NUTRIO DE MICRORGANISMOS E CRESCIMENTO MICROBIANOOs microrganismos so, entre os seres vivos, os mais versteis e diversificados em suas exigncias nutricionaisO cultivo de microrganismos requer meios de cultura apropriados.Meios de cultura so preparaes de nutrientes utilizados para o crescimento de microrganismosRequerimentos nutricionais das clulas Todo organismo precisa encontrar em seu ambiente, todas as substncias necessrias para a gerao de energia e biossntese celular. Nutrientes: So todos os elementos qumicos utilizados pelo microrganismos, para seu crescimento. No laboratrio os microrganismos crescem em um meio de cultura que fornece todos os nutrientes essenciais, em soluo, para o crescimento microbiano.

Staphylococcus aureus e Haemophilus influenzae crescendo em gar sangue

Colnias de Pseudomonas aeruginosa crescendo em placa com gar.

Elementos qumicos principais para o crescimento das clulas microbianas CarbonoUm dos elementos qumicos mais importantesForma o esqueleto das trs principais classes de nutrientes orgnicos: carboidratos, lipdeos e protenas Compostos orgnicos e inorgnicosHeterotrficosAutotrficos Nitrognio Todos os organismos necessitam de nitrognio uma parte essencial dos aminocidosFixao biolgica do nitrognio

O ciclo do carbono. Matria orgnica (CH2O) derivada da fotossntese (plantas, algas e cianobactrias) Fornecem nutrientes para os heterotrficos (ex. Animais, fungos e bactrias), que converte de volta em CO2. Restos organicos, bem como matria orgnica morta no solo e gua, so degradadas at CO2 por processos microbianos de biodegradao.

O ciclo do nitrognio

Hidrognio, Oxignio, Enxofre e Fsforo Tambm so elementos essncias H e O fazem parte de muitos compostos orgnicos Enxofre constituinte de aminocidos Fsforo essencial para sntese de cidos nuclicos e ATP Outros elementos K, Mg, Fe, Ca e Mn Elementos traos So ons metlicos requeridos por certas clulas, em quantidades to pequenas que so difceis de se detect-los e no necessrio adicion-los ao meio de cultura como nutrientesZn, Co, Cu, e Mo

Tabela. Elementos principais, suas fontes e funes nas clulas bacterianas.

Fatores de crescimento Um organismo pode necessitar de pequenas quantidades de certos compostos orgnicos para seu crescimento, pelo fato delas serem substncias essenciais que no podem ser sintetizadas pelo organismo a partir de nutrientes disponveis. Estes compostos so chamados de fatores de crescimento Fatores de crescimento so organizados em trs categorias:1.purinas e pirimidinas: requeridas para a sntese de cidos nuclicos (DNA e RNA) 2. aminocidos: necessrios para a sntese de protenas 3. vitaminas: necessrias como coenzimas e grupos funcionais de certas enzimas

Tabela. Vitaminas necessrias na nutrio de certas bactrias.

Classificao nutricional dos microrganismos Microrganismos quimiotrficos: Obtm energia de compostos qumicos Microrganismos fototrficos: dependem da energia radiante

Baseado nas fontes de carbono e energia, os microganismos podem ser classificados em quatro principais grupos (tabela).

Tabela. Principais grupos nutricionais de procariotos

Meios utilizados para o cultivo de microrganismos O meio de cultura proporciona uma ambiente nutricional (bioqumico) para o crescimento de microrganismos. Dependendo das necessidades especiais de um microrganismo particular, uma variedade de meios de culturas tm sido desenvolvidos com diferentes propsitos e usosMeios lquidosMeios slidosgarMeios para o cultivo de BactriasMeios para o cultivo de FungosMeios para o cultivo de ProtozoriosMeios para o cultivo de Algas

Tipos de meios de crescimentoMeio quimicamente definido (Sinttico) aquele cujo a exata composio qumica conhecida

Tabela. Meio mnimo para o crescimento de Bacillus megaterium. Um exemplo de meio qumicamente definido para o crescimento de uma bactria heterotrfica.

Tabela. Meio definido (tambm um meio enriquecido) para o crescimento de Thiobacillus thiooxidans, uma bactria litoautotrfica.

* Meio aerado intermitantemente com ar contendo 5% de CO2.

Tipos de meios de crescimentoMeio complexo (indefinido) aquele cujo a exata composio qumica desconhecidaTabela. Meio complexo para o crescimento de bactrias fastidiosas.

Tabela. Meio seletivo enriquecido para o crescimento de haloflicos extremos.

Tipos de meios de crescimento Meios para anaerbios aquele para o crescimento de microrganismos aerbios

Meios seletivosPermitem o crescimento de um tipo particular de microrganismos ou suprime o crescimento de outros tipos de microrganismos. Ex. gar sabouraud

Meios diferenciaisMeios de cultura utilizados para diferenciar vrios tipos de microrganismos em uma mesma placa com gar

Colnias de E. coli crescendo em gar EMB.

