálculos dos mínimos quadrados ou linha de regressão, levando em consideração

as faixas de concentração adequadas das soluções do padrão, recomendaram que as

concentrações das soluções-teste devem ser diluídas na mesma razão do padrão e que o

número de observações seja o mesmo para cada ponto.

Kavanagh (1974) apresentou um estudo sobre a equação de Cooper, relacionando o

diâmetro das zonas de inibição a diversos parâmetros. As variáveis estudadas foram espessura

do ágar, temperatura, composição do meio, sendo que foram estabelecidos como influências

da maior importância o tempo de pré-difusão e a concentração da carga microbiana.

Kavanagh sugeriu o enchimento dos cilindros em série crescente de concentrações. No

entanto, este procedimento implica em difusão do antibiótico antes do início de incubação,

em vista disso, este trabalho dá orientações de como minimizar o erro, no doseamento

microbiológico. A diminuição na temperatura de incubação causou o aumento do tamanho

das zonas de inibição e a espessura do ágar, influenciou os resultados quando foi utilizado o

meio em sistema de bicamada, provocando erro significativo pela alteração na concentração

bacteriana em cada placa. Todos os fatores mencionados afetam diretamente o tempo de

geração do microrganismo-teste. Assim, mudanças de 10 vezes na quantidade do inóculo

podem causar diferença de 3 mm no tamanho do halo, sendo que placas com inóculos

menores apresentam maiores zonas de inibição de crescimento. O autor sugeriu para

minimizar erros, deve-se espalhar o meio nas placas apoiadas em superfície nivelada e colocar

as soluções nos reservatórios da placa em tempo inferior a 1 minuto.

Os procedimentos envolvendo ensaios microbiológicos de antibióticos e vitaminas

foram detalhadamente discutidos e descritos por Kavanagh e Ragheb (1979), com objetivo de

assegurar a exatidão dos testes. Considerando os procedimentos turbidimétricos e de difusão

em ágar, destacou o trabalho humano como fator limitante, salientando a necessidade de

seleção e treinamento cuidadoso dos analistas, além de equipamentos, materiais e operações

que podem levar a erros.

2.4. Espectrofotometria

A espectrofotometria é qualquer processo que utiliza a luz para medir as concentrações

químicas. Para um composto ser analisado por espectrofotometria, ele deve absorver luz, e

essa absorção deve ser distinguível daquela oriunda de outras substâncias presentes na

amostra. A maioria dos compostos absorve a radiação ultravioleta; a absorvância ultravioleta

tende a não ser conclusiva, e a análise, geralmente, fica restrita ao visível. Se não houver

espécies interferentes, contudo, a absorvância ultravioleta pode ser usada (HARRIS, 2001).

A absorção molecular na região do ultravioleta e do visível do espectro depende da

estrutura eletrônica da molécula. A absorção de energia é quantizada e conduz à passagem

dos elétrons de orbitais de maior energia em um estado excitado. A espectrofotometria no

ultravioleta é limitada, na maior parte, aos sistemas conjugados (SILVERSTEIN et al.,

1994).

A espectrofotometria no infravermelho corresponde à parte do espectro situada entre as

regiões do visível e das microondas. No espectro de infravermelho a correlação pico a pico é

uma excelente evidência para a identidade da amostra. Embora o espectro seja característico

da molécula como um todo, certos grupos de átomos dão origem a bandas que ocorrem mais

ou menos na mesma freqüência, independente da estrutura da molécula (SILVERSTEIN et

al., 1994).

2.5. Métodos Cromatográficos

2.5.1. Cromatografia em camada delgada (CCD)

A cromatografia em camada delgada (CCD) tem sido considerada tradicionalmente

como um método simples, rápido e econômico para separação, identificação experimental e

semi-quantificação visual de uma ampla variedade de substâncias (FRIED e SHERMA,

1994). A CCD permite analisar e identificar qualitativamente, um largo número de amostras

simultaneamente. Esta técnica requer uma modesta utilização de equipamentos e recursos,

que demonstra ser um procedimento ideal, para áreas sem eletricidade e para operadores com

treinamento limitado (KENYON et al., 1995).

As amostras utilizadas na CCD são aplicadas normalmente com volumes entre 1 e10,0

L na origem da placa. Quando a concentração do soluto é conhecida, a solução aplicada é

usualmente na concentração de 0,01-1,00 g/ L. Se a quantidade de amostra aplicada é

muito pequena, o composto de interesse pode não ser detectado. Inversamente, se bastante

amostra é aplicada, o material pode não ser absorvido totalmente, pela espessura da camada,

conduzindo à sobrecarga da amostra e diminuindo a resolução (ADAMOVICS e

ESCHBACH, 1997; FRIED e SHERMA, 1994). Normalmente, este método de detecção

possui sensibilidade na escala de microgramas ou nanogramas, mas quantidades em

picogramas algumas vezes podem ser detectadas (FRIED e SHERMA, 1994).

A detecção em CCD pode ser qualitativa ou quantitativa. Procedimentos qualitativos

requerem que o produto seja identificado na placa cromatográfica, utilizando o valor de Rf

para identificação e tendo sobre igual magnitude o valor da substância de referência. A

determinação semiquantitativa pode ser comparada visualmente pelo tamanho e intensidade

da mancha frente a várias concentrações da substância de referência. Procedimentos

quantitativos requerem um densitômetro ou a extração dos componentes da sílica, para

posterior análise por espectrofotometria. Vários fármacos são detectados na luz ultravioleta

(254 nm) com a fase estacionária impregnada por fósforo. Compostos que são naturalmente

fluorescentes podem ser detectados no comprimento de onda na luz UV-350 nm

(ADAMOVICS e ESCHBACH, 1997).

Antes da aplicação da amostra, as placas devem ser ativadas de 70 –110oC por 30

minutos. A linha de origem para aplicação das amostras é usualmente localizada entre 1,5-2,5

cm do começo da placa. A migração de 10 cm do solvente é conveniente, quando valores de

Rf são calculados (FRIED e SHERMA, 1994). A aplicação da amostra é um passo crítico

para a obtenção de uma boa resolução e quantificação em CCD (POOLE e DIAS, 2000).

A fase móvel pode ser escolhida considerando a natureza do analito e da camada

adsorvente que será utilizada. Substâncias polares requerem um solvente polar para que

ocorra migração na sílica gel. Um solvente forte aumenta valores de RF e no caso de CCD de

fase normal, o solvente adequado para uso seria, polar. Na CCD de fase-reversa, substâncias

apolares são fortemente atraídas pela camada, e fase móvel apolar são requeridas para que

ocorra a migração. Neste caso, solventes fortes são os mais apolares (FRIED e SHERMA,

1994). A vantagem da mistura de solventes, é que a resolução e seletividade podem ser

melhoradas. A porcentagem de ácido acético ou amônia é adicionada para prevenir zonas de

cauda (FRIED e SHERMA, 1994).

Um sistema solvente clássico e comprovadamente versátil para a separação de

substâncias polares e apolares consiste de hidrocarboneto-acetona-clorofórmio. Um típico

exemplo é hexano-acetona-clorofórmio (65:30:5). Pentano, isooctano ou benzeno são outros

hidrocarbonetos adequados para substituir o hexano para melhorar a seletividade. Para

substâncias muito polares, uma pequena porcentagem de metanol é incluída, e pequenas

quantidades de ácido ou base são adicionadas para controlar a ionização dos solutos. O efeito

do clorofórmio parece ser o controle da evaporação dos vários solventes utilizados, durante o

desenvolvimento do equilíbrio do processo (FRIED e SHERMA, 1994).

Segundo Geiss (1968), dentre os parâmetros que influenciam a separação das

substâncias por CCD, afetando a reprodutibilidade dos resultados, encontram-se: fase

estacionária, fase móvel, tipo de cuba utilizada para revelação, saturação da cuba e da camada

com o vapor do solvente, diâmetro da partícula da fase estacionária, volume da amostra e

tamanho da mancha inicial, umidade relativa (ativação da placa), velocidade do solvente,

temperatura, espessura da placa (tamanho e uniformidade), solventes impuros, pH.

RENGER, em 1993, discutiu o modelo de CCD como ferramenta para análise farmacêutica.

Avanços na instrumentação, camadas e metodologias têm aumentado a utilização da CCD

permitindo melhoria da confiabilidade, exatidão e reprodutibilidade.

2.5.2. Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia pode ser conceituada como um método físico-químico de separação,

no qual os constituintes da amostra a serem separados são particionados entre duas fases,

uma estacionária, geralmente de grande área, e a outra um fluído insolúvel, na fase

estacionária, que percola através da primeira (CIOLA, 1998). Embora a cromatografia

líquida, tradicionalmente seja classificada dentro de diferentes modelos de separação, de fato

todas as separações dependem de dois parâmetros básicos: a estrutura e a composição da fase

estacionária e a natureza da interação entre a fase móvel e a fase estacionária com

determinados mecanismos de separação (HANCOCK e SPARROW, 1984). O emprego de

CLAE para solucionar problemas analíticos ou preparativos necessita, além da

instrumentação adequada, a combinação correta das condições experimentais, tais como: tipo

de coluna (fase estacionária), fase móvel (sua composição e vazão), temperatura, quantidade

da amostra injetada e outros parâmetros (CIOLA, 1998).

Dentre as fases estacionárias, encontram-se a fase com superfície de sílica, com a

cobertura de grupos silanóis, em que 5% dos grupos silanóis são particularmente reativos nas

ligações de hidrogênio intramolecular (HANCOCK e SPARROW, 1984). Estes grupos são

ligeiramente ácidos (com um pKa de 5 a 7 dependendo da quantidade de hidrogênio

intramolecular na coluna) e interagem facilmente com amostras polares (KOCH e

KISSINGER, 1979). Sob o ponto de vista cromatográfico, os grupos silanóis são os mais

importantes, devido à sua polaridade, facilidade de fazer pontes de hidrogênio e capacidade

de induzir dipolos em outras moléculas (CIOLA, 1998). A sílica gel é pouco solúvel nos

solventes orgânicos normalmente empregados em cromatografia (metanol, acetonitrila,

cloreto de metileno, THF, etc), porém dependendo do pH ela pode ser apreciavelmente

solúvel em água, limitando o uso de fases móveis com pH acima de 8 ou 9, fato que leva sua

desativação prematura.

Esta propriedade dos grupos silanóis interagir com as substâncias da fase móvel, é

utilizada na cromatografia de adsorção, onde os componentes polares da mistura são retidos

na fase estacionária devido à interação com os grupos silanóis. Atualmente, têm sido

desenvolvidas fases estacionárias quimicamente ligada à sílica, que assumiram nos últimos

anos cerca de 98% das aplicações analíticas cromatográficas. Os grupos ligados à sílica

podem produzir tipos distintos de fases estacionárias, dependendo da sua natureza polar, não

polar, iônica, ou mesmo complexante. Podemos classificar essas fases em polares e não

polares (CIOLA, 1998):

(a) Fases não polares: mais importantes da atualidade, em que há grupos alquílicos

com cadeias de 2, 4, 8, 18 e em alguns casos 22 átomos de carbono. Existem

também grupos fenilas ligados à sílica, porém com poucas aplicações.

(b) Fases polares: os grupos ligados à sílica são amino, ésteres, carboxilas, fenóis.

Tradicionalmente, por razões históricas, as fases não polares são chamadas de fase

reversa, ao contrário das polares que são chamadas de fase normal. A separação perfeita de

misturas, empregando a cromatografia a líquido, somente terá sucesso se for possível acoplar

uma fase móvel correta a uma fase estacionária conveniente. A seleção dos solventes deve ser

feita de maneira que eles satisfaçam os requisitos necessários para o seu manuseio seguro,

eficiente e econômico.

A separação dos compostos em CLAE, deve-se principalmente aos seguintes

fenômenos que ocorrem na interface fase estacionária/fase móvel: adsorção, partição e

exclusão por tamanho molecular. Adsorção é um fenômeno que ocorre quando duas fases

imiscíveis são postas em contato, ocorrendo uma tendência de acumulação de uma substância

sobre a superfície de outra (CIOLA, 1998). Os processos de adsorção são classificados em

dois tipos: adsorção física e adsorção química.

A adsorção física ocorre com todos os sólidos, principalmente a baixas temperaturas.

Os adsorventes polares, como a sílica, possuem grupos hidroxila que podem fazer pontes de

hidrogênio com álcoois, aminas e ácidos carboxílicos. A adsorção química envolve a

formação de ligações químicas entre a fase sólida e líquida.

A partição envolve um sistema de dois líquidos imiscíveis ou parcialmente miscíveis, em que

o soluto irá se distribuir entre estes líquidos, de modo que o quociente entre as concentrações

do soluto nas duas fases é uma constante. A constante é denominada de coeficiente de

partição. O movimento de solutos de uma fase para outra depende da afinidade do soluto por

cada fase, expressa no coeficiente de partição (NETZ e ORTEGA, 2002).

Considerando que as substâncias se movem dentro da coluna somente quando elas

estão na fase móvel, a velocidade de eluição dentro da coluna será sempre inversamente

proporcional ao valor do coeficiente de partição, isto é, o tempo de retenção necessário para

eluir as substâncias dentro da coluna, desde o instante da injeção até o máximo do pico, será

tanto menor quanto menor for o coeficiente de partição e maior for a velocidade da fase

móvel (CIOLA, 1998). Por esses motivos é que na cromatografia a líquido a fase móvel tem

um papel extremamente importante, pois rege a distribuição dos compostos entre as duas

fases e, portanto, a ordem de eluição e tempo de retenção dos picos.

2.6. Método titrimétrico

A análise titrimétrica refere-se à análise química quantitativa efetuada pela

determinação do volume de uma solução, cuja concentração é exatamente conhecida, que

reage quantitativamente com um volume conhecido da solução que contém a substância a ser

determinada (VOGEL, 1992). Os métodos titrimétricos podem ser classificados de acordo

com a reação utilizada. Na titulação em meio não-aquoso, aplica-se a teoria de ácidos e bases

de Bronsted-Lowry, para explicar as reações que ocorrem durante este tipo de titulação.

A teoria de Bronsted-Lowry considera ácido qualquer substância que tenha tendência a

doar um próton e base a substância que aceitará um próton. As substâncias que proporcionam

pontos finais indefinidos, em virtude de serem ácidos fracos, ou bases fracas, em solução

aquosa, freqüentemente proporcionam pontos finais mais satisfatórios quando as titulações

são efetuadas em meios não aquosos. Os solventes não-aquosos são classificados em quatro

grupos: solventes apróticos, solventes protofílicos, solventes protogênicos e solventes

anfipróticos (VOGEL, 1992).

Solventes Apróticos: incluem substâncias que podem ser consideradas

quimicamente neutras e praticamente inertes. As substâncias possuem constantes

dielétricas baixas, não provocam ionização dos solutos e não sofrem reações com

os ácidos ou com as bases. Exemplo: benzeno e tetracloreto de carbono.

Solventes Protofílicos: são substâncias como a amônia líquida, as aminas e as

cetonas, que possuem alta afinidade por prótons.

Solventes Protogênicos: possuem natureza ácida e doam prótons com facilidade.

Exemplo: ácidos anidros, como o fluoreto de hidrogênio e o ácido sulfúrico; em

virtude da respectiva força, e da capacidade de doar prótons, realçam a força das

bases fracas.

Solventes Anfipróticos: são ligeiramente ionizados e combinam as propriedades

protogênicas e protofílicas, pois são capazes de doar e receber prótons. Assim, o

ácido acético exibe propriedades ácidas na dissociação em que liberta prótons:

Porém, em presença de ácido perclórico, que é um ácido muito mais forte, o ácido

acético aceitará um próton:

O íon

CH3COOH2+ que se forma pode reagir prontamente com uma base.

Portanto, uma base fraca terá as suas propriedades básicas realçadas, e por isso as

titulações entre bases fracas e o ácido perclórico podem ser feitas, muitas vezes e com

facilidade, no ácido acético como solvente.

CH3COOH CH3COO- + H+

CH3COOH + HClO4 CH3COOH2+ +

2.7. Métodos analíticos para fluorquinolonas em formas farmacêuticas

Na literatura há vários métodos analíticos desenvolvidos para análise de

fluorquinolonas, onde destacamos alguns métodos mais comumente utilizados como:

cromatografia líquida de alta eficiência, doseamento microbiológico, espectrofluorimetria,

espectrofotometria no UV, espectrofotometria no visível e métodos titrimétricos.

A Farmacopéia Americana (USP 25, 2002), relata as monografias somente de três

fluorquinolonas: ciprofloxacino, em solução injetável, solução oftálmica e comprimidos

quantificado por HPLC utilizando fase móvel ácido fosfórico 0,025 M e acetonitrila (87:13);

norfloxacino, em solução injetável, solução oftálmica e comprimidos quantificado por

titrimetria potenciométrica utilizando ácido perclórico 0,1 N em meio com ácido acético;

ofloxacino, solução oftálmica, quantificado por titrimetria potenciométrica utilizando ácido

perclórico 0,1 N em meio com anidrido acético.

No suplemento 3 da Farmacopéia brasileira editado em 2002 constam as seguintes

monografias de fluorquinolonas: ciprofloxacino matéria-prima, comprimidos, solução

injetável e solução oftálmica; norfloxacino matéria-prima e comprimidos, e ofloxacino

matéria-prima, comprimidos e solução injetável (F. Bras. 2002).

Os códigos oficiais apresentam poucos métodos para análise de fármacos da classe

das fluorquinolonas tanto na matéria-prima, como em formas farmacêuticas. Por isso, o

desenvolvimento de metodologias analíticas para essa classe de fármacos é bastante

importante na área de controle de qualidade. Na literatura há vários métodos analíticos

sugeridos para as fluorquinolonas, começando pelo doseamento microbiológico, que utilizam

uma variedade de microrganismo como indicador, incluindo Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae, Micrococcus luteus e Bacillus subtilis.

White e colaboradores (1999) relatam doseamento microbiológico para

ciprofloxacino, utilizando como microrganismo indicador Escherichia coli e tampão pH 7,2

para dissolver as soluções aplicadas ao teste. Os mesmos autores também sugeriram ensaio

microbiológico para norfloxacino, utilizando como microrganismo indicador Klebsiella

pneumoniae. Froelich e Schapoval, em 1990, realizaram doseamento microbiológico de

norfloxacino, em comprimidos e matéria-prima, utilizando Bacillus subtilis ATCC 6633, em

tampão fosfato pH 8,0, com concentrações de 10, 20 e 40 g/mL com meio inoculado a 1%.

Outras duas fluorquinolonas, ciprofloxacino (FRATINI, 1993) na forma farmacêutica

comprimidos e em soluções para infusão e pefloxacino (SOUZA, 1995), também foram

desenvolvidos método microbiológico para análise. Ensaio microbiológico de difusão em

ágar, cilindros em placa, foi desenvolvido para ofloxacino, em soluções injetáveis, utilizando

como microrganismo indicador Micrococcus luteus ATCC 9341, em concentração de 12-27

µg/mL (EV, 1997). O esparfloxacino, em comprimidos, também foi doseado utilizando

Micrococcus luteus ATCC 9341, como microrganismo indicador, em concentração de 4-25

µg/mL (MARONA e SCHAPOVAL, 1998).

A espectrofotometria no UV é um método analítico utilizado para análise das

fluorquinolonas, principalmente devido à estrutura química desses fármacos, que absorvem na

luz UV. Em 1999, Marona e Schapoval desenvolveram e validaram um método analítico para

esparfloxacino, em comprimidos, utilizando espectrofotometria no UV, com absorção em 292

nm, onde a linearidade foi observada entre 2-12 µg/mL.

Carlucci e colaboradores (1993), utilizaram espectrofotometria no UV derivada, 297

nm, para quantificar ofloxacino, em comprimidos, colírios e soluções otológicas. O

coeficiente de correlação obtido foi de 0,9995.

Inúmeros artigos publicados na literatura utilizam espectrofotometria no visível para

fluorquinolonas. Kapetanovic e colaboradores (1996), publicaram um estudo demonstrando a

complexação de ofloxacino com íons cobre II, em diferentes valores de pH, com investigação

polarográfica, para quantificação do fármaco em comprimidos.

Três métodos na região do visível foram desenvolvidos por Issa e colaboradores (1997)

para quantificação de ofloxacino e lomefloxacino em comprimidos, utilizando azul de

bromofenol (BPB), azul de bromotimol (BTB) e púrpura de bromocresol (BCP). Neste artigo

os autores fizeram um estudo da complexação de ofloxacino e lomefloxacino com

bromofenol, azul de bromotimol e púrpura de bromocresol em diferentes valores de pH.

Ofloxacino e lomefloxacino foram quantificados, separadamente, com absorção máxima em

410 nm para os complexos formados com BPB e BCP e 415 nm para BTB. Os comprimidos

encontravam-se em formulações diferentes.

O esparfloxacino, em comprimidos, foi quantificado utilizando azul de bromotimol, em

pH 3,2 (MARONA e SCHAPOVAL, 2001b). Enrofloxacino, solução oral, e pefloxacino,

comprimidos e solução injetável, também foram determinados espectrofotometricamente

utilizando azul de bromofenol e alaranjado de metila (AM) em solução tampão pH 2,3-2,5 no

caso de BPB e pH 3,6 para alaranjado de metila. Os produtos foram quantificados a 420 nm e

424 nm, para BPB e AM, respectivamente (MOSTAFA et al., 2002).

