relatório meios de cultura 2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA INDÚSTRIAL
PROFESSOR DR. CARLOS ANDRÉ VEIGA BURKERT
PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E ESTERILIZAÇÃO DE
MATERIAIS
Bruno A. Silva, 48055
Fernanda Schiller, 44957
Natiele Kleemann, 44977
Thiago R. Almeida, 42759
Rio Grande
2013
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................4
2. OBJETIVO....................................................................................................................5
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................................6
3.1 Meios de cultura......................................................................................................6
3.1.1 Classificação dos meios de cultura...................................................................6
3.2 Esterilização de materiais........................................................................................8
3.2.1 Autoclave..........................................................................................................8
3.2.2 Calor seco.......................................................................................................10
3.2.3 Radiação.........................................................................................................11
4. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................13
4.1 Materiais utilizados...............................................................................................13
4.2 Metodologia...........................................................................................................13
4.2.1 Preparo de Meios de Cultura..........................................................................13
4.2.2. Esterilização dos Materiais............................................................................14
5. CONCLUSÃO.............................................................................................................16
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................17
7. ANEXO.......................................................................................................................18
7.1 Perguntas...............................................................................................................18
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Esquema de funcionamento de autoclave.........................................................9
Figura 2 - Autoclave de parede simples..........................................................................10
Figura 3 - Estufa de esterilização e secagem a calor seco...............................................11
Figura 4 - Irradiador Gamma Cell de fonte radioativa Co-60 usado para esterilização de
materiais..........................................................................................................................12
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1. INTRODUÇÃO
Para o estudo de microrganismos são imprescindíveis operações tais como a
execução de preparações microscópicas, esterilização de vidrarias, preparo de meios de
cultura, técnicas de cultivo, isolamento e outros ensaios microbiológicos.
Os meios de cultura (preparações sólidas, líquidas ou semi-sólidas que
contêm todos os nutrientes necessários para o crescimento de microrganismos) são
utilizados com a finalidade de cultivas e manter microrganismos viáveis no laboratório,
sob a forma de culturas puras. Os meios de cultura dever ter na sua composição os
nutrientes indispensáveis ao crescimento do organismo em questão, sob a forma
assimilável e em concentração não inibitória do crescimento. Além disso, após a sua
preparação, cada meio de cultura deve ser submetido à esterilização, por forma a
eliminar qualquer organismo vivo contaminante. (Meios de Cultura, 2005)
A esterilização é o processo que inativa todos os microrganismos presentes
em determinado material ou ambiente, sendo portanto o método indicado para uso em
itens que de forma alguma podem ser utilizados quando houver qualquer tipo de
contaminação. (MENDES & KESSLER, 2003).
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2. OBJETIVO
Proporcionar a compreensão sobre os métodos de esterilização e propiciar
conhecimento sobre o preparo de meios de cultura. Ainda como objetivo da prática,
realizar a esterilização dos materiais apresentados.
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3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Meios de cultura
Os meios de cultura, também chamados meios de cultivo, são complexos
que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos. As técnicas de semeadura
permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja eficiente e que
as seguintes finalidades sejam atingidas:
Crescimento bacteriano;
Isolamento bacteriano;
Estudo da morfologia colonial;
Pesquisa de patogenicidade;
Pesquisa das características bioquímicas.
Os meios de cultivo devem conter as substâncias exigidas pelas bactérias
para o seu crescimento e multiplicação. Para que possam fazer a síntese de sua própria
nutritiva devem dispor de fontes de carbono (proteínas e açúcares), fontes de nitrogênio
(peptonas) e fontes de energia. São também necessários alguns sais inorgânicos,
vitaminas e outras substâncias favorecedoras do crescimento. (MENDES & KESSLER,
2003).
3.1.1 Classificação dos meios de cultura
Segundo Mendes & Kessler (2003), os meios de cultura podem ser
classificados da seguinte maneira.
I. Quanto à consistência:
Meios líquidos: são aqueles em que os nutrientes estão dissolvidos em uma
solução aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja,
sofre uma turvação.
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Meios semi-sólidos: são aqueles que possuem na sua composição, além de
nutrientes, uma pequena percentagem de um polissacarídeo proveniente de algas
marinhas, chamado ágar. São geralmente utilizados em tubos e a partir desse
tipo de cultura é possível observar a motilidade bacteriana.
Meios sólidos: são aqueles que possuem uma percentagem maior de ágar (cerca
de 15g/litro de água destilada), além dos nutrientes. Podem ser dispostos em
tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Através do meio sólido
em placas de Petri é possível, utilizando-se a técnica do esgotamento, conseguir
o isolamento de colônias bacterianas e, portanto, é o meio ideal para que seja
feito o estudo da morfologia colonial. Já a cultura em ágar inclinado fornece
somente o crescimento bacteriano com a obtenção de uma biomassa de
microrganismos.
