27/03/2014

1

Microbiologia

Aula 4

Meios de Cultura

Prof. Dr. Agenor Messias Silvestre Jr

agenor@uninove.br

Meios de Cultura – Semeadura e

Crescimento Bacteriano

Meios de Cultura (cultivo) são materiais nutritivos preparados em

laboratório que permitem o crescimento (aumento em quantidade)

de microrganismos.

Quando microrganismos são colocados em um meio de cultura

para iniciar seu crescimento, são chamados de INÓCULO. E, ao

crescer, formam COLÔNIAS (agrupamentos bacterianos) visíveis.

27/03/2014

2

Até cerca de 1880 os microrganismos eram mantidos em

laboratório em extratos (caldos nutritivos), até que Robert Koch e

colaboradores introduziram os meios de cultura sólidos, os quais

permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras) de

bactérias, separando-as de espécies contaminantes.

Quando se deseja o crescimento de bactérias em um meio

sólido, um agente solidificante denominado AGAR (polissacarídeo

extraído de algas marinhas) é adicionado ao meio que será

posteriormente distribuído em tubos de ensaio ou placas de Petri.

Meios Sólidos, Semi-Sólidos e Líquidos

Agar- Agar

desidratado algas marinhas

:

SÓLIDOS, quando contêm agentes solidificantes como o

AGAR, sendo utilizados para visualização de colônias;

[ ] maior que15g/1000ml.

SEMI-SÓLIDOS, quando a quantidade de AGAR é

pequena, dando uma consistência intermediária de modo a

permitir o crescimento de microrganismos em concentrações

variadas de oxigênio ou para verificação da motilidade

(presença de flagelos); [ ] menor que 15g/1000ml;

LÍQUIDOS (CALDOS), quando não possuem agente

solidificantes, apresentando-se de forma líquida, utilizados

para o enriquecimento das culturas, repiques de

microrganismos, entre outros.

Meios Sólidos, Semi-Sólidos e Líquidos

Os meios de cultura são classificados então, quanto ao seu estado físico, em

27/03/2014

3

MEIO QUIMICAMENTE DEFINIDO

Um meio quimicamente definido é aquele em que a procedência

dos constituintes é conhecida e a composição química exata é

conhecida.

MEIO DE CULTURA COMPLEXO.

Muitas bactérias desenvolvem-se em meios complexos, cuja

composição química não é definida, compostos de nutrientes

como extratos de levedura, de carne, de vegetais, produtos de

digestão protéica, sangue e outros. A composição química exata

pode conter pequenas variações em diferentes culturas do

produto.

Composição dos meios de cultura

MEIO DE CULTIVO SELETIVO

Os meios seletivos contêm substâncias que inibem o

desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos,

permitindo o crescimento de outros. São elaborados com o

objetivo de favorecer o crescimento da bactéria de interesse e

impedir o crescimento das outras bactérias;

MEIO DE CULTIVO DIFERENCIAL

Meio diferencial é aquele que contém substâncias que

permitem estabelecer diferenças entre bactérias parecidas,

sendo utilizado para a fácil identificação da colônia da bactéria

de interesse quando existem outras bactérias crescendo

na mesma placa de meio de cultura.

Composição dos meios de cultura

27/03/2014

4

Meios de cultura

ÁGAR SANGUE

A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a

formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a

diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus

spp.

PRINCÍPIO:

Usado para o isolamento de

microrganismos não fastidiosos.

Verificação de hemólise dos

Streptococcus spp. e

Staphylococcus spp.

Cor original do meio: vermelho

Meios de cultura

ÁGAR SANGUE : Cor original do meio: vermelho.

Beta hemólise: presença de halo

transparente ao redor das colônias

semeadas (lise total dos eritrócitos).

Alfa hemólise: presença de halo

esverdeado ao redor das colônias

semeadas (lise parcial dos

eritrócitos).

Gama hemólise (sem hemólise):

ausência de halo ao redor das colônias

(eritrócitos permanecem

íntegros).

27/03/2014

5

Meios de cultura

ÁGAR MAC CONKEY

PRINCÍPIO

O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram

positivos especialmente enterococos e estafilococos.

A concentração de sais de bile é relativamente baixa em

comparação com outros meios, por isso não é tão seletivo

para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS.