Bhowal e Das (1991) desenvolveram método espectrofotométrico para determinação de

norfloxacino e ciprofloxacino, em comprimidos e cápsulas, utilizando cloreto férrico em meio

metanol-dimetilsulfóxido. As absorvâncias máximas para norfloxacino e ciprofloxacino foram

442 nm e 440 nm.

Fratini e Schapoval (1996), desenvolveram um método no visível para ciprofloxacino na

forma farmacêutica comprimidos e em soluções para infusão, utilizando nitrato férrico 1% em

HNO3 1%. O complexo formado obteve absorção máxima em 435 nm, sendo estável por 60

minutos.

Foi desenvolvido um método espectrofotométrico para ciprofloxacino e norfloxacino,

separadamente, em comprimidos, utilizando íons ferro III, em meio com ácido sulfúrico, em

que a medida de absorvância dos complexos formados, correspondem a 447 nm e 430 nm,

respectivamente. A estequiometria e a constante de formação do complexo também foram

analisadas neste estudo (SULIMAN e SULTAN, 1996).

Nagaralli e colaboradores (2002) determinaram ciprofloxacino, complexando-o com tris

(o-fenantrolina) ferro II (absorvância 510 nm) e trisbipiridil ferro II (absorvância 522 nm). O

ciprofloxacino foi quantificado em comprimidos e cápsulas.

Foi desenvolvido um método titrimétrico para determinação de esparfloxacino em

comprimidos, utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio com ácido acético (MARONA e

SCHAPOVAL, 2001a).

Recentemente foi desenvolvido um método espectrofluorimétrico para moxifloxacino,

uma nova 8-métoxi-fluorquinolona, da mesma geração do gatifloxacino. Os autores diluíram

o fármaco em solução de tampão fosfato - ácido fosfórico pH 8,3, com absorvância máxima a

287 nm. Este estudo foi aplicado em comprimidos de moxifloxacino (OCAÑA et al., 2000).

Em relação aos métodos cromatográficos, a cromatografia líquida de alta eficiência é o

método mais comumente aplicado para análise das fluorquinolonas. Carlucci e colaboradores

(1993) quantificaram por CLAE ofloxacino, utilizando como fase móvel tampão fosfato 0,05

M pH 7,0/acetonitrila (20:80 V/V). A detecção foi realizada a 297 nm, com tempo de

retenção de 10,4 minutos. O ofloxacino foi analisado em comprimidos, colírios e soluções

otológicas.

Em 2002, Souza e colaboradores desenvolveram e validaram um método em CLAE

para enrofloxacino, solução injetável. A fase estacionária utilizada foi uma coluna C18 e a

fase móvel acetato de sódio pH 4,7 0,1 M/acetonitrila (60:40, V/V), com fluxo de 1,5

mL/min. A detecção foi a 278 nm e o tempo de retenção de 1,278 minutos.

Solução oftálmica e comprimidos de ciprofloxacino foram quantificados por CLAE

em fase reversa, utilizando detecção fluorescente com λexc= 300 nm e λemi = 458 nm. A fase

móvel empregada consistem de acetonitrila: metanol: tampão acetato (pH 3,60; 0,05 M)

(10:30:60 V/V/V) contendo 1% de ácido acético. O tempo de retenção foi 4,98 minutos para

solução oftálmica e 5,11 minutos para os comprimidos (ZOTOU e MILTIADOU, 2002).

O método para determinação de esparfloxacino, em comprimidos, foi desenvolvido e

validado por Marona e Schapoval (1999), utilizando cromatografia em fase reversa, com fase

móvel composta de ácido acético 5 %: metanol: acetonitrila (70:15:15, V/V/V).

Em relação ao gatifloxacino, não há até o momento, desenvolvimento de métodos

analíticos para determinação do fármaco em formas farmacêuticas. Os trabalhos que

encontramos na literatura, relacionam-se com determinação em fluidos biológicos. Um dos

primeiros artigos científicos na literatura, quantifica gatifloxacino no soro e urina, utilizando

CLAE - fase reversa com detecção fluorimétrica. A fase móvel utilizada foi acetonitrila:

fosfato de tetrabutilamônio: água (17:10:83), ajustando a solução para pH 3,48 com ácido

fosfórico. O tempo de retenção foi de 4,5 minutos no soro e 4,6 minutos na urina (BORNER

et al., 2000).

Em 2001, Vishwanathan e colaboradores, desenvolveram e validaram um método para

quantificar gatifloxacino no plasma humano. Foi utilizado cromatografia líquida de alta

eficiência, com detecção por espectrometria de massas, em que a fase móvel utilizada foi

ácido fórmico 0,1% e o tempo de retenção foi de 2,07 minutos. Outro método desenvolvido

para identificação de gatifloxacino envolveu a determinação simultânea de várias

fluorquinolonas, como levofloxacino, ciprofloxacino, moxifloxacino, trovafloxacino e

cinoxacino. A determinação em CLAE, envolveu detecção fluorimétrica, utilizando coluna de

fase reversa e fase móvel constituída de 10 mM sulfato de sódio/ 10 mM de acetato de

tetrabutilamônio/ 25 mM de ácido cítrico com 43 % de acetonitrila pH 3,5 (LIANG et al.,

2002).

2.8. Validação de métodos analíticos

Os métodos analíticos têm por objetivo fornecer informações confiáveis quanto à

natureza e à composição dos materiais submetidos à análise. Sabe-se, entretanto, que um

certo grau de variabilidade está atrelado a todas as avaliações. Portanto, um dos objetivos de

garantia de qualidade é manter em patamar mínimo esta variabilidade. A validação é parte

importante do programa de garantia de qualidade, sendo os procedimentos incluídos nas

normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF) exigidas pela Food and Drug Administration

(FDA) dos Estados Unidos, e aplicadas nas indústrias farmacêuticas, devendo, também

ocorrer conforme as boas práticas de laboratório (BPL), do inglês, Good Laboratory

Practice (GLP). Recentemente a ANVISA, na resolução no 899, de 29 de Maio de 2003,

divulgou aspectos relacionados a validação de métodos analíticos (BRASIL, 2003). Os

métodos de ensaio devem ser descritos de forma clara para evitar a interpretação errônea dos

resultados analíticos.

A escolha do método deve levar em consideração fatores como sua adequação à

substância analisada, em determinada forma farmacêutica. Precisão, exatidão, sensibilidade e

especificidade (ERMER, 2001; USP 25, 2002), são características fundamentais de um

método analítico, porém outras como a disponibilidade de instrumentos e equipamentos,

rapidez, custo reduzido, simplicidade e baixo risco ocupacional devem também ser

consideradas.

A validação envolve, não apenas os procedimentos do processo produtivo, mas todos

os métodos empregados no controle de qualidade, incluindo a comparação do método

estudado com o método oficial ou outro método anteriormente validado.

Esta variabilidade aumenta quando as determinações são realizadas por diferentes

analistas em diferentes laboratórios (TAYLOR, 1983). Para minimizar os erros, é necessário

que os métodos de análise sejam descritos de forma objetiva, simples e clara, de modo que

mesmo o profissional pouco treinado possa realizar os ensaios corretamente. Outro atributo,

a robustez, para cromatografia líquida de alta eficiência, corresponde à capacidade de um

método não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros,

como a composição orgânica da fase móvel, pH, força iônica, temperatura (ICH, 1996;

SWARTZ e KRULL, 1998; HEYDEN et al., 2001), permitindo redução da variabilidade

analítica.

As farmacopéias americana (2002) e britânica (2001) fazem referência à validação

analítica de forma destacada, incluindo a definição dos termos e parâmetros analíticos

envolvidos nos ensaios de validação. Os atributos do método analítico ou parâmetros de

validação estão descritos em inúmeras publicações (VESSMAN, 1996; WOOD, 1999;

ERMER, 2001; HEYDEN et al., 2001; PERSON e VESSMAN, 2001).

O procedimento de validação depende do tipo de metodologia analítica utilizada. Os

métodos analíticos são classificados por tipo ou categoria (USP 25, 2002), ou seja, categoria

I (quantificação), II (teste para determinação de impurezas ou produtos de degradação), III

(determina a característica de desempenho) e IV (testes de identificação). Para a categoria I,

atributos como precisão, exatidão, especificidade, linearidade, intervalo de quantificação e

robustez devem ser estudados na validação. A categoria II envolve ensaios de quantificação e

ensaios limite. Nos ensaios limites não é necessário realizar testes de precisão, limite de

quantificação e linearidade. No ensaio de quantificação, não há necessidade de realizar o

limite de detecção. Na categoria III, são exigidos apenas a precisão e robustez do método

analítico. Na categoria IV, só é necessário teste de especificidade.

A ICH (The International Conference on the Harmonization of the Technical

Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) harmoniza requerimentos

em duas diretrizes: no primeiro documento orienta definições de características sobre

validação necessários para vários tipos de procedimentos (ICH, 1994), e no segundo

documento inclui dados experimentais requeridos e algumas interpretações estatísticas (ICH,

1996).

Estas diretrizes servem como bases internacionais tanto para a indústria farmacêutica,

para academia e para autoridades regulamentares. As características de validação são

normalmente avaliadas para diferentes procedimentos (ICH, 1994) e obedecem um número

mínimo de determinações requeridas para cada processo de validação (Tabela 1).

Tabela 1. Determinações requeridas para o processo de validação, seguindo diretrizes da

ICH.

Parâmetros devalidação

Número mínimo Procedimento testeIdentificação Impurezas

Quantitativo LimiteEnsaioa

Especificidade b _ Sim Sim Sim Sim

Linearidade 5 concentrações Não Sim Não Sim

Intervalo - Não Sim Não Sim

Exatidão 9 determinaçõessobre 3 níveis de

concentração (3 x 3)

Não Sim Não Sim

PrecisãoRepetibilidade

6 determinações de100% ou 9

determinações (3x 3)

Não Sim Não Sim

Precisãointermediária/

reprodutibilidadec2 séries

Não Sim Não Sim

Limite dedetecção -

Não Nãod Sim Não

Limite dequantificação

- Não Sim Não Não

a Incluindo dissolução

b Falta de especificidade de um procedimento analítico pode ser compensado por outro procedimento

analítico

c A precisão intermediária é suficiente para submissão

d Pode ser necessário em alguns casos

A exatidão, um dos atributos primordiais, expressa a medida do desvio dos valores

obtidos por um determinado método analítico, e indica a diferença entre valor médio obtido

de uma série de valores experimentais e valor verdadeiro (ICH, 1994; USP 25, 2002). Uma

forma de determinar a exatidão é através do teste de recuperação, que consiste em adicionar

à solução-teste uma quantidade conhecida da substância padrão acima e abaixo daquela

esperada na amostra (ALTESOR et al., 1994; CAUSON, 1997). Neste caso, a exatidão é

calculada pela diferença da concentração entre a solução adicionada do padrão e da amostra

sem adição de padrão. O teste de recuperação permite, além da determinação da exatidão do

método, verificar a interferência dos componentes da formulação quando não é possível

omiti-los da formulação, ou quando não se conhece a composição desta formulação.

Outro importante atributo, a precisão do método, é definida como a medida da

proximidade dos resultados do ensaio, obtidos individualmente de várias amostras de um lote,

sendo expressa como variância, coeficiente de variação ou desvio padrão dos valores

observados (DEAN e DIXON, 1951; CAUSON, 1997). A precisão pode ser considerada em

três níveis diferentes: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade (ICH, 1996;

USP 25, 2002).

Na repetibilidade ou precisão intra-dia ou intra-ensaio, é considerada a variação que

ocorre quando da realização de réplicas do ensaio, em um curto período de tempo nas

mesmas condições operacionais. A precisão intermediária está relacionada com análises

realizadas em diferentes dias, analistas, instrumentos e reagentes (ICH, 1996). A

reprodutibilidade está relacionada com procedimentos realizados por dois ou mais

laboratórios, como ocorre em estudos colaborativos. Assim, a repetibilidade é considerada

como ensaios realizados em condições repetidas, enquanto que a reprodutibilidade em

condições comparativas.

Na linguagem farmacopéica, a precisão é entendida como a concordância entre os

valores de uma série, obtida de análises múltiplas da mesma amostra homogênea sob as

condições de ensaio estabelecidas. A precisão reflete a capacidade de reproduzir o mesmo

método, mas não necessariamente o resultado correto ou o esperado, toda vez em que seja

realizado conforme padronizado (USP 25, 2002). Portanto, o método analítico adequado

deve apresentar exatidão e precisão.

A especificidade de um método analítico representa sua capacidade de avaliar e

quantificar de forma inequívoca a substância em exame, mesmo quando presente, na amostra,

interferentes como os excipientes, compostos de estrutura química semelhantes, produtos de

degradação (VESSMAN, 1996; PERSSON e VESSMAN , 2001). O método analítico que

apresenta sensibilidade possui a capacidade de responder adequadamente e detectar

quantidades decrescentes da substância.

A averiguação da sensibilidade do método inclui a determinação dos limites de

detecção, específica para teste qualitativo, e quantificação, empregada nas determinações

quantitativas das impurezas. O limite de detecção é a menor quantidade da substância que é

detectada, mas não necessariamente quantificada (BRITAIN, 1998; ICH, 1996; USP 25,

2002), enquanto que o limite de quantificação é a menor concentração ou quantidade que

pode ser determinada pelo método.

O procedimento de validação engloba também a construção da curva de calibração e a

verificação de sua linearidade. Através da linearidade pode ser comprovado que o método

analítico produz resposta diretamente relacionada com a quantidade ou concentração da

substância analisada. O intervalo de linearidade é definido como o intervalo entre a

concentração mais baixa e mais alta em que o método analítico apresenta exatidão, precisão e

linearidade. Esta linearidade precisa ser determinada na faixa de concentração em que será

realizado o ensaio.

A introdução de métodos analíticos exige a adoção de procedimentos de validação que

conferem a confiabilidade necessária para a aplicação das técnicas de quantificação. O

desenvolvimento de metodologias que permitam quantificar fármacos em matérias-primas e

produtos acabados são fundamentais para o controle de qualidade destes produtos tanto no

âmbito da indústria farmacêutica nacional e internacional como em farmácias magistrais

públicas e privadas.

3. OBJETIVOS

O gatifloxacino é comercializado no Brasil desde 1999 na forma farmacêutica

comprimido e, ainda não possui metodologia de análise descrita em compêndios oficiais,

embora faça parte do arsenal terapêutico mundial. Uma vez que impulsiona uma indústria

farmacêutica de bilhões de dólares e possui ampla atividade antimicrobiana, torna-se

necessário o estabelecimento de métodos analíticos para análise quantitativa e procedimentos

de análise qualitativa para a identificação do fármaco em formas farmacêuticas.

Objetivos:

- Desenvolver método volumétrico em meio não-aquoso utilizando ácido

perclórico em meio com ácido acético.

- Desenvolver e validar método de análise espectrofotométrico na região UV para

gatifloxacino na matéria-prima e na forma farmacêutica comprimido.

- Desenvolver e validar metodologia empregando cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE).

- Desenvolver e validar método microbiológico de doseamento para o gatifloxacino por

meio de método de difusão em ágar-cilindros em placa.

- Desenvolver método qualitativo e semiquantitativo para gatifloxacino em

cromatografia em camada delgada (CCD).

- Identificar por espectrofotometria na região de infravermelho e análise térmica o

gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos e matéria-prima.

4. MATERIAL e MÉTODO

4.1. MATERIAL

4.1.1. Descrição

Nome genérico: gatifloxacino (Figura 10).

Descrição: pó cristalino, inodoro, levemente amarelo

Nome químico:

1-ciclopropil-6-flúor-1,4-dihidro-8-metóxi-7-(3-metil-1-piperazinil)-4-oxoquinolino-3-carbox

ílico

Nomes: gatifloxacin, gatifloxacino

Nome comercial: Tequin (Bristol-Myers Squibb)

Siglas: AM-1155 (MERCK, 2001)

CG-5501 (ODLAND et al., 1999)

BMS –206584 (FUKUDA et al., 1998)

CAS: 160738-57-8 (PEREIRA, 2002)

Número de registro no D.C.I.: 7423

Categoria: Fluorquinolona antibacteriana

Figura 10. Estrutura tridimensional de gatifloxacino

Fórmula molecular: C19H22FN3O4

Massa molecular: 375,39

Análise elementar:

C (60,79%); H (5,91%); F (5,06%); (11,19%); O (17,05%)

Ponto de fusão:162o C (MERCK, 2001)

Solubilidade: água, etanol, metanol

4.1.1.2. Substância de Referência

Foi utilizado gatifloxacino1, substância de referência, com teor estimado em 99,99%, e

identificado pelo lote: 0003000330.

4.1.1.3. Forma Farmacêutica

Comprimidos revestidos2 contendo 400 mg de gatifloxacino sesquiidratado (teor

rotulado), sob nome comercial de Tequin e identificado pelo lote de número

0005000543.

Fórmula unitária: gatifloxacino (400 mg), hidroxipropilmetilcelulose, estearato de

magnésio, metilcelulose, celulose microcristalina, polietilenoglicol, polissorbato 80,

simeticona, glicolato de amido sódico, ácido sórbico, dióxido de titânio (DEF, 2001/02).

1 GATX-SR foi gentilmente doado pela indústria farmacêutica Bristol-Myers Squibb

2 GATX-Comprimidos foi gentilmente doado pela indústria farmacêutica Bristol-Myers Squibb

2. Solventes, matérias-primas e reagentes

Ácido acético (Merck, Alemanha)

Ácido fórmico (Synth, Brasil)

Ácido perclórico – (Sigma, Alemanha)

Acetonitrila (Merck, Alemanha)

Acetonitrila grau HPLC - VETEC

Ágar no 11 (Merck, Alemanha)

Biftalato de potássio (Synth, Brasil)

Butanol (Synth, Brasil)

Ciprofloxacino, matéria-prima, gentilmente doado pelo laboratório EMS, Brasil.

Cloreto de metilrosaníleo 0,1% em ácido acético

Clorofórmio (Merck, Alemanha)

Diclorometano (Merck, Alemanha)

Etanol (Synth, Brasil)

Esparfloxacino, substância de referência – gentilmente doado pelo laboratório

Rhone-Poulenc Rorer, EUA.

Fosfato de potássio monobásico (Reagen, Brasil)

Gatifloxacino substância de referência (Bristol-Myers Squibb)

Hidróxido de amônio (Synth, Brasil)

Hidróxido de sódio (Synth, Brasil)

Levofloxacino: comprimidos. Indústria Jassen-cilag.

Lomefloxacino: solução oftálmica. Indústria cibavision ophthalmics.

Metanol (Merck, Alemanha)

Metanol grau HPLC (Merck, Alemanha)

Sílica gel 60 F254 - (Merck, Alemanha)

Tequin® 400mg comprimidos (Bristol Myers Squibb)*

TSB - Tryptic soy broth (DIFCO, EUA)

4.1.3 Equipamentos

Agitador de Tubos, PHOENIX, modelo AP56

Seringa HAMILTON, 100 L

Aparelho de sonicação “SONICATOR – ULTRASONIC LIQUIDPROCESSOR”,

HEAT SYSTEMS –mod.XL 2020

Autoclave, PHOENIX

Balança analítica, METTLER, modelo H10

Balança analítica METTLER, modelo AE100

Balança semi-analítica, MARK-BEL

Balança semi-analítica, micronal B160

Câmara UV 254 nm Contador de colônias, PHOENIX, modelo CP600

Cromatógrafo líquido Varian 2550, equipado com detector UV-Vis, integrador

Spectra-physics, modelo chromjet integrator, injetor Rheodyne (Loop 20 L)3 e

Coluna de aço inox Phenomenex4, luna 5 C18 (2), 250 x 4,6 mm, EUA.

3 O equipamento foi gentilmente cedido pelo instituto do trabalhor em Bauru, UNESP, pelo Prof. Dr. ManoelLima de Menezes4 A coluna Phenomenex foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Manoel Lima de Menezes, UNESP-Bauru.

Estufa de incubação, ODONTOBRÁS, modelo ECB 1.2

Estufa de secagem e esterilização, NOVA ÉTICA

Espectrofotômetro UV-VIS SHIMADZU 1603

Espectrofotômetro UV-Vis BEECHMAN

Módulo DSC 2910 (TA Instruments), com taxa de aquecimento programável de 0,01

a 200O C/min, sensibilidade máxima de 0,2 W.

Lâmpada UV

Micropipetas, BOECO

pH metro – METTLER – mod. Delta 345

Paquímetro, STARRET, modelo digital eletrônico série 727

Pipeta automática

4.2. MÉTODO

4.2.1. Doseamento em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em meio com

ácido acético

Para a análise quantitativa de gatifloxacino foi desenvolvido o método titrimétrico em

meio não aquoso utilizando ácido perclórico em ácido acético glacial padronizado frente ao

biftalato de potássio como titulante. Foi realizado ensaio em branco para correção do volume

gasto no doseamento.

