nutrição e crescimento bacteriano
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Nutrição e Crescimento Bacteriano
Prof. Adjunto Ary Fernandes Junior
Departamento de Microbiologia e Imunologia
Instituto de Biociências – UNESP
Tel. 14 3880.0412/0413
Características básicas das bactérias
Estudos de Biologia Celular
10 horas 1 bilhão de células
95% do
peso
seco da
célula
Crescimento bacteriano
+ Motilidade,
Luminescência, etc
Visão geral do metabolismo celular
Cultura: Propagação do microrganismo
em condições adequadas
(Exigências Nutricionais e Ambientais)
Nutrição: Fornecimento de substâncias
nutritivas para o crescimento
bacteriano
(Energia e Matéria Plástica)
FATORES NUTRITIVOS (in vitro = in vivo)
Ex: Haemophilus influenzae
Hemina (fator X), NAD+ (fator V)
Fastidiosos
N NaHK
Mg
Co Zn Mo Se etc
CaFatores de
Crescimento
OBS. Não existe um meio de cultura universal.
Classificação dos Meios de Cultura
(Substâncias nutritivas Sintéticos e Complexos)
Líquido
(Turvação do
meio)
Sólido
(1,5 a 2,0%)
(Colônias)
Classificação dos Meios de Cultura
(Estado fisico) Agar
Semi-Sólido
(0,5%)
(Movimento)
(Enriquecidos)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
Agar Sangue
Agar Chocolate
Lowenstein - Jensen
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Seletivos)
(Meio seletivo para Bacillus cereus)(Agar MacConkey)
(MAS – Manitol Salt Agar)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Seletivos)
(Eosin Methilen Blue (EMB) Oxoid Chromogenic Listeria Agar (OCLA)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Diferencial)
(Agar Sangue)
(Padrão de Hemólise)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(Diferencial)
(Agar MacConkey)
(Fermentação da Lactose)
Lactose (-)
Lactose (-)
Lac + Lac -
(Meio Cromogênico)
(E. coli/coliformes em alimentos e água)
(Meio de Tetrationato)(Meio de Selenito Cistina)
Classificação dos Meios de Cultura
(Poder Seletivo e Diferencial)
(De Enriquecimento)
Etapas do preparo de um meio sólido
FATORES NUTRICIONAIS
ÁGUA - Solvente; Elevado Calor Específico;
Regula Pressão Osmótica; Participação em
Reações Químicas, Estrutura de
Macromoléculas, etc
FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio
*Fotossintetizantes Fototróficas
Quimiossintetizantes Quimiotróficas
(Quimiolitotróficas e Quimiorganotróficas)
FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio
RECEPTORES DE HIDROGÊNIOS
Respiração aeróbia O2.
Respiração anaeróbia NO3-, SO4
-, CO2..
Fermentação Fermentação Lática, Alcoólica, etc.
Respiração anaeróbia receptor inorgânico ≠ do O2
(ex: SO42-, NO3
-, CO2, S)
Salmonella, the host and its microbiota. S. Typhimurium uses its virulence factors (flagella, T3SS-1 and T3SS-2) to invade the epithelium and
survive in mononuclear cells. The ensuing inflammatory response results in the epithelial release of an antimicrobial (lipocalin-2) that sequesters
iron chelators (enterobactin) produced by the microbiota, but not an iron chelator (salmochelin) produced by S. Typhimurium. ROS generated by
neutrophils migrating into the intestinal lumen oxidize an endogenous sulfur compound (thiosulfate) to generate a respiratory electron acceptor
(tetrathionate) that enables S. Typhimurium to edge out the fermenting microbiota, thereby enhancing transmission of the pathogen.
Thiennimitr et al, 2011. Salmonella: the host and its microbiota. Current opinion in Microbiology, v.15, n.02, p.108-114, 2012.
4 H2 + SO42- + H+
HS +4 H20 4 H2 + CO2 CH4 + 2 H20
Fermentação Composto orgânico produzido durante o
próprio processo fermentativo.
CARBONO (Composição dos Compostos Orgânicos
-Compostos orgânicos - Quimio-heterotróficos.
-CO2 (Fotossíntetizantes) - Fotoautotróficos.
NITROGÊNIO (Proteínas, Ácidos Nucléicos, Coenzimas)
Orgânica - Aminoácidos, Sais Orgânicos de Amônia.
