relatório cultura de células

CULTURAS CELULARES BIOLOGIA E BIOQUÍMICA

24 DE ABRIL DE 2015

TRABALHO REALIZADO POR:

CÁTIA FERREIRA, Nº 9130336

FILIPA SILVA, Nº 9130338

HELENA ALVES, Nº 9130341

Biologia e Bioquímica

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Conteúdo 1 – Introdução ............................................................................................................................... 2

2 – Materiais Utilizados ................................................................................................................. 4

3 – Procedimento Experimental .................................................................................................... 5

4 – Procedimento Prático .............................................................................................................. 7

5 – Tratamento de Dados .............................................................................................................. 8

6 – Conclusão .............................................................................................................................. 10

7 – Bibliografia ............................................................................................................................. 11


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1 – Introdução No âmbito da unidade curricular de Biologia e Bioquímica foi-nos proposto a elaboração

de um trabalho experimental, cujo tema é “Culturas Celulares”.

As células vegetais e animais podem prolongar o seu crescimento in vitro, quando

isoladas de tecidos vivos, se os nutrientes e todos os outros fatores necessários à sua

sobrevivência, crescimento e proliferação forem corretamente fornecidos. Quando este

processo é realizado em laboratório, em condições controlada de temperatura, humidade,

oxigénio e dióxido de carbono, este é denominado por cultura celular.

A cultura de células permite que as mesmas funcionem como unidades independentes,

estas são capazes de crescer e se dividir normalmente, de forma similar a quando estão a crescer

in vivo, isto se os nutrientes necessários forem fornecidos ao meio de cultura e possuem

crescimento ilimitado até que um dos suplementos essenciais se esgote.

O meio de cultura é um líquido onde as células crescem e multiplicam-se, possuindo na

sua composição sais inorgânicos, aminoácidos essenciais e não essenciais, vitaminas,

antibióticos, uma fonte de energia, como a glicose, e um indicador de pH.

Dependendo do tecido de origem, numa cultura celular, as células podem crescer tanto

suspensas no meio de cultura, quando aderem formando monocamadas no fundo da garrafa

em que são cultivadas. As células em suspensão derivam de linhagens que originalmente não

necessitam de adesão ao substrato para proliferação. As células aderidas necessitam de ligar-se

ao substrato para se dividir e crescer, sendo esta ligação essencial porque as células perdem a

ancoragem ao substrato, elas param de proliferar e morrem.

As culturas celulares podem ser de três tipos:

Primárias, são produzidas a partir de células retiradas de um tecido por processos de

desagregação por métodos mecânicos, enzimáticos ou químicos. As culturas primárias

são portanto formadas a partir células que sobrevivem aos processos de desagregação,

aderem-se ao substrato da garrafa de cultura, ou mantêm-se em suspensão, e

proliferam. As células primárias possuem morfologia idêntica ao do tecido das quais se

originam. A cultura primária permite pouco número de divisões celulares, após as quais

entram em estado de senescência e morrem;

Finitas, são formadas após a primeira passagem de uma cultura primária. Estas culturas

irão proliferar por um número finito de divisões celulares, após as quais irão morrer. O

potencial proliferativo de algumas culturas finitas pode ser prolongado através da

introdução de genes virais transformantes.

Contínuas, este tipo de culturas irão fatalmente morrer ou eventualmente adquirir uma

mutação estável capaz de produzir uma cultura contínua. Esta mutação sofrida pelas

células é conhecida como transformação ou imortalização.

Existe um grande número de aplicação para células animais ou vegetais cultivadas, de entre

eles:

Estudos fisiológicos e bioquímicos de células normais ou tumorais;

Estudos dos efeitos de compostos químicos ou drogas variadas sobre tipos específicos

de célula;

Estudos para a geração de tecidos artificiais;

Síntese de produtos biológicos a partir de culturas celulares em larga escala;


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Produção de proteínas recombinantes glicosídeas, as quais não podem ser produzidas

por bactérias, uma vez que estas não possuem metabolismo necessário.

Para que haja uma manutenção do equilíbrio do meio celular é necessário colocar as linhas

celulares numa incubadora a uma temperatura de 37ºC e uma atmosfera de 5% de CO2. Os

meios celulares de cultura são o que mais varia entre as linhas celulares. O que pode variar é o

pH, os fatores de crescimento, concentração de glicose e a presença ou ausência de outros

nutrientes.

O fator de crescimento mais utilizado para a suplementação dos meios de cultura é o Soro

Fetal Bovino (FBS). Para além disso, é necessário adicionar um antibiótico e um fungicida.

