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Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacteriana

- Definições: pirogênio endógeno e exógeno , endotoxina bacteriana (lipopolissacáride)

- Aplicação e abrangência

- Ações biológicas da endotoxina bacteriana

- Métodos de despirogenização e sua aplicação em produtos estéreis

- Produtos Apirogênicos

- Teste de pirogênio: método de detecção in vivo

- Teste de endotoxina : método de detecção in vitro – Kit LAL

- Vantagem e desvantagens dos métodos in vivo e in vitro


Pirogênio: Substância que induz a febre, proveniente de um produto injetável.

São divididos em 2 classes:

a) Pirogênios exógenos

b) Pirogênios endógenos


Pirogênios exógenos: São substâncias originárias fora do corpo e induzem a elevações térmicas quando injetados em humanos e animais.

Ex.: Endotoxina bacteriana (lipopolissacarídeo)

Mais importante pirogênio exógeno.

Outros Pirogênios exógenos: bactéria, fungo, vírus e outros não microbianos, como por exemplo fármacos, esteróides, frações do plasma, e adjuvante sintético muramil dipeptídeo.Produtos estéreis = ausência de microrganismos viáveis e apirogênicos

Endotoxinas bacterianas: - São complexos de alto peso molecular associados a

membrana externa de bactérias Gram negativas, sejam elas patogênicas ou não.

- São altamente resistentes ao calor, dessecação, tratamentos químicos e pH extremos.

- São liberadas durante o processo de multiplicação bacteriana ou quando morrem.


Cont. Endotoxinas bacterianas:

- Constituem maior fonte de pirôgenio para a Indústria Farmacêutica

* Diferença entre endotoxina e lipolissacarídeo (LPS)


A atividade biológica da endotoxina está associada ao LPS da membrana externa de bactéria Gram negativa

Pirogênios endógenos: É produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênio exógeno.


Produtos estéreis: ausência de m.o viáveis e apirogênicos

Método Analítico para controle de qualidade microbiológico de produtos estéreis – Pirogênio e endotoxina bacterianaAplicação:

- Produtos farmacêuticos injetáveis , como fármacos, soluções de injetáveis de pequeno e grande volume.

- Produtos correlatos ligados a injetáveis ( seringas, agulhas, catéteres)

- Embalagens de acondicionamento de produtos injetáveis

- Próteses

- Fluidos para infusão

Ações Biológicas da Endotoxina Bacteriana

- São tóxicas para a maioria dos mamíferos- Quando injetadas - injeção de células vivas, mortas ou

purificadas (LPS), podem causar várias reações fisiológicas, tais como:

a) Febreb) Alteração na contagem de leucócitosc) Coagulação intravasculard) Hipotensãoe) Apatiaf) Dores de cabeçag) Convulsãoh) Até mesmo a morte

Devido a estes fatores, é de grande importância a detecção e eliminação das endotoxinas bacterianas de produtos

farmacêuticos injetáveis

Processos de Despirogenização

Existem 2 grandes classes de Processos de Despirogenização:

a) Processo de Inativação

b) Processo de Remoção


Processo de Inativação da Endotoxina

1) Hidrólise ácido – básica ou alcalina- Reduz ou elimina a atividade do LPS, pela desativação do

lipídeo A ( considerado responsável pela ação biológica) HCl 0,05N por 30 min a 100ºC ouÁcido acético glacial 1% por 2 – 3 h a 100ºC

Aplicação: Despirogenização de materiais



2) Oxidação

- Inativação oxidativa da endotoxina bacteriana com peróxido de Hidrogênio (H2O2). É dependente do tempo, pH e concentração.

Aplicação: Eliminação de pirogênio da água estéril para injeção USP, solução salina normal, salina dextrose, lavagem de componentes plásticos na fabricação de correlatos.

Vantagem : ausência de peróxido no final do processo

Outros produtos, porém com limitações: ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido nítrico, dióxido de selênio,entre outros.


3) Alquilação Um agente alquilante é o gás óxido de etileno, que, segundo

alguns estudos, pode promover a redução da atividade de endotoxinas bacterianas, além de promover a esterilização de produtos.

Aplicação: produtos médicos - hospitalares Outros agentes alquilantes: tratamento com anidridos acéticos e

succínico




4) Processo térmico – Calor seco

- Estufas- Túneis por convecção, condução ou irradiação

(Infravermelho)

Aplicação: Método de escolha para materiais temoresistentes, como frascos de vidro e instrumentos metálicos

Processo de despirogenização: Exposição do material a 250ºC , no mínimo por 30 min. Ocorre incineração.

Autoclavação não é efetiva para inativação de endotoxinas


5) Radiação Ionizante Cobalto ( Co60)

- Reduz a toxicidade de endotoxinas, porém, são dose dependentes.

- Pode aumentar alterações químicas desconhecidas em fármacos e soluções parenterais.

- Seu uso na despirogenização de materiais não tem sido considerado.

Seus riscos podem superar suas propriedades benéficas




6) Polimixina B

- Antibiótico pode anular a atividade do LPS.

