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MEIOS DE CULTURA

MEIO DE CULTURA

DEFINIÇÃO

- São preparados especiais com finalidade de cultura e isolamento de microrganismos.

- Uma grande variedade de processo e de preparações nutrientes é utilizada para induzir o crescimento e as reproduções de microorganismos.

MEIOS DE CULTURA

- Não existe um meio de cultura universal para o crescimento de todos os microrganismos.

Ex: não existe meio de cultura para microrganismos como Treponema pallidum e Micobacterium leprae.

- Estes microrganismos só podem ser cultivados em animais de laboratório.

MEIOS DE CULTURA

NATURAIS

- Lagos

- Oceanos

- Solo

ARTIFICIAIS OU SINTÉTICOS

- São nutrientes preparados no laboratório para o crescimento de microrganismos.

MEIOS DE CULTURA

APRESENTAÇÃO

Pós

MEIOS DE CULTURA

PREPARAÇÃO

- De acordo com o fabricante.

- Técnica de preparação vem especificada no rótulo dos frascos.

- Pesar e hidratar o meio conforme as instruções do fabricante.

MEIOS DE CULTURA

PREPARAÇÃO

MEIOS DE CULTURA

MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO

1 - Autoclave (calor úmido) 121ºC por 15 a 20 minutos.

- Vapor fluente

MEIOS DE CULTURA

MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO

2 – FILTRAGEM

- Produtos termo sensíveis

- Membranas de acetato de celulose (0,22 μm).

RECIPIENTES PARA OS MEIOS DE CULTURA.

- Placas de petri, tubos de ensaio, garrafas, frascos, etc...

CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA

- Água: Principal solvente dos nutrientes.

- Fontes de Carbono: pode ser do CO2 ou de nutrientes orgânicos (carboidratos, lipídeos e proteínas).

- Fonte de energia: Carboidratos como amido, glicogênio, monossacarídeos


• - Fonte de Nitrogênio “base amino-proteína”: peptidase: Aminoácidos, peptídeos, proteínas complexas e peptona.

• - Fontes de oxigênio, hidrogênio, fósforo (fosfatos) e enxofre (sulfatos)

- Vitaminas: Complexo B ( biotina e ácido pantotênico).


- Sais tamponados: Fósforo (fosfatos), enxofre (sulfato) e citrato.

- Sais minerais: Cálcio, Ferro, Magnésio

- Fatores de crescimento: sangue, soro e extrato de levedura.

MEIOS DE CULTURA

- Agentes seletivos: Químicos, Corantes, e Antimicrobianos

- Indicadores de pH: feno vermelho

- Agentes de gelificação para meios sólidos: Ágar

CLASSIFICAÇÃO

DOS

MEIOS DE CULTURA

1 – DE ACORDO COM A CONSISTÊNCIA

SÓLIDOS

- Usa ágar, um polímero de galactose como agente solidificante na concentração de 1,35 a 2,0%.

- Funde-se à 100ºC, Líquido à 40ºC e sólido à 37ºC.

- São feitos em frascos, placas de petri e tubos de ensaio.


SEMI-SÓLIDOS

- Usa ágar, como agente solidificante na concentração de 0,2 à 0,75%.

- Funde-se à 100ºC, Líquido à 40ºC e Semi-sólido à 37ºC.

- São feitos em tubos de ensaio


LÍQUIDOS

- São os meios isentos de ágar.

- São sempre líquidos mesmo até a 37ºC e em temperaturas inferiores.

- São feitos em tubos de ensaio

CRESCIMENTO MICROBIANO

MEIO SÓLIDO: o crescimento de bactérias é visualizado pela formação de colônias.

MEIO SEMI-SÓLIDO: o crescimento de bactérias é visualizado pela turvação. Meio muito utilizado para verificar a motilidade (movimento) da bactéria.

MEIO LÍQUIDO: o crescimento de bactérias é visualizado pela turvação do meio.


MEIO SÓLIDO

COLÔNIAS: são milhares de células bacterianas derivadas de uma única célula bacteriana semeada na superfície do ágar.

TEMPO PARA VISUALIZAÇÃO DAS COLÔNIAS:

- Maioria dos microrganismos cresce de 12 à 48 horas.

- Outros exigem semanas e até mêses.