Inorgânica - NH3, NO3-, N2
ENXOFRE (Aminoácidos Sulfurados, Vitaminas)
-Forma orgânica (Radicais sulfidrilas);
-Forma inorgânica ( SO4- , H2S)
-Forma elementar
FÓSFORO (ATP, Ácidos Nucléicos, Fosfolipídeos, Coenzimas)
-Fosfato inorgânico (PO42- )
ATIVADORES DE ENZIMAS
Minerais na forma de sais:
-Mg++e K+ (Ribossomos)
-Fe++ (citocromos e peroxidases)
-Ca++ (Parede celular de Gram positivas e esporulação)
ELEMENTOS TRAÇOS - Cobalto, Zinco (Atividade de
Enzimas), Molibdênio
FATORES DE CRESCIMENTO - Ex: Vitaminas,
Aminoácidos, Bases Nitrogenadas, Ácidos
Graxos, etc.
FATORES AMBIENTAIS
pH
Temperatura
Aeração (O2)
Osmolaridade
FATORES AMBIENTAIS
pH – Estrutura e funções das proteínas
Maioria na faixa ótima de pH entre 6 e 8.
Ex. Thiobacillus - 1 e 2 (Acidófila)
Vibrio comma - 10 (Alcalinófila)
Obs. Normalmente os meios de cultura são
tamponados.
Bactérias patogênicas pH ao redor de 7
Organismo
Mínimo Ótimo Máximo
Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0-2,8 4,0-6,0 Sulfolobus acidocaldarius 1,0 2,0-3,0 5,0
Bacillus acidocaldarius 2,0 4,0 6,0 Zymomonas lindneri 3,5 5,5-6,0 7,5
Lactobacillus acidophilus 4,0-4,6 5,8-6,6 6,8 Staphylococcus aureus 4,2 7,0-7,5 9,3
Escherichia coli 4,4 6,0-7,0 9,0 Clostridium sporogenes 5,0-5,8 6,0-7,6 8,5-9,0
Erwinia caratovora 5,6 7,1 9,3 Pseudomonas aeruginosa 5,6 6,6-7,0 8,0
Thiobacillus novellus 5,7 7,0 9,0 Streptococcus pneumoniae 6,5 7,8 8,3
Nitrobacter sp 6,6 7,6-8,6 10,0
Valores mínimos, ótimos e máximos de pH durante o cultivo para algumas bactérias
Acidofílicas
Neutrofílicas
Alcalinofílicas
Temperatura - Velocidade das reações químicas
Concentração
elevada de ácidos
graxos insaturados
garante fluidez da
membrana
plasmática
Patogênicas
ao homem e
animais)
Organização tridimensional das proteínas
permite a manutenção da estrutura
adequada para sua ação em elevadas
temperaturas
Aeração - Metabolismo energético
Aeróbio estrito
(18-21% )
P. aeruginosa,
Mycobacterium
Anaeróbio estrito
(<0,5%)
C.haemolyticum
Facultativo
(<0.5-21%)
Enterobactérias
Microaerófilo
aeróbio (1-5%)
Campylobacter,
Neisseria
Microaerófilo
anaeróbio
(Aerotolerante)
(2-8%)
Bacteroides,
Clostridium
Bactérias aeróbias e facultativas
O2 Metabolismo
Ação das enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase. Estas
enzimas eliminam radicais tóxicos do oxigênio que são inevitavelmente gerados
em sistemas vivos na presença de O2. A distribuição destas enzimas nas células
determina a capacidade destas células existirem na presença de O2 .