4.2.1.1. Determinação do teor de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimido

Vinte comprimidos (602,805mg), foram pesados individualmente, para determinação do peso

médio. Em seguida, os comprimidos foram triturados em gral de porcelana e dessecados em

estufa a 105o C por duas horas. O equivalente ao peso médio dos comprimidos foi

transferido para erlenmeyer de 250 mL. Adicionaram-se 40 mL de ácido acético glacial, 5

gotas de cloreto de metilrosanílio 0,1% SI (cristal violeta) em ácido acético. Titulou-se com

ácido perclórico 0,1 M até o ponto de equivalência. Foi realizado a titulometria com o

branco, para as devidas correções. Este procedimento foi realizado em triplicata, durante 3

dias consecutivos. O teor de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos foi

determinado pela equação abaixo:

Onde: v = volume (mL) de ácido perclórico 0,1 M; dmEq = decimiliequivalente de GATX; m

= peso de GATX (g), em que 1 mL de ácido perclórico 0,1 M eqüivale a 37,54 mg de

GATX-SR.

4.2.1.2. Exatidão do método

A exatidão do método foi avaliada pelo teste de recuperação que foi realizado

adicionando quantidades conhecidas de GATX-SR nas amostras de gatifloxacino

comprimidos. Foram incorporados 10,1 mg, 20,3 mg e 39,7 mg de GATX-SR, em diferentes

erlenmeyers, ao equivalente à 400 mg de gatifloxacino nos comprimidos. Adicionaram-se 40

mL de ácido acético glacial, 5 gotas de cloreto de metilrosanílio SI (cristal violeta) 0,1% em

ácido acético. Titulou-se com ácido perclórico 0,1 M até o ponto de equivalência. O ensaio

foi realizado em 3 dias consecutivos e em triplicata.

4.2.1.3. Precisão do método

A precisão do método foi avaliada pelo coeficiente de variação, utilizando gatifloxacino

analisados nos comprimidos. O ensaio foi realizado em três diferentes dias diferentes e em

triplicata.

4.2.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV

V x dmEq x 100Teor do fármaco (%) =

m

4.2.2.1. Espectro de absorção de GATX-SR

O espectro de absorção de GATX-SR foi obtido em água deionizada, em concentração

de 24 µg/mL na região UV. As leituras foram realizadas entre 200–400 nm em

espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu, utilizando-se cubetas com 10mm de caminho óptico.

4.2.2.2. Construção da curva de Ringbom

A curva de Ringbom foi obtida com o objetivo de estabelecer a faixa de concentração

na qual o método espectrofotométrico na região de ultravioleta apresenta linearidade. Foram

pesados, analiticamente, 10 mg de GATX-SR, previamente dessecados em estufa a 105oC

durante duas horas, e transferidos para balão volumétrico de 100 mL. A substância foi

dissolvida em água deionizada e mantida em ultra-som por 10 minutos. O volume do balão,

foi completado, obtendo-se solução com concentração final de 100 μg/mL. A partir desta

solução, foram transferidas alíquotas para balões volumétricos, obtendo-se a curva com 22

pontos, com concentrações variando de 0,5 a 50,0 μg/mL de GATX-SR. A curva de

Ringbom foi obtida plotando-se os valores de transmitância e de concentração em escala

logarítmica.

4.2.2.3. Construção da curva padrão para gatifloxacino

Para a obtenção da curva padrão, foram pesados analiticamente 10 mg de GATX-SR,

previamente dessecados em estufa a 105oC durante duas horas, transferidos para balão

volumétrico de 100 mL, dissolvidos em água deionizada e mantidos em aparelho de

ultra-som, para melhor solubilização. Com a utilização de bureta foram obtidas soluções com

concentrações de 4,0 a 14,0 μg/mL de gatifloxacino substância de referência (Tabela 2). As

leituras das soluções foram efetuadas a 287 nm, utilizando água deionizada como branco. A

curva padrão foi construída em três diferentes dias e em triplicata, utilizando o programa

Sigma plot 4,01.

Tabela 2. Preparo das soluções para obtenção da curva padrão de gatifloxacino por meio de

espectrofotometria no UV a 287 nm, em água deionizada.

gatifloxacino 100 µg/mL (mL) água (mL) concentração final

(µg/mL)

0,4 9,6 4,0

0,6 9,4 6,0

0,8 9,2 8,0

1,0 9,0 10,0

1,2 8,8 12,0

1,4 8,6 14,0

4.2.2.4. Análise estatística

A representação gráfica da equação da reta foi determinada pela análise de regressão

linear através do método dos mínimos quadrados. As absorvâncias utilizadas na determinação

da curva padrão foram estatisticamente avaliadas pela análise de variância (ANOVA).

4.2.2.5. Exatidão do método proposto

Foi preparada solução de gatifloxacino substância de referência com concentração de

100 µg/mL. As soluções da amostra foram preparadas com concentração de 60 µg/mL a

partir da solução de gatifloxacino comprimidos com concentração de 1200 µg/mL. As

soluções foram transferidas para balão volumétrico de 100 mL, completando-se o volume

com água deionizada. A Tabela 3 apresenta as soluções obtidas para o teste de recuperação

de GATX-SR para o método espectrofotométrico na região UV.


gatifloxacino para o método espectrofotométrico na região UV a 287 nm, em água

deionizada.

Vol. Sol. da amostra 60 µg/mL

(mL)

Vol. Sol. GATX-SR. 100

µg/mL (mL)

Concentração

(μg/mL)

A 10,0 - 6,0

R1 10,0 2,0 8,0

R2 10,0 4,0 10,0

R3 10,0 6,0 12,0

P - 6,0 6,0

A percentagem de recuperação (R%) foi calculada através da expressão descrita abaixo

(AOAC, 1997):

Onde:

R% = [(CF - CA)/CP] . 100

CF = concentração da substância de referência + amostra

CA = concentração da amostra

CP = concentração da substância de referência adicionada


A precisão do método foi avaliada pelo coeficiente de variação de gatifloxacino. O

ensaio foi realizado em três diferentes dias e em triplicata.

4.2.2.7. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos

4.2.2.7.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência

Foram transferidos 6,0 mL de solução de gatifloxacino substância de referência com

concentração de 100 µg/mL para balão volumétrico de 100 mL. O volume foi completado

com água deionizada para a obtenção da solução com concentração de 6,0 µg/mL.

4.2.2.7.2. Preparo das amostra de comprimidos

Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio (603,605 mg).

Após triturados manualmente em gral, uma quantidade de pó equivalente a 3 pesos médios do

comprimido foi exatamente pesada e transferida para balão volumétrico de 1000 mL. Foram

adicionados 500 mL de água deionizada e a solução foi mantida em aparelho de ultra-som

por 20 minutos. O volume foi completado com água deionizada para a obtenção de solução

com concentração de 1200 µg/mL. Foram transferidas alíquotas de 5,0 mL para balões

volumétricos de 100 mL e o volume completado com água (concentração teórica de 60

µg/mL). Dessa solução retiraram-se alíquotas de 10 mL para balões volumétricos de 100 mL

e os volumes foram completados com água deionizada para a obtenção de soluções com

concentrações teóricas de 6,0 µg/mL (Figura 11).

As leituras das soluções foram realizadas em espectrofotômetro a 287 nm, utilizando-se

cubetas de quartzo com 10 mm de caminho óptico e água deionizada como branco.A Figura

11 apresenta como foram realizadas as diluições para a preparação das soluções-amostra

utilizadas no método espectrofotométrico na região de ultravioleta a 287 nm.

1200 µg/mL

5,0 mL/BV* 100 mL

60 µg/mL

Figura 11. Representação do preparo das soluções da amostra utilizada no método

espectrofotométrico na região UV a 287 nm.*BV = Balão volumétrico

A concentração da solução amostra foi determinada pela equação abaixo:

Onde:

CA = concentração da amostra (µg/mL)

CSR = concentração da substância de referência (µg/mL)

AA = absorvância da amostra

10,0 mL/ BV 100 mL

6 µg/mL

CA = AA . CSR/ASR

ASR = absorvância da substância de referência

O teor percentual de gatifloxacino nas amostras foi calculado pela equação:

Onde:

CA = concentração de gatifloxacino encontrada na amostra (µg/mL)

Ct = concentração teórica de gatifloxacino na amostra (µg/mL)

4.2.3. Cromatografia líquida de alta eficiência

A Tabela 4 informa as condições cromatográficas utilizadas na padronização do método.

A fase móvel foi filtrada através de membrana com poro de 0,45 µm e 47 mm de diâmetro,

sob vácuo, desgaseificada no ultra-som, durante 30 minutos. Após a estabilização do sistema,

foram injetados 20,0 µL, previamente filtrados em membrana com poro de 0,45 µm e 13 mm

de diâmetro.

Tabela 4. Condições cromatográficas utilizadas no método por CLAE.

Fase móvel Ácido acético 5%: acetonitrila: metanol

(70:15:15,V:V:V)

CA% = CA . 100/Ct

Coluna Phenomenex, Luna 5 m C18 (2)

Comprimento de onda 287 nm

Fluxo 1,0 mL/min

Volume de injeção 20,0 µL

Velocidade de registro 0,5 cm/min

Temperatura 25o C ± 1o C

4.2.3.1. Construção da curva padrão

Para realização da curva padrão, foram pesados, analiticamente, 10,0 mg de

gatifloxacino substância de referência, previamente dessecados em estufa a 105o C durante

duas horas, transferidos para balão volumétrico de 100 mL e completando-se o volume com

água deionizada. A representação das soluções para obtenção da curva padrão, está

apresentado na Tabela 5. A curva padrão foi construída em três diferentes dias e em triplicata,

utilizando o programa Sigma plot 4,01.

Tabela 5. Preparo das soluções-padrão de gatifloxacino utilizadas na obtenção da curva

padrão em CLAE.

Volume da solução GATX

(mL) 100 µg/mL

Volume BV*

utilizado (mL)

Concentração (µg/mL)

1 1,0 25 4,0

2 1,5 25 6,0

3 2,0 25 8,0

4 2,5 25 10,0

5 3,0 25 12,0

6 3,5 25 14,0

* Balão volumétrico

4.2.3.2. Análise estatística

A representação gráfica da equação da reta foi determinada pela análise de regressão

linear através do método dos mínimos quadrados. As áreas utilizadas na determinação da

curva padrão foram estatisticamente avaliadas pela análise de variância (ANOVA).

4.2.3.3. Exatidão do método proposto

Foi preparada solução de gatifloxacino substância de referência com concentração de

100 µg/mL. As soluções da amostra foram preparadas com concentração de 240 µg/mL a

partir da solução de gatifloxacino comprimidos com concentração de 2400 µg/mL. A Tabela

6 apresenta as soluções obtidas para o teste de recuperação de GATX-SR em CLAE.


gatifloxacino para método por CLAE.

Volume da solução-amostra Volume da Solução GATX-SR Concentração

240 µg/mL (mL) 100 µg/mL (mL) (μg/mL)

A 1,0 - 9,6

R1 1,0 0,1 10,0

R2 1,0 0,2 10,4

R3 1,0 0,4 11,2

R4 1,0 0,6 12,0

P - 2,4 9,6


A precisão do método foi avaliada pelo coeficiente de variação de gatifloxacino nas

amostras de comprimido em três diferentes dias. Em cada dia foram preparadas seis soluções

da amostra e da substância de referência.

4.2.3.5. Determinação de gatifloxacino nos comprimidos

4.2.3.5.1. Preparo da solução de gatifloxacino substância de referência

Foram transferidos 6,0 mL de solução de gatifloxacino substância de referência com

concentração de 100 µg/mL para balão volumétrico de 50 mL. O volume foi completado com

água deionizada para a obtenção da solução com concentração de 12,0 µg/mL.

4.2.3.5.2. Preparo das amostras de comprimidos

Foram pesados 20 comprimidos para a determinação do peso médio (607,81 mg). Após

triturados manualmente em gral, uma quantidade de pó equivalente a 3 pesos médios do

comprimido foi exatamente pesada e transferida para balão volumétrico de 500 mL. Foram

adicionados 250 mL de água deionizada e a solução foi levada ao aparelho de ultra-som por

20 minutos. O volume foi completado com água deionizada para a obtenção de solução com

concentração de 2400 µg/mL. Foram transferidas alíquotas de 10,0 mL para balões

volumétricos de 200 mL completando-se os volumes com água. As soluções preparadas têm

concentrações teóricas de 120 µg/mL de gatifloxacino. Dessa solução retiraram-se alíquotas

de 5,0 mL para balões volumétricos de 50,0 mL e os volumes foram completados com água

deionizada para a obtenção de soluções com concentrações teóricas de 12,0 µg/mL .

A concentração da solução amostra foi determinada pela seguinte equação:

Onde:

CA = concentração da amostra (µg/mL)

CSR = concentração da substância de referência (µg/mL)

AA = área da amostra

ASR = área da substância de referência

CA = AA . CSR/ASR

O teor percentual de gatifloxacino nas amostras foi calculado pela equação:

Onde:

CA = concentração de gatifloxacino encontrada na amostra (µg/mL)

Ct = concentração teórica de gatifloxacino na amostra (µg/mL)

4.2.4. Doseamento microbiológico

Foram realizados ensaios preliminares para o desenvolvimento de metodologia de

análise para gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos alternando-se alguns

parâmetros (Tabela 7).

Tabela 7. Parâmetros utilizados para a avaliação de gatifloxacino por ensaio microbiológico -

método de difusão em ágar- cilindros em placas.

Parâmetros Descrição

MicrorganismosStaphylococcus aureus ATCC 6538

Bacillus subtilis ATCC 9372Escherichia coli ATCC 25922

Meio de cultura Meio no 11 de Grove-Randall

Soluções diluentes Solução tampão pH 6,0Solução tampão pH 8,0

Concentrações das soluçõespadrão (μg/mL)

4,0; 10,0; 25,0 4,0; 8,0; 16,0

CA% = CA . 100/Ct

Os parâmetros estabelecidos para o doseamento microbiológico estão apresentados na

Tabela 8.

Tabela 8. Parâmetros estabelecidos na padronização de gatifloxacino no ensaio

microbiológico

Parâmetros Descrição

Microrganismo Bacillus subtilis ATCC 9372

Meio de cultura Meio no 11 de Grove-Randall

Solução diluente Tampão fosfato pH 6,0

Concentração do inóculo 2%

Concentrações da solução padrão (µg/mL) 4,0; 8,0; 16,0

Temperatura de incubação ( oC) 35 ± 2

Tempo de incubação (horas) 18

4.2.4.1. Preparo das soluções-padrão

Foram transferidos 10,0 mg de gatifloxacino substância de referência, exatamente

pesados, para balão volumétrico de 100 mL e dissolvidos em água para obtenção de solução

com 100 µg/mL.

A solução foi levada ao ultra-som por 10 minutos, para melhor solubilização. A partir

desta solução foram transferidos, analiticamente, 1,0, 2,0 e 4,0 mL para balões volumétricos

de 25 mL, completando-se o volume dos balões com solução tampão pH 6,0 para obtenção

de soluções com concentrações de 4,0, 8,0 e 16,0 µg/mL.

4.2.4.2. Preparo das soluções de gatifloxacino na forma farmacêutica

A partir do peso médio dos comprimidos (607,15 mg), pesou-se o equivalente a 10,0

mg de gatifloxacino, preparando-se solução da amostra com concentração de 100 µg/mL.

Seguiu-se o mesmo procedimento na preparação das soluções padrão, obtendo-se soluções

com concentrações de 4,0, 8,0 e 16,0 µg/mL.

4.2.4.3. Preparo do inóculo

O microrganismo-teste Bacillus subtilis ATCC 9372 foi mantido em meio TSB à 35o ±

2oC, durante 24 horas. A padronização foi realizada em espectrofotômetro a 580 nm com

transmitância de 25% ± 2% (F. Bras., 1988). Após a padronização, o inóculo foi utilizado a

2% em meio no 11 de Grove-Randall mantido em banho de vapor à 47oC ± 1oC.

4.2.4.4. Ensaio

Foram utilizadas 18 placas de Petri para o doseamento de gatifloxacino em

comprimidos. Em cada ensaio foram utilizadas 6 placas de Petri, e os resultados analisados

estatisticamente. Em capela de fluxo laminar, foram transferidos para cada placa, com auxílio

de pipetador automático, 20 mL de meio no 11 para a camada base. Após a solidificação

desta camada, foram adicionados através de pipetador automático, 5 mL de meio no 11

contendo 2% inóculo. Após a solidificação da camada semeada, foram distribuídos,

eqüidistantemente, 6 cilindros de aço inoxidável por placa. Cada cilindro recebeu com auxílio

de pipetador automático, 200 µL das soluções do padrão ou da amostra (comprimido), em

delineamento 3 x 3 (Figura 12).

As placas foram colocadas em estufa incubadora à 35oC ± 2oC. Após 18 horas, foram

realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de inibição ao centésimo de milímetro, com

auxílio de paquímetro. Em cada ensaio os resultados foram analisados estatisticamente e a

potência de cada doseamento calculada. A potência do medicamento foi calculada pela

equação de Hewitt (1977).

Figura 12. Delineamento 3 x 3, demonstrando a disposição das soluções padrão (P) e

amostra (A) na placa de Petri, onde P1 (4 µg/mL); P2 (8 µg/mL); P3 (16 µg/mL) e A1 (4

µg/mL); A2 (8 µg/mL); A3 (16 µg/mL).

4.2.4.5. Cálculo da potência do medicamento

A potência do fármaco foi determinada pela equação de HEWITT (1977). Os ensaios

foram realizados em dias diferentes, e cada amostra corresponde à média de seis

determinações.

Equação de HEWITT

4.2.4.6. Construção da curva padrão

A curva padrão foi construída em gráfico logarítmo da concentração versus diâmetro

dos halos de inibição, com as médias dos diâmetros de cada uma das concentrações da

substância de referência. A curva foi construída utilizando o programa Sigma Plot 4.01.

4.2.4.7. Exatidão do método

Onde:

F= 1/3[(A1 +A2 + A3) - (P1+P2+ P3)]

I = logaritmo da razão das doses

T/R (%) = Antilog M x 100

M=F/b b = E/I

O teste de recuperação para o método microbiológico foi realizado para comprovar a

exatidão do método proposto.

4.2.4.7.1. Preparo das soluções

Neste ensaio, preparou-se uma solução de substância de referência com concentração

de 100 g/mL. A solução amostra adicionada da substância de referência foi preparada

pesando-se o equivalente a 10 mg, que foram transferidos para balões volumétricos de 100

mL. Em cada balão adicionaram-se 50 mL de água levando ao ultra-som para melhor

solubilização. Adicionou-se alíquota de 0,5 mL da solução-padrão no balão 1 (recuperação

1), 1,0 mL de solução-padrão no balão 2 (recuperação 2) e 1,5 mL no balão 3 (recuperação

3). A Tabela 9 representa o esquema de preparo das amostras no teste de recuperação.

Tabela 9. Preparo das soluções para análise do teste de recuperação para gatifloxacino no

doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa

Quantidade da

amostra

adicionada (mg)

Quantidade da solução

padrão adicionada 0,1

mg/mL (mL)

Concentração teórica de

amostra + padrão mg/ 100

mL

1 10,0 0,5 10,5

2 10,0 1,0 11,0

3 10,0 1,5 11,5

A partir destas soluções foram transferidos analiticamente, 1,0, 2,0 e 4,0 mL para

balões volumétricos de 25 mL, completando os volumes dos balões com tampão fosfato pH

6,0, para obtenção das seguintes concentrações teóricas:

Para o teste de recuperação 1: 4,2; 8,4 e 16,8 g/mL



Após a execução do ensaio, as placas foram colocadas em estufa incubadora à 35oC ±

2oC. Após 18 horas, foram realizadas as medidas dos diâmetros dos halos de inibição ao

centésimo de milímetro, com auxílio de paquímetro. A potência do antimicrobiano foi

calculada pela equação de Hewitt (1977), e a partir do valor encontrado, foi calculada a

concentração experimental da solução amostra adicionada de padrão.


A precisão do método proposto foi avaliada pelo coeficiente de variação da

concentração de gatifloxacino nos comprimidos, realizada em três diferentes dias e em

triplicata.

4.2.5. Cromatografia em camada delgada

4.2.5.1. Preparo das placas

As placas utilizadas para identificação do fármaco, foram preparadas com sílica-gel 60

F254 (20 x 20 cm), com espessura de 0,25 mm e ativadas em estufa a 105o C por uma hora.

4.2.5.2. Preparo da solução-padrão de gatifloxacino

Pesou-se o equivalente 5 mg de substância de referência, previamente dessecados em

estufa a 105oC, durante duas horas, transferindo para balão volumétrico de 50 mL, e

dissolvidos com etanol, para obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL.

4.2.5.3. Preparo da solução amostra de gatifloxacino

Foram pesados o equivalente a 5 mg de gatifloxacino da amostra de comprimidos,

transferindo-os para balão volumétrico de 50 mL, dissolvendo a solução em etanol, para

obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL.

4.2.5.4. Preparo da solução de esparfloxacino

Foram utilizados esparfloxacino matéria-prima para a preparação da solução de

comparação. Pesaram-se, analiticamente, 5 mg de esparfloxacino, transferindo para um balão

volumétrico de 50 mL, dissolvendo o fármaco em etanol, para obtenção de solução com

concentração final de 100 µg/mL.