MEIO SÓLIDO: COLÔNIAS


MEIO SEMI-SÓLIDO E LÍQUIDO : TURVAÇÃO


MEIO SÓLIDO

Exemplos: Ágar Sangue, Ágar chocolate, Ágar MacConkey, Ágar SS (Salmonela, Shigella), Ágar VB (Verde-Brilhante), Ágar CLED (Cisteína Lactose Eletrólitos Deficientes), Ágar Base, Ágar Citrato de Simmons, Ágar Nutriente, Ágar TSI (Triplice Açúcar e Ferro), Ágar Müller Hinton), etc....


MEIO SÓLIDO

Ágar Sangue Ágar chocolate


MEIO SEMI-SÓLIDO

Exemplos: Ágar SIM (Motilidade Indol Sulfeto) etc....

MEIO LÍQUIDO:

Exemplos: BHI (Infusão de cérebro e coração), Tetrationato, Selenito, Uréia, etc...


MEIO SÓLIDO X MEIO LÍQUIDO

- Meio líquido é impossível afirmar a existência de mais de uma espécie de bactérias ou até mesmo quantificar.

- Meio sólido pode-se afirmar a presença de várias espécies bacterianas.

CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA

2 – TIPOS ou FUNÇÃO

MEIOS COMPLEXOS

- São meios quimicamente indefinidos, mas tem como função similar ao ambiente natural da bactéria.

Ex: Ágar sangue, Ágar chocolate.


2 – TIPOS

MEIOS SINTÉTICOS

- São meios de composição química conhecida. São utilizados para estudo de necessidades nutricionais de determinadas bactérias.

Ex: Meio para micobactérias.


2 – TIPOS

MEIOS DIFERENCIAIS

- São meios que permitem a distinção (diferenciação) entre dois ou mais tipos de bactérias pelas simples observação das características apresentadas pelas suas colônias que neles se desenvolvem.

- Os meios diferenciais permitem o crescimento de várias espécies ao mesmo tempo, que facilita a discriminação entre os diferentes microrganismos.


2 – TIPOS

MEIOS DIFERENCIAIS

Ex: Mac Conkey

- Permite a distinção entre bactérias fermentadoras da lactose (lactose positiva – apresenta colônias rosa) e bactérias não fermentadora da lactose (lactose negativa – apresenta colônias incolores).


MEIOS DIFERENCIAIS

Ex: Mac Conkey

CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURAMEIOS DIFERENCIAIS

Ex: Mac Conkey


2 – TIPOS

MEIOS SELETIVOS

- São meios cuja composição promovem e/ou inibem o crescimento de um determinado microrganismo ou grupo de microrganismos.

- Os meios seletivos proporcionam o meio pelo qual podemos isolar uma determinada espécie ou categoria de bactérias.


2 – TIPOS

MEIOS SELETIVOS

- São usadas substâncias seletivas como os corantes tais como cristal violeta, azul de metileno, eosina e verde brilhante.

Ex. Mac Conkey além de seus nutrientes contém cristal violeta e sais biliares que inibe o crescimento de bactérias Gram- positivas e permitindo o crescimento de Gram-negativas.


2 – TIPOS

OSERVAÇÃO

- ALGUNS MEIOS SÃO TANTO DIFERENCIAIS COMO SELETIVOS.

Ex: Ágar Mac Conkey


2 – TIPOS

MEIOS DE ENRIQUECIMENTO

- São meios utilizados para isolar um microrganismo de um meio em que está presente em pequena quantidade.

- São meios enriquecidos com sangue, soro ou outros nutrientes.

Ex: Ágar sangue, Ágar chocolate.


2 – TIPOS

MEIOS DE ENRIQUECIMENTO

Ex: Tetrationato e Selenito

- São meios usados para amostras fecais (coprocultura) inibindo o crescimento da microbiota (bactérias normais das fezes) e permitindo o crescimento de Salmonella e Shigella que são patogênicas.


2 – TIPOS

MEIOS DE TRANSPORTE

- São meios utilizados para o transporte e manutenção de amostras biológicas como fezes e secreções.

- São meios inertes, pois, permitem a viabilidade da maioria dos patógenos sem alterar a sua concentração.


2 – TIPOS

MEIOS DE TRANSPORTE

Ex: Meio de Stuart ou Amies usado para o transporte com swabs.

Ex: Meio Cary-Blair e salina glicerinada tamponada útil no transporte de fezes para o isolamento de shigella e Salmonella.


MEIOS DE TRANSPORTE


2 – TIPOS

MEIOS DE MANUTENÇÃO

- São meios utilizados para a preservação das bactérias para a realização de exames complementares para estudos futuros como pesquisa clínica, epidemiológica ou educacional.