Sistema de
desintoxicação
Produtos
não tóxicos
O2 + 2 e- + 2 H+ H2O2
O2 + e- O-
2
O2 + H2O2 OH*
O-2 + H2O2 O2 + OH2- + OH*
H2O2 + e- + H+ H2O + OH*
Produtos
tóxicos
Bactérias anaeróbias estritas
Danos ao DNA, destroem
componentes lipídicos, inativam
enzimas
Morte
bacteriana
O2 Metabolismo
O2 + 2 e- + 2 H+ H2O2
O2 + e- O-
2
O2 + H2O2 OH*
O-2 + H2O2 O2 + OH2- + OH*
H2O2 + e- + H+ H2O + OH*
Produtos
tóxicos
Ausência do
sistema de
desintoxicação
Reação positiva produzida por Bacillus sp,
Staphylococcus sp; Reação negativa produzida
por Clostridium sp, Streptococcus sp.Teste da Catalase
Método da
vela acesa
(microaerofilia)
Grampo
de rosca
Tampa com
anel
selador
Catalisador
de paládio
em pastilha
Envelope
contendo
bicarbonado de
sódio e boroidreto
de sódio
Placas de
Petri
Indicador de
anaerobiose
(azul de
metileno)
Jarra de anaerobiose (Sistema GasPak)
Câmara de anaerobiose (“Glove Box”)
Controle da Osmolaridade Transporte ativo de K+ para interior da célula e
eliminação de PUTRESCINA
Osmolaridade - Concentração de solutos no
meio Disponibilidade de água
Aumento no número de células no meio de cultivo
Meio líquido Turvação do meio de cultivo;
Meio Sólido Formação de colônias
Concentração Celular = Núm. Cel. / Vol. meio
Densidade Celular = Massa Cel./ Vol. meio
CRESCIMENTO BACTERIANO
Após inoculação no meio de cultura (= “semeadura”)
em condições ótimas
Contagem bacteriana
(Plaqueamento)
Absorbância = 2 - Log de % de Transmissão
NMP
(Número Mais provável)
Tubos de meio
nutriente (grupo de
cinco tubos
Número de tubos
positivos por
grupo
Volume de
inóculo
para cada
grupo de
cinco tubos
Combinação de
tubos positivos
Índice de
NMP/100mL Inferior Superior
Limites com 95%
de confiabilidade
Fases do crescimento bacteriano
Fisiologicamente
ativas
Tempo de
geração
Progressão
geométrica (Crescimento
Morte)
(Crescimento << Morte)
Formas de involução
Taxa de Crescimento x Tempo de
Geração
Semeadura = Inocular (transferir o microrganismo a um meio de
cultura)
SEMEADURA POR ESGOTAMENTO
SEMEADURA EM QUADRANTES
Semeadura Correta
Semeadura Errada
Princípios de Alguns Testes
Bioquímicos
2 H2O2 2 H2O + O2
Catalase
Comum em bactérias aeróbias e anaeróbias
facultativas
Staphylococcus, Bacillus (+) e Streptococcus (-)
Oxidase (Citocromo oxidase)
Oxidação do Citocromo C pelo O2
Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima
adquirindo cor vermelha
Neisseria (+), Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)
Prova de OF
(Oxidação - Fermentação)
(Carboidrato Ácido)
Azul de Bromotimol: pH Alcalino (Azul), pH Ácido
(Amarelo)
Glicose Enterobactérias, Staphylococcus
(Fermentam), Pseudomonas, Micrococcus (Oxidam)
Fermentação de Açúcares
Produção de Ácido ou Ácido mais gás
Açúcar a ser estudado + indicador de Andrade
(vermelho em pH ácido)
Enterobactérias Glicose (Todas), Lactose
(Algumas espécies apenas)
Glicose Lactose
Família Enterobacteriaceae
Lactose
-
Gêneros
Shigella
Salmonella
Proteus
Providência
Morganella
+
Gêneros
Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Agar MacConkey
Vermelho de Metila (VM): Fermentação Mista
(Glicose Acidos Orgânicos)
Vermelho de Metila em pH ácido (4,5) fica Vermelho
E.coli (+), Enterobacter (-) 1 2 3
Voges-Proskauer (VP)Fermentação
Butilenoglicólica
Glicose Acetilmetilcarbinol (= Acetoina) 2,3 butilenoglicol
Acetoina + Creatinina composto vermelho
E. coli (-), Klebsiella pneumoniae (+), Enterobacter (+)
Indol
Triptofanase
Triptofano Indol
Para Dimetilaminobenzaldeído = Reativo de Kovacs + indol
Composto vermelho.
E. coli (+), Klebsiella-Enterobacter (-)
Não inoculado + -
Citrato de Simnons
Citrato de Sódio como única fonte de C
Se bactéria usa (Cresce) – Alcaliniza o meio Azul
(Azul de Bromotimol)
Klebsiella - Enterobacter (+), E. coli (-)
Uréia
(Urease)
Amônia
Alcalinização do meio (Vermelho Fenol Vermelho)
E. coli (-), K. pneumoniae (+)
Fenil-Alanina
Desaminação da Fenil-alanina Ácido Fenilpirúvico
Ac. Fenilpirúvico + Cloreto Férrico Hidrazina (Cor
verde-garrafa)
Característica de todas espécies de Proteus
+-
Movimento
Crescimento em meio semi-sólido (0,5% de Ágar)
Imóvel - Cresce só no local da picada: K. pneumoniae
Móvel - Cresce além da picada: E. coli
EPM, MILI
Tríplice Açúcar com ferro
TSI
Métodos Miniaturizados