4.2.5.5. Preparo de solução de ciprofloxacino

Para preparação desta solução, foi utilizado ciprofloxacino matéria-prima. Pesaram-se 5

mg do fármaco, analiticamente, que foram transferidos para balão volumétrico de 50 mL,

para obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL de ciprofloxacino.

4.2.5.6. Preparo de solução de lomefloxacino

Foram utilizados comprimidos de lomefloxacino para a preparação da solução de

comparação. Pesaram-se, analiticamente, o equivalente a 5 mg do fármaco que foram

transferidos para balão volumétrico de 50 mL, obtendo solução com concentração final de

100 µg/mL.

4.2.5.7. Preparo da solução de levofloxacino

Foi utilizada, a forma farmacêutica colírios contendo levofloxacino, para a preparação

da solução de comparação. O equivalente a 5 mg do fármaco, foi transferido para balão

volumétrico de 50 mL, para obtenção de solução com concentração final de 100 µg/mL.

4.2.5.8. Sistemas de fases móveis

Foram testados inicialmente os sistemas de fases móveis somente com solução-padrão e

solução-amostra de gatifloxacino e posteriormente com outras fluorquinolonas em placas de

sílica gel 60 F254.

1) Diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:2:1) V:V:V:V

2) Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2) V:V:V:V

3) Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2) V:V:V:V

4) Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5) V:V:V:V

5) Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5) V:V:V:V

6) Clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1) V:V:V

7) n-Butanol: ácido acético: água (40:10:50) V:V:V

4.2.5.9. Ensaio

Procedeu-se, inicialmente à saturação da placa com o sistema de fase móvel. Com

auxílio de seringa de 100 µL transferiram-se as soluções com concentrações crescentes de

gatifloxacino padrão e amostra, para as placas procedendo-se à cromatografia. Após

migração da fase móvel, a placa foi retirada da cuba de vidro, deixando o solvente evaporar.

As placas foram reveladas na câmara UV, para a comparação das manchas quanto a forma,

posição e tamanho. Foi determinado o Rf de cada fármaco.

4.2.5.10. Execução do ensaio com as cinco fluorquinolonas

Após a saturação da cuba com o sistema solvente foi colocada a placa de sílica-gel com

as aplicações das soluções preparadas no dia da análise. As soluções foram transferidas para a

placa com uma seringa de 100 µL. Foram aplicados 10 µL de cada solução na placa

(gatifloxacino substância de referência, gatifloxacino comprimidos, ciprofloxacino,

lomefloxacino e levofloxacino) com exceção de esparfloxacino, em que foram aplicados 30

µL da solução. Após a migração da fase móvel, a placa foi retirada da cuba de vidro,

deixando o solvente evaporar. A placa foi revelada na câmara UV.

4.2.6. Espectrofotometria de absorção na região de infravermelho

Os espectros foram obtidos com 1,5 mg de gatifloxacino substância de referência e

gatifloxacino comprimidos, utilizando-se pastilhas de 150 mg de brometo de potássio

dessecado a 105o C durante duas horas.

A amostra extraída dos comprimidos foi obtida pelo preparo de solução aquosa 1000

µg/mL, que após, filtrada, foi levada à secura em evaporador rotatório em temperatura

inferior a 60o C.

4.2.7. Análise térmica de gatifloxacino

As amostras, GATX-SR e GATX-comp, foram colocadas em frascos de vidro e secas

em estufa a 95OC por oito horas. Foram pesadas analiticamente aproximadamente 3 mg de

cada uma das amostras e colocadas em cadinhos de alumínio para realização das análises.

Cada amostra foi analisada separadamente em aparelho de calorimetria exploratória

diferencial (DSC 2910 – TA Instruments), previamente calibrado de acordo com os seguintes

parâmetros: razão de aquecimento de 20OC/minuto; variação de temperatura de 40-450OC e

vazão de nitrogênio a 90 mL/minuto. Utilizou-se um cadinho de alumínio vazio no forno de

referência.

5. RESULTADOS

5.1. Doseamento de gatifloxacino em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M

em meio de ácido acético glacial.

A Tabela 10 apresenta os valores experimentais obtidos para o doseamento de

GATX-comp.

Tabela 10. Valores obtidos no doseamento de GATX-comp em meio não-aquoso utilizando

a titrimetria com ácido perclórico 0,1 M em ácido acético glacial.

Dia 1(%)

Dia 2

(%)

Dia 3

(%)

I 100,48 99,72 101,37

II 100,85 100,02 101,32

III 99,65 99,72 100,79

Média intra-dia 100,28 99,82 101,16

Média inter-dia (%) 100,42

5.1.1. Teste de recuperação de gatifloxacino na análise titrimétrica

A Tabela 11 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação para

GATX-comp. no doseamento titrimétrico.

Tabela 11. Teste de recuperação de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos

obtidos por titrimetria em meio não-aquoso utilizando ácido perclórico 0,1 M em ácido

acético glacial.

Substância de referência

adicionada (mg)

Substância de referência

recuperada (mg)

Recuperação

(%)

10,1 9,91 98,1

20,3 20,42 100,6

39,7 39,56 99,6

5.1.2. Teor de gatifloxacino nos comprimidos e precisão do método em análise

titrimétrica

A Tabela 12 apresenta os valores experimentais da amostra de gatifloxacino nos

comprimidos, obtidos no doseamento titrimétrico, bem como a precisão do método pelo

valor do coeficiente de variação.

Tabela 12. Valores experimentais da amostra obtidos no doseamento titrimétrico.

Dia 1 (%) Dia 2 (%) Dia 3 (%) Teor médio (%)

1 100,48 99,72 101,37

2 100,85 100,02 101,32

3 99,65 99,72 100,79

Desvio

padrão 0,61 0,17 0,32

CV % 0,61 0,17 0,32

Média 100,28 99,82 101,16 100,42

5.2. Metodologia analítica por espectrofotometria na região UV

5.2.1. Espectro de absorção da substância de referência GATX

O espectro de absorção na região UV de GATX-SR com concentração de 24 g/mL em

água deionizada está representado na Figura 13.

Figura 13. Espectro de absorção de solução de GATX-SR, na concentração de 24 g/mL,

por espectrofotometria na região do UV, utilizando água deionizada.

5.2.2. Curva de Ringbom de GATX utilizando água deionizada como solvente

A Tabela 13 apresenta os valores utilizados na construção da curva de Ringbom para

GATX-SR utilizando água deionizada como solvente e a Figura 14 a curva de Ringbom

correspondente.

Tabela 13. Valores obtidos para construção da curva de Ringbom para GATX-SR em água

deionizada.

Solução de

GATX-SR

100 g/mL (mL)

Volume do balão

volumétrico (mL)

Concentração

( g/mL)

Absorvância 100-T%

1,0 200 0,5 0,035 7,74

1,0 100 1,0 0,079 16,63

1,0 50 2,0 0,157 30,33

1,5 50 3,0 0,217 39,32

1,0 25 4,0 0,316 51,69

0,5 10 5,0 0,389 59,16

0,6 10 6,0 0,456 65,00

0,7 10 7,0 0,565 72,77

0,8 10 8,0 0,633 76,72

0,9 10 9,0 0,701 80,09

1,0 10 10,0 0,790 83,78

1,2 10 12,0 0,932 88,3

1,4 10 14,0 1,108 92,2

1,6 10 16,0 1,229 94,09

1,8 10 18,0 1,406 96,07

2,0 10 20,0 1,555 97,21

2,4 10 24,0 1,823 98,49

2,8 10 28,0 2,128 99,25

3,2 10 32,0 2,422 99,62

3,6 10 36,0 2,709 99,80

4,0 10 40,0 2,960 99,89

5,0 10 50,0 3,311 99,95

Figura 14. Curva de Ringbom para gatifloxacino substância de referência utilizando água

deionizada como solvente.

5.2.3.Construção da curva padrão de GATX utilizando água deionizada como solvente.

A Tabela 14 apresenta os valores experimentais obtidos na construção da curva padrão

para GATX-SR, utilizando água deionizada como solvente, e a Figura 15 a curva padrão

correspondente.

Tabela 14. Valores experimentais obtidos na construção da curva padrão para GATX.

Concentração

(µg/mL)

Absorvância* Absorvância média

± e.p.m.

Desvio

padrão

CV%

4,0

0,311

0,323

0,321

0,318 ± 0,0037 0,0064 2,02

0,470

6,0 0,468

0,474

0,470 ± 0,0017 0,0030 0,60

8,0

0,619

0,622

0,646

0,629 ± 0,0085 0,0147 2,35

10,0

0,767

0,769

0,790

0,775 ± 0,007356 0,0127 1,60

12,0

0,921

0,938

0,962

0,940 ± 0,0118 0,0205 2,19

14,0

1,070

1,072

1,117

1,086 ± 0,0153 0,0265 2,44

*Média de três leituras

e.p.m. - erro padrão da média

CV% - coeficiente de variação percentual

Figura 15. Representação gráfica da curva padrão (e o coeficiente de correlação) das

soluções de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método

espectrofotométrico na região de ultravioleta a 287nm.

5.2.4. Análise estatística

A Tabela 15 apresenta os valores experimentais obtidos para GATX na construção da

curva padrão.


utilizando água deionizada.

X

(μg/mL)

Absorvância(

Y)

x-(xmédio

)

x-(xmédio).y x-(xmédio

)2

ymédio

observado

ymédio

calculado

4 0,311 -5 -1,555 25

4 0,323 -5 -1,615 25

4 0,321 -5 -1,605 25

0,318 0,318

6 0,470 -3 -1,410 9

6 0,468 -3 -1,404 9

6 0,474 -3 -1,422 9

0,470 0,472

8 0,619 -1 -0,619 1

8 0,622 -1 -0,622 1

8 0,646 -1 -0,646 1

0,629 0,626

10,0 0,767 1 0,767 1

10,0 0,769 1 0,769 1

10,0 0,790 1 0,790 1

0,775 0,780

12,0 0,921 3 2,763 9

12,0 0,938 3 2,814 9

12,0 0,962 3 2,886 9

0,940 0,934

14,0 1,070 5 5,35 25

14,0 1,072 5 5,36 25

14,0 1,117 5 5,585 25

1,086 1,088

Σ =162 Σ = 12,66 Σ = 16,186 Σ = 210 Σ = 4,218

X =9 X =0,703

O valor de ymédio calculado foi obtido pela equação abaixo:

ycalculado = a +(b.(X1 – XM), onde:

a = média do yobservado b = Soma x-(xmédio).y/Soma x-(xmédio)2

b = 16,186/210

A Tabela 16 apresenta o desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na

construção da curva de calibração de GATX-SR em água deionizada.


padrão para gatifloxacino

X(μg/mL) yobs ycalculado (ycalc –yobs) (ycalc – yobs)2 n(ycalc – yobs)2

4 0,318 0,318 0,0 0,0 0,0

6 0,470 0,472 -0,002 0,000004 0,000012

8 0,629 0,626 0,003 0,000009 0,000027

10 0,775 0,780 -0,005 0,000025 0,000075

b = 0,077076a = 0,703

12 0,940 0,934 0,006 0,000036 0,000108

14 1,086 1,088 -0,002 0,000004 0,000012

SOMA 0,000078 0,000234

A Tabela 17 apresenta a análise variância dos valores utilizados na curva padrão.


da curva padrão

X(µg/ml) 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0

Y1 0,311 0,470 0,619 0,767 0,921 1,070

Y2 0,323 0,468 0,622 0,769 0,938 1,072

Y3 0,321 0,474 0,646 0,790 0,962 1,117

ΣY 0,955 1,412 1,887 2,326 2,821 3,259

Ymédio 0,318 0,470 0,629 0,775 0,940 1,086

(ΣY)2 0,912 1,993744 3,560769 5,410276 7,958041 10,621081

Y2 0,096721 0,2209 0,383161 0,588289 0,848241 1,1449

Y2 0,104329 0,219024 0,386884 0,591361 0,879844 1,149184

Y2 0,103041 0,224676 0,417316 0,6241 0,925444 1,247689

n = 3

ΣY2 0,304091 0,6646 1,187361 1,80375 2,653529 3,541773

T 12,66 SQdesvios(VT) = 1,250904

T2 160,2756 SQentre(VE) = 1,2471

Σ 10,155104 SQdentro(res) = 0,003804

Equações utilizadas para calcular os valores de T, Σ, Sqdesvios (VT), Sqentre (VE) e

Sqdentro(res).

T= Soma ΣY

Σ = Soma ΣY2

SQdesvios(VT) = Σ – (T2/18)

SQentre(VE) = ((ΣY)2/3) – T2/18

SQdentro(res) = VT – VE

A Tabela 18 apresenta o cálculo do coeficiente de correlação da curva de calibração do

método espectrofotométrico de GATX-SR na região UV.


curva de calibração do método espectrofotométrico de gatifloxacino na região UV.

Dx dy dx.dy dx2 dy2

-5 -0,385 1,925 25 0,148225

-3 -0,233 0,699 9 0,054289

-1 -0,074 0,074 1 0,005476

1 0,072 0,072 1 0,005184

3 0,237 0,711 9 0,056169

5 0,383 1,915 25 0,146689

SOMA 5,396 70 0,416032

O valor de Dy, Dx e r, foram obtidos através das

seguintes fórmulas:

A validade da regressão linear da curva padrão média obtida foi calculada através de

análise de variância (ANOVA) dos valores de absorvância determinados na obtenção da

Dx = x- (xmédio)

r = (soma dx.dy)/RAIZ(somadx2 x somady2)r = 5,396/RAIZ (70 x 0,416032)r = 0,9999r2 = 0,9998

Dy = ymédioobs – média ymédioobs

curva padrão de gatifloxacino pelo método espectrofotométrico na região UV está

apresentada na Tabela 19.

Tabela 19. Análise de variância das absorvâncias obtidas na curva padrão de gatifloxacino

por espectrofotometria UV.

Fontes de

variação

gL Soma dos

quadrados

Variância Fcalc Ftab

Entre 5 1,2471 0,24942 786,81* 3,11

Regressão linear 1 1,246866 1,246866 3933,33* 4,75

Desvio de

linearidade

4 0,000234 0,0000585 0,18 3,26

Resíduo 12 0,003804 0,000317

Total 17

*Significativo p< 0,05


a curva padrão

A Tabela 20 apresenta os parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores

experimentais obtidos para a curva padrão.


a curva padrão.

Parâmetros Resultados

(nm) 287

Faixa de concentração utilizada (μg/mL) 4,0 - 14,0

Equação: y = bx + a y = 0,077x + 0,703

a 0,703

b (sensibilidade) 0,077

r (coeficiente de correlação) 0,9998

n 6

5.2.6. Teste de recuperação para GATX

A Tabela 21 apresenta os valores obtidos no teste de recuperação para GATX-SR

utilizando a espectrofotometria UV a 287 nm.

Tabela 21. Valores obtidos no teste de recuperação para GATX-SR utilizando a

espectrofotometria UV a 287 nm.

Concentração teórica

adicionada

(µg/mL)

Concentração

Recuperada

(µg/mL)

Recuperação

(%)

R1 2,0 1,96 98,00

R2 4,0 3,97 99,25

R3 6,0 5,91 98,50

5.2.7. Precisão do método e valores experimentais obtidos na determinação do teor de

gatifloxacino nos comprimidos por espectrofotometria na região UV

A Tabela 22 apresenta os valores experimentais dos comprimidos obtidos pelo método

espectrofotométrico na região UV para gatifloxacino, bem como a precisão do método.


região UV e a precisão do método representado pelo coeficiente de variação.

Quantidade

encontrada (mg)

Teor (%) Teor médio

(%)

Desvio

padrão

CV%

1 392,20 98,05

2 387,70 96,90

3 397,58 99,40

4 393,40 98,30

5 393,70 98,40

6 394,30 98,60

98,32 0,81 0,83

5.3. Cromatografia líquida de alta eficiência

5.3.1. Cromatogramas de GATX-SR e GATX-comp.

As Figuras 16 e 17 apresentam os cromatogramas de GATX-comp. e GATX-SR.

Figura 16. Cromatograma obtido por CLAE para solução aquosa de comprimidos (12

g/mL). Fase móvel: ácido acético 5%: metanol: acetonitrila (70:15:15); Coluna phenomenex

C18 (250 x 4,6 mm); Tempo de retenção 5,00 min.

Figura 17. Cromatograma obtido por CLAE para solução aquosa de GATX-SR (12

g/mL). Fase móvel: ácido acético 5%: metanol: acetonitrila (70:15:15); Coluna phenomenex

C18 (250 x 4,6 mm); Tempo de retenção 5,00 min.

5.3.2. Curva padrão

A Tabela 23 apresenta os valores experimentais obtidos na construção da curva padrão

para GATX-SR por CLAE e a Figura 18 a curva padrão correspondente.

Tabela 23. Áreas absolutas obtidas para construção da curva padrão por CLAE

Concentração

( g/mL)

Áreas absolutas Área absolutas média ±

e.p.m.

CV %

4,0

179639

182206

175806

179217 ± 1859,53 1,80

6,0

278896

274408

273642

275648,70 ± 1638,65 1,03

8,0

368751

363621

384585

372319,00 ± 6309,26 2,94

10,0

454490

453480

457082

453985,30 ± 1072,72

0,41

12,0

556075

547162 553096,30 ± 2967,17 0,93

(B)

556052

14,0

644872

654550

652066

650496,00 ± 2901,99 0,77

e.p.m.=erro padrão da média

CV% = coeficiente de variação

y = 46861,80x + 414299,05r2= 0,9995

Figura 18. Representação gráfica da curva padrão (e o coeficiente de correlação) das

soluções de gatifloxacino em concentrações de 4,0 a 14,0 µg/mL pelo método em CLAE,

com detecção à 287 nm.

5.3.3. Análise estatística

A Tabela 24 apresenta os valores experimentais obtidos para GATX na construção da

curva padrão.

Tabela 24. Parâmetros estatísticos obtidos na construção da curva padrão para GATX-SR

em CLAE

x(μg/mL) Áreas(y) x-(xmédi

o)

x-(xmédio).y x-(xmédio)

2

ymédio

observado

ymédio

calculado

4 179639 -5 -898195,00 25

4 182206 -5 -911030,00 25

4 175806 -5 -879030,00 25

179217,00 179990

6 278896 -3 -836688,00 9

6 274408 -3 -823224,00 9

6 273642 -3 -820926,00 9

275648,667 273714

8 368751 -1 -368751,00 1

8 363621 -1 -363621,00 1

8 384585 -1 -384585,00 1

372319,00 367437

10,0 454490 1 454490,00 1

10,0 453480 1 453480,00 1

10,0 457082 1 457082,00 1

455017,33 461161

12,0 556075 3 1668225,00 9

12,0 547162 3 1668156,00 9

12,0 556052 3 1668156,00 9

553096,33 554884

14,0 644872 5 3224360,00 25

14,0 654550 5 3272750,00 25

14,0 652066 5 3260330,00 25

650496,00 648608

Σ =162 9840979 Σ = 210 Σ = 2485794

Média =

414299,0556

O valor de ymédio calculado foi obtido pela equação abaixo:

ycalculado = a +(b.(X1 – XM), onde:

a = média do yobservado b = Soma x-(xmédio).y/Soma x-(xmédio)2

b = 9840979/210

A Tabela 25 apresenta o desvio de linearidade dos valores experimentais utilizados na

construção da curva de calibração de GATX-SR em água deionizada.

a = 414299,0556 b = 46861,80


padrão para gatifloxacino em CLAE.

X (μg/mL) yobs ycalculado ( y c a l c

–yobs)

(ycalc – yobs)2 n(ycalc –

yobs)2

4 179217 179990 773,03 597578,080 1792734,24

6 275648,67 273714 -193,035 3744323,286 11232969,86

8 372319 367437 -4881,75 23831475,314 71494425,94

10 455017,33 461161 6143,53 37742923,805 113228771,41

12 553096,33 554884 1788,14 3197432,171 9592296,51

14 650496 648608 -1887,92 3564244,324 10692732,97

Σ 72677976,980 218033930,94

A Tabela 26 apresenta a análise variância dos valores utilizados na curva padrão emCLAE.

Tabela 26. Elementos para análise variância (ANOVA) dos valores experimentais utilizados

para a obtenção da curva padrão em CLAE.

