Controle Microbiológico de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos Não Estéreis

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Aspectos GeraisProdutos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização;

De administração oral ou tópicaProdutos cosméticos

Em condições ordinárias de uso terão contato com áreas portadoras de flora microbiana natural, constituída de saprófitas em número por vezes elevado;

A atenção no controle dos produtos não estéreis assegura que a carga microbiana presente no produto, seja no aspecto qualitativo ou quantitativo, não comprometa a sua qualidade final ou a segurança do paciente;

Aspectos GeraisO objetivo imediato é comprovar a ausência de microrganismos patogênicos e determinar o número de microrganismos viáveis, em função dos tipos de utilização do produto;

Padrões MicrobianosAs primeiras inclusões de limites microbianos aplicados a produtos farmacêuticos e seus insumos ocorreram de forma vaga, como a recomendação de “ausência de emboloramento”;

11ª e 12ª edições da USP:1936 e 1942, respectivamente;

No formulário Nacional de 1970 e na 18ª Edição da Farmacopéia, do mesmo ano, a expressão foi modificada para:

Padrões Microbianos“Drogas vegetais e animais deverão estar, o máximo possível, isentas de microrganismos, sendo que os patogênicos não deverão estar presentes”;

É interessante lembrar que o primeiro insumo farmacêutico com especificação relativa à qualidade microbiológica foi a gelatina, na USP XII de 1942, com o limite tolerado, em função de sua origem, de 104 bactérias totais por grama;

Esta especificação foi alterada diversas vezes, tendo passado por 5x103/g, na 18ª Edição; 104/g, na edição seguinte e, finalmente, 103/g a partir da 20ª Edição;

Padrões MicrobianosAlém dessa exigência quantitativa havia outro requisito, isto é, ausência de patógenos específicos numa determinada tomada de ensaio, sendo que este aspecto foi se tornando mais exigente;

10 mg ou menos – USP XXII;

Com a tomada de ensaios de:

10 mg – USP XVI;

10 g ou menos – USP XVIII;

ALTERADA PARA

ALTERADA PARA

Padrões MicrobianosEm relação aos fitoterápicos, a Portaria nº 123 de 19 de outubro de 1994, na Norma Técnica para Registro de Fitoterápicos, estabelece a seguinte especificação para matérias-primas vegetais:

Menos que 104/g de leveduras ou fungos;

Menos que 105/g de total de viáveis;

Menos que 103/g de enterobactérias;

Ausência de Salmonella sp., P. aeruginosa, S. aureus, E. coli e fungos da família Aspergillus;

Padrões MicrobianosApesar do reconhecimento, há muitos anos, da importância do controle microbiano de produtos não estéreis, a implantação e aceitação dos padrões sanitários tem ocorrido lentamente;

Produtos cosméticos Quanto aos produtos cosméticos, a CTFA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Assoc.) adotou limites de tolerância que se tornaram referência internacional. Estes limites são não mais que 500 microrganismos por grama em produtos para bebês e naqueles utilizados na área dos olhos e de não mais que 1000 microrganismos por grama para todos os outros, além de mencionar que nenhum produto deve ter conteúdo microbiano considerado nocivo para o usuário;

transporte e preparação da amostra para análise;

Métodos de AnáliseEnvolvem tanto os medicamentos não estéreis quanto os cosméticos, abrangem três etapas fundamentais:

Amostragem – englobando coleta;

Métodos de AnáliseDeterminação numérica ou contagem das formas viáveis;

Métodos de AnáliseIsolamento e identificação dos microrganismos indesejáveis a serem pesquisados;

A amostragem a ser efetuada para investigação quanto ao atendimento aos padrões microbianos deve ser:

Amostragem

Representativa

Em termos de abrangência do volume contido, do número de unidades contenedoras, e das operações unitárias envolvendo risco de contaminação adicional ou proliferação microbiana;

Em se tratando de sacos ou barricas contendo matéria-prima não estéril na forma pulverizada, dispositivos de amostragem devem permitir a obtenção de frações da parte inferior, mediana e superior de cada um de (raiz de N ou raiz de N + 1) do número total dos recipientes;

