aulas ii - prof flavio - controle de qualidade microbiológico - 2013

7/22/2019 Aulas II - Prof Flavio - Controle de Qualidade Microbiolgico - 2013

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TESTE DE ESTERILIDADE

Mtodos do teste de esterilidade Direto: inoculao direta no meio de cultura

Mtodo mais simples.

Indicado para suturas cirrgicas, algodo e

gaze estril e dispositivos parenterais.

Indireto: mtodo de filtrao em membrana

Utiliza sistema de filtrao.

Indicado para parenterais de maior volume.


Mtodos Indireto Utiliza fluidos de diluio e lavagem.

Utiliza membranas com dimetro de 50 mm e

porosidade 0,45 m (geralmente 0,2 m).

Filtro de nitrato de celulose: indicado para

solues aquosas, oleosas e fracamente

alcolicas. Filtro de acetato de celulose: indicado para

solues fortemente alcolicas.

Filtro de PTFE e PVDF: indicado para produtos

oncolgicos e com solventes agressivos.

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REALIZADO EM CMARA DE FLUXO LAMINAR

Classe I ar horizontal;Classe II ar vertical;

Classe III hermeticamente fechada com luvas acopladas.

Tipo A recicla 70% e expulsa 30% do ar para a sala;Tipo B1 recicla 30% e expulsa 70% do ar para o exterior;

Tipo B2 expulsa 100% do ar;

Tipo B3 recicla 70% e expulsa 30% do ar para o exterior.


Filtros HEPA (High Efficiency

ParticulateAir Filter)

Eficincia de 99,7%

Estrutura fsica projetada

Ligar 30 min antes.

Limpeza do interior

com lcool 70%

Velocidade do ar =

0,35 a 0,55m/s




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EQUIPAMENTOS DE PROTEOEPI macaco, gorro, mscara, luva e

sapatilha

Tcnica de manipulao e descarte



Meios de culturaMeio fluido de tioglicolato

Colorao rsea em 1/3 do tubo

Usado para cultura de bactrias anaerbicas

Temperatura de incubao: 32,5 2,5C

Tempo: 14 dias

Caldo de casena-soja Usado para cultura de bactrias aerbicas,

fungos e leveduras.

Temperatura de incubao: 22,5 2,5C

Tempo: 14 dias



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Teste de adequao dos meios

Teste de esterilidade dos meios (14 dias de

incubao).

Promoo de crescimento (inocular microrganismo

teste).

Padronizao do microrganismo teste (inculo)

No mais que 100 UFC por frasco de meio de

cultura.


Teste para penicilinas e cefalosporinas

Mtodo direto: acrescentar -lactamase nos meios

de cultura.

Mtodo indireto: acrescentar -lactamase nos

fluidos de lavagem.

Controle negativo: sem amostra.

Controle positivo: com microrganismo teste. Teste de validao para bacteriostase e fungistase

Promoo de crescimento com amostra e

microrganismo teste deve ser idntica ao controle

(sem amostra).



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Disponvel em: www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htmVolume 1 item 5.5.3.2.1 Teste de esterilidade

LEITURA RECOMENDADA

Qualquer substncia capaz de induzirelevaes trmicas em animais e humanos,em resposta a injeo ou infeco.

Os pirognios dividem-se em duas classes:

PIROGNIOS

Exgeno

Endgeno



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So aqueles que se originam fora do corpo einduzem elevaes trmicas quando injetados.

Incluem os pirognios de origem microbiana(endotoxinas) e no microbianos, que incluemalguns frmacos, esterides e fraes doplasma.

PIROGNIOS EXGENOS

considerado omediador primrio dafebre.

Tambm chamado depirogniogranuloctico.

PIROGNIO ENDGENO

produzido internamente pelo hospedeiro emresposta ao estmulo de pirognios exgenos.



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As endotoxinas so complexos de alto pesomolecular associados membrana externa debactrias Gram-negativas.

ENDOTOXINAS



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So atribudas diversas atividades biolgicas unidade lipdeo A da endotoxina:

TOXICIDADE LETAL

LEUCOPENIA

NECROSE DA MEDULA SSEA

REABSORO DO OSSO EMBRIONRIO

QUEDA DE PRESSO SANGUNEA

AGREGAO PLAQUETRIA

REATIVIDADE DRMICA AUMENTADA EPINEFRINA

AES BIOLGICAS DAS ENDOTOXINAS



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Os nveis de endotoxinas so cruciais na liberao deprodutos farmacuticos.

InjetveisAcessrios

detransfuso

Dispositivos

implantveis

Terapia

parenteral

CONTROLE DE QUALIDADE

Limites para produtos farmacuticos:

Produtos farmacuticos e biolgicos: 5 UE/Kg

Radiomarcadores: 2,5 UE/Kg

Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL

gua para injeo: 0,25 UE/mL

Drogas intratecais: 0,2 UE/mL Correlatos: 0,5 UE/mL

Correlatos intratecais: 0,06 UE/mL

NVEIS DE ENDOTOXINAS



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MTODOS DE DESPIROGENIZAO

Inativao daendotoxina

Remoo daendotoxina

Um produto estril nem sempre est apirognico. Osmtodos de despirogenizao podem ser de 2 tipos.