X 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0

Y1 179639 278896 368751 454490 556075 644872

n = 3

Y2 182206 274408 363621 453480 547162 654550

Y3 175806 273642 384585 457082 556052 652066

ΣY 537651 826946 1116957 1365052 1659289 1951488

Ymédi

o

179217 275649 372319 455017 553096 650496

(ΣY)2 2,8906 x

1011

6 , 8 3 8 3 x

1011

12,4759

x 1011

18,6336 x

101127,5323 x 1011 38,0830x

1011

Y2 3 , 2 2 7 0 x

1010

7 , 7 7 8 2 x

1010

1,3597

x 1011

2 , 0 6 5 6 x

1011

3,092194056 x

1011

4 , 1 5 8 5 x

1011

Y2 3 , 3 1 9 9 x

1010

7,5299 x

1010

1 , 3 2 2 2 x

1011

2 , 0 5 6 4 x

1011

2,9938

x 1011

4,2843

x 1011

Y2 3,0907 x

1010

7,4879 x

1010

1 , 4 7 9 0 x

1011

2 , 0 8 9 2 x

1011

3,0919

x 1011

4,2519

x 1011

ΣY2 0,9637 x

1011

2 , 2 7 9 6 x

1011

4 , 1 6 1 0 x

1011

6 , 2 1 1 2 x

1011

9,1779

x 1011

12,6948

x 1011

T 7457383 SQdesvios(VT) = 4,592704183x1011

T2 5,5612561

21x1013

SQentre(VE) =4,588844627x 1011

Σ 3,5488571

52x1012

SQdentro(res) =385955600

Equações utilizadas para calcular os valores de T, Σ, Sqdesvios (VT), Sqentre (VE) e

Sqdentro (res).

T= Soma ΣY

Σ = Soma ΣY2

SQdesvios(VT) = Σ – (T2/18)

SQentre(VE) = ((ΣY)2/3) – T2/18

SQdentro(res) = VT - VE

A Tabela 27 apresenta o cálculo do coeficiente de correlação da curva padrão obtida para

gatifloxacino em CLAE.


curva de calibração em CLAE.

Dx dy dx.dy dx2 dy2

-5 -235082,0556 1175410,30 25 55263572844

-3 -138650,3889 415951,17 9 19223930339

-1 -41980,0556 41980,056 1 1762325068

1 40718,2777 40718,278 1 1657978139

3 138797,2777 416391,83 9 19264684319

5 236197,9444 1180985,7 25 55788996565

Σ = 3271436,3 70 1,52961 x 1011

O valor de Dy e r foram obtidos através das seguintes fórmulas:

A validade da regressão linear da curva padrão média obtida foi calculada através de

análise de variância (ANOVA) dos valores das áreas determinadas na construção da curva

padrão de gatifloxacino em CLAE estão apresentados na Tabela 28.

Tabela 28. Análise de variância das áreas determinadas na obtenção da curva padrão de

gatifloxacino em CLAE.

Fontes de

variação

gL Soma dos

quadrados

Variância Fcalc Fobs

Entre 5 4,58884x1011 91776892366 2853,4848* 3,11

R e g r e s s ã o

linear

1 45866596610 45866596610 14260,6450* 4,75

Desvio de

linearidade

4 218033931 54508482,75 1,6948 3,26

Resíduo 12 385955600 32162966,67

Total 17 45927041830

*Significativo p<0,05

r = (soma dx.dy)/RAIZ(somadx2 x somady2)r = 3271436,3/RAIZ (70 x 1,52961 x 1011)r = 0,9998

Dy = ymédioobs – média ymédioobs


a curva padrão

A Tabela 29 apresenta os parâmetros do tratamento estatístico sobre os valores

experimentais obtidos para a curva padrão em CLAE.


a curva padrão em CLAE.

Parâmetros Resultados

Faixa de concentração utilizada (μg/mL) 4,0 - 14,0

Equação: y = bx + a y = 46861,80x + 414299,05

a 414299,05

b (sensibilidade) 46861,80x

r (coeficiente de correlação) 0,9995

n 6

5.3.5. Teste de recuperação para GATX

A Tabela 30 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação para

GATX-SR utilizando CLAE.

Tabela 30. Valores experimentais obtidos no teste de recuperação para GATX-SR em

CLAE.

Concentração teórica

adicionada

(µg/mL)

Área absoluta

Concentração

encontrada

(µg/mL)

Recuperação

(%)

R1 0,4 463375,25 0,39 99,47

R2 0,8 480829,33 0,78 97,50

R3 1,6 521831,33 1,67 104,79

R4 2,4 553724,33 2,37 98,94

5.3.6. Precisão do método a partir dos valores experimentais obtidos na determinação

de gatifloxacino nos comprimidos por CLAE.

A Tabela 31 apresenta as áreas obtidas na determinação de gatifloxacino nos comprimidos

por CLAE.

Tabela 31. Valores das áreas dos comprimidos, obtidos por CLAE.

Áreas Média Desvio padrão CV%

1

534228

542679,7

550305

2

558050

554826

565591

3

530464

522962

524222

4

541990

541924,5

551313

542404,20

559489

525882,70

545078,80

8042,04

5524,88

4017,25

5401,64

1,48

0,98

0,76

0,99

5.3.7. Teor dos comprimidos em CLAE

A Tabela 32 apresenta o teor de gatifloxacino nos comprimidos analisados.

Tabela 32. Teor de gatifloxacino nos comprimidos em CLAE.

Quantidade encontrada

de comprimido (mg)

Áreas absolutas Teor (%) Teor médio

(%)

1 12,04

534228,00

542679,70

550305,0099,01

2 12,42

558050,00

554826,00

565591,00102,13

3 11,67

530464,00

522962,00

524222,0097,30

4 12,10

541990,00

541924,50

551313,00100,91

99,83

5.4. Doseamento microbiológico

5.4.1. Doseamento microbiológico de gatifloxacino em delineamento 3 x 3

A Tabela 33 apresenta o ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino, em difusão

em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.

Tabela 33. Valores correspondentes ao ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino

(comprimido), difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.

Placas P1 P2 P3 A1 A2 A3

1 19,96 21,60 23,27 19,64 21,43 23,27

2 19,79 21,76 23,13 19,79 21,65 23,14

3 20,00 21,51 23,11 20,03 21,58 23,22

4 19,84 21,50 23,27 19,83 21,49 23,26

5 19,82 21,67 23,23 19,82 21,72 23,22

6 19,75 21,53 23,21 19,75 21,58 23,29

Média 19,86 21,60 23,20 19,81 21,58 23,23

CV % 0,50 0,48 0,30 0,65 0,49 0,23

O Quadro 1 apresenta cálculo da potência de gatifloxacino no ensaio da amostra 1, no

doseamento microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa, utilizando a equação de

H E W I

T T

(1977).


microbiológico em difusão em ágar cilindros em placa.



Tabela 34. Valores correspondentes ao ensaio da amostra 2, no doseamento de gatifloxacino

comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3


1 19,66 21,82 23,18 19,81 21,82 23,12

2 19,63 21,28 23,18 19,91 21,12 23,21

3 19,70 21,14 23,03 19,70 21,14 23,10

4 19,96 21,92 23,05 19,77 21,56 23,10

5 20,00 21,49 23,08 20,03 21,49 23,10

6 19,78 21,79 23,07 19,78 21,80 23,25

F = 1/3 [(A3 + A2 +A1) - (P1 + P2 +P3)]F = 1/3 [( 19,81 + 21,58 + 23,23)] – (19,86 + 21,60+ 23,20)]F = -0,013333

I = log2 I = 0,301E = ¼ [(A3 + P3) - (A1 + P1)]E = ¼ [(23,23 + 23,20) – (19,81+ 19,86)]E = 1,69b= 1,69/0,301 b = 5,61

Média 19,79 21,57 23,10 19,83 21,49 23,15

CV % 0,79 1,48 0,28 0,60 1,43 0,29



HEWITT (1977).






comprimido, difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3


1 19,47 21,24 23,13 19,45 21,24 23,22

2 19,66 21,38 23,18 19,65 21,41 23,38

3 19,46 21,47 23,19 19,59 21,48 23,36

4 19,32 21,43 23,10 18,79 21,53 23,11

F = 1/3 [(A3 + A2 +A1) - (P1 + P2 +P3)]F = 1/3 [(19,83 + 21,49 + 23,15)] – (19,79 + 21,57+ 23,10)]

F = 0,0033

I = log2 I = 0,301E = ¼ [(A3 + P3) - (A1 + P1)]E = ¼ [(23,15 + 23,10) – (19,83+ 19,79]E = 1,6575b= 1,6575/0,301 b = 5,506

5 19,58 21,24 23,22 19,66 21,39 23,32

6 19,44 21,40 23,20 19,72 21,31 23,30

Média 19,49 21,36 23,17 19,48 21,39 23,28

CV % 0,61 0,46 0,20 1,79 0,50 0,43



HEWITT (1977)



5.4.2. Análise estatística do doseamento microbiológico

A Tabela 36 apresenta os valores correspondentes da análise estatística do ensaio da

amostra 1 (Tabela 33), no doseamento de gatifloxacino, difusão em ágar cilindros em placa,

delineamento 3 x 3.

F = 1/3 [(A3 + A2 +A1) - (P1 + P2 +P3)]F = 1/3 [(19,48 + 21,39 + 23,28)] – (19,49 + 21,36+ 23,17)]

F = 0,0433

I = log2 I = 0,301E = ¼ [(A3 + P3) - (A1 + P1)]E = ¼ [(23,28 + 23,17) – (19,48+ 19,49)]E = 2,0b= 2/0,301 b = 6,6445M = 0,0433/6,6445 M = 0,00721

Tabela 36. Análise estatística do ensaio da amostra 1, no doseamento de gatifloxacino,

difusão em ágar cilindros em placa, delineamento 3 x 3.

Fontes de variação gL SQ QM Fcal Ftab.

Preparação 1 0,002 0,002 0,156 4,24

Regressão 1 68,682 68,682 6679,941* 4,24

Desvio de paralelismo 1 0,010 0,010 0,934 4,24

Quadrático 1 0,027 0,027 2,648 4,24

Diferença de quadrático 1 0,000 0,000 0,019 4,24

Entre doses 5 68,720 13,744 1336,739* 2,6

Entre placas 5 0,020 0,004 0,384 2,6

Dentro (erro) 25 0,257 0,010 ........ ........

Total 35 69,00 ........... ......... .........

*Significativo para p <0,05



delineamento 3 x 3.




Preparação 1 0,000 0,000 0,002 4,24

Regressão 1 65,803 65,803 2014,283* 4,24


Quadrático 1 0,033 0,033 1,008 4,24


Entre doses 5 65,871 13,174 403,271* 2,6

Entre placas 5 0,398 0,080 2,438 2,6

Dentro (erro) 25 0,817 0,033 ........ .......

Total 35 67,09 ........... ......... ........

*Significativo para p<0,05



delineamento 3 x 3.




Preparação 1 0,018 0,018 0,738 4,24

Regressão 1 84,075 84,075 3492,271* 4,24


Quadrático 1 0,004 0,004 0,168 4,24


Entre doses 5 84,120 16,824 698,830* 2,6

Entre placas 5 0,242 0,048 2,008 2,6

Dentro (erro) 25 0,602 0,024

Total 35 84,96

*Significativo para p<0,05

5.4.3. Curva padrão de GATX no doseamento microbiológico

A Tabela 39 apresenta os valores obtidos na construção da curva padrão no doseamento

microbiológico para gatifloxacino.

Tabela 39. Valores médios obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino, em

difusão em ágar cilindros em placa, para obtenção da curva de calibração.

Concentração

de GATX-SR

(µg/mL)

Diâmetro dos halos de

inibição*(mm)

Diâmetro

médio (mm)

Desvio

padrão

CV

(%)

PADRÃO

P1 4,0

19,79

19,86

19,49

19,71 0,196554 1,00

P2 8,0

21,57

21,60

21,36

21,51 0,130767 0,61

P3 16,0

23,10

23,20

23,17

23,15 0,051316 0,22

* Cada valor corresponde a média de 6 halos de inibição

CV% - coeficiente de variação percentual

5.4.4. Construção da curva padrão de GATX-SR no doseamento microbiológico pelo

método de difusão em ágar, cilindros em placa

A curva padrão no doseamento microbiológico pelo método de difusão em ágar,

cilindros em placa de GATX-SR está representada na Figura 19.

Figura 19. Curva padrão do GATX-SR obtida no doseamento microbiológico em

difusão em ágar, cilindros em placa.

5.4.5. Teste de recuperação de gatifloxacino no doseamento microbiológico

A Tabela 40 apresenta os valores experimentais obtidos no teste de recuperação do ensaio

microbiológico das três amostras do gatifloxacino.

Tabela 40. Valores experimentais obtidos no doseamento microbiológico de gatifloxacino no

teste de recuperação para o ensaio das três amostras (R1, R2 e R3).

Quantidade

da amostra

adicionada

(mg)

Valor da

substância

padrão

adicionada

(mg)

Concentração

teórica da

amostra + padrão

(mg)

Potência em

cada ensaio

(%)

Concentração

encontrada

(mg)*

R1 10 0,5 10,5 105,30 10,530

R2 10 1,0 11,0 110,05 11,005

R3 10 1,5 11,5 115,31 11,531

*O cálculo é realizado levando em consideração o valor de amostra adicionada.

A Tabela 41 apresenta os valores experimentais obtidos para o teste de recuperação de

gatifloxacino no doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa.

Tabela 41. Valores experimentais obtidos para o teste de recuperação de gatifloxacino no

doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros em placa.

Concentração de

substância de referência

adicionada (mg)

Atividade de padrão

recuperada (mg)

Recuperado (%)

1 0,5 0,501 100,20

2 1,0 0,976 97,60

3 1,5 1,501 100,13

5.4.6. Potência dos comprimidos de gatifloxacino no doseamento microbiológico

A Tabela 42 apresenta os valores experimentais obtidos para o doseamento de

comprimidos de gatifloxacino, através do ensaio microbiológico.

Tabela 42. Valores experimentais obtidos para o doseamento de comprimidos de

gatifloxacino, através do ensaio microbiológico difusão em ágar, cilindros em placa.

Amostra Valor encontrado

(mg/comp)

Teor (%) Média CV%

1 396,88 99,22

2 400,52 100,15 100,29 1,14

3 406,04 101,51

5.5. Identificação de gatifloxacino por cromatografia em camada delgada

A Figura 20 apresenta o cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. analisados no

sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2,

V:V:V:V).

Figura 20. Representação gráfica do cromatograma de GATX-SR e GATX-comp. no

sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2,

V:V:V:V). 1-solução padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,20.


sistema solvente no sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5%

(6:4:4:2, V:V:V:V).


sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V).

1-solução padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,65.





1-solução padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,55.


sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5, V:V:V:V).


sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5, V:V:V:V). 1-solução

padrão de GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,74.


sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V).


sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V).1-solução padrão de

GATX. 2-solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,55.


sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V).


sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V). 1 -

solução padrão de GATX. 2 - solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,7.


sistema n-butanol: ácido acético: água (40:10:50, V:V:V).


sistema solvente n-butanol: ácido acético: água (40:10:50, V:V:V). 1- solução padrão de

GATX. 2 - solução-amostra de GATX. Valor de Rf = 0,22.

A Tabela 43 apresenta os Rf dos diversos sistemas solventes empregados na análise de

GATX-SR e GATX-comp.

Tabela 43. Sistemas de fases móveis testados para GATX-SR e GATX-comp.

Sistema solvente GATX-SR e GATX-comp. (Rf)

Diclorometano: metanol: hidróxido de

amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V) 0,20

Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido

acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V). 0,65

Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido

acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V). 0,55

Clorofórmio:metanol:ácido fórmico:água

(16:7:3:0,5, V:V:V:V) 0,74

Clorofórmio:metanol:ácido fórmico (18:7:1,

V:V:V) 0,55

Clorofórmio:metanol:ácido fórmico:água

(33:7:3:0,5, V:V:V:V) 0,70

n-butanol:ácido acético:água (40:10:50,

V:V:V) 0,22

5.6. Identificação de gatifloxacino utilizando a cromatografia em camada delgada e

diferenciação deste fármaco frente a outras fluorquinolonas.

A Figura 27 apresenta o cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX, SPAX,

CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água

(16:7:3:0,5, V:V:V:V).

Figura 27. Representação gráfica do cromatograma das cinco fluorquinolonas (GATX,

SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico:

água (16:7:3:0,5, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2- GATXcomp Rf = 0,74; 3 -

SPAX Rf = 0,82; 4 - CIPX Rf = 0,57; 5 - LOME Rf= 0,74; 6 - LEVX Rf = 0,42.

A Figura 28 apresenta a representação gráfica do cromatograma das cinco

fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio:

metanol: ácido fórmico (18:7:1, V:V:V).


SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico

(18:7:1, V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATX comp Rf = 0,55; 3 - SPAX Rf =

0,70; 4 –

CIPX Rf = 0,24; 5 - LOME Rf= 0,55; 6 - LEVX Rf = 0,21.


fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio:

metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5, V:V:V:V).


SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente clorofórmio: metanol: ácido fórmico:

água (33:7:3:0,5, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf = 0,70; 3 -

SPAX Rf = 0,73; 4 - CIPX Rf = 0,58; 5 - LOME Rf= 0,65; 6 - LEVX Rf = 0,49.


fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano:

metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V).


SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila:

ácido acético 5% (6:4:4:2, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf =

0,65; 3 - SPAX Rf = 0,79; 4 - CIPX Rf = 0,47; 5 - LOME Rf = 0,55; 6 - LEVX Rf = 0,43.



metanol: acetonitrila: ácido acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V).


SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano: metanol: acetonitrila:

ácido acético 5% (6:4:2:2, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATX comp Rf =

0,55; 3 - SPAX Rf = 0,66; 4 - CIPX Rf = 0,39; 5 - LOME Rf = 0,50; 6 - LEVX Rf = 0,31.


fluorquinolonas (GATX, SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente butanol: ácido

acético 5%:água (40:10:50, V:V:V).


SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente butanol: ácido acético 5%:água

(40:10:50, V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf = 0,22; 3 - SPAX Rf

= 0,28; 4 - CIPX Rf = 0,22; 5 - LOME Rf = 0,25; 6 - LEVX Rf = 0,22.



metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V).


SPAX, CIPX, LOME, LEVX) em sistema solvente diclorometano: metanol: hidróxido de

amônio: acetonitrila (6:4:1:2, V:V:V:V). Valores de Rf: 1 - GATX-SR e 2 - GATXcomp Rf

= 0,20; 3 - SPAX Rf = 0,20; 4 - CIPX Rf = 0,12; 5 - LOME Rf = 0,18; 6 - LEVX Rf = 0,18.

A Tabela 44 apresenta os diferentes Rfs das fluorquinolonas encontrados nos diversos

sistemas de fases móveis testados.

Tabela 44. Apresentação dos diferentes Rfs de várias fluorquinolonas analisadas em CCD.

Sistema solvente

GATX-SR e

GATX-comp

. (Rf)

SPAX

(Rf)

CIPX

(Rf)

LOME

(Rf)

LEVX

(Rf)

Diclorometano: metanol:

hidróxido de amônio:

acetonitrila (6:4:1:2,

V:V:V:V)

0,20 0,20 0,12 0,18 0,18

n-butanol:ácido

acético:água (40:10:50,

V:V:V)

0,22 0,28 0,22 0,25 0,22


acetonitrila: ácido acético

5% (6:4:2:2, V:V:V:V).

0,55 0,66 0,39 0,50 0,31

Clorofórmio:metanol:ácid

o fórmico (18:7:1, V:V:V) 0,55 0,70 0,24 0,55 0,21


acetonitrila: ácido acético

5% (6:4:4:2, V:V:V:V).

0,65 0,79 0,47 0,55 0,43


o fórmico:água

(33:7:3:0,5, V:V:V:V)

0,70 0,73 0,58 0,70 0,49


o fórmico:água

(16:7:3:0,5, V:V:V:V)

0,74 0,82 0,57 0,74 0,42

5.7. Espectro de absorção na região do infravermelho

A Figura 34 apresenta o espectro de absorção na região do infravermelho de

GATX-SR.

Figura 34. Espectro na região do infravermelho para GATX-SR em pastilha de KBr.

A Figura 35 apresenta o espectro de absorção na região do infravermelho para

GATX-comp.

Figura 35. Espectro na região do infravermelho para GATX-comp. em pastilha de KBr.

5.8. Análise térmica de gatifloxacino

A calorimetria diferencial de varredura (DSC) permite a análise entre o fluxo de calor para

uma amostra e para uma célula referência que são submetidas as condições de temperatura.

A Figura 36 apresenta o DSC de gatifloxacino substância de referência

Figura 36. Curva de DSC de gatifloxacino substância de referência sob atmosfera de

nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C

A Figura 37 apresenta o DSC de gatifloxacino comprimidos

Figura 37. Curva de DSC de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos sob

atmosfera de nitrogênio, em razões de aquecimento de 20o C.

6. DISCUSSÃO

Para a análise de fármacos e medicamentos existem várias metodologias nos

compêndios oficiais, que vão desde a cromatografia líquida de alta eficiência a métodos

titrimétricos. Seguindo as diretrizes de validação de métodos analíticos, foram desenvolvidos

e validados, metodologias analíticas para o gatifloxacino, utilizando espectrofotometria-UV,

cromatografia líquida de alta eficiência, doseamento microbiológico difusão em ágar cilindros

em placa e também foi desenvolvido método titrimétrico para análise de gatifloxacino. Além

disto, foi desenvolvido sistema de cromatografia em camada delgada, para identificação do

gatifloxacino, qualitativamente e semi-quantitativamente, em comprimidos, como também sua

diferenciação perante outras fluorquinolonas. A espectrofotometria de absorção na região de

infravermelho e a análise térmica, foram realizadas com o objetivo de identificar o GATX-SR

e GATX-comp.