Nos processos contínuos, a segmentação como início, meio e fim do processo deve estar contemplada na amostragem;

Amostragem

Considerando o produto terminado, toma-se via de regra duplicata ou triplicata da amostra, representando início, meio e fim do processo de enchimento, admitindo que após o fechamento do material de acondicionamento a introdução de contaminantes não mais existirá;

O transporte deve ser em condições adequadas de temperatura;

Quantidade a ser analisada:

Amostragem

No caso do volume total da amostra ser de 10 g(mL), ou inferior, este total deve ser analisado. A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(mL) em amostras de produtos de alto valor agregado;

A recomendação das principais farmacopéias, para enriquecimento na pesquisa de patogênicos é, geralmente, de 10 g(mL), além da contagem total em igual quantidade;

Preparação da amostra:

Amostragem

A primeira preocupação ao preparar a amostra consiste na verificação da atividade antimicrobiana do produto devido à presença de conservantes na fórmula;

Estes devem ser inativados com substâncias adequadas, conforme sua natureza química;

Preparação da amostra:

Amostragem

A adição dos inativantes, previamente esterilizados por algum dos processos eficientes, deve ser previamente validada;

Outro cuidado importante, para não impedir o crescimento microbiano, é o ajuste do pH do produto diluído para a faixa da neutralidade;

Preparação da amostra:

Amostragem

A homogeneização da amostra é fundamental no sentido de conduzir a transferência para etapas subsequentes de forma representativa, ainda que a mesma tenha sido diluída por exemplo em solução salina peptonada (0,1 %), solução tamponada (pH 7,0) ou caldo lactose;

Algumas formas farmacêuticas ou cosméticas poderão exigir tratamento específico, no sentido de permitir o contato íntimo da amostra com o meio diluente:

Assim, no caso de produtos em aerossol, em que a tomada de amostra pode considerar o peso da embalagem antes e após expelir alíquotas do produto e propelente, este será naturalmente eliminado;

Produtos com fase oleosa exigem a adição de agente tensoativo, cuja concentração deve ser cuidadosamente definida para evitar efeito inibidor sobre possíveis microrganismos contaminantes;

Preparação da amostra:

Amostragem

Forma de manuseio operacional trabalhosa é o sabonete, que exige fragmentação criteriosa, seguida de leve aquecimento, recurso também aplicável no caso de supositórios e pomadas;

Figura – Agente tensoativo

• Em meio sólido, com semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate);

Métodos de Contagem de Microrganismos

• Em meio sólido, com semeadura da amostra em superfície;

• Membrana filtrante;

• Número mais provável;

O meio de cultura estéril fundido e resfriado a 45 – 48°C, em quantidade de cerca de 20 mL, é vertido sobre cada uma das placas contendo amostra, realizamos então a homogeneização com movimentos em S ou 8 sobre a bancada de trabalho, as quais permanecem até solidificação a temperatura ambiente;

Pour Plate:

Métodos de Contagem de Microrganismos

Consiste na transferência de alíquota de 1 a 2 mL da diluição da amostra (de cada diluição a ser considerada) para réplicas de placas de Petri estéreis (usualmente de 2 a 3 a cada diluição);

Pour Plate:

Métodos de Contagem de Microrganismos

Segue-se incubação das placas, em estufa, na posição invertida;

Após 2 a 5 dias de incubação a 30 – 35°C, para bactérias e 5 a 7 dias para bolores e leveduras, a 20 – 25°C, as colônias são contadas;

Pour Plate:

Métodos de Contagem de Microrganismos

Para contagem total de bactérias os meios oficialmente recomendados são principalmente ágar caseína-soja e ágar nutriente;

Para fungos, ágar Sabouraud-dextrose e ágar batata;

A escolha do meio de cultura, condições de incubação e cálculos para determinação da carga contaminante viável equivalem ao descrito para a técnica Pour Plate;