MTODOS DE INATIVAO

Hidrlise cido-base

HCl 0,05N 30min 100C ou NaOH 0,25N 1h 50C

Alquilao

xido de etileno

Oxidao Perxido de hidrognio (gua para injeo)

Processo trmico

Calor seco 30min 250C



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MTODOS DE REMOO

Lavagem

Usa gua estril para injeo

Destilao

Indicada para parenterais de grande volume

Ultrafiltrao

Usada em vrios frmacos, incluindo antibiticos.

Osmose reversa Produo de gua estril para injeo

TESTE DE PIROGNIO

Teste

in vivo

Teste

in vitro



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Medida do aumento da temperatura corporal decoelhos aps injeo intravenosa da amostra aser testada.

Coelhos do mesmo sexo, raa, adultos, sadios,pesando 1,5kg no mnimo e com temperaturacorporal 39,8C.

Manter os animais em gaiolas individuais, livre deperturbaes e temperatura ambiente entre 20 e23C.

Usar termmetro calibrado no reto do animal.

TESTE DE PIROGNIO IN VIVO



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Injetar na veia marginal da orelha de 3 coelhosno menos de 0,5mL e nem mais que 10mL/kg.

Registrar a temperatura em intervalos de 30mindurante 3h.

Nenhum dos 3 coelhos deve apresentar aumentode temperatura 0,5C.

Caso apresente, repetir o teste com outros 5animais. Nesse caso, no mximo 3 dos 8 coelhospodem apresentar aumento de temperaturacorporal 0,5C. A soma dos aumentos de todosos coelhos no deve exceder 3,3C.

TESTE DE PIROGNIO IN VIVO

Usado para detectar ou quantificar endotoxinasbacterianas.

Utiliza o extrato aquoso dos amebcitoscirculantes do Limulus polyphemus, caracterizadocomo reagente LAL.

O reagente LAL um extrato aquoso dosamebcitos, que so as clulas sanguneas dahemolinfa azul da espcie de caranguejoferradura, composto de enzimas que reagem empresena de pequenas quantidades deendotoxina.

TESTE DE ENDOTOXINA IN VITRO



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Semi-quantitativo

Baseado na formaode cogulo

Mtodo decoagulao

em gel

Quantitativo

Mtodo turbidimtrico

Mtodo cromognico

Mtodo

fotomtrico

o procedimento mais simples e amplamenteusado para deteco de endotoxinas.

Volumes iguais de reagente LAL e da soluo aser analisada so transferidos a tubos de ensaio.

A mistura homogeneizada incubada em banhode gua a 37oC por uma hora. O ponto final da

reao facilmente verificado pela remoo dostubos e inverso a 180.

A presena do gel que se mantm slido durantea inverso considerada positiva paraendotoxinas.

MTODO DA COAGULAO EM GEL



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MTODO DA COAGULAO EM GEL

Proenzima Enzimaativada

Coagulognio Coagulina

Formao degel

Endotoxina

MTODO TURBIDIMTRICO


Coagulognio Coagulina(turbidez)

Leitura em340nm

Endotoxina



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MTODO CROMOGNICO


Coagulognio+ substrato

Coagulina +p-nitroanilina

Leitura em405nm

Endotoxina

Os testes para endotoxinas devem incluirincubao de vrias concentraes deendotoxina padro para obter uma curva decalibrao.




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O ensaio de pirognio em coelhos tem a seufavor a situao do envolvimento de toda areao fisiolgica do animal, constituindo umteste de segurana para os produtosinjetveis, lquidos para infuso e perfuso,materiais cirrgicos e descartveis em geral.

A desvantagem do teste in vivo ser maissusceptvel a interferncias, principalmente

dos animais.

TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO

O teste in vitro especfico paraendotoxinas bacterianas, mas no avalia osdemais pirognios exgenos, tais como algunsfrmacos, esterides e fraes do plasma.

A principal vantagem do teste in vitro permitir a quantificao ou estabelecimento

de limites para as endotoxinas, podendo serempregado na avaliao dos processos dedespirogenizao da indstria farmacutica.

TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO



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PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F.

Controle Biolgico de Qualidade de Produtos

Farmacuticos, Correlatos e Cosmticos. SoPaulo: Atheneu, 3 ed., 2010.

Captulo IX Pirognio e Endotoxina Bacteriana.

LEITURA RECOMENDADA

Disponvel em: www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm

Volume 1 item 5.5.2.1 (Pirognios) e 5.5.2.2 (Endotoxinas)

LEITURA RECOMENDADA


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