CRESCIMENTO MICROBIANO-mais detalhes-

Prof. IVAnéa

Crescimento Microbiano

1. Fatores necessários para o crescimento

• Fatores Físicos ( temperatura, pH, pressão osmótica)• Fatores Químicos (nutrientes, água, O2 etc.)

2. Meio de Cultura

• Meio Complexo• Meio Definido

3. Crescimento da cultura bacteriana

• Quantificação Direta (nº. de colônias viáveis ou não)• Quantificação Indireta (turbidez, peso seco etc.)

CRESCIMENTO MICROBIANO:

Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares.

Crescimento Microbiano = associado ao crescimento de uma população de células (uma célula dará origem a duas ao fim de um certo tempo, tempo de geração ou de duplicação.)

Fatores físicos

1. TEMPERATURA:

A maioria dos microrganismos cresce bem nas temperaturas ideais para os seres humanos.Temperatura

de crescimento

mínima: Temperatura

de crescimento

ótima:Temperatura de

crescimento máxima:

• Temperatura onde a espécie é capaz de crescer• onde a espécie apresenta melhor crescimento• temperatura, onde ainda é possível o crescimento

Figura 1. Taxa de crescimento vs. temperatura

Bacterias e os alimentos

Bactéria: Bacillus cereus Respiração: aeróbico facultativo Incubação: 1-6 horas (casos de vomito) 6-24 (casos de diarréia) Principais Alimentos Associados: arroz cozido Observações: produz esporos e toxinas

Bactéria: Clostridium botulinum Respiração: anaerobico Incubação: 12-36 horas Principais Alimentos Associados: alimentos em conservas e embutidos de carne Observações: produz esporos e toxinas termolábeis

Bactéria: Clostridium perfringensRespiração: anaerobico Incubação: 10-12 horas Principais Alimentos Associados: carnes aquecidas e reaquecidas em temperaturas inadequadas

Observações: produz esporos e toxinas comum em alimentos servidos em escolas, hospitais e presídios

Bactéria: Listeria monocytogenes Respiração: aerobica Incubação: 3 semanas Principais Alimentos Associados: derivados lacteos, frutos do mar e ostras Observações: nao forma esporos mas é resistente ao congelamento, secagem e calor

Bactéria: Staphyloccus aureus Respiração: aeróbico Incubação: 2 - 4 horas Principais Alimentos Associados: alimentos com alto grau de manipulação que permaneçam por muito tempo em temperatura ambiente Observações: produz toxina termoestavel

Bactéria: Streptococcus spp (grupo A e D)Respiração: aerobico Incubação: grupo A 1-3 dias horas, grupo D 2-36 horas Principais Alimentos Associados: leite não pasteurizados e alimentos preparados por pessoas infectadas Observações: Grupo A causa faringite estreptococica, Grupo D causa a sindrome semelhante a Staphylococcus

Microrganismos são classificados em 3 grupos:

Psicrófilos:

Mesófilos:

Termófilos:

Termófilos extremos

• crescem em baixas temperaturas (-10 a 15 °C)• crescem em temperaturas moderadas (10 a 50 °C)• crescem em altas temperaturas (40 a 70 °C)

• Temperaturas (68 a 110 °C)

Figura 2. Curva de crescimento característica de diferentes microrganimos

Termófilos extremos

Exceções:

• Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5)- Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).

• Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).

2. pH:

Refere-se a acidez ou a

alcalinidade de uma solução;

• Maioria dos microrganismos cresce melhor perto da neutralidade (pH 6,5 – 7,5);

• Poucas bactérias são capazes de crescer em pH ácido (como pH 4,0)

3. PRESSÃO OSMÓTICA: Não Halófilos:

• não necessitam de sal e não toleram a presença no meio.

Halotolerantes:

• não necessitam de sal mas toleram a presença no meio.

Halófilos:

• necessitam de sal em uma concentração moderada

Halófilos extremos:

• necessitam de sal em altas concentrações.

Figura 3. Taxa de crescimento de alguns microrganimos vs. a concentração de sal.

Fatores Quimicos

FATORES QUÍMICOS

1. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:

CARBONO:

Essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos necessários para a viabilidade celular (elemento estrutural

básico para os seres vivos)organismos quimio-heterotróficos: obtém C a

partir de materiais orgânicos como proteínas, carboidratos e lipídeos.

organismos quimioautotróficosorganismos fotoautotróficos

NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:

- N, S: síntese de proteínas

- N, P: síntese de DNA e RNA,

ATP

Peso seco de uma célula bacteriana:•14 % N, •4 % S, P

NITROGÊNIO

utilizado para sintetizar os

grupos aminos presentes nos aminoácidos.

Obtenção de N:

Decomposição de materiais

orgânicos (proteínas,

aminoácidos)

Amônia (NH4 +)

Nitrato (NO3-)

Fixação de N: algumas bactérias são capazes de utilizar N gasoso diretamente da atmosfera.

Microrganismos do solo (ex. bactérias dos gêneros Rhizobium e Bradyrhizobium) utilizam este processo para obtenção de N, tanto para elas como para as plantas que convivem simbioticamente (algumas leguminosas – soja, feijão).

Cultivo de leguminosas: > fertilidade do solo sem a necessidade de implementação de fertilizantes químicos

Bactérias Fixadoras de Nitrogênio

ENXOFRE

• utilizado na síntese de aminoácidos contendo S e de vitaminas (tiamina e biotina)

FÓSFORO

• essencial para a síntese dos ácidos nucléicos e para os fosfolipídios componentes da membrana celular.