Semeadura da amostra em superfície:

Métodos de Contagem de Microrganismos

O meio de cultura é preparado e distribuído previamente em placas de Petri. Empregando-se pipetas estéreis, volumes de 0,1 a 0,5 mL de cada diluição considerada são distribuídos na superfície do gel já solidificado, sendo o espalhamento efetuado com movimentos cuidadosos ou com o auxílio de bastão de vidro ou alça de Drigalski;

Na dependência da densidade da amostra, haverá absorção total pelo meio. As placas invertidas são então incubadas;

O cálculo para determinar o número total de contaminantes viáveis é igual ao descrito anteriormente;

Membrana filtrante:

Métodos de Contagem de Microrganismos

Alíquotas do produto sob forma líquida ou suas diluições são filtradas através de membranas apropriadas (0,45 m ou 0,20 m de poro e 47 mm de diâmetro, constituídas em derivados celulósicos), seguindo-se a deposição das membranas, na mesma posição, sobre placas contendo meio de cultura;

Esta metodologia é vantajosa por permitir volumes elevados na amostragem e pela acuidade, apresentando recomendação especial para amostras contendo agentes antimicrobianos;

Número mais provável (NMP):

Métodos de Contagem de Microrganismos

A determinação do NMP de microrganismos se baseia em estimativa fundamentada em probabilidade. Assim, indica o valor dentro de uma faixa que reflete o número de microrganismos presente;

Embora apresentando imprecisão maior que os outros métodos descritos, é ainda recomendado e muito empregado, inclusive como método oficial, no controle microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos e águas;

Número mais provável (NMP):

Métodos de Contagem de Microrganismos

Uma vantagem de seu emprego consiste em permitir melhor revitalização dos microrganismos debilitados, em função do perfeito contato da amostra com o meio de cultura, enquanto o uso do meio sólido fundido seria fator adicional de estresse, uma vez que a temperatura do meio, no momento da homogeneização da amostra não seria favorável a esses contaminantes;

Embora permita avaliação de amostras com níveis elevados de contaminação, sua indicação é para situações nas quais se espera valores baixos de contagem;

Número mais provável (NMP):

Métodos de Contagem de Microrganismos

A metodologia emprega meios líquidos, usando-se diluições seriadas das amostras inoculadas nos mesmos. Exige a disponibilidade de tabelas estatísticas específicas para obtenção de resultados a partir das leituras;

O número de réplicas empregadas a cada diluição pode variar, sendo mais comuns tabelas construídas a partir de 3 ou 5 réplicas. No cálculo de contaminantes da amostra deve ser considerado ainda o fator de diluição utilizado;

Procedimentos:

Pesquisa de Patogênicos Específicos

Os procedimentos básicos sofrem pequenas distinções entre os compêndios oficiais de diferentes países, entretanto os aspectos básicos são mantidos;

Meios de Enriquecimento:As tomadas de ensaio recomendadas são da ordem de 10 g(mL), quantidade que pode ser simultaneamente usada para promover o enriquecimento não seletivo;

Para pesquisa de E. coli e Salmonella sp., em 100 mL de caldo lactose e para pesquisa de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, 100 mL de caseína-soja;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Enriquecimento:A incubação deve ser a 36 ± 1°C, durante 24 a 48 horas;

Para Salmonella sp., procede-se também ao enriquecimento seletivo, tomando-se volumes de 10 mL da suspensão resultante do enriquecimento não seletivo, para os caldos tetrationato e selenito-cistina, em volumes de 100 mL, então incubados em estufa, durante 24 horas a 36 ± 1°C;

Meios de Diferenciação:Após enriquecimento, alíquotas são transferidas, por repique, no geral por estria ou por picada, para meios de cultura para isolamento e de diferenciação;

Pesquisa de Patogênicos Específicos

Espalhamento nos quatro quadrantes

Repique por picada com movimento em S

Ágar semi-sólido para provas de motilidade

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Staphylococcus aureus;