Ex: Caldo TSB, caldo nutriente, água destilada.

MEIOS DE MANUTENÇÃO

Métodos de preservação:

Curto período de tempo: temperaturas de 2 a 8 ºC ou de 4 à 10ºC (refrigerador): duração por semanas. Fazer subculturas em caldo TSB ou caldo nutriente.

Longo período de tempo: temperaturas de-70 à -196ºC. Duração por anos (1 até 10 anos).

- Nitrogênio líquido: (-196ºC)- Freezers: (-70 à -120ºC) temperatura

ultra baixa.- Liofilização: congelamento à seco.


2 – TIPOS

MEIOS DE IDENTIFICAÇÃO

- São meios utilizados na identificação das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

Ex: EPM e MILI para identificação de Enterobactérias (Gram-negativas) e Rugai

Ágar Bile esculina. Identificação de Gram-positivas.


MEIOS DE IDENTIFICAÇÃO

EPM E MILI RUGAI

CONDIÇÕES FÍSICAS PARA A CULTURA DAS BACTÉRIAS

- TEMPERATURA

- pH

- ATMOSFERA GASOSA

- PRESSÃO OSMÓTICA

- PRESSÃO HIDROSTÁTICA

- LUZ

CONDIÇÕES FÍSICAS PARA A CULTURA DAS BACTÉRIAS

PRESSÃO OSMÓTICA

- Meios hipertônicos: as bactérias perdem água e sofrem plasmólise ou enrugamento da célula.

- Meios isotônicos: concentrações iguais, é o mais recomendado.

- Meios hipotônicos: as células ganham água e sofrem lise.

CONDIÇOES FÍSICAS PARA CRESCIMENTO.

TEMPERATURA

- Psicotróficos: 0 à 7ºC

- Psicrófilos: 0 à 20ºC.

- Mesófilos: 20 à 45°C.

- Termófilos: 45 à 90°C.

A maioria são mesófilas.

- Temperatura ótima: 36,5 a 37°C em estufa bacteriológica.

CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS

pH

- Acidófilos: pH 0,1 à 5,4

- Neutrófilos: pH 5,4 à 8,5

- Alcalófilas: ph 7,0 à 11,5

A maioria na faixa de 4,0 a 9,0.

- Ideal: próximo da neutralidade 6,8 a 7,2.

- pH próximo do neutro (7,0) para a maioria das bactérias.


LUZ

- Bactérias fotossintetizantes

- Bactérias inibidas pela luz.

CRESCIMENTO DAS BACTÉRIAS

PRESSÃO HIDROSTÁTICA

- Água dos oceanos e lagos exercem pressão hidrostática.

- Bactérias barófilas: vivem em alta pressão “profundidade”.


ATMOSFERA GASOSA

- Microrganismos aeróbios: 21% de oxigênio.

- Jarra de microaerofilia para microrganismos que necessitam de CO2.


ATMOSFERA GASOSA

- Microrganimos anaeróbios facultativos: crescem na presença de ar ou anaeróbiose.

- Microrganimos microaerófilos: Não resistem á níveis de oxigênio (1-15%).


ATMOSFERA GASOSA

- Microrganismos anaeróbios: Morrem em presença de oxigênio, não crescem em presença de ar e não utilizam oxigênio para reações de produção de energia.

- Jarra de anaerobiose.


TEMPO

- Aumento no número da população na cultura: 1→2→4→8→16→……

Progressão geométrica?

1→21→22→23→24….→2n

n = número de gerações

2n = número total de células em uma cultura.


TEMPO DE GERAÇÃO DAS BACTÉRIAS.

- De 30 em 30 minutos.

- PERÍODO DE INCUBAÇÃO

- 24 a 48 horas em estufa bacterilógica.


INCUBAÇÃO: Estufa bacterilógica.

MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.

Ágar sangue de carneiro a 5,0%

- Meio não seletivo e diferencial que permite o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além de permitir a visualização de hemólise.


Ágar Mac Conkey

- Meio seletivo e diferencial que permite o crescimento de bactérias (bacilos) Gram-negativas, diferenciando as bactérias em lactose positiva e lactose negativa. Inibe o crescimento de bacctérias Gram-positivas.

MEIOS DE CULTURA MAISUTILIZADOS.