Uma cultura de células necessita de estar livre de contaminações. A taxa de multiplicação

de células animais é relativamente baixa, comparada com células bacterianas. Enquanto as

bactérias podem-se duplicar a cada 30 minutos, as células animais requerem 18 a 24 horas. Isto

torna as culturas de células animais mais vulneráveis à contaminação uma vez que um pequeno

número de bactérias introduzido na garrafa de cultura pode crescer rapidamente em uma

população de células normal. Para evitar a introdução de microrganismos na cultura, vários

cuidados básicos de manipulação e prevenção devem ser tomados. Todo o trabalho da cultura

de células deve ser realizado em um fluxo laminar inspecionado e em bom estado de

funcionamento. Antes do procedimento, a luz ultravioleta que fica dentro do fluxo laminar deve

ser ligada e mantida por, no mínimo, 30 minutos e de preferência, com os materiais a serem

expostos a ela. Todo o material utilizado deve ser desinfetado com agentes próprios. Todos os

equipamentos e materiais utilizados na cultura celular devem ser esterilizados. É obrigatório o

uso de luvas e a cada vez que são retiradas as mãos do espaço interno do fluxo, devem lavar-se

com álcool de 70%. O uso de fogo dentro do fluxo também pode minimizar a ocorrência de

contaminação. Utilizando estes cuidados fundamentais, é possível evitar a contaminação do

meio de cultura com microrganismos nocivos.


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2 – Materiais Utilizados Equipamentos

Câmara de fluxo de ar laminar

Incubadora CO2 a 37ºC

Centrifugadora

Microscópio de contraste de fase/invertido

Pipetador automático

Micropipetas ou pipetas automáticas

Contador automático ou Camara de Newbauer

Banho-maria

Reagentes

Meio de cultura (500mL)

Glutamina

FBS

Antibióticos (Penstrep)

Fungicidas – Fungizona (1%)

Álcool 70%

PBS (tampão fosfato)

RKO

Tripsina

Azul Tripano

Consumíveis

Frascos de cultura (27 cm2/75cm2)

Tubos de falcon (15mL e 50mL)

Pipetas graduadas de plástico e degradáveis

Pipetas Pasteur descartáveis

Eppendorfeis

Criotubos de DNSO


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3 – Procedimento Experimental A – Inicio da Cultura

1- Retirar o meio de cultura do frigorífico e colocá-lo na estufa/banho a 37º cerca de 40 minutos antes de iniciar a cultura.

2- Marcar um tubo Falcon de 15 mL com a sigla da linha celular.

3- Colocar 4 mL de meio de cultura no Falcon.

4- Retirar a alíquota da linha celular da arca a -80ºC.

5- Com uma pipeta de Pasteur adicionar meio de cultura ao criotubo com a alíquota congelada, homogeneizar e passar para o Falcon.

6- Repetir o passo anterior as vezes necessárias para que o criotubo fique vazio (este passo deve ser feito o mais rapidamente possível dado que o DMSO é tóxico acima de 4ºC).

7- Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos.

8- Marcar 1 frasco de cultura de 25 mL com nome da linha, meio de cultura utilizado, data e o nome do grupo e colocar 4 mL de meio no frasco de cultura.

9- Após centrifugação rejeitar o sobrenadante.

10- Colocar 1 mL de meio de cultura no Falcon para ressuspender o pellet (deixar o meio escorrer pelas paredes).

11- Colocar o meio com as células no frasco de cultura.

12- Espalhar o meio homogeneamente pelo fundo da caixa.

13- Colocar o frasco de cultura na estufa a 37ºC com 5% de CO2.

B – Mudar o Meio de Cultura

1 - Retirar o meio de cultura do frigorífico e colocá-lo na estufa a 37º cerca de 40 minutos antes de iniciar o procedimento.

Se as células ainda estiverem em suspensão: Se as células estiverem aderentes:

1- Marcar um tubo Falcon de 15 mL com a sigla da linha celular.

1- Inclinar o frasco de cultura para que o meio se concentre num dos cantos inferiores

da caixa.

2- Inclinar o frasco de cultura para que o meio se concentre num dos cantos inferiores

da caixa.

2- Com uma pipeta de Pasteur recolher o meio de cultura e rejeitar no lixo.

3- Com uma pipeta de Pasteur recolher o meio de cultura e colocá-lo no Falcon.

3- Colocar novo meio no frasco de cultura.

4- Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos.

4- Espalhar o meio homogeneamente pelo fundo do frasco.

5- Colocar 4 a 6 mL de meio num novo frasco de cultura.


6- Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet em

1mL de meio de cultura.

7- Colocar o meio com as células no frasco de cultura previamente identificado.


9- Colocar a caixa de cultura na estufa a 37ºC com 5% de CO2.


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C – Dividir a Cultura

1- Retirar o meio de cultura e a tripsina do frigorífico e colocá-los na estufa a 37º cerca de 40 minutos antes de iniciar o procedimento.

2- Retirar o meio do frasco de cultura e rejeitá-lo no lixo.

3- Colocar 2 mL de tripsina no frasco de cultura e colocá-lo na estufa durante 5-6 minutos, até as células se soltarem todas do fundo do frasco. Verificar ao microscópio.