A escolha dos métodos analíticos para quantificação de gatifloxacino nesta dissertação

seguiu em acordo com os trabalhos publicados na literatura e as monografias padronizadas

nas farmacopéias para fluorquinolonas, empregando doseamento titrimétrico para

norfloxacino e ofloxacino, e CLAE para ciprofloxacino. O doseamento microbiológico foi

realizado com o objetivo de verificar a potência antimicrobiana do gatifloxacino. Há poucos

estudos na literatura em relação ao desenvolvimento de metodologia analítica para esta

fluorquinolona, e pesquisas envolvendo métodos analíticos são de fundamental importância e

altamente relevantes para otimizar sua análise na indústria farmacêutica e garantir a qualidade

do produto a ser comercializado.

O gatifloxacino é comercializado no Brasil, na forma farmacêutica comprimidos e

solução injetável, com o nome de Tequin®, pelo laboratório Bristol-Myers Squibb. O FDA

aprovou e liberou a comercialização do gatifloxacino em 19 de dezembro de 1999, portanto

esta molécula ainda encontra-se sobre patente, na forma farmacêutica comprimidos e solução

injetável. Recentemente, a indústria Allergan produtos farmacêuticos LTDA, colocou no

mercado farmacêutico brasileiro um colírio, de nome comercial Zymar®, tendo como

substância ativa o gatifloxacino. Este produto farmacêutico foi aprovado pelo FDA em 28 de

março de 2003, e no Brasil, seu registro foi aceito pela ANVISA, em agosto de 2003

(BRASIL, 2003).

Apesar da comprovada eficácia e segurança no seu tratamento, este fármaco, até então,

não possui uma metodologia de análise padronizada em compêndios oficiais. Este fato

justifica novas pesquisas nessa área para desenvolvimento de metodologia analítica para esta

fluorquinolona. Os trabalhos encontrados na literatura envolvendo este fármaco estão

relacionados à quantificação em fluidos biológicos. Um dos primeiros trabalhos determinando

esta substância em fluidos biológicos, foi o de Borner (2000) e colaboradores, utilizando

CLAE em fase reversa, com detecção fluorimétrica. Em 2001, Vishwanathan e

colaboradores, desenvolveram e validaram um método para quantificar gatifloxacino no

plasma humano. Em 2002, Liang e colaboradores analisaram várias fluorquinolonas

simultaneamente em CLAE, utilizando uma fase móvel com vários solventes e detecção

fluorimétrica.

O desenvolvimento de metodologia analítica para fármacos e medicamentos é de

fundamental importância para determinação do teor de substância ativa, possíveis

contaminações, produtos de degradação ou falsificações. Vários órgãos oficiais (ICH, 1994;

ICH, 1996; AOAC, 1997; USP 25, 2002) apresentam as diretrizes para a validação de

métodos analíticos e o registro de novos medicamentos. O planejamento dos estudos de

validação é fundamental para garantir que os resultados obtidos reflitam a operação dos

procedimentos analíticos e que o método forneça informações confiáveis. Foram encontrados

na literatura inúmeros materiais que analisam e discutem sobre as definições e parâmetros

para a validação de métodos analíticos. Em muitos artigos publicados, há controvérsia com os

termos seletividade x especificidade. Uma definição bastante pragmática descreve a

seletividade como uma separação (física) de misturas de substâncias, como, por exemplo,

cromatografia e eletroforese, determinando um analito misturado com outras substâncias. A

determinação individual de uma substância na presença de outras substâncias (sem influência

significativa de outras substâncias ou classes de substâncias) é definido como específico

(RILEY, 1996). Os termos seletividade x especificidade são definições que invariavelmente

são citadas em artigos científicos de forma inadequada. É necessário que os termos utilizados

na validação de métodos analíticos sejam adequadamente utilizados, para evitar erros

sistemáticos.

Nos três métodos analíticos desenvolvidos e validados, bem como o método em meio

não aquoso, verificamos que os mesmos são adequados para análise do gatifloxacino em

comprimidos. Realizando uma análise comparativa dos quatro métodos estudados,

observamos que o teor médio encontrado nos comprimidos em cada método variou de

98,00% a 101%. No método titrimétrico encontramos um valor médio de 100,42%, no

método espectrofotométrico na região UV, o teor foi de 98,32%, em CLAE o resultado

obtido foi 99,83% e a potência microbiológica encontrada foi de 100,29%.

6.1. Desenvolvimento de metodologia analítica por titrimetria em meio não-aquoso

A análise titrimétrica é um método químico quantitativo, relativamente antigo, utilizado

largamente nos compêndios oficiais. Com advento de novos métodos analíticos de controle

de fármacos e medicamentos, e com as apresentações sobre validação de métodos analíticos,

esqueceu-se um pouco desta técnica de análise. Entretanto, a titrimetria em meio não aquoso

é a análise volumétrica mais utilizadas nas monografias farmacopéicas. Esta técnica pode ser

utilizada no doseamento de bases fracas ou de ácidos fracos, sendo o doseamento de bases

fracas com ácido perclórico em ácido acético o mais usado. Este agente titulante compete

menos com a substância a ser analisada pela doação ou recepção dos prótons (WATSON,

1999). Nas monografias oficiais de algumas fluorquinolonas, são preconizados métodos

titrimétricos para sua análise. A Farmacopéia Americana (USP 25, 2002) recomenda para o

doseamento de ofloxacino e norfloxacino titulação potenciométrica, dissolvendo o fármaco

em anidrido acético e titulando com ácido perclórico 0,1 M. Na literatura científica,

encontra-se artigo abordando está técnica para outra fluorquinolona, o esparfloxacino

(MARONA e SCHAPOVAL, 2001b).

O gatifloxacino demonstra caráter de dissociação protônica no grupo carboxílico do

carbono 3 e na metilpiperazinila do carbono 7. A reação entre gatifloxacino e o meio não

aquoso com ácido acético glacial é uma reação ácido-base, em que o ácido forte pode doar

um próton ao nitrogênio do anel piperazínico. Desta forma, foi possível realizar este

procedimento, o qual apresentou, desvio padrão e coeficiente de variação no método

titrimétrico desenvolvido menor que 1%, demonstrando que o método possui uma boa

repetibilidade. O teste de recuperação demonstrou que a titulação em meio não aquoso é

exata, tendo um valor absoluto de 99,4%.

O teor médio de gatifloxacino encontrado nos comprimidos foi de 100,42%, em que

verificamos, que os excipientes não interferiam na análise da substância ativa. A linearidade

do gatifloxacino no método titrimétrico não foi realizada, por falta de substância de referência

disponível para a realização da curva padrão. Precisaríamos de pelo menos 4,0 g de

GATX-SR para construir a curva padrão. Devido a esta limitação, não foi possível validar

este método de acordo com as diretrizes de validação estabelecidas. Entretanto, a partir dos

dados obtidos nesta dissertação, como precisão, exatidão e teor de comprimidos,

encaminhamos diretrizes para a validação de gatifloxacino pelo método titrimétrico. A

titulometria é um método econômico, que não precisa de mão de obra especializada e o

tempo para análise é relativamente curto. Tais características são importantes para o controle

de qualidade em farmácias magistrais, preconizado recentemente pela RDC 33 (BRASIL,

2001) que normaliza que estes estabelecimentos realizem controle de qualidade para as

matérias-primas e produto acabado. A titulometria é um método que pode ser facilmente

aplicável a uma farmácia magistral, pois utiliza materiais e vidrarias de simples manipulação e

técnica de análise reduzida. No método desenvolvido, não utilizamos solventes orgânicos

tóxicos, facilitando assim, a aplicação deste método em farmácias magistrais. Uma maneira de

melhorar o método e torná-lo mais especifico ou seletivo, é acoplar um potenciômetro no

erlenmeyer para verificar o ponto de equivalência com maior especificidade para a substância

doseada.

6.2. Desenvolvimento e validação de metodologia analítica em espectrofotometria UV

A espectrofotometria é um método largamente utilizado para determinação de vários

compostos orgânicos (HARGIS et al., 1996). A literatura registra alguns trabalhos utilizando

a espectrofotometria no ultravioleta para análise fluorquinolonas (CARLUCCI et al., 1993;

CAZALLAS et al., 1994; MARONA e SCHAPOVAL, 1999) e a Farmacopéia Americana

(USP 25, 2002) recomenda para análise de cinoxacino cápsulas, a espectrofotometria no UV,

utilizando solução de borato de sódio. Com o conhecimento da estrutura química de

gatifloxacino (Figura 9) e verificando que esta molécula possuía ligações que absorvem luz,

desenvolvemos um método analítico na região UV para este fármaco. Para desenvolver o

método na região UV, primeiramente, verificamos a solubilidade do GATX-SR em água e

etanol, verificando-se que a molécula era solúvel nos dois solventes. Procurando um método

simples, e a utilização de solventes de baixa toxicidade, optamos pela água, por ser um

solvente atóxico e de fácil acesso. O método desenvolvido e validado para gatifloxacino

demonstrou linearidade, precisão e exatidão. O espectro de absorção para gatifloxacino

mostrou um pico de absorção máxima a 287 nm, utilizando solução aquosa de GATX-SR em

concentração de 24 μg/mL. Com o objetivo de verificar-se a faixa de concentração que a

solução de GATX-SR era linear, foi realizada a construção da curva de Ringbom. De acordo

com a lei de Lambert-Beer, o intervalo de concentração de 4,0 - 14,0 μg/mL, mostrou-se

linear, apresentando coeficiente de correlação de 0,9998, entre as concentrações estabelecidas

e as absorções lidas. A equação da reta,obtida porregressão linear através do método dos

mínimos quadrados, foi y = 0,077x + 0,0092 .

A exatidão do método foi verificada pelo teste de recuperação (AOAC, 1997), em que

obtivemos uma recuperação média do GATX-SR de 98,60%. Com este resultado,

comprovamos a exatidão do método proposto, que é um dos requisitos obrigatórios na

validação de métodos analíticos. A precisão do método foi obtida utilizando 6 determinações

de comprimidos de GATX. O coeficiente de variação foi de 0,83 %, demonstrando a precisão

do método com os valores das amostras.

A análise estatística dos resultados das absorvâncias obtidas foi matematicamente

verificada pela análise de variância. Os resultados obtidos, com F significativo para o desvio

de linearidade e regressão, valida o método na região do UV para o gatifloxacino. O teor de

gatifloxacino nos comprimidos foi 98,32%, demonstrando a sensibilidade do método para

quantificar a substância ativa nos comprimidos, não ocorrendo interferência dos excipientes

na absorção do gatifloxacino. O teste de recuperação permite, além da determinação da

exatidão do método, verificar a interferência dos componentes da formulação quando não é

possível omiti-los da formulação.

6.5. Cromatografia líquida de alta eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência é um método analítico, que nos últimos anos

domina as técnicas de análise e determinação de medicamentos, alimentos, ensaios biológicos,

entre outros. A Farmacopéia Americana (USP 25, 2002), dedica a esta técnica, a análise da

maior parte de produtos com monografias neste compêndio. Atualmente, prioriza-se a análise

de produtos farmacêuticos por CLAE, devido a especificidade e seletividade relacionadas à

utilização desta técnica.

Uma das limitações da utilização de CLAE, é o alto custo da análise de um

medicamento por este método, que emprega solventes orgânicos de alta pureza admitidos

para uso e padrões de referências. Entretanto, este método analítico é mais específico, pois

possui coluna de separação que determina o composto analisado, originando uma

identificação mais específica. O método analítico desenvolvido por CLAE, teve como

referência a tese de doutorado de Marona (2000), que validou um método por CLAE com

fase móvel simples, sem a utilização de tampão, que torna as análises em CLAE mais

trabalhosas, pois o sais inorgânicos podem danificar o equipamento e a coluna.

A fase móvel utilizada neste trabalho foi ácido acético 5%: metanol: acetonitrila

(70:15:15,V:V:V). Utilizamos uma fase móvel já conhecida, verificando o tempo de retenção

do gatifloxacino para este sistema solvente, com a coluna de fase reversa. O tempo de

retenção obtido, foi de 5,0 minutos, facilitando o doseamento, pois o tempo gasto para

análise é curto. Em relação à outra fluorquinolona, esparfloxacino, em que foi utilizada a

mesma fase móvel, com coluna de fase reversa, observamos um tempo de retenção de 7,23

minutos, diferindo do GATX, que foi 5,02 minutos. A utilização de ácido acético na fase

móvel, como dito anteriormente, mantém esta substância na forma não dissociada ,

facilitando a eluição de gatifloxacino na fase móvel.

Observamos que este método possui linearidade, precisão, exatidão e especificidade.

Para determinar a linearidade do método foram injetadas soluções entre 4,0 e14,0 µg/mL,

apresentando coeficiente de correlação de 0,9995. A precisão do método foi demonstrado

pelo coeficiente de variação médio de 1,05% entre as amostras do gatifloxacino analisadas. O

estudo de recuperação demonstrou a exatidão do método.

O teor médio encontrado nas amostras analisadas em CLAE, foi de 99, 83%. Os

resultados obtidos demonstraram que este método é adequado para análise de gatifloxacino

em comprimidos e pode ser empregado em análises de rotina em laboratório de controle de

qualidade.

6.3. Doseamento de gatifloxacino de difusão em ágar cilindros em placa

O doseamento microbiológico por difusão em ágar, cilindros em placa, é um método

específico para antibióticos, antimicrobianos e antifúngicos. O ensaio microbiológico vem

sendo utilizado em laboratórios clínicos desde a introdução de antibióticos e outros agentes

antimicrobianos. Na terapêutica, muitos métodos de ensaio foram elaborados pela própria

indústria farmacêutica para controle das preparações comerciais (ANDREWS, 1999).

Embora os métodos microbiológicos demonstrem um desempenho relativamente simples

muitos aspectos devem ser considerados no seu desenvolvimento, para assegurar que eles

sejam suficientemente seguros e exatos. Tais métodos necessitam de mão de obra

especializada e técnica apurada. Deve-se observar vários aspectos durante o desenvolvimento

do método, como temperatura de incubação, espessura do ágar, microrganismo utilizado, pH

da solução diluente, entre outras características para garantir que o método desenvolvido

demonstre uma resposta eficiente. Na literatura, encontramos alguns artigos que relatam o

doseamento de difusão em ágar cilindros em placa, utilizando diferentes classes de

antibióticos e antimicrobianos como gentamicina (RATCLIFF et al., 1981; DELANEY et al.,

1982), cefalosporinas (BIEDENBACH et al., 1993), esparfloxacino (MARONA e

SCHAPOVAL, 1998), azitromicina (BREIER et al., 2002) e ofloxacino (EV e

SCHAPOVAL, 2002).

Para desenvolvermos e validarmos o método, iniciamos realizando alguns testes no

doseamento microbiológico, utilizando vários parâmetros, como por exemplo, diferentes

cepas bacterianas. As bactérias selecionadas para padronização do método foram,

Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922 e Bacillus subtilis ATCC

9372. As três cepas responderam adequadamente ao método, no entanto, pelo fato do

Staphylococcus aureus ATCC 6538 ser uma cepa de alta virulência para o ser humano,

decidimos utilizá-la caso as outras cepas não respondessem adequadamente, quando os

outros parâmetros fossem analisados.

A espécie bacteriana Escherichia coli ATCC 25922 foi analisada utilizando vários

parâmetros, mas a resposta do crescimento microbiano foi irregular. Posteriormente

utilizamos o Bacillus subtilis ATCC 9372, que obteve um crescimento satisfatório e

uniforme. As concentrações utilizadas no desenvolvimento e validação do método foram

estipuladas, de acordo com a facilidade de diluição das soluções.

A solução tampão escolhida foi em pH 6,0, pois quando preparávamos soluções com

tampão pH 8,0 os halos de inibição do antimicrobiano interpolavam-se e com isso invalidava

o método microbiológico. Isso ocorria, provavelmente devido ao caráter básico do

gatifloxacino, que em pH 8,0, potencializava seu efeito. O doseamento em difusão em ágar

cilindros em placa desenvolvido e validado para gatifloxacino demonstrou ser um método

preciso, exato, linear e sensível. Para assegurar a validade do ensaio microbiológico na

determinação da potência de gatifloxacino, foram utilizadas três concentrações diferentes

para amostra, idênticas às da substância de referência, em delineamento 3 x 3. Estas doses

estão em progressão geométrica (razão 2,0) já que o sistema utilizado possui relação linear

entre o logaritmo da concentração da substância analisada e o diâmetro dos halos de inibição.

Em cada ensaio foram utilizadas seis placas, efetuando-se a leitura dos halos de inibição. Com

os resultados obtidos foi construída a curva de calibração para GATX-SR, calculando-se o

erro padrão da média (Tabela 39) e o coeficiente de correlação (r2 = 0,9992).

A potência dos comprimidos foi calculada pela equação de HEWITT (HEWITT,

1977), em que os resultados obtidos foram excelentes para analisar o teor de gatifloxacino em

comprimidos, obtendo-se um coeficiente de variação de 1,12%. O teste de recuperação foi

efetuado com o objetivo de comprovar a exatidão do método proposto. Desta forma,

quantidades conhecidas da substância de referência foram adicionadas nas soluções de

gatifloxacino comprimidos, para quantificação da substância. Os resultados obtidos

demonstraram que o método desenvolvido apresenta exatidão, precisão e linearidade. O

ensaio foi validado, através de análise estatística, utilizando análise de variância, descrita na

Farmacopéia Brasileira, 1988.

6.4. Cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada foi empregada com o objetivo de identificar e

semi-quantificar o gatifloxacino, nos comprimidos, e distinguir o gatifloxacino, perante outras

fluorquinolonas, em vários sistemas solventes analisados. O gatifloxacino apresenta, na luz

UV, uma mancha bem característica, verde fluorescente, facilmente identificável

separadamente, ou com, as outras fluorquinolonas utilizadas neste ensaio. A maioria dos

sistemas solventes testados foram adequados para identificar e semi-quantificar o

gatifloxacino em comprimidos, com exceção de diclorometano: metanol: hidróxido de

amônio: acetonitrila (6:4:1:2,V:V:V:V) com Rf = 0,20 e n-butanol: ácido acético e água

(40:10:50, V:V:V) com Rf = 0,22.

O gatifloxacino é uma molécula altamente ionizável. Segundo Marona (2000), o

esparfloxacino, uma fluorquinolona com estrutura química semelhante ao GATX, possui dois

grupamentos na molécula ionizáveis com pKa= 6,27 e pKa = 8,80. O gatifloxacino possui

esses dois grupamentos, 3-carboxílico e 7-metil-piperazínico, que semelhantes ao

esparfloxacino também se dissociam. Quando se adiciona um composto básico na fase móvel,

o equilíbrio da dissociação tende a favorecer a maior formação do grupamento 3-carboxílico

ionizável, fazendo com que o fármaco possua maior afinidade pela fase estacionária, sílica, do

que pela fase móvel. Por isso que o Rf neste sistema é tão baixo, diferenciando-se do sistema

com diclorometano, metanol, ácido acético 5 % e acetonitrila. Neste caso a utilização da fase

móvel ácida permitiu que o equilíbrio da dissociação favorecesse a formação da forma H2Q+

.

A polaridade elevada do sistema de solvente que utiliza butanol, ácido acético e água, a

baixa solubilidade de butanol em água, a viscosidade do butanol e a migração lenta da fase

móvel tornam este sistema de solvente inadequado.

Em relação aos sistemas contendo diclorometano, metanol, acetonitrila e ácido acético

5%, diminuímos a polaridade do sistema, adicionando acetonitrila para observarmos a

influência na migração de gatifloxacino. No sistema que possuía uma maior quantidade de

acetonitrila (diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético 5 %; 6:4:4:2; V/V/V/V),

sistema mais polar, o Rf de GATX-SR e GATX-comp. foi mais elevado (Rf = 0,65), do que o

mesmo sistema com quantidade de ACN menor, Rf = 0,55 (6:4:2:2; V/V/V/V), sistema

menos polar.

Em relação aos sistemas contendo clorofórmio, metanol e ácido fórmico, estudamos a

influência do clorofórmio (solvente menos polar) e ácido fórmico na migração de GATX-SR

e GATX-comp. no sistema de solvente testado. No sistema solvente clorofórmio: metanol:

ácido fórmico: água (33:7:3:0,5;V/V/V/V) Rf = 0,70, que contém o dobro de clorofórmio,

em relação ao sistema clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,V/V/V/V) Rf =

0,74, verificamos que o Rf dos dois sistemas não diferiram significativamente, apesar de

termos dobrado o valor do solvente menos polar, clorofórmio. Isto ocorreu provavelmente,

pois a quantidade de água no sistema (solvente mais polar) não diferiu nos dois sistemas.

Agora em relação a quantidade de ácido fórmico adicionada, verificamos uma diferença

significativa nos sistemas solventes analisados,. O sistema clorofórmio: metanol: ácido

fórmico (18:7:1, V/V/V/V), apresentou Rf = 0,50, enquanto que o sistema clorofórmio:

metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5,V/V/V/V), apresentou Rf = 0,74. Em relação ao

ácido fórmico, a diferença da migração deve-se a maior ionização do grupamento

7-metil-piperazínico, fazendo com que o gatifloxacino possua maior afinidade pela fase

móvel, e com isso ocorrendo um maior deslocamento da substância no sistema.