II. Quanto à função:
Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de
microrganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples.
Meios de enriquecimento: são adicionadas ao meio simples substâncias
enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: Ágar
sangue.
Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados
microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias
inibidoras. Ex: Ágar Salmonella-Shigella.
Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos
como características relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo
ou uma espécie de microrganismo. Ex: Ágar MacConkey.
Meios de manutenção: são aqueles destinados a manter a viabilidade de uma
cultura bacteriana. Ex: Ágar Nutriente.
III. Quanto à natureza:
Meios animados: são constituídos de células vivas, como animais de laboratório,
tecidos vivos ou ovo embrionado.
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Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou sintéticos.
Naturais são aqueles que possuem substâncias provenientes da natureza, e o
sintético contém substâncias obtidas em laboratório.
Os meios de cultura são preparados e armazenados seguindo um rigoroso
controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais
e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.
3.2 Esterilização de materiais
3.2.1 Autoclave
O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor
úmido. O aparelho destinado a este fim é o autoclave. É um processo mais eficiente para
destruir microrganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavação é feita a 121°C
com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante
maior nível de destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido.
(MENDES & KESSLER, 2003).
Ainda segundo Mendes et al. (2003), a eficiência do processo de
esterilização depende de alguns fatores:
Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente
embalados;
O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121°C
é atingida;
A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor
atinja todo o material por igual;
Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve
ser novamente esterilizado.
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Figura 1 - Esquema de funcionamento de autoclave
FONTE: (www.blog.mcientifica.com.br)
3.2.1.1 Autoclave de parede simples
Este tipo de autoclave pode existir em vários tamanhos, sendo geralmente
formada por um cilindro metálico resistente, vertical ou horizontal, e com uma tampa
que permite fechar hermeticamente a autoclave. Geralmente é composta por um
manômetro, uma torneira para descarga e uma válvula de segurança. (GOMES, 2010).
No interior da autoclave, em sua parte inferior, coloca-se água e logo acima
um cesto ou tabuleiro com o material a esterilizar, aquece-se a água com o auxílio de
fogo ou resistências elétricas. As autoclaves não necessitam de termômetro para indicar
em que temperatura se encontra o vapor de água no interior, visto que existe uma
relação direta entre a pressão e a temperatura do vapor. (GOMES, 2010).
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Ainda segundo Gomes (2010), um ciclo completo constitui-se basicamente
de três etapas: aquecimento, esterilização e secagem, podendo após a realização das três
etapas completas, dizer que a esterilização foi completa.
Figura 2 - Autoclave de parede simples
FONTE: (www.pakdicklas.com)
3.2.2 Calor seco
O calor seco é o mais difundido método de esterilização, por apresentar
custo inicial mais baixo, rotina de trabalho relativamente fácil e baixo custo de
manutenção. No entanto, requer um longo tempo de esterilização. (LIMA &
MIGNOLO, 2001)
Segundo Lima at al. (2001), a esterilização pelo calor seco é passível de
falhas pois:
O ciclo pode ser interrompido;
Ausência de cronômetros de alerta para marcação do tempo de esterilização;
Ausência de termômetros de mercúrio para tomada da temperatura real da
câmara de esterilização;
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Excesso de materiais ou de carga na estufa;
Dificuldade de espera para que os instrumentos esfriem quando retirados da
estufa.
Figura 3 - Estufa de esterilização e secagem a calor seco
FONTE: (www.splabor.com.br)
3.2.3 Radiação
A radiação ionizante age como esterilizante por produzir modificações no
DNA das células, provocando lesões estruturais, o que acarreta alterações funcionais
graves por difusão de radicais livres no volume adjacente da célula microbiana.
(ORIENTAÇÕES..., 2001).
A forma mais utilizada é a radiação gama, cujo elemento mais utilizado é o
Cobalto 60, que possui grande poder de penetração nos materiais. É utilizado
principalmente em implantes. (ORIENTAÇÕES..., 2001).
O tempo de permanência do material frente à bomba de Cobalto é calculado
a partir da distância do material à fonte, das condições de atividade da fonte e da
natureza do material a esterilizar. O processo é monitorado por painel eletromecânico
que avalia os riscos, ou seja, os níveis de radiação no equipamento. Cada lote de artigos
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é monitorado por dosímetros que controlam a quantidade de radiação recebida.
(ORIENTAÇÕES..., 2001)
Figura 4 - Irradiador Gamma Cell de fonte radioativa Co-60 usado para esterilização de materiais
FONTE: (www.grupodoin.com)
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Materiais utilizados
Autoclave;
Forno de microondas;
Cronômetro;
Tubos de ensaio;
Tubos de Duhran;
Pipetas;
Algodão;
Papel pardo;
Água peptonada;
Água destilada;
Solução salina;
Caldo lauril sulfato triptose;
Placas;
Erlenmeyer;
Álcool;
Ágar padrão para contagem (PCA);
4.2 Metodologia
4.2.1 Preparo de Meios de Cultura
4.2.1.1. Água Peptonada
É utilizada como solução diluente. Pode-se utilizar uma solução salina.