4- Marcar um tubo Falcon de 15 mL com as indicações referentes à linha celular.

5- Colocar 4 mL de meio de cultura no frasco de cultura para neutralizar a tripsina e ir passando as células para o Falcon (até o frasco ficar completamente vazio e limpo de

células).

6- Centrifugar 5 minutos a 1200 rpm.

7- Colocar 4 mL de meio no frasco de cultura.

8- Rejeitar o sobrenadante após centrifugação.

9- Colocar 1 mL de meio de cultura no Falcon para ressuspender o pellet (deixar o meio escorrer pelas paredes).

10- Colocar o meio com as células no frasco de cultura.




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4 – Procedimento Prático 1- Retirar o meio de cultura e a tripsina do frigorífico e colocá-los na estufa a 37º cerca de 40

minutos antes de iniciar o procedimento.

2- Retirar o meio do frasco de cultura e rejeitá-lo no lixo.

3- Colocar 2 ml de tripsina no frasco de cultura e colocá-lo na estufa durante 5-6 minutos, até as células se soltarem todas do fundo do frasco. Verificar ao microscópio.

4- Marcar um tubo Falcon de 15 ml com as indicações referentes à linha celular.

5- Colocar 4 ml de meio de cultura no frasco de cultura para neutralizar a tripsina e ir passando as células para o Falcon (até o frasco ficar completamente vazio e limpo de

células).

6- Centrifugar 5 minutos a 1200 rpm.

7- Rejeitar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender o pellet em 4 ml de meio de cultura.

8- Num eppendorf preparar a solução de Azul tripano e células. Efetuar uma diluição das células de 1/5 num volume final de 250 µL. O Azul tripano deve estar a ½ no volume final.

a. 50 µL de células b. 125 µL de Azul tripano

c. 75 µL de meio de cultura

9- Prepare a câmara de Neubauer: humedeça os lados esmerilados com a solução que vai fixar a lamela, e coloque a lamela.

10- Toque com a pipeta que contêm a suspensão de células num dos lados da câmara, junto à lamela. Deixe sair a quantidade estritamente necessária para preencher por difusão o

espaço de contagem, mas não deixe sair solução em excesso para não inutilizar a contagem.

11- Deixe repousar a câmara no mínimo durante 3 minutos.

12- Conte as células usando o microscópio.

13- Calcule a concentração de células na suspensão fornecida (número de células contadas por unidade de volume, ml ou mm3 células que corarem de azul estarão mortas.

14- Apresente os cálculos efetuados. Se necessitou de efetuar diluições não se esqueça de entrar com o seu valor nos cálculos.


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5 – Tratamento de Dados

Ao efetuar a contagem das células consideramos que contam as células que se

encontram no interior do quadrado mais pequeno e nos limites superior e lateral esquerdo.

Nº de células Quadrado 1 Quadrado 2 Quadrado 3 Quadrado 4 Quadrado 5

Contagem 1 8 15 9 7 8

Contagem 2 7 14 9 17 16

Total de células 110

Média de Células Total 11

Volume de cada Quadrado 4x10-6 ml


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𝑛º 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

Á𝑟𝑒𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜 (𝑚𝑚2) × 𝑝𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (𝑚𝑚)× 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 =

𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

𝑚𝑚3<=>

11

4 × 10−6× 2

= 5.5 × 106 𝑐𝑒𝑙/𝑚𝑙

Cálculo do Volume Inicial

𝑐𝑖 × 𝑣𝑖 = 𝑐𝑓 × 𝑣𝑓 <=> 11.3 × 106 × 𝑣𝑖 = 1 × 106 × 4 <=> 𝑣𝑖

= 0.35398 𝑚𝑙 = 35 𝜇𝑙


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6 – Conclusão A atividade experimental realizada teve como objetivos a execução de culturas

celulares, a sua posterior manipulação, e a quantificação celular e deliberar a viabilidade celular.

A viabilidade celular delimita a quantidade de células que se encontram vivas ou mortas

numa amostra total de células. É uma medida direta com o número de células saudáveis de uma

amostra.

O Azul Tripano é um corante vital, cuja reatividade é baseada no facto de este ser

carregado negativamente e não interagir com a célula, a menos que a membrana esteja

danificada. Em suma, todas as células que excluem o corante são viáveis.

Ao longo da atividade podemos concluir que as células observadas ao microscópio

encontravam-se num número razoável sendo que poucas estavam coradas com o Azul Tripano.

No processo de contagem de células só foram contabilizadas as células que não estavam

coradas com o corante utilizado porque as que estavam coradas eram mortas, logo não eram

viáveis.

Em suma, podemos concluir que a nossa atividade foi bem-sucedida pois o número de

células mortas era reduzido e as células estavam a crescer de forma saudável.


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7 – Bibliografia Manual de protocolos práticos de apoio às aulas da componente Biologia.

Martins, M. R. 2013.

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