fisiologia microbiana: nutrição e crescimento nutrição microbiana –componentes necessários...

Fisiologia microbiana: nutrição e crescimento

• Nutrição microbiana– Componentes necessários às células– Meios de cultura– Condições ambientais

• Crescimento populacional– Velocidade de crescimento– Tempo de geração– Medidas do crescimento

Introdução

• De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais.

• Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais.

• Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades nutricionais em comum:- carbono- nitrogênio- água

NUTRIÇÃO MICROBIANA

• Em algumas situações os microrganismos são estudados em seu hábitat natural.Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo

• Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório

Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais

Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.



Para o cultivo in vitro são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais.

Os elementos químicos principais para o crescimento das células incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes.

• O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano – todos requerem carbono

• Os compostos orgânicos são os que contém carbono

• Exceção para o dióxido de carbono que é considerado como inorgânico.


MACROnutrientes: necessários em grande quantidade. Tem papel importante na

estrutura e metabolismo.

MICROnutrientes: quantidades mínimas. Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas

Uma célula típica

Matéria seca

Água

C

N

H

P, S, K, Na ...

Componentes necessários às células

• Fonte de Carbono

O carbono forma o esqueleto das três maiores classes de nutrientes orgânicos:- Carboidratos

- Lipídeos - Proteínas

• Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular.Utilização de compostos orgânicos – heterotróficos

• Utilização de CO2 – autotróficos

É a forma mais oxidada do C, assim a fonte de energia para os autotróficos

provém da luz.

• Fonte de Nitrogênio

- Depois do C é elemento mais abundante, cerca de 12%

(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)

► Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, etc.)

► Moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)


• Hidrogênio

- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases)

• Função do H:

– Manutenção do pH– Formação de ligações de H entre moléculas – Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da

respiração


• Oxigênio

- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos ...)

- É obtido a partir das proteínas e gorduras.

► Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos

para os processos de geração de energia.

► Embora não adicionado inicialmente no meio, é um

componente muito importante nos processos aeróbios.


• P – Sínese de ácidos nucléicos, ATP;

• S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas;

• K – Atividade de enzimas;

• Mg – Estabilidade dos ribossomos;

• Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de

endósporos;

• Na – Requerido por microrganismos marinhos;

• Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das

proteínas envolvidas no transporte de elétrons.


Outros macronutrientes:

• Traços dos seguintes METAIS são necessários na composição de

um meio de cultura:

Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B

► Exercem função estrutural em várias enzimas

Nem sempre sua adição é necessária: existência de traços

Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água destilada

purificada pode apresentar deficiências.

Requisitos nutricionais - Micronutrientes

• Água

- Componente absolutamente indispensável

(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)

► Laboratório: destilada, filtrada, deionizada

• Outros aditivos

Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH.

►Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos

Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos

Água e outros aditivos

► Tampões

- Carbonato de cálcio

- Fosfatos

- Proteínas (peptona)

►Inibidores

Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger

Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico

Outros aditivos

►Indutores

- A maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.

Ex: celulose induz a celulasepectina induz a pectinaseamido induz a amilase

►Antiespumantes

- Cultivos com aeração ocorre a produção de espuma

• Remoção de células, perda do produto, contaminação;• Redução do volume do meio

• Um antiespumante reduz a tensão superficial das bolhas

(álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis, ... )

Outros aditivos

MEIOS DE CULTURA

Soluções nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.

Classes Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)

Complexos (utilizam hidrolisados – caseína, carne, soja, levedura)

Não existe um meio de cultura universal, mas

Existem vários tipos meios para diversas finalidades

Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de

suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e

proporção adequada.

MEIOS DE CULTURA

MEIOS DE CULTURA

• Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo:

Composição elementar média (% do peso seco)

Elemento Bactéria Fungo

Carbono 52 51

hidrogênio 7 7

Nitrogênio 13 8,5

Fósforo 2,5 0,4-4,5

Enxofre 0,6 0,1-0,5

Potássio 2,5 0,2-2,5

Sódio 0,75 0,02-0,5

Cálcio 0,55 0,1-1,4

Magnésio 0,25 0,1-0,5

Cloro 0,5 -

Ferro 0,1 0,15

Relação C:N média 4:1 6:1

Relação C:N:P:S 85:23:4:1

Passo 1: utilizar dados da composição elementar

Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de N, ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N)

Obs.: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles.

Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos)

Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)

Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose

Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1

.... E assim por diante.

Passo 2: otimização

MEIOS DE CULTURA

Temperatura oxigênio pH Radiação eletromagnética Pressão barométrica, hidrostática e osmótica

Condições ambientais

Efeito da temperatura no crescimento microbiano

Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante

Efeito do oxigênio no crescimento microbiano

Meio gelatinoso com indicador redox:

Rosa quando oxidado

Incolor quando reduzido

Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos.

Ex: H2O2, OH°, O2-

Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas

Sistema para cultivo de anaeróbios

Sistema para cultivo de aeróbios

• Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células

• Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão

Varia de minutos até diasDepende muito das condições ambientais

Escherichia Coli - 20 minutosPisolithus microcarpus – 2,5 dias

CRESCIMENTO MICROBIANO

O padrão de crescimento é o exponencial

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 50 100 150 200 250 300

minutos

célu

las

Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos:

21 > 22 > 23> 24

Onde N = n° microrganismos ao fim de n divisões N0 é o número inicial

O número de gerações será:

A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo:

A recíproca de R é o tempo de geração:

Essas equações não se aplicam a microrganismos filamentosos.

Assim, é mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se considera a variação da massa (X), em função do tempo como sendo proporcional a concentração de biomassa presente:

n0N =N .2

0n = 3,3(logN- logN )

0

nR =

t - t

01 t - tG = =

R n

dX

Xdt

• Velocidade específica de crescimento:

Num cultivo batelada ocorre o aumento da concentração da biomassa

Assim, é necessário definir uma velocidade de crescimento que considere a

quantidade de biomassa presente.

1 dX

=X dt

A integração dessa equação diferencial fornece a equação algébrica do crescimento exponencial da biomassa:

Ou escrita de outra forma:

iM0i

μ (t-t )X = X e

M 0ilnX = μ .t + lnX

• Tempo de duplicação: considerando que X = 2.X0i, resulta:M

ln2G =

μ

dX

Xdt

dX

.Xdt

O estudo cinético de um cultivo microbiano consiste da análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema, em função do tempo de cultivo.

► microrganismo, nutrientes, metabólitos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

2

4

6

8

10

12

14

S (

g.L-1

)

Tempo (dia)

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

pH

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X (

g.L-1

)

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

CP (

mg.

L-1)

O ciclo de crescimento

• A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana

• O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.

1) Fase Lag

Período de adaptação da cultura

• Mudança de meio, preparação do complexo enzimático (síntese)

• Células com danos, mas ainda vivas (stress osmótico, temperatura, tóxicos).

2) Fase exponencial

Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.

• A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as

velocidades de crescimento são bastante variáveis:

- Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos

- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

3) Fase estacionária:

Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial

não pode ocorrer indefinidamente.

• Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.

Divisão = morte → crescimento líquido nulo

• Ainda pode ocorrer: metabolismo energético e produção de metabólitos

secundários

4) Fase de morte (declínio):

• A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as

células ao processo de morte.

- A morte celular é acompanhada da lise celular

MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO

• Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:

1) Peso seco total das próprias células – filtração, secagem e pesagem

2) Peso de algum componente celular – extração, secagem e pesagem

3) Variação no número de células a) contagem de células totais b) contagem de células viáveis

a) Contagem de células totais (contagem microscópica direta)

Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)Ex.: Câmara de Neubauer

MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta

• Vantagens: método rápido e fácil

• Desvantagens

Não distingue as células vivas das mortas

Pode-se omitir células pequenas

Células móveis precisam ser imobilizadas

Entre outras.

MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem indireta

b) Contagem de células viáveis:

Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.

Razões:

Erros devido à junção de células na colônia

Restrições podem fazer células viáveis não originar colônias

São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis.

É contada a placa com 30 a 300 colônias

• Diluição das suspensões celularesAmostras concentradas precisam ser diluídas

MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Outros métodos:

TurbidimetriaAs células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio

Pode ser medida com um espectrofotômetro

•O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão•Turbidez X quantidade de células

Contagem eletrônica

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