Tipos de meios de crescimentoMeios seletivos/diferenciaisParticularmente teis em microbiologia de sade pblica

Meios de enriquecimentoFavorece o crescimento da espcie desejada, mas no o crescimento de outra espcies presentes em uma populao mista

Meios para ensaios microbiolgicos

Tabela. Alguns meio seletivos e/ou diferenciais comercialmente disponveis para bactrias

Meio Uso pretendidoPrincpios de usogar MacConkeyMeio seletivo e diferencial para isolamento e diferenciao de bactrias Gram-negativas fermentadoras de lactose das bactrias entricas no-fermentadoras de lactoseAs colnias de bactrias capazes de fermentar lactose produzem uma variao de pH que pode ser evidenciada pela mudana de cor de um indicador de pH (vermelho neutro), que confere cor vermelha as colnias.gar desoxicolatoMeio seletivo e diferencial em placa para o isolamento de bacilos entricos Gram-negativosAs colnias de coliformes (fermentadoras de lactose) so vermelhas.gar feniletanolMeio seletivo para o isolamento de estafilococos e estreptococos Gram -positivos a a partir de espcimes tambm contendo organismos Gram-negativosO feniletanol permite o crescimento de bactrias gram-positivas

gar columbia CNAO meio seletivo ao qual se adicionou sangue, utilizado para o isolamento dos coco Gram-positivosOs agentes antimicrobianos colistina e cido nalidxico suprimem o crescimento de bactrias Gram-negativas

Condies fsicas para o cultivo de microrganismos Quatro condies principais influenciam o meio fsico de um microrganismo: temperatura, pH, atmosfera gasosa e presso osmticaTemperaturaMicrorganismos tem sido encontrados crescendo em virtualmente todos os ambientes onde existe gua no estado lquido, inifernte da temperaturaCada microrganismo apresenta uma temperatura mnima, tima e mxima de crescimento conhecidas como pontos cardinaisOs microrganismos podem ser divididos em trs grupos de acordo com a temperatura de crescimento:1- Psicrfilos: crescem em baixas temperaturas;2- Mesfilos: crescem em temperaturas moderadas;3- Termfilos: crescem em altas temperaturas.

Figure. Taxa de crescimento vs temperatura para cinco classes de procariotos. A maioria dos procariotoes iro crescer em temperaturas em torno de 30 graus. As curvas exibem trs pontos cardinais: mnimo, timo e mximo para o crescimento.

Figura. MEV de uma espcie de Bacillus termoflico isolado de uma pilha de composto orgnico a 55o C

Tabela. Termos usados para descrever microrganismos em relao aos requerimentos de temperatura de crescimento.

Temperatura de crescimento (C)

Tabela. Temperatura mnima, mxima e tima para o crescimento de certas bactrias e arqueas Temperatura para crescimento (C)

Tabela. Temperatura tima de crescimento de alguns procariotos

Tabela. Arqueas Hipertermofilicas.

Temperatura para crescimento(C) Figura. Sulfolobus acidocaldarius um acidfilo e termfilo extremo encontrado em fontes geotermais cidas, vasos de barro e superfcies de solos aquecidas a temperaturas entre 60 a 95C e pH de 1 a 5

Condies fsicas para o cultivo de microrganismosAtmosfera gasosa Os microrganismos no seu habitat natural necessitam de quantidades variadas de gases tais como oxignio, CO2, nitrognio e metano O O2 e CO2 so os dois gases principais que afetam o crescimento de clulas microbianas. O oxignio um componente universal das clulas e fornecido sempre em grandes quantidades pela H2O. Porm, os procaritos apresentam uma ampla variedade de respostas ao oxignio molecular O2 De acordo com a resposta ao oxignio gasoso, os microrganismos so divididos em quatro grupos fisiolgicos1- Aerbios: normalmente requerem oxignio para o crescimento2-Facultativos: podem crescer na presena do ar atmosfrico bem como em anaerobiose

Condies fsicas para o cultivo de microrganismosAtmosfera gasosaDe acordo com a resposta ao oxignio gasoso, os microrganismos so divididos em quatro grupos fisiolgicos3- Anaerbios: podem ser mortos pelo oxignio4-Microaerfilos: podem utilizar oxignio em suas reaes qumicas para produo de energia, mas no resistem a nveis de O2 presentes na atmosferaTabela. Termos usados para descrever os microrganismos em relao ao O2

Anaerbio aerotoleranteCresceCresceNo necessrio, no utilizado

Condies fsicas para o cultivo de microrganismosAtmosfera gasosa Todos os organismos fotossintticos so protegidos da oxidao letal do oxignio singleto por possuirem pigmentos carotenides que reagem com o oxignio, reduzindo-o a seu estado no txico (tripleto).Figura. Ao da superxido dismutase, catalase e peroxidase. Esssas enzimas detoxificam os radicais oxignio que so inevitvelmente gerados por sistemas vivos na presena de O2. A distribuio dessas enzimas na clula determina sua abilidade em existir na presena de O2