Pesar 0,1 g de peptona e diluir em 100 mL de água destilada;
Ajustar o pH próximo a 7,0;
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Distribuir 9 mL do meio em tubos de ensaio com tampa de rosca. Esterilizar em
autoclave a 121°C/15 min.
4.2.1.2. Caldo Lauril Sulfato Triptose
É um meio utilizado no teste presuntivo de coliformes totais,
termotolerantes e Escherichia coli pela técnica dos tubos múltiplos.
Pesar 7,12 g do caldo lauril sulfato triptose comercial e diluir em 200 mL de
água destilada;
Distribuir 10 mL do meio nos tubos de ensaio contendo tubos de Duhran
invertidos;
Tampar os tubos com buchas de algodão e esterilizar em autoclave a 121°C/
15min.
4.2.1.3. Agar Padrão para Contagem (PCA)
É um meio de enriquecimento utilizado para a contagem total de
microrganismos em placas, ou para a manutenção de culturas bacterianas.
Pesar 2,35g de PCA e diluir em 100 mL de água destilada;
Aquecer em micro-ondas, parando a cada 30 s para agitar o frasco, até que o
meio esteja completamente dissolvido;
Tampar o frasco com bucha de algodão e esterilizar em autoclave a
121°C/15min.
4.2.2. Esterilização dos Materiais
A esterilização compreende a destruição de todas as células viáveis
(incluindo esporos) que possam ser enumeradas por técnicas apropriadas de semeadura.
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Em alimentos é muito comum utilizarmos o termo esterilização comercial, indicando a
mesma finalidade. A esterilização compreende processos físicos (calor úmido, seco e
radiação) e químicos (agentes químicos).
4.2.2.1 Esterilização de Pipetas
Colocar algodão no bocal da pipeta;
Enrolar individualmente em papel pardo;
Enrolar em pacotes separados, identificando a turma, o número e volume das
pipetas;
Esterilizar em autoclave a 121°C/15min.
4.2.2.2 Esterilização das Placas de Petri
Passar algodão embebido em álcool 70% dentro e fora das placas;
Enrolar as placas individualmente em papel pardo;
Enrolar em pacotes separados, identificando a turma e o número de placas;
Esterilizar em autoclave a 121°C/15min.
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5. CONCLUSÃO
A partir dos procedimentos práticos realizados no laboratório pode-se
perceber a importância e utilidade do preparo de meios de cultura, assim como a
esterilização adequada dos materiais.
A especificidade dos meios de cultura é muito significativa, principalmente
no isolamento e identificação de determinados microrganismos, ou em testes de
sensibilidade a antibióticos ou na análise microbiológica de águas, alimentos,
coliformes, etc.
A fim de obter-se um meio de cultura adequado, a esterilização é
fundamental, pois com ela pode-se eliminar microrganismos interferentes, aquele que
não é de interesse.
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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GOMES, K. (2010). Conhecimentos Básicos de Esterilização e Qualificação de
Autoclaves. Acesso em 02 de Janeiro de 2014, disponível em
http://www.pharmaster.com.br/artigos/docs/20101206_5162_conhecimentosesterilizaca
o.pdf
LIMA, M. N., & MIGNOLO, M. J. (2001). CADERNO CIENTÍFICO: Esquema Geral
de Esterilização; Central de Recirculação de Material.
Meios de Cultura. (18 de Novembro de 2005). Acesso em 02 de Janeiro de 2014,
disponível em e-escola: http://www.e-escola.pt/topico.asp?hid=312
MENDES, M. A., & KESSLER, C. C. (2003). Aulas Práticas de Microbiologia para
Odontologia. Acesso em 02 de Janeiro de 2014, disponível em
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAerQUAD/apostila-microbiologia#
(2001). Orientações Gerais para Central de Esterilização. Ministério da Saúde.
www.blog.mcientifica.com.br. (s.d.). Acesso em 02 de Janeiro de 2014, disponível em
http://www.blog.mcientifica.com.br/wpcontent/uploads/2013/04/esquema_autoclave.jpg
www.grupodoin.com. (s.d.). Fonte: http://www.grupodoin.com/serv_calculo.htm
www.pakdicklas.com. (s.d.). Acesso em 02 de Janeiro de 2014, disponível em
http://www.pakdicklas.com/dental/surgical/retractors%20new/hpi-835.gif
www.splabor.com.br. (s.d.). Fonte: http://www.splabor.com.br/equipamentos-
laboratorio/estufa-de-esterilizacao-e-secagem/estufa-secagem-e-esterilizaao-
microprocessado-digital-.html
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7. ANEXO
7.1 Perguntas
1) Quais os procedimentos de assepsia usuais em um laboratório de
microbiologia, a fim de evitar contaminação? Cite exemplos e situações.