Ágar Mac Conkey

• - É utilizado para o isolamento de

Enterobactérias (Escherichia coli,

Proteus sp, etc.. e bacilos entéricos não

fermentadores (Shigella e Salmonella).• - Amostras utilizadas: fezes, urina,

água de esgoto, alimentos , etc...


Ágar Mac Conkey

- Sua composição contém cristal violeta e sais biliares que inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas.

- Utiliza a lactose como único carboidrato como fonte de energia e carbono.


Ágar Mac Conkey

- Bactérias fermentadoras de lactose produzem enzimas como a beta-galactosidase e lactose permease que produzem ácido diminuindo o pH e produzem colônias rosas chamadas de colônias lactose positiva.

Ex: Escherichia coli


Ágar Mac Conkey

- Bactérias não fermentadoras de lactose não produzem enzimas portanto não produzem ácidos, aumenta o pH do meio, produzindo colônias incolores, transparentes ou ambar chamadas de colônias lactose negativa.

Ex: Salmonella typhi, Shigella dysenteriae.

MEIO DE CULTURA Mac Conkey

Lactose positiva Lactose negativa

IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS

1 - CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS

TAMANHO (mm)

- Grande: maior que 1 mm de tamanho

- Média: 1 mm de diâmetro

- Pequena: menor que 1 mm de diâmetro.


COR

- Amarela, Branca, Branca- acinzentada, Cinza, Rosa, Esverdeada, Preta, Alaranjada, Creme, Incolor, etc...

ODOR

- Uva, Água sanitária, Fermento de pão, Vinagre, Queijo, Terra molhada, Peixe, Caramelo, etc...


DENSIDADE

- Opaca, Translúcida, Transparente

CONSISTÊNCIA

- Brilhante, Cremosa, Seca, Mucóide

PIGMENTO

- Amarelo, Vermelho, Mostarda


BORDA OU FORMA

- Circular (redonda), irregular, puntiforme, ondulada

ELEVAÇÃO

- Convexa, Achatada, Elevada, Umbilicada, centro elevado


HEMÓLISE: é a lise (quebra, rompimento) da hemácia.

Total (beta- hemólise): zona clara ao redor das colônias.

Parcial (alfa-hemólise): há formação de um halo esverdeado em volta da colônia, indicando hemólise parcial das hemácias.

Ausência de hemólise (gama-hemólise): o meio permanece íntegro em volta das colônias.


Hemólise


Tipos de hemólise (alfa, beta e gama)

MEIOS DE CULTURA

CONTROLE DE QUALIADE

- Cepas padrão

MEIOS DE CULTURA

TÉCNICAS DE SEMEADURA

1 - Semeadura quantitativa com alça calibrada.

MEIOS DE CULTURA

TÉCNICAS DE SEMEADURA

2 - Semeadura por esgotamento.

MEIOS DE CULTURA

Inoculação dos meios de cultura.

- INÓCULO: é quando os microrganismos são colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento.

Inocular primeiramente os meios menos seletivos para evitar que substâncias inibidoras sejam transferidas de um meio para o outro.

Ex: semear primeiro no ágar sangue ou ágar chocolate em seguida no mac Conkey.

CULTURA: é quando os microrganismos cresecem e se multiplicam no meio de cultura.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBARBOSA, H. R.; TORRES, B. B. Microbiologia básica. São Paulo: Atheneu, 2005. BLACK, J. G. Microbiologia – fundamentos e aplicações. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERGER, P. C.; WINN JÚNIOR, W. C. Diagnóstico microbiológico. Texto e atlas colorido. 5. ed. Rio de Janeiro: MEDSI Ed. Médica e Científica, 2001.LEVINSON, W.; JAWETZ, E. Microbiologia médica e imunologia. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. MINS, C.; PLAYFAIR, J.; RITT, I. WAKELIN, D.; WILLIAMS. R. Microbiologia médica. 2. ed. São Paulo: Manole, 1999. PELCZAR Jr., M. J.; CHAN, E. C. S. KRIEG, N. R. Microbiologia – conceitos e aplicações. 2. ed. v. 1 e 2. São Paulo: Makron Books do Brasil, 1997. SPICER, W. J. Bacteriologia, micologia e parasitologia clínicas – um texto ilustrado em cores. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. THOMAS, C. L. Dicionário médico enciclopédico – Taber. 17. ed. São Paulo: Manole, 2000. TORTURA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. H. Microbiologia. 8. ed. São Paulo: Artmed, 2005.TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.

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