Ágar Baird-Parker (colônias pretas, halo transparente):De uso específico para estafilococos coagulase-positivos, este meio contém cloreto de lítio e telurito em concentrações que inibem a flora acompanhante;

Simultaneamente, o piruvato e a glicina estimulam seletivamente o crescimento de estafilococos;

Devido à presença de gema de ovo no meio de cultura, as colônias de estafilococos apresentam halos transparentes originados por lipólise ou proteólise; o meio de cultura é opaco devido à lecitina. Adicionalmente, é originada a coloração negra devido à redução do telurito;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Staphylococcus aureus;

Ágar Vogel-Johnson (colônias pretas, halo amarelo):Trata-se de meio adequado para a investigação de estafilococos manitol-positivos. Considerando a capacidade de redução do telurito e a fermentação do manitol deste grupo de microrganimos;

A concentração elevada de manitol e a adição de vermelho de fenol como indicador de pH facilitam a visualização desta característica;

Os estafilococos em geral apresentam-se tolerantes frente a concentrações elevadas de sais como cloreto de sódio e cloreto de lítio. Este ágar devido à presença de cloreto de lítio, inibe o crescimento de microrganismos indesejáveis. A produção de ácido a partir de manitol é responsável pelo halo amarelo característico;

Caracteriza-se por formulação adequada para a investigação de estafilococos. Devido à elevada concentração salina impede o crescimento da maioria das outras bactérias, exceto alguns microrganismos halófilos. A degradação do manitol a ácido é comprovada pela viragem do indicador de pH vermelho de fenol;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Staphylococcus aureus;

Ágar Manitol (colônias amarelas, halo amarelo):

Tanto a formação do pigmento verde piocianina como o aspecto fluorescente das colônias à luz ultravioleta ocorrem neste meio;

Valoriza a detecção do pigmento piocianina, reconhecido pela fluorescência azul;Ágar Pseudomonas para Fluoresceína(colônias claras e amarelas, com fluorescência amarela):

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Pseudomonas aeruginosa;

Ágar Cetrimida (colônias esverdeadas, com fluorescência):Emprega brometo de sal de amônio quaternário de cetiltrimetilamonio (cetrimida) como agente seletivo, com notável poder inibitório sobre microrganismos distintos de Pseudomonas aeruginosa;

Ágar Pseudomonas para Piocianina(colônias esverdeadas, com fluorescência azul):

Também de composição semelhante, porém facilitando a visualização da fluorescência amarelo-esverdeada;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Escherichia coli;

Ágar Mac Conkey (colônias vermelho-tijolo a púrpura, com halo de precipitação de bile):Consiste em meio seletivo para o isolamento de Salmonelas e bactérias coliformes, característica decorrente de seus componentes sais biliares e cristal violeta, que inibem a flora Gram (+);

A lactose, também presente na composição, tem sua degradação evidenciada devido à presença do indicador de pH vermelho neutro;

As colônias lactose-negativas são incolores (Salmonella sp.) e as lactose-positivas são vermelho-violeta com halo turvo, devido à diminuição do valor de pH e a precipitação dos ácidos biliares (Escherichia coli), ou rosadas e mucóides (Enterobacter, Klebsiella);

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Escherichia coli;Ágar Eosina-Azul de Metileno (EMB) (colônias vermelho-escuras, brilho metálico):Usualmente empregado na identificação de Escherichia coli, este meio de cultura apresenta conteúdo rico em corantes, que inibe os microrganismos Gram (+);

Enquanto colônias de Enterobacter aerogenes se apresentam com centro cinzento, aquelas de Escherichia coli, graças à sua interação com a eosina e o azul de metileno, apresentam colônias típicas com brilho metálico esverdeado e centro escuro, inconfundíveis;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Escherichia coli;Ágar Endo (colônias rosadas a vermelhas, brilho metálico):Meio de cultura para identificação de coliformes fecais, devido ao seu conteúdo de sulfito sódico e fuccina reprime consideravelmente o crescimento de bactérias Gram (+);