- Mais estudos devem ser feitos, pois a Polimixina pode interferir no teste LAL ( para determinação de endotoxina bacteriana in vitro)


Processo por Remoção de Endotoxina

1) Lavagem

- Método mais simples e um dos mais antigos para remoção de endotoxinas.

- Efetivo- Lavagem com solvente apirogênico : Água estéril para

injetáveis USP.

Aplicação: Vidrarias, dispositivos médicos, tampas e superfícies de materiais.



2) Destilação

- Método mais antido para remoção de endotoxinas.

Mecanismo: Alteração de fase:

a) L para V – Água ( vapor) e LPS ( Líquido) LPS ( Alto peso molecular) : tende a cair, devido a gravidade.b) V para L – Água Condensa, sem as endotoxinas.

Aplicação: Remoção de pirogênio da água


3) Ultrafiltração- Utilização de membranas ultrafiltrantes

Tamanho da subunidade básica do LPS: 10.000 a 20.000 daltons.

Mecanismo: Filtros despirogenantes – exclusão por peso molecular / tamanho da partícula.

Aplicação: Fármacos (ex. antibióticos) e soluções de baixo a médio peso molecular.



4) Osmose reversa

- Filtração sobre pressão .- Membranas constituída de acetato de celulose ou poliamida,

com pequenos poros para exclusão de partículas.

Mecanismo: Exclusão por tamanho - poros pequenos impedem a passagem de pirogênios.

Aplicação: Produção de água estéril para injeção. Método reconhecido pela USP, assim como o processo de Destilação.

- Consegue remover de 99,5 a 99,9 % da carga pirogênica do sistema.



5) Carvão Ativado- Adição de carvão a solução- Pode ser aplicado em ampla faixa de pH

Mecanismo: Adsorção de partículas pirogênicas (endotoxina) , agitação e remoção do carvão por filtração.

Aplicação: Soluções de eletrólitos.

Limitações: - Pode ocorrer a adsorção de ingredientes ativos, devido sua

afinidade por subst. não ionizáveis de elevado peso molecular.




6) Atração por membrana hidrófoba

- Polímeros de polipropileno, polietileno, polifluoreto de vinilideno e politetrafluoretileno apresentam afinidade para ligação a endotoxina.

Mecanismo: Processo de microfiltração com estes materiais são empregados permitem efetiva eliminação de endotoxinas por ADSORÇÃO

Aplicação:Subst. instáveis hormônios, antibióticos e substâncias difíceis de despirogenizar pelos métodos tradicionais.

Produtos Apirogênicos:

È importante ressaltar que:

1) Apesar dos métodos de despirogenização, existem limitações ( natureza do produto, riscos envolvidos ou aspectos econômicos)

2) Deve – se avaliar a natureza do produto ara escolha do processo de despirogenização adequado.

3) É importante seguir a BPF, para que se possa obter um produto apirogênico e não haver necessidade de tratamentos adicionais

Teste de Pirogênio

1) Teste in vivo

2) Teste in vitro

Teste de Pirogênio : Método in vivo

- Também conhecido como Método biológico ou Método in vivo

- Teste de hipertermia realizado em coelhos.

- Consiste em injetar uma solução nas veias periféricas das orelhas de coelhos.

- Após a injeção, verifica-se se ocorre uma reação pirética, ou

seja, um aumento da temperatura do corpo do animal (febre).

- A elevação da temperatura indicará a presença de pirogênios na solução.

Teste de Pirogênio : Método in vitro

- Também conhecido como Teste LAL ou Método in vitro

- Teste LAL (Limulus Amebocyte Lysate): proteína de caranguejo

- Caranguejos de espécie Limulus polyphemus - Ocorre uma reação entre o componente proteico do LAL e a endotoxina bacteriana.

- Consiste em adicionar o reagente LAL , que é uma proteína que coagula ou gelifica na presença de endotoxinas bacterianas.


Métodos analíticos

1)Ponto Final de Gelificação

- Mais simples e amplamente utilizado- Consiste em adicionar solução e reagente em quantidades iguais

em tubo de ensaio despirogenizado.- Mistura-se LAL com a solução a ser analisada e incuba-se por

1h a 37ºC.- Inversão dos tubos a 180º

- Positivo: formação de gel- Negativo : não formação de gel

Métodos analíticos

2) Ensaio Turbidimétrico

- Permite medida quantitativa da endotoxina em diferentes faixas de concentração

- O método é baseado no fato em que: Aumento da concentração de toxina é proporcional ao aumento da turbidez da solução, devido a ppt de proteína coagulável.

- Mistura se a solução com o reagente e incuba-se para reação da endotoxina.

- Realiza-se a leitura em espectrofotometria de absorção, calculando-se a concentração (compara-se com padrão).


Questão Provão / ENADE – 2001

As diálises peritoneais, administradas em pacientes em hospitais, têm sido causa de infecções. As análises das soluções determinaram a presença de pirogênio.

a) Quais as consequências para um paciente que recebe formulações medicamentosas injetáveis contaminadas com pirogênio?

b) Como é realizada a pesquisa do pirogênio em medicamentos?

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