A identificação do gatifloxacino perante outras fluorquinolonas foi realizada com os

mesmos sistemas utilizados para a semi-quantificação do GATX-comp. Os sistemas

inadequados foram diclorometano: metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2) com

Rf = 0,20 e butanol: ácido acético e água (40:10:50) com Rf = 0,22. Apenas o levofloxacino

apresenta uma mancha com a mesma cor do GATX, mas o seu Rf é bem menor em relação

ao Rf de GATX, em todos os sistemas analisados. Nos outros sistemas estudados

verificaram-se que as fluorquinolonas foram adequadamente identificadas.

6.5. Espectro de absorção na região de infravermelho e análise térmica

O espectro de absorção na região IV, para o GATX-SR, identifica uma banda larga a

3500 cm-1, característica de hidroxila na molécula, bem como o espectro de GATX-comp.,

que também possui esta banda. A molécula de gatifloxacino possui um grupamento carboxila

no carbono 3 do anel carboxílico. Os dois espectros na região de IV para as duas substâncias

foram praticamente idênticos, confirmando o propósito desta técnica, que é a identificação da

molécula por comparação com um padrão de referência.

Os espectros de IV de gatifloxacino substância de referência e comprimidos

apresentados na Figura 34 e 35, respectivamente, permitem as seguintes atribuições:

A calorimetria exploratória diferencial (DSC) é uma técnica similar a (DTA),

introduzida em 1963 por Watson e O´neil, diferindo pelo fato de a amostra e a substância de

referência se encontrarem em células (fornos) diferentes e possuírem, também, resistências

distintas.

Atualmente, o recurso da análise térmica no domínio farmacêutico é considerável, não

só para o estudo do polimorfismo, mas também pela sua versatilidade em outras aplicações,

tais como: (a) Estudos de compatibilidade fármaco-fármaco e fármaco-excipiente em

pré-formulações; (b) Estudo de polimorfismo, compostos de inclusão e dispersões sólidas; (c)

Determinação da pureza química; (d) Estudo de reações no estado sólido (estabilidade

térmica e parâmetros cinéticos) e (d) Análise de formas farmacêuticas sólidas. Controle de

qualidade.

Em relação às curvas de DSC para gatifloxacino, a forma hemiidrato se apresenta como

prismas amarelo-pálido provenientes de metanol, em que o ponto de fusão é de 162o C. O

pico endotérmico que caracteriza o gatifloxacino encontra-se a 195 – 200o C. A DSC

permitiu caracterizar a presença de gatifloxacino na forma farmacêutica comprimidos

conforme é observado nas Figuras 36 e 37. Desta forma, a DSC pode ser utilizada nas

monografias de fármacos em determinação da faixa de fusão de substâncias, permitindo a

caracterização quanto a aspectos como pureza e poliformismos (GIRON-FOREST et al.,

1989).

7. CONCLUSÃO

Foi desenvolvido análise titrimétrica em meio não-aquoso utilizando ácido acético glacial

em ácido perclórico 0,1 M. O método de análise titrimétrica é simples, rápido e

econômico e pode ser aplicado para determinação de gatifloxacino em matéria-prima e

comprimidos. O método desenvolvido possui bons resultados, incluindo precisão e

exatidão. Verificou-se que os excipientes no comprimido comercial não interferem no

ensaio.

Foi desenvolvido e validado um método em espectrofotometria UV para gatifloxacino,

utilizando água como solvente. O método demonstrou ser linear, preciso e exato. Os

excipientes do comprimido comercial não interferem no ensaio.

Foi desenvolvido e validado método microbiológico por difusão em ágar cilindros em

placa para gatifloxacino em comprimidos, em que o método mostra-se linear, preciso e

exato.

Foi desenvolvido e validado método em CLAE, utilizando como fase móvel ácido

acético5%: acetonitrila: metanol (70:15:15,V:V:V), e como fase estacionária coluna de

fase reversa. O método demonstrou ser linear, preciso e exato.

Foram analisados vários sistemas solventes para identificação de gatifloxacino em CCD.

Cinco sistemas analisados demonstraram boa resolução e identificação de gatifloxacino

em CCD, bem como sua distinção perante outras fluorquinolonas. Os sistemas adequados

para análise de gatifloxacino foram:

- Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (16:7:3:0,5) V:V:V:V

- Clorofórmio: metanol: ácido fórmico: água (33:7:3:0,5) V:V:V:V

- Clorofórmio: metanol: ácido fórmico (18:7:1) V:V:V

- Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido acético (6:4:4:2) V:V:V:V

- Diclorometano: metanol: acetonitrila: ácido ácético (6:4:2:2) V:V:V:V

Dois sistemas analisados em CCD para detecção de gatifloxacino e identificação em

presença de outras fluorquinolonas, não foram adequados.

- Diclorometano; metanol: hidróxido de amônio: acetonitrila (6:4:1:2) V:V:V:V

Butanol: ácido acético 5%: água (40:10:50) V:V:V

A espectrofotometria na região do infravermelho foi utilizada para identificar o composto

nos comprimidos.

A análise térmica permitiu determinar a substância na forma farmacêutica e seu ponto de

fusão.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABRAHAM, E. P.; DUTHIE, E. S. Effect of pH of the medium on activity of streptomycin

and penicillin. Lancet, v. 1, p. 455-459, 1946.

ADAMOVICS, J. A.; ESCHBACH, J. C. Planar chromatography. In: ADAMOVICS, J. A.

Chromatographic analysis of pharmaceuticals. 2. ed. New York: Marcel Dekker, 1997.

v.74: Chromatographic science series.

ALEXANDER, C. J.; GOLDSTEIN, E. J. C.; CITRON D. M.; DECHERNEY, A. H.

Review of the comparative in vitro susceptibilities of lower female genital tract pathogens to

older and newer fluoroquinolones. Anaerobe, v.6, p.313-323, 2000.

ALTESOR, C.; DOL, I.; KNOCHEN, M. Aplicación de técnicas estadísticas para la

comprobación dela exactitud en el desarrollo de métodos analíticos farmacéuticos. Acta

Farm. Bonaerense, v.13, n.1, p.49-52, 1994.

ANDREWS, J. M. Microbiological assays. In: REEVES, D. S.; ISE, R.; ANDREWS, J. M.;

HITE, L. O. (Ed). Clinical Antimicrobial Assays. New York, Oxford University Press.

1999. Cap. 4. 35-44p.

AOAC. Association of Official Analytical Chemists. Official Methods of Analysis. 16. ed.

Arlington, 1997. v.1, v. 2.

APPELBAUM, P. C.; HUNTER, P. A. The fluoroquinolone antibacterials: past, present and

future perspectives. Int. J. Antimicrob. Agents, v.16, p.5-15, 2000.

ASAHINA, Y.; ISHIZAKI, T.; SUZUE, S. Recent advances in structure activity

relationships in new quinolones. Prog. Drug. Res., v.38, p.57-106, 1992.

BARTLETT, J. G.; MUNDY, L. M. Community-acquired pneumonia. N. Engl. J. Med.,

v.333, p. 1614-1624, 1995.

BAUERNFEIND, A. Comparison of the antibacterial activities of the quinolones Bay

12-8039, gatifloxacin (AM-1155), trovafloxacin, clinafloxacin, levofloxacin and

ciprofloxacin. J. Antimicrob. Chemother., v.40, p.639-651, 1997.

BERTINO Jr. J.; FISH, D. The safety profile of the fluoroquinolones. Clin. Ther., v.22, n.7,

p. 798-817 , 2000.

BHOWAL, S. K.; DAS, T. K. Spectrophotometric determination of some recently introduced

antibacterial drugs using ferric chloride. Analytical Letters, v. 24, n. 1, p. 25-37, 1991.

BIEDENBACH, D. J.; JONES, R. N.; ERWIN, M. E. Interpretive accuracy of the disk

diffusion method for testing newer orally administered cephalosporins against Morganella

morganii. J. Clin. Microbiol., v.31, n.10, p.2828-2830, 1993.

BLONDEAU, J. M. A review of the comparative in-vitro activities of 12 antimicrobial

agents, with a focus on five new “respiratory quinolones”. J. Antimicrob. Chemother.,

v.43, suppl. B, p.1-11, 1999.

BLONDEAU, J. M.; LASKOWSKI, R.; BJARNASON, J.; STEWART, C. Comparative in

vitro activity of gatifloxacin, grepafloxacin, levofloxacin, moxifloxacin and trovafloxacin

against 4151 gram-negative and gram-positive organisms. Int. J. Antimicrob. Agents, v.14,

p.45-50, 2000.

BORNER, K.; HARTWIG, H.; LODE, H. Determination of gatifloxacin in human serum and

urine by HPLC. Chromatographia, supplement, v.52, p.105-107, 2000.

BRADY, M. S.; KATZ, S. E. Factors influencing optimization of diffusion assays for

antibotics. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 73, n. 2, p. 202-205,1990.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução no 33, que aprova

o regulamento técnico sobre boas práticas de manipulação de medicamentos em farmácias e

seus anexos. 2001.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução no 899, de 29 de

maio de 2003, que apresenta um guia sobre validação de métodos analíticos e bioanalíticos.

Acesso em 10 de novembro de 2003. Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/banco-med.htm.

BREIER, A. R.; GARCIA, C. V.; OPPE, T. P.; STEPPE, M.; SCHAPOVAL, E. E. S.

Microbiological assay for azithromycin in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Biomed.

Anal.,v. 29, p.957-961, 2002.

BRITAIN, H. G. Validação de métodos analíticos não cromatográficos. Pharmaceutical

Technology, junho, p. 4-9, 1998.

CARLUCCI, G.; MAZZEO, P.; FANTOZZI, T. Determination of ofloxacin in

pharmaceutical forms by high-performance liquid chromatography and derivate

UV-spectrophotometry. Anal. Lett., v. 26, n.10, p.2193-2201, 1993.

CARLUCCI, G. Analysis of fluoroquinolone in biological fluids by high-performance liquid

chromatography. J. Chromatogr. A, v.812, p.343-367, 1998.

CAUSON, R. Validation of chromatographic methods in biomedical analysis Viewpoint and

discussion. J. Chromatogr. B, v. 689, p. 175-180, 1997.

http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/banco-med.htm

CAZALLAS, R.; CITORES, M. J.; ETXEBARRIA, N.; FERNANDEZ, L. A.;

MADARIAGA, J. M. SPECA: a program for the calculation of thermodynamic equilibrium

constants from spectrophotometric data. Talanta, v.41, n.10, p. 1637-1644, 1994.

CIOLA, R. Fundamentos da cromatografia a líquido de alto desempenho HPLC. São

Paulo: Edgard Blucher, 1998.

COOPER, K. E.; WOODMAN, D. J. The diffusion of antiseptics through agar gels, with

special reference tothe agar cup assay method of estimating the activity of penicillin. J.

Pathol. Bacteriol., v. 58, p. 75-84, 1946.

COOPER, K. E. The theory of antibiotics inhibition zones. In: KAVANAGH, F., Analytical

Microbiology. New York: Academic Press, 1963, v. 1, p. 1-83.

COYLE, E. A. KAATZ, G. W. RYBAK, M. J. Activities of newer fluoroquinolone against

ciprofloxacin-resistant Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother., v.45,

n.6, p.1654-1659, 2001.

CROFTON, J. Tuberculosis: world perpectives and the challenges ahead. J. Pharm.

Pharmacol., v.49, supplement 1, p.3-6, 1997.

DEAN, R. B.; DIXON, W. J. Simplified statistics for small numbers of observations.

Analytical Chemistry, v.23,p. 636-638, 1951.

DEF. Dicionário de especialidades farmacêuticas. 30. Ed. Produção JBM – jornal brasileiro

de medicina. EPUC – editora de publicações cientificas. Editor: J.M.S. Melo.

DELANEY, C. J.; OPHEIM, K. E.; SMITH, A. L.; PLORDE, J. J. Performance

characteristics of biossay, radioenzymatic assay, homogeneous enzyme imunoassay, and high

performance liquid chromatographic determination of serum gentamicin. Antimicrob.

Agents Chemother.,v.21,n.1, p.19-25, 1982.

DEUTSCHBERGER, J.; KIRSHBAUM, A. Simplified equations for fitting least square lines

to data. Antibiot. Chemother., v. 9, p. 752-754, 1959.

DIEKEMA, D. J.; JONES, R. N.; ROLSTON, K. V. I. Antimicrobial activity of gatifloxacin

comparent seven other compounds tested against gram-positive organisms isolated at 10

cancer-treatment centers. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v. 34, p.37-43, 1999.

DOMAGALA, J. M. Structure-activity and structure-side-effect relationships for the

quinolone antibacterials [review]. J. Antimicrob. Chemother., v.33, p.685-706, 1994.

DONG, Y.; XU, C.; ZHAO, X.; DOMAGALA, J.; DRLICA, K. Fluoroquinolone action

against mycobacteria: effects of C-8 substituents on growth, survival and resistance.

Antimicrob. Agents Chemother., v.42, n.11, p.2978-2984, 1998.

DUNCAN, K. Tuberculosis overview: the current situation. J. Pharm. Pharmacol., v.49,

supplement 1, p.1, 1997.

EDNIE, L. M.; JACOBS, M. R.; APPELBAUM, P. C. Activities of gatifloxacin compared to

those of seven other agents against anaerobic organisms. Antimicrob. Agents Chemother.,

v.42, n.9, p. 2459-2462, 1998.

ERMER, J. Validation in pharmaceutical analysis. Part I. An integrated approach. J. Pharm.

Biomed. Anal., v.24, p.755-767, 2001.

EV, L. S. Estudo da estabilidade do ofloxacino em forma injetável. Porto Alegre:

UFRGS, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, 1997. Tese (Doutorado em

Ciências Farmacêuticas).

FARMACOPÉIA Brasileira. 4 ed. São Paulo: Atheneu, 1988.

FARMACOPÉIA Brasileira. 4.e.d. São Paulo: Atheneu, 2002. Suplemento 3.

FDA. Food and Drug Administration. Washington: Office of the Federal Register National

Archives and Records Administration, 1996.

FDA. Acesso em 17 de outubro de 2003, às 8:30. Disponível em: www.fda.gov em

www.acessdata.fda.gov/scripts/cder/ob/docs/tempai.cfm.

FILE , T. M. Treating CAP caused by penicillin-resistant S. pneumoniae

(community-acquired pneumonia). J. Respir. Dis., v.20, n.12, p.833, 1999.

FRATINI, L. Estudos de métodos físico-químicos e microbiológicos para a análise de

ciprofloxacino. Porto Alegre: UFRGS, Programa de Pós-graduação em Ciências

Farmacêuticas, 1993. Dissertação (Mestrado em Farmácia).

FRATINI, L.; SCHAPOVAL, E. E. S. Ciprofloxacin determination by visible light

spectrophotometry using iron (III) nitrate. Int. J. Pharm., v. 127, p. 279-282, 1996.

FRIED, B.; SHERMA, J. Thin Layer Chromatography: techniques and applications.

3.ed. New York: Marcel Dekker, 1994. v.66, 451p.

http://www.fda.gov/

http://www.acessdata.fda.gov/scripts/cder/ob/docs/tempai.cfm

FRIEDMAN, L.; KRAEMER, E. O. The structure of gelatin gels from studies of diffusion. J.

Am. Chem. Soc., v. 52, n. 4, p. 1295-1304, 1930.

FROEHLICH, P. E.; SCHAPOVAL, E. E. S. Microbiological cilinder-plate assay method of

norfloxacin. Rev. Cienc. Far., v. 12, p.161-165, 1990.

FUKUDA, H.; HORI, S.; HIRAMATSU, K. Antibacterial activity of gatifloxacin (AM-1155,

CG 5501, BMS-206584), a newly developed fluoroquinolone, against sequentially acquired

quinolone-resistant mutants and the norA transformant of Staphylococcus aureus.

Antimicrob. Agents Chemother.,v. 42, n.8, p. 1917-1922, 1998.

FUKUDA, H.; KISHII, R.; TAKEI, M.; HOSAKA, M. Contributions of the 8-methoxy

group of gatifloxacin to resistance selectivity, target preference, and antibacterial activity

against Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother., v.45, n.6, p.

1649-1653, 2001.

FUNG-TOMC, J.; GRADELSKI, E.; HUCZO, E.; MINASSIAN, B.; BONNER, D. P.

Activity of gatifloxacin against strains resistant to ofloxacin and ciprofloxacin and its ability to

select for less susceptible bacterial variants. Int. J. Antimicrob. Agents, v.18, p.77-80,

2001.

GARCÍA, M. L; GOMEZ, J. L. V.; SANCHO, M. C. G.; ÁLVARES, R. A. S., ZACARÍAS,

F.; AMOR, J. S. Epidemiologia del SIDA y la tuberculosis. Bol. Oficina Sanit. Panam.,

v.116, n.6, p.546-562, 1994.

GAVIN, J. J. Analytical microbiology I. The diffusion methods. Appl. Microbiol., v. 4, p.

2323-2331,1956.

GEISS, F. Stand der reproduzierbarkeitin der diinnschicht chromatographie. J.

Chromatogr., v. 33,p.9-24,1968.

GIRON-FOREST, D.; GOLDBRONN, C. H.; PIECHON, P. Thermal analysis methods for

pharmacopeial materials. J. Pharm. Biomed. Anal., v.7, n.12, p.1421-1433, 1989.

GOLDSTEIN, E. J. C. Norfloxacin, a fluoroquinolone antibacterial agent: classification,

mechanism of action, and in vitro activity. Am. J. Med., v.82, n.6B, p.3-17, 1987.

GORDON, J. J.; KAUFFMAN, C. A. Superinfection with Streptococcus pneumoniae during

therapy with ciprofloxacin. Am. J. Med., v.89, p.383-384, 1990.

GRASELA, D. M. Clinical pharmacology of gatifloxacin, a new fluoroquinolone. Clin.

Infect. Dis., v.31, suppl. 2, p.51-58, 2000.

HANCOCK, W. S.; SPARROW, J. T. HPLC analysis of biological compounds. New york:

ed. Marcel Dekker. Chromatographic Science series, 1984. v.26.

HARRIS, D. A. Use of microorganisms as analytical tools. Anal. Chem., v. 27,

p.1690-1694, 1955.

HARRIS, D. C. Análise química quantitativa. 5. ed. Rio de Janeiro: LTC- livros técnicos e

científicos, 2001. Cap. 19. 435-459 p.

HECHT, D. W.; VEDANTAM, G.; OSMOLSKI, J. R. Antibiotic resistance among

anaerobes: What does it mean? Anaerobe, v.5, p.421-429, 1999.

HEYDEN, Y. V.; NIJHUIS, A.; SMEYERS-VERBEKE, J.; VANDEGINSTE, B. G. M.;

MASSART, D. L. Guidance for robustness/ruggedness tests in method validation. J. Pharm.

Biomed. Anal., v.24, p.723-753, 2001.

HEWITT, W. Microbiological assay. New York: Academic Press, 1977.

HOBAN, D. J.; DOERN, G. V.; FLUIT, A. C.; ROUSSEL-DELVALLEZ, M.; JONES, R.

N. Worldwide prevalence of antimicrobial resistance in Streptococcus pneumonia,

Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis in the SENTRY Antimicrobial

Surveillance Program, 1997-1999. Clin. Infect. Dis., v.32, n.10, suppl. 2, p. 81-93, 2001.

HOELLMAN, D. B.; LIN, G.; JACOBS, M. R.; APPELBAUM, P. C. Anti-pneumococcal

activity of gatifloxacin compared with other quinolone and non-quinolone agents. J.

Antimicrob. Chemother., v.43, p.645-649, 1999.

HONEYBOURNE, D. Community-acquired pneumonia in ambulatory patients: relative

importance of atypical pathogens. Int. J. Antimicrob. Agents, v.18, suppl. 1, p.57-61, 2001.

HOSAKA, M.; YASUE, T.; FUKUDA, H.; TOMIZAWA, H.; AOYAMA, H.; HIRAI, K. In

vitro and in vivo antibacterial activities of AM-1155, a new 6-fluoro-8-methoxy quinolone.

Antimicrob. Agents Chemother., v.36, p.2108-2117, 1992.

HUMPHREY, J. H.; LIGHTBOWN, J. W. A general theory for plate assay of antibiotics

with same practical applications. J. Gen. Microbiol., v. 7, n. 1-2, p. 129-143, 1952.

ICH (INTERNATIONAL CONFERENCE ON THE HARMONIZATION OFTECHNICAL

REQUIREMENTS FOR THE REGISTRATION OF PHARMACEUTICALS FOR

HUMAN USE Q2A): Validation of Analytical Methods (Definitions and Terminology).

Outubro, 1994.

ICH: Q2B Analytical Validation-Methodology. November, 1996.

ISSA, Y. M.; ABDEL-GAWAD, F. M.; ABOU TABLE, M. A.; HUSSEIN, H. M.

Spectrophotometric determination ofloxacin and lomefloxacin hydrochloride ith

somesulphonphthalein dyes. Analytical Letters, v. 30, n.11, p. 2071-2084, 1997.