Os coliformes que degradam a lactose produzem aldeído e ácido. O aldeído, por sua vez, libera fuccina a partir da combinação fuccina-sulfito, conferindo às colônias a coloração vermelha. No caso de Escherichia coli esta reação apresenta tal intensidade que promove a cristalização da fuccina, o que resulta em coloração das colônias com brilho metálico estável, com reflexos verdes;

O efeito seletivo destes meios de cultura baseia-se no seu conteúdo de verde brilhante, inibindo a flora Gram (+) acompanhante. O efeito diferenciador deve-se ao fato de as colônias de microrganismos fortemente redutores apresentarem uma elevada pressão de elétrons na parte central, que diminui na periferia;Portanto, no centro destas colônias ocorre redução a sulfeto de ferro, ocorrendo a coloração negra. Ao redor, apenas é possível a redução dos íons bismuto a bismuto metálico, acarretando o surgimento de brilho metálico na periferia da colônia;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Salmonella sp.;MEIOS DE ENRIQUECIMENTO SELETIVO – Caldo Selenito-Cistina e Caldo Tetrationato;MEIOS DE ISOLAMENTO – Ágar Verde Brilhante (coloração transparente) e Ágar Sulfito de Bismuto (colônia preta ou esverdeada);

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Salmonella sp.;Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (colôn. Vermelhas, núcleo negro):Devido à sua composição, e particularmente graças ao conteúdo reduzido de desoxicolato, é adequado para demonstrar a presença de Salmonella e Shigella;

A degradação dos açucares xilose, lactose e sacarose da sua composição a ácido promove a viragem do indicador de pH vermelho de fenol a amarelo, indicativo de outras bactérias;

O tiossulfato serve como substância de reação e o sal de Ferro (III) como indicador da formação de sulfeto de hidrogênio, visualizado então nas colônias negras de sulfeto de ferro;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Salmonella sp.;Ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD) (colôn. Vermelhas, núcleo negro):As bactérias que descarboxilam lisina à cadaverina são reconhecidas por promoverem a coloração púrpura ao redor das colônias, devido à elevação do valor de pH;

Várias destas reações podem ocorrer simultânea e sucessivamente, permitindo originar matizes de coloração;

Também, incubações prolongadas podem promover inversões de viragem do indicador de pH, podendo ser inclusive devido à evaporação dos ácidos formados;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Salmonella sp.;Ágar Tríplice Açucar-Ferro (coloração avermelhada na superfície, amarela no fundo, precipitação de sulfeto de ferro):Possibilita a investigação de Proteus, Hafnia, Providencia e outras bactérias que não fermentam a lactose ou o fazem muito lentamente, mas que fermentam a sacarose de maneira relativamente rápida;

A degradação de açúcar com formação de ácido pode ser comprovada pelo indicador vermelho de fenol, que passa para a coloração amarela, e a alcalinização decorre em cor vermelho-escura (Salmonella sp.). O tiossulfato sofre redução a sulfeto de hidrogênio por alguns microrganismos, o que por reação com sal férrico produz sulfeto de ferro, de cor negra;

Pesquisa de Patogênicos EspecíficosMeios de Diferenciação:Salmonella sp.;Ágar Tríplice Açucar-Ferro (coloração avermelhada na superfície, amarela no fundo, precipitação de sulfeto de ferro):

O volume de meio de cultura dispensado no tubo e a sua solidificação são de forma a permitir que haja, no mesmo, uma porção inclinada para repique por estria superficial, e uma coluna na parte inferior para repique por picada, em profundidade;

Provas AdicionaisHavendo suspeita de presença destes microrganismos, e coerência com a característica micromorfológica, deve ser seguida a pesquisa empregando outras provas bioquímicas e sorológicas específicas conforme se faça necessário;

Capacidade de fermentação de diferentes açúcares;

Potencial de aproveitamento de sais amoniacais como única fonte de nitrogênio e de citrato como única fonte de carbono (ágar citrato);

Formação de acetoína (reação positiva de Voges-Proskauer), reação de peroxidase, coagulase e outros;

OBRIGADO