Assepsia é um conjunto de procedimentos utilizados para impedir a
penetração de microrganismos em objetos ou ambientes estéreis ou até mesmo quando
se está trabalhando com culturas puras. Esses procedimentos envolvem o uso de
ambiente apropriado, meios de cultura e instrumentais estéreis. Caso necessário usar
luvas, máscaras e óculos protetores. Pipetar usando pipetadores automáticos ou pêras de
borracha. Flambar as alças e agulhas, boca dos tubos, limpar e desinfetar
periodicamente a bancada e o ar do ambiente de trabalho. Todas as operações
envolvendo manipulação de culturas e meios de cultura deverão ser efetuadas na área de
proteção conferida pela chama do bico de Bunsen. Como exemplo, podemos citar: um
recipiente que contenha uma dada cultura deve ser aberto perto da chama do bico de
Bunsen, de forma a impedir uma contaminação devido à entrada de ar exterior
contaminado. A transferência de uma porção da cultura contida num tubo ou balão para
outro recipiente (inoculação) é realizada normalmente com uma ansa previamente
esterilizada pela passagem pela chama do bico de Bunsen (e posteriormente arrefecido)
ou através de uma micropipeta com pontas de plástico previamente esterilizadas (em
autoclave, por exemplo).
2) O que são meios de enriquecimento? E meios de identificação? E meios de
conservação/manutenção? Cite exemplos e aplicações.
- Meios de Enriquecimento: quando proporcionam nutrientes adequados ao
crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de
crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos (com dificuldades
de nutrição). Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de
determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o
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crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de
Salmonelas (líquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens;
- Identificação: prestam-se para a realização de provas bioquímicas e
verificação de funções fisiológicas de organismos submetidos a identificação (meios
Oxidação/Fermentação, Ágar Citrato, Caldo nitrato, meio semi-sólido, caldo triptofano,
meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.;
- Estocagem ou manutenção: utilizados para conservação de
microrganismos no laboratório, isto é, garantem a viabilidade de microrganismos (Ágar
Sabouraud, Meios com leite, Ágar suco de tomate, Ágar sangue, Ágar Simples, meio
semi-sólido, etc.).
3) Defina os seguintes constituintes de meios de cultura: extrato de carne,
peptona; Agar-ágar; Extrato de levedura. Quais suas funções no meio de
cultura?
- Extrato de Carne: é preparado de carne fresca especialmente selecionado
para fornecer um crescimento máximo de microorganismos exigentes. Funções: a alta
qualidade da carne magra pura usada garante características consistentes da colônia,
quando usado em meios diferenciais; é usado nos seguintes meios: para propósitos
gerais, Meio Nutriente Padrão, Caldo de enriquecimento de Staphylococcus, Caldo
Teste de Desinfecção, Meio A e B de Teste de Esterilidade, Meio VL, etc.;
- Peptona: é usada em objetivos gerais em meios de cultura para o cultivo de
uma variedade de organismos. Também é usado em larga escala para o cultivo de
microorganismos para produção de antibióticos, enzimas, vitaminas ou outros produtos
similares de origem microbiana, sendo essa sua função;
- Agar-ágar: é extraído de algas marinhas que, por assimilarem grande
quantidade de minerais na água do mar, tornam-se ricas em fósforo, iodo e sais
minerais. É bastante rico em fibras vegetais, que atuam na regularização das funções
intestinais, proporcionando um suave efeito laxante. Por isso, é comumente utilizado em
dietas com baixo teor calórico, auxiliando nos regimes de emagrecimento.
- Extrato de Levedura: é preparado secando o extrato obtido de células de
levedura especialmente cultivadas para este propósito. É fabricado sob condições
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controladas para garantir sua função, que é manter seu conteúdo de vitamina e outros
valores nutritivos, assim como aminoácidos livres.
4) Como pode ser verificada a esterilidade de um meio de cultura (prova de
esterilidade)?
Pode-se verificar a esterilidade de um meio de cultura através de um
material chamado Fita Adesiva Autoclave, que deve ser colada no exterior do papel
pardo que engloba os materiais que deseja-se esterilizar (no nosso caso, pipetas,placas
de Petri e três meios de cultura). A fita possui coloração clara, em tons de bege, com
linhas paralelas de cor amarela. Para verificar a esterilidade, deve-se observar a
coloração dessas linhas contidas da fita. Se a esterilização foi eficiente, ao fim da
esterilização as linhas terão uma tonalidade escura, de cor preto.
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