Condies fsicas para o cultivo de microrganismosAtmosfera gasosaTabela. Distribuio de superxido dismutase, catalase e peroxidase em procariotos com diferentes tolerncia ao O2

-+Anaerbios obrigatrios (ex. Clostridia, Methanogenicos, Bacteroides)---

Condies fsicas para o cultivo de microrganismosEfeito do pH sobre o crescimento A faixa de pH na qual um microrganismo cresce definida por trs pontos cardinais: 1- pH mnimo, abaixo do qual o microrganismo no pode crescer;2- pH mximo, acima do qual o microrganismo no pode crescer;3- pH timo, onde ocrescimento do microrganismo mximo.Dependendo do pH timo de crescimento, os microrganismo podem ser classificados em:1- Acidfilos: crescem melhor abaixo da neutralidade (pH 7.0)2- Neutrfilos: aqueles que crescem melhor em pH neutro3- Alcaloflicos: crescem melhor acima da neutralidade

Figura. Crescimento vs pH para trs classes ambientais de procariotos. A maioria de vida livre crescendo em uma faixa de pH de trs unidades. Note a simetria das curvas acima e abaixo do pH timo de crescimento.

Tabela. pH mnimo, mximo e timo para o crescimento de alguns procariotos.

Condies fsicas para o cultivo de microrganismos Presso osmtica A gua o solvente no qual as molculas da vida esto dissolvidas, e a disponibilidade de gua um fator crtico que afeta o crescimento celular.A disponibilidade de gua depende de sua presena na atmosfera (umidade relativa) ou em uma soluo ou substncia (atividade de gua) Os microrganismos podem ser classificados quanto a sua capacidade de crescer na presena de NaCl1- Haloflicos: requerem sal para o crescimento a-mediamente haloflicos (requer 1-6% de sal);b-halofilicos moderados (requer 6-15% de sal);c-Extremo haloflicos (requer 15-30% de sal).2- Halotolerante: Toleram sal, mas crescem melhor na sua ausncia

Condies fsicas para o cultivo de microrganismos Presso osmtica Embora haloflicos sejam osmfilos ( e halotolerante so osmotolerante) o termo osmfilo usualmente reservado para organismos capazes de viverem em ambientes com alta concentrao de acar. Organismos que vivem em ambientes secos so chamados de xerofilos.

Figura. crescimento vs osmolaridade para diferentes classes de procariotos. A osmolaridade determinada pela concentrao de soluto no ambiente.

Tabela. Atividade de gua (Aw) limitante para o crescimento de certos procariotos.

Crescimento de uma cultura bacteriana Crescimento um aumento na quantidade dos constituintes celulares. Isto dependen da habilidade da clula formar novo protoplasma a partir de nutrientes disponveis no ambiente. Na maioria das bactrias, crescimento envolve aumento na massa celular e nmero de ribossomos, duplicao do cromossomo bacteriano, sntese de nova parede celular e membrana plasmtica, partio de dois cromossomos, formao de spto e diviso celula. Este processo de reproduo assexuada chamada de fisso binria. Para organismos unicelulares como bactrias, o crescimento pode ser medido por dois parmetros: mudanas na massa celular e mudanas no nmero de clulas.

Figura.Crescimento bacteriano por fisso binria. A maioria das bactrias se reproduzem por um processo assexual relativamente simples chamado de fisso binria: cada clula aumenta seu tamanho e se divide em duas clulas.

Crescimento de uma cultura bacteriana Mtodos para medir a massa celular1- Medidas fsicas diretas do peso seco, peso mido ou volume celular aps. 2- Medidas qumicas diretas de componentes celulares como N total, protena total ou contedo total de DNA.3- Medidas indiretas da atividade qumica como a razo entre produo e consumo de O2, produo e consumo de CO2, etc. 4- medida da Turbidimetria (ou densidade tica) de uma suspenso de clulas. A sensibilidade limitada em aproximadamente 107 clulas por ml para a maioria das bactrias.

Crescimento de uma cultura bacteriana Mtodos para medir o nmero de clulas1- Contagem direta no microscpio. Para suspenses > 107 clulas por mL 2- Cmara eletrnica de contagem.3- Contagem em placas ou contagem indireta de clulas viveis.unidades formadoras de colnias (UFC/mL) 4- medida da Turbidimetria (ou densidade tica) de uma suspenso de clulas. A sensibilidade limitada em aproximadamente 107 clulas por ml para a maioria das bactrias.

Tabela. Alguns mtodos usados para medir cresciemnto bacteriano

Crescimento de uma cultura bacteriana Curva de crescimento bacteriano

Figura. Curva de crescimento bacteriano

Crescimento de uma cultura bacteriana Tempo de gerao

Tabela. Tempos de gerao para algumas bactrias comuns em condies timas para o crescimento.

Crescimento de uma cultura bacteriana Cultura contnua de microrganismosClulas crescendo continuamente em uma taxa particular, na fase logartmica.Culrura sincrnicaClulas so induzidas a uma mesma fase de crescimento

Figura. Esquema de um quimiostatoFigura. Crescimento sincrnico de uma populao bacteriana