FUNÇÂO: Isolar bacilos Gram negativos

Meios de cultura

ÁGAR MAC CONKEY

INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio: rosa avermelhado.

Crescimento de bacilos Gram negativos.

Colônias cor de rosa: fermentadoras de lactose.

Colônias incolores: não fermentadoras de lactose.

Não há crescimento de cocos Gram positivos.

27/03/2014

6

Meios de cultura

ÁGAR MAC CONKEY

Lac+ Lac-

Meios de cultura

ÁGAR CLED –

CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT

PRINCÍPIO

Usado para isolamento e quantificação de microrganismos

presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos

inibe o véu de cepas de Proteus.

FUNÇÂO:

Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram

negativos e leveduras.

27/03/2014

7

Meios de cultura

ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE

DEFICIENT

INTERPRETAÇÃO:

Cor original do meio: azul claro.

Colônias lactose positiva: cor amarela.

Colônias lactose negativa: cor azul.

Meios de cultura

CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION

PRINCÍPIO

É um meio derivado de nutrientes de cérebro e

coração, peptona e dextrose.

A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio,

carbono, enxofre e vitaminas.

A dextose é um carboidrato que os microrganismos

utilizam para fermentação.

27/03/2014

8

Meios de cultura

CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION

PRINCÍPIO

Função:

Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos,

meningococos, enterobactérias, não fermentadores,

leveduras e fungos.

Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de

susceptibilidade aos antimicrobianos, para realização de teste

de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano

a 42 e 44°C e para teste de motilidade em lâmina.

Meios de cultura

CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION

PRINCÍPIO

INTERPRETAÇÃO

Cor original do meio:

amarelo claro, límpido.

Positivo: presença de

turvação = crescimento

bacteriano.

Negativo: ausência de

turvação.

27/03/2014

9

Meios de cultura

LÖWENSTEIN JENSEN

PRINCÍPIO:

A base do meio é constituída por ovos integrais, o

que permite amplo crescimento das micobactérias e

o crescimento é satisfatório para o teste de niacina

(que é positivo para Mycobacterium tuberculosis).

Função:

Isolamento primário das micobactérias.

Meios de cultura

LÖWENSTEIN JENSEN

INTERPRETAÇÃO:

Cor original do meio: verde claro

Positivo: Crescimento de colônias

amarelas

Negativo: ausência de crescimento.

27/03/2014

10

Meios de cultura

LÖWENSTEIN JENSEN

Controle de Qualidade

Uma amostra do lote deve ser inoculada e observada para testar viabilidade dos nutrientes e certeza de resultados.

Ex: Estreptococos grupo A em ágar sangue – observar bom crescimento e beta-hemólise.

27/03/2014

11

Medidas Assépticas para a

Inoculação do Meio de Cultura

Alças flambadas antes e depois;

Deve-se esperar o resfriamento;

Os recipientes contendo meios deverão ser abertos somente na zona de esterilidade gerada pelo Bico de Bunsen;

A boca do tubo de ensaio deve ser aquecida antes e depois de ser retirada a tampa,

A rolha nunca deve ser apoiada na bancada;

Inoculação

27/03/2014

12

As cabines de fluxo laminar são unidades

projetadas para criar áreas de trabalho estéreis

para a manipulação, com segurança, de materiais

biológicos ou estéreis que não possam sofrer

contaminação do meio ambiente. Utilizam um

filtros de alta eficiência – filtro HEPA.

Nos fluxos da classe II que o manipulado não

contamine o operador e o meio ambiente.

Cabinas de fluxo laminar

Inoculação pour-plate

• O objetivo é obter colônias isoladas (estudo

qualitativo) para realizar a contagem de colônias

(estudo quantitativo)

Espécime 0,1 ml

+ 9,9 ml

= 1:100

0,1 ml

+ 9,9 ml

= :10.000

0,1 ml

+ 9,9 ml

= 1:1.000.000

27/03/2014

13

Plaqueamento - pour-plate

Espécime 0,1 ml

+ 9,9 ml

= 1:100

0,1 ml

+ 9,9 ml

= :10.000

0,1 ml

+ 9,9 ml

= 1:1.000.000

1 ml 1 ml 1 ml

ágar + incubação