JONES, R. N.; PFALLER, M. A. Bacterial resistance: a worldwide problem. Diagn.

Microbiol. Infect. Dis., v. 31, n.2, p.379-388, 1998.

JONES, R. N.; JOHNSON, D. M.; ERWIN, M. E.; BEACH, M. L.; BIEDENBACH, D. J.;

PFALLER, M. A. Comparative antimicrobial activity of gatifloxacin tested against

Streptococcus spp. including quality control guidelines and E-test method validation. Quality

Control Study Group. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v.34, n.2, p.91-8, 1999.

JONES, R. N.; BIEDENBACH, D. J.; ERWIN, M. E.; BEACH, M. L.; PFALLER, M. A.

Activity of gatifloxacin against Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis, including

susceptiblility test development, E-test comparisons, and quality control guidelines for H.

influenzae. J. Clin. Microbiol, v.37, n.6, p. 1999-2002, 1999.

KAPETANOVIC, V.; MILOVANOVIC, L. J.; ERCEG, M. Spectrophotometric and

polarographic investigation of the ofloxacin-Cu (II) complexes. Talanta, v.43, p.2123-2130,

1996.

KAVANAGH, F. Microbiological equations diffusion assay. I. Microbiological diffusion

Cooper equation. J. Pharm. Sci, v.63, n. 9, p. 1459-1463, 1974.

KAVANAGH, F.; RAGHEB, H. S. Microbiological assays for antibiotics and vitamins:

Considerations for assuring accuracy. J. Assoc. Off. Anal. Chem., v. 62, n. 4, p. 943-950,

1979.

KENYON, A. S.; FLINN, P. E.; LAYLOFF, T. P. Rapid screening of pharmaceuticals by

thin-layer chromatography: Analysis of essential drugs by visual methods. J. AOAC Int.,

v.78, n.4, p.1109-1111 1995.

KOCH, D. D.; KISSINGER, P. T. J. Chromatogr., v.164, n.441, 1979.

KOGA, H.; ITO, H. A.; MURAYAMA, S.; SUZUE, S.; IRIKUBA, T. Structure-activity

relationships of antibacterial 6,7 and 7,8-disubstituted

1-alkyl-1,4-dihydro-4-oxoquinoline-3-carboxylic acids. J. Med. Chem., v.23, p.1358-63,

1980.

LESHER, G. Y.; FROELICH, E. J.; GRUTT, M. D. 1,8-naphtyridine derivates. A new class

of chemotherapeutics agents. J. Med. Pharm. Chem., v.5, p.1063-1072, 1962.

LIANG, H.; KAYS, M. B.; SOWINSKI, K. M. Separation of levofloxacin, ciprofloxacin,

gatifloxacin, moxifloxacin, trovafloxacin and cinoxacin by high-performance liquid

chromatography: application to levofloxacin determination in human plasma. J. Chromatogr.

B, v.772, p.53-63, 2002.

LODE, H.; ALLEWETT, M. Role of newer fluoroquinolones in lower respiratory tract

infectious. J. Antimicrob. Chemother., v.49, p.709-712, 2002.

LOO, Y. H.; SKELL, P. S.; THORNBERRY, H. H.; ERLICH, J.; McGUIRE, J. M.;

SAVAGE, G. M.; SYLVESTER, J. C. Assay of streptomycin by the paper-disc plate method.

J. Bacteriol., v.50, p.701-709, 1945.

LU, T.; ZHAO, X.; DRLICA, K. Gatifloxacin activity against quinolone-resistant gyrase:

allele-specific enhancement of bacteriostatic and bactericidal activities by the C-8-methoxy

group. Antimicrob. Agents Chemother., v.43, n.12, p.2969-2974, 1999.

LUTSAR, I.; FRIEDLAND, I. R.; WUBBEL, L.; McCOIG, C. C.; JAFRI, H. S.;

WINSTON, N. G.; GHAFFAR, F.; McCRACKEN Jr, G. H. Pharmacodynamics of

gatifloxacin in cerebrospinal fluid in experimental cephalosporin-resistant pneumococcal

meningitis. Antimicrob. Agents Chemother., v.42, n.10, p.2650-2655, 1998.

LUTSAR, I.; FRIEDLAND, I. R.; JAFRI, H. S.; WUBBEI, L.; WINSTON, N. G.;

GHAFFAR, F.; McCRACKEN Jr, G.H.M. Efficacy of gatifloxacin in experimental

Escherichia coli meningitis. Antimicrob. Agents Chemother., v.43, n.7, p.1805-1807,

1999.

MANDELL, G. L.; PETRI Jr., W.A. Fármacos antimicrobianos. In: HARDMAN, J.G.;

LIMBIRD, L.E.(Ed.). Goodman e Gilman: As bases farmacológicas da terapêutica. 9.

ed. Rio de Janeiro: Mc GrawHill, 1996. cap.44, p.783-6.

MARONA, H. R. N.; SCHAPOVAL, E. E. S. Desarollo de análisis microbiológico para la

determinación de esparfloxacino en polvo y en tabletas de 200 mg. Información

Tecnológica, v.9, p.251-254, 1998.

MARONA, H. R. N.; SCHAPOVAL, E. E. S. Spectrophotometric determination of

sparfloxacin in tablets. J. Antimicrob. Chemother, v.44, p.136-137, 1999.

MARONA, H. R. N.; SCHAPOVAL, E. E. S. A high-performance liquid chromatographic

assay for sparfloxacin. J. Pharm. Biomed. Analysis, v.20, p.413-417, 1999.

MARONA, Hérida Regina Nunes. Esparfloxacino: estudo químico-farmacêutico e

caracterização de mutantes resistentes. Faculdade de Farmácia. Programa de

Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. Porto Alegre, UFRGS, 2000. Tese (Doutorado).

MARONA, H. R. N.; SCHAPOVAL, E. E. S. Development and validation of a nonaqueous

titration with perchloric acid to determine sparfloxacin in tablets. Eur. J. Pharm.

Biopharm., v.52, p.227-229, 2001.

MARONA, H. R. N.; SCHAPOVAL, E. E. S. Spectrophotometric determination of

sparfloxacin in pharmaceutical formulations using bromothymol blue. J. Pharm. Biomed.

Anaysis, v.26, p.501-504, 2001.

MARRIE, T. J.; PEELING, R. W.; FINE, M. J.; SINGER, D. E.; COLEY, C. M.;

KAPOOR, W. N. Ambulatory patients with community-acquired pneumonia: The frequency

of atypical agents and clinical course. Am. J. Med., v.101, n.5, p.508-515, 1996.

MARUTANI, K.; MATSUMOTO, M.; OTABE, Y.; NAGAMUTA, M.; TANAKA, K.;

MIYOSHI, A.; HASEGAWA, T.; NAGANO, H.; MATSUBARA, S.; KAMIDE, R.

Reduced phototoxicity of a fluoroquinolone antibacterial agent with a methoxy group at the

8-position in mice irradiated with long-wavelength UV light. Antimicrob. Agents

Chemother., v.37, n.10, p.2217-2223, 1993.

MATSUMOTO, M.; KOJIMA, K.; NAGANO, H.; MATSUBARA, S.; YOKOTA, T.

Photostability and biological activity of fluoroquinolones substituted at the 8 position after

UV irradiation. Antimicrob. Agents Chemother., v.36, n.8, p.1715-1719, 1992.

MERCK INDEX. 31. ed. 2001.

MOSS, P. J.; FINCH, R. G. The next generation: fluoroquinolones in the management of

acute lower respiratory infection in adults. Thorax, v.55, n.1, p.83-85, 2000.

MOSTAFA, S.; EL-SADEK, M.; ALLA, E. A. Spectrophotometric determination of

enrofloxacin and pefloxacin through ion-pair complex formation. J. Pharm. biomed.

Analysis, v. 28, p.173-180, 2002.

MUNDY, L. M.; AUWAERTER, P. G.; OLDACH, D.; WARNER, M. L.; BURTON, A.;

VANCE, E.; GAYDOS, C. A.; JOSEPH, J. M.; GOPALAN, R.; MOORE, R. D.

Community-acquired pneumonia: impact of immune status. Am. J. Respir. Crit. Care Med.,

v.152, n.4, p.1309-1315, 1995.

NABER, C. K.; STEGHAFNER, M. A.; KINZIG-SCHIPPERS, M.; SAUBER, C.;

SÖRGEL, F.; STAHLBERG, H. J.; NABER, K. G. Concentrations of gatifloxacin in plasma

and urine and penetration into prostatic and seminal fluid, ejaculate, and sperm cells after

single oral administrations of 400 milligrams to volunteers. Antimicrob. Agents

Chemother., v.45, n.1, p.293-297, 2001.

NAGARALLI, B. S.; SEETHARAMAPPA, J.; MELWANKI, M. B. Sensitive

spectrophotometric methods for the determination of amoxycilin, ciprofloxacin and piroxicam

in pure and pharmaceutical formulations. J. Pharm. Biomed. Analysis, v. 29, p. 859-864,

2002.

NAKASHIMA, M. UEMATSU, T.; KOSUGE, K.; KUSAJIMA, H.; OOIE, T.; MASUDA,

Y.; ISHIDA, R.; UCHIDA, H. Single- and-multiple-dose pharmacokinetics of AM-1155, a

new 6-fluoro-8-methoxy quinolone, in humans. Antimicrob. Agents Chemother., v.39,

n.12, p.2635-2640, 1995.

NETZ, P. A.; ORTEGA, G. G. Fundamentos de físico-química: uma abordagem

conceitual para as ciências farmacêuticas. Porto Alegre: Artmed Editora, 2002.

OCAÑA, J. A.; BARRAGÁN, F. J.; CALLEJÓN, M. Spectrofluorimetric determination of

moxifloxacin in tablets, human urine and serum. Analyst, v. 125, p. 2322-2325, 2000.

ODOU, M. F.; SINGER, E.; DUBREUIL, L. Description of complex forms of a porin in

bacteroides fragilis and possible implication of this protein in antibiotic resistance. Anaerobe,

v.7, n.4, p.219-225, 2001.

ODLAND, B. A.; JONES, R. N.; VERHOEF, J.; FLUIT, A.; BEACH, M. L. Antimicrobial

activity of gatifloxacin (AM-1155, CG-5501), and four other fluoroquinolones tested against

2,284 recent clinical strains of Streptococcus pneumoniae from Europe, Latin America,

Canada, and the United States. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., v.34, p.315-320, 1999.

PEREIRA, O. A. Substâncias Farmacêuticas Comerciais. 2 ed. Rio de Janeiro, ABIQUIF,

2002.

PERSSON, B-A.; VESSMAN, J. The use of selectivity in analytical chemistry- some

considerations. Trends in Analytical Chemistry, v.20, n.10, p.526-532, 2001.

PESTANA, A. C. N. R.; OLIVEIRA, A. A. P.; COSTA, J. E.; NICOLI, J. R.; CARVALHO,

M. A. R.; FARIAS, L. M. Susceptibility to antimicrobial agents in Fusobacterium strains

isolated from healthy humans and patients with periodontal disease in Brazil. Anaerobe, v.5,

p.473-475, 1999.

POOLE, C. F.; DIAS, N. C. Practitioner´s guide to method development in thin-layer

chromatography. J. Chromatogr. A, v. 892, p. 123-142, 2000.

RATCLIFF, R. M.; MIRELLI, C.; MORAN, E.; O´LEARY, D.; WHITE, R. Comparison of

five methods for the assay of serum gentamicin. Antimicrob. Agents Chemother., v.19, n.4,

p. 508-512, 1981.

REILLY, H. C.; SOBERS, H. O. The use of plain agar as a base large in the paper disk

assay. Antibiot Chemoter., v.2, n.9, p.469-471, 1952.

RENGER, B. Quantitative planar chromatography as a tool in pharmaceutical analysis. J.

AOAC Int., v. 76, n.1, p.7-13, 1993.

RILEY, C. M. Statistical parameters and analytical figures of merit. In: RILEY, C. M.;

ROSANSKE, T. Development and validation of analytical methods. England: British

library cataloguing, 1996.

ROSEN, J. E.; CHEN, D.; PRAHALAD, A. K.; SPRATT, T. E.; SCHLUTTER, S. G.;

WILLIAMS, G. M. A fluoroquinolone antibiotic with a methoxy group at the 8 position,

yields reduced generation of 8-oxo-7,8-dihydro 2-deoxyguanosine after ultraviolet-A

irradiation. Toxicol. Appl. Pharmacol., v.145, p.381-387, 1997.

RUIZ, M.; EWIG, S.; MARCOS, M. A.; MARTINEZ, J. A.; ARANCIBIA, F.; MENSA, J.;

TORRES, A. Etiology of community-acquired pneumonia: impact of age, comorbidity and

severity. Am. J. Respir. Crit. Care Med., v.160, n. 2, p. 397-405, 1999.

SCHAUMANN, R.; ACKERMANN, G.; PLESS, B.; CLAROS, M. C.; RODLOFF, A. C. In

vitro activities of gatifloxacin, two other quinolones, and five nonquinolone antimicrobials

against obligately anaerobic bacteria. Antimicrob. Agents Chemother., v.43, n.11, p.

2783-2786, 1999.

SHINNICK, T. M.; KING, C. H.; QUINN, F. D. Molecular-biology, virulence, and

pathogenicity of mycobacteria. Am. J. Med. Sci., v.309, n.2, p.92-98, 1995.

SILVERSTEIN, R. M.; BASSLER, G. C.; MORRILL, T. C. Identificação espectrométrica

de compostos orgânicos. 5 ed. Rio de Janeiro: Editora LTC- Livros Técnicos e Científicos ,

1994.

SINDELAR, G.; ZHAO, X.; LIEW, A.; DONG, Y.; LU, T.; ZHOU, J.; DOMAGALA, J.;

DRLICA, K. Mutant prevention concentration as a measure of fluoroquinolone potency

against mycobacteria. Antimicrob. Agents Chemother., v.44, n.12, p.3337-3343, 2000.

SOUZA, F. M. B. Métodos físico-químicos e microbiológico para controle de qualidade

e estudo da estabilidade da pefloxacina. Porto Alegre: UFRGS, Programa de

Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, 1995. Dissertação (Mestrado em Farmácia).

SOUZA, M. J.; BITTENCOURT, C. F.; MORSCH, L. M. LC determination of enrofloxacin.

J. Pharm. Biomed. Analysis, v.28, p.1195-1199, 2002.

STANLY, P. G. The agar diffusion of insoluble antibacterial substances. Antibiot.

Chemother.,v.2, n.9, p. 467-471,1952.

SULIMAN, F. E. O.; SULTAN, S. M. Sequential injection technique employed for

stoichiometric studies, optimization and quantitative determination of some fluoroquinolone

antibiotics complexed with iron (III) in sulfuric acid media. Talanta, v. 43, p. 559-568, 1996.

SWARTZ, M. E.; KRULL, I. S. Validação de métodos cromatográficos. Pharmaceutical

Technology, junho, p. 12-19, 1998.

TAYLOR, J. K. Validation of analytical methods. Analytical Chemistry, v.55, n.6, 1983.

THORNSBERRY, C.; SAHM, D. F.; KELLY, L. J.; CRITCHLEY, I. A.; JONES, M. E.;

EVANGELISTA, A. T.; KARLOWSKY, J. A. Regional trends in antimicrobial resistance

among clinical isolates of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella

catarrhalis in the United States. (Supplement Article). Clin. Infect. Dis., v.34, n.5, p.S4 -13,

2002.

TOMIOKA, H.; SATO, K.; AKAKI, T.; KATIJANI, H.; KAWAHARA, S.; SAKATANI, M.

Comparative In Vitro Antimicrobial Activities of the Newly Synthesized Quinolone

HSR-903, Sitafloxacin (DU-6859a), Gatifloxacin (AM-1155), and Levofloxacin against

Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium Complex. Antimicrob. Agents

Chemother., v.43, n.12, p.3001-3004, 1999.

TOMIZAWA, H.; TATEDA, K.; MIYAZAKI, S.; YAMAGUCHI, K. Antibacterial activity

of AM-1155 against penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae. J. Antimicrob.

Chemother., v.41, n.1, p.103-106, 1998.

USP 25. The United States Pharmacopeia. Rockville, USP Convention, 2002.

p.2256-2259.

VESSMAN, J. Selectivity or Specificity? Validation of analytical methods from the

perspective of an analytical chemist in the pharmaceutical industry. J. Pharm. Biomed.

Anal., v.14, p.867-869, 1996.

VISHANATHAN, K.; BARTLETT,M. G.; STEWART, J. T. Determination of gatifloxacin

in human plasma by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry. Rapid.

Commun. Mass Spectrom., v. 15, p. 915-919, 2001.

VOGEL. Análise química quantitativa. 5. ed. Rio de Janeiro: LTC- Livros Técnicos e

Científicos, 1992.

WATSON, D. G. Pharmaceutical analysis – A textbook for pharmacy students and

pharmaceutical chemists. Londres: Churchill livingstone, 1999. 337p.

WEXLER, H. M.; MOLITORIS, D.; FINEGOLD, S. M. In vitro activity of gatifloxacin

against 238 strains of anaerobic bacteria. Anaerobe, v.7, p.285-289, 2001.

WHITE, L. O.; TOBIN, C. M.; LOVERING, A. M.; ANDREWS, J. M. The 4-quinolones.

In: REEVES, D. S.; ISE, R.; ANDREWS, J. M.; HITE, L. O. (Ed). Clinical Antimicrobial

Assays. New York, Oxford University Press, 1999. Cap.11. 149-175p.

WISE, R.; BRENWALD, N. P.; ANDREWS, J. M.; BOSWELL, F. The activity of the

methylpiperazinyl fluoroquinolone CG 5501: a comparison with other fluoroquinolones. J.

Antimicrob. Chemother., v.39, p.447-452, 1997.

WOOD, R. How to validate analytical methods. Trends in Analytical Chemistry, v.18, n.

9+10, p. 624-632, 1999.

YAMAMOTO, T.; KUSAJIMA, H.; HOSAKA, M.; FUKUDA, H.; OOMORI, Y.;

SHINODA, H. Uptake and intracellular activity of AM-1155 in phagocytic cells.

Antimicrob. Agents Chemother., v.40, n.12, p.2756-2759, 1996.

YAMAMOTO, T.; TSURUMAKI, Y.; TAKEI, M.; HOSAKA, M.; OOMORI, Y. In vitro

method for prediction of the phototoxic potentials of fluoroquinolones. Toxicol. in vitro,

v.15, p.721-727, 2001.

ZHANNEL, G. G.; WALKTY, A.; VERCAIGNE, L.; KARLOWSKY, J. A.; EMBIL, J.;

GIN, A. The new fluoroquinolone: a critical review. Can. J. Infect. Dis., v.10, p.207-238,

1999.

ZHAO, X.; WANG, J. Y.; XU, C.; DONG, Y.; ZHOU, J.; DOMAGALA, J.; DRLICA, K.

Killing of Staphylococcus aureus by C-8-methoxy fluoroquinolones. Antimicrob. Agents

Chemother., v.42, n.4, p.956-958, 1998.

ZHAO, B. Y.; PINE, R.; DOMAGALA, J.; DRLICA, K. Fluoroquinolone action against

clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis: effects of a C-8 methoxyl group on survival

in liquid media and human macrophages. Antimicrob. Agents Chemother., v.43, n.3, p.

661-666, 1999.

ZOTOU, A.; MILTIADOU, N. Sensitive LC determination of ciprofloxacin in

pharmaceutical preparations and biological fluids with fluorescence detection. J. Pharm.

Biomed. Analysis, v.28, p. 559-568, 2002.

Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )

Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas










http://www.livrosgratis.com.br/cat_1/administracao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_2/agronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_3/arquitetura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_4/artes/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_5/astronomia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_6/biologia_geral/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_8/ciencia_da_computacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_9/ciencia_da_informacao/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_7/ciencia_politica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_10/ciencias_da_saude/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_11/comunicacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_12/conselho_nacional_de_educacao_-_cne/1















http://www.livrosgratis.com.br/cat_13/defesa_civil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_14/direito/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_15/direitos_humanos/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_16/economia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_17/economia_domestica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_18/educacao/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_19/educacao_-_transito/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_20/educacao_fisica/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_21/engenharia_aeroespacial/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_22/farmacia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_23/filosofia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_24/fisica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_25/geociencias/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_26/geografia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_27/historia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_31/linguas/1







Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo

http://www.livrosgratis.com.br/cat_28/literatura/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_30/literatura_de_cordel/1











http://www.livrosgratis.com.br/cat_29/literatura_infantil/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_32/matematica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_33/medicina/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_34/medicina_veterinaria/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_35/meio_ambiente/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_36/meteorologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_45/monografias_e_tcc/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_37/multidisciplinar/1





http://www.livrosgratis.com.br/cat_38/musica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_39/psicologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_40/quimica/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_41/saude_coletiva/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_42/servico_social/1









http://www.livrosgratis.com.br/cat_43/sociologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_44/teologia/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_46/trabalho/1







http://www.livrosgratis.com.br/cat_47/turismo/1







desenvolvimento de mÉtodos analÍticos para a …livros01.livrosgratis.com.br/cp036866.pdf ·...

Documents