controle de qualidade biológico e microbiológico de produtos farmacêuticos e cosméticos teste de...

Controle de Qualidade Biológico e Microbiológico de Produtos Farmacêuticos

e Cosméticos

Teste de Endotoxinas bacterianas

Prof. Fernando Henrique Andrade Nogueira


É considerado um método alternativo ao dos coelhos (USP XX – 1980)

Mais rápido e mais sensível → endotoxina

Teste in vitro – ausência da resposta fisiológica do animal ao pirogênio.

Dúvidas quanto à deteção de pirogênio não oriundo de bactérias Gram (-)


O lisado do amebócito do caranguejo Limulus polyphemus coagula em contato com endotoxinas bacterianas

O sangue do caranguejo é drenado e centrifugado

Os amebócitos são separados e lisados com o uso de solução hipotônica ou métodos mecânicos

O lisado é então estabilizado e liofilizado, sendo estável por 3 anos a 4 oC


Princípio da técnica:

Reação enzimática entre o lisado (LAL) e a endotoxina resultando em coagulação

Temperatura ótima – 37 a 39 oC

pH ótimo – 6,0 a 7,0


Materiais:

Todos os materiais devem ser apirogênicos (30 minutos a 250 oC ou equivalente)

Água reagente para LAL: deve-se utilizar água estéril para injetáveis ou outra que não reaja com o LAL no limite de sensibilidade deste


Os reagentes são disponibilizados em kits

Reagente LAL: padronizado para detectar 0,03; 0,06; 0,125 e 0,25 unidades de endotoxina (UE) por ml

A quantidade de LAL utilizada é fixa (0,1 ml)

Pode ser congelado a -4 oC e utilizado em até 4 semanas


Endotoxina bacteriana: reconstituir com 5 ml de água estéril e apirogênica e agitar em vórtex por 5 minutos. Guardar em 2 a 8 oC por até 4 semanas

São preparadas diluições seriadas do padrão de endotoxina para a determinação da sensibilidade do lisado (LAL) e para comparação no teste propriamente dito.


Amostra: deve ter o pH ajustado para a faixa de 6,0 a 7,5; a menos que citado diferentemente na monografia

Podem ser empregadas soluções apirogênicas e estéreis de NaOH ou HCl 0,1 M ou mais diluídas


Método semi-quantitativoConfirmação da sensibilidade do LAL (antes do

teste)

Sensibilidade do LAL: menor quantidade de endotoxina detectável pelo reagente

Teste realizado em quadruplicata

Controle negativo: água + LAL


Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)

Diluições seriadas do padrão de endotoxina compreendendo 0,25; 0,5; 1 e 2 vezes a sensibilidade rotulada (λ) do lisado

Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Concentrações de endotoxina: 0,03; 0,06; 0,12 e

0,24 UE/ml



Incubar por 1 hora a 37 oC

Reação positiva: gel firme mesmo quando invertido a 180º

Reação negativa: não forma gel firme ou forma gel viscoso que não mantém a integridade quando invertido



Ponto final – maior diluição da endotoxina que apresenta resultado positivo

Sensibilidade do lisado = antilogaritmo da média dos 4 pontos finais convertidos em log

Deve estar entre 0,5 e 2 vezes a sensibilidade rotulada do lisado (λ)



Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml10-1,075 = 0,08 UE/ml; de acordo (0,06 – 0,24)

Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03 Ponto final Log10 do ponto final 1 + + + + 0,06 -1,222 2 + + + 0,12 -0,921 3 + + + + 0,06 -1,222 4 + + + 0,12 -0,921

média = -1,0715


Teste propriamente dito

A quantidade do reagente LAL é a mesma em todos os tubos (0,1 ml)

A endotoxina é diluída em série geométrica que deve compreender a faixa de 0,5 a 2 λ

A amostra é diluída em série até que o ponto final seja alcançado



Soluções preparadas em duplicata (exceto o controle negativo)

Agitar levemente os tubos e incubar a 37 oC por 1 hora. Os tubos não podem sofrer vibração

Reação positiva, negativa e ponto final da mesma maneira que no teste de sensibilidade do lisado



Controle negativo: água + LAL

Controle positivo da amostra: endotoxina + amostra + LAL – verificar a interferência da amostra com a sensibilidade do lisado – 0,5 a 2 λ

Padrão: diluições endotoxina + LAL - 0,5 a 2 λ

Amostra: diluições produto + LAL → UE/ml


Cálculos e interpretação

Sensibilidade do lisado - antilogaritmo da média dos 2 pontos finais convertidos em log

Concentração de endotoxina na amostra: sensibilidade rotulada do lisado multiplicado pela diluição da amostra na última reação positiva

A concentração de endotoxina na amostra deve ser inferior à especificada na monografia individual


Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Controle negativo: água + LAL Controle positivo da amostra:

10-0,921 = 0,12 UE/ml (0,06 – 0,24)

Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03Ponto final

Log10 do ponto

final

1 + + + 0,12 -0,921

2 + + + 0,12 -0,921

média = -0,921


Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Controle positivo – padrão

10-1,072 = 0,08 UE/ml (0,06 – 0,24)

Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03Ponto final

Log10 do ponto

final

1 + + + 0,12 -0,921

2 + + + + 0,06 -1,222

média = -1,072


Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ)= 0,12 UE/ml Amostra: 10-1,054 = 0,088 // 1/0,088 = 11,4

Réplicas 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64Ponto final

Log10 do

ponto final

1 + + + 1/8 = 0,125

-0,903

2 + + + + 1/16 = 0,0625

-1,204

média = -1,054


Cálculo da concentração de endotoxina

Multiplica-se a concentração de endotoxina pela sensibilidade do lisado rotulada (λ)

0,12 x 11,4 = 1,37 UE/ml

Esse valor deve ser inferior ao especificado na monografia individual


Máxima diluição válida (MDV)

A amostra não pode ser diluída indefinidamente. Prejuízo da detecção de endotoxina

Se o limite é expresso em UE/mg ou UE/UI, utilizar a fórmula acima

Se o limite é expresso em UE/ml, basta dividi-lo por λ

lisadodorotuladaadeSensibilid

produtodoãoConcentraçendotoxinadeLimiteMDV


Máxima diluição válida (MDV)

O resultado da diluição da amostra não deve ser maior que a MDV → mais diluído que a MDV

Pode se utilizar reagente LAL de sensibilidade maior, permitindo soluções amostra mais diluídas

lisadodorotuladaadeSensibilid

produtodoãoConcentraçendotoxinadeLimiteMDV


Fatores críticos para o teste utilizando LAL:

Tempo: 60 ± 2 minutos. Temperatura: 37 ± 1 oC (banho-maria ou estufa)

Não expor os tubos a vibrações – resultados falso-negativos

pH: 6,0 a 7,5. Perda de sensibilidade do lisado

Perda de água por evaporação - concentração


Fatores críticos para o teste utilizando LAL:

Concentração adequada de cátions divalentes – já adicionados no reagente LAL

controle de qualidade biológico e microbiológico de produtos farmacêuticos e cosméticos teste de...

Documents