Fontes naturais de S:

íon sulfato (SO4-2), sulfito de hidrogênio, aminoácidos

Fontes naturais de P:

íon fosfato (PO4-3), DNA, RNA, ATP

FATORES QUÍMICOS

1. FONTES DE CARBONO, NITROGÊNIO, ENXOFRE E FÓSFORO:

FATORES QUÍMICOS

2. ÁGUA:

Essencial para os microrganismos- Disponibilidade variável no ambiente

Ambiente com < concentração de água:

•Desenvolvem mecanismos para obter água através do aumento da concentração de solutos internos seja pelo bombeamento de íons para o interior celular ou pela síntese de solutos orgânicos (açúcares, alcoóis ou aminoácidos).

FATORES QUÍMICOS

Extremamente importante no desenvolvimento microbiano

Os organismos classificados em:

1. AERÓBIOS• Estritos (obrigados): necessitam de O2

• Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor com O2

• Microaerófilo: necessitam de O2 mas em níveis menores

2. ANAERÓBIOS• Aerotolerantes: não necessitam de O2

mas crescem melhor sem O2

• Estritos (obrigados): não toleram O2 (letal)

3. OXIGÊNIO:

AERÓBIO

ESTRITOS

alta [O2]catalaseSOD

ANAERÓBIO ESTRITO

sem O2

ausência: catalaseSOD

MICROAERÓFILO

baixa [O2]

AERÓBIO FACULTATIVO

alta e baixa [O2]catalaseSOD

alta e baixa [O2]SOD

ANAERÓBIO AEROTOLERANTES

Figura 4. Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.

Catalase e a

superóxido

dismutase

reduzem para

H2O os compost

os tóxicos.

Meios de cultura

Aula pratica

meio de cultura:• material nutriente preparado

no laboratório para o crescimento de microrganismos.cultura:

• microrganismos que crescem e se multiplicam no meio de cultura.meio definido:

• toda a composição química é conhecida

meio complexo:• composição química não

conhecida (composto por nutrientes como extrato de levedura, de carne ou de plantas)

MEIO DE CULTURA

MEIO SELETIVO:• favorece o crescimento de uma determinada

bactéria de interesse, impedindo o crescimento de outras bactérias.ex: ágar sabouraud dextrose, ph 5,6, é utilizado no crescimento de fungos que são favorecidos, em relação as bactérias, pelo baixo ph.MEIO DIFERENCIAL:

• facilita a identificação de um determinado organismo.ex: meio ágar-sangue, utilizado para a identificação de bactérias capazes de destruir células sangüíneas (anel claro em torno da colônia).MEIO DE ENRIQUECIMENTO:

• favorece o desenvolvimento de uma população bacteriana que esta em desvantagem entre outras populações.

MEIOS REDUTORES:• meios com reagentes, como o tioglicolato de

sódio, que é capaz de se combinar com o oxigênio dissolvido eliminando este elemento do meio de cultura (específico para microrganismos anaeróbicos).

DIVISÃO BACTERIAN

A:• FISSÃO BINÁRIA• TEMPO DE GERAÇÃO• FASES DE CRESCIMENTO:• FASE lag• FASE log• FASE ESTACIONÁRIA

• FASE DE MORTE CELULAR

CRESCIMENTO DAS CULTURAS BACTERIANAS

Figura 5. Fissão binária bacteriana.

É o tempo necessário para uma célula se dividir (e

sua população dobrar de tamanho).

• tempo varia de acordo com o organismo;

• depende das condições ambientais (nutricionais, temperatura, etc);

• maioria das bactérias: 1 – 3 h

TEMPO DE GERAÇÃO:

Figura 6. Curva de crescimento bacteriano mostrando as 4 fases típicas.

FASE lag:• Pouca ou ausência de

divisão celular (fase de adaptação) - ≥ 1 hora (estado de latência, com intensa atividade metabólica)

FASE log:• Início do processo de

divisão (período de crescimento ou aumento logaritmo). Reprodução celular extremamente ativa, sensíveis as mudanças ambientais

• (* EFEITO DE ANTIBIÓTICOS)

FASE ESTACIONÁRIA:• Velocidade de

crescimento diminui o nº de células vivas = nº de células mortasFASE DE MORTE CELULAR:

• O nº de células mortas excede o de células novas.

MÉTODOS PARA QUANTIFICAR O CRESCIMENTO

QUANTIFICAÇÃO DIRETA:• CONTAGEM EM PLACAS• FILTRAÇÃO• MÉTODO DO NÚMERO

MAIS PROVÁVEL• CONTAGEM DIRETA AO

MICROSCÓPIO

QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:• TURBIDIMETRIA• ATIVIDADE METABÓLICA• PESO SECO

QUANTIFICAÇÃO DIRETA:

CONTAGEM EM PLACAS

• técnica mais utilizada na determinação do tamanho da população bacteriana;

VANTAGEM: qualificação de células viáveis

DESVANTAGEM: tempo (24 h para o aparecimento das colônias)

Cálculo:

• nº de colônias na placa x índice de diluição da amostra = nº de bactérias/mL

• DILUIÇÃO SERIADA• MÉTODO DE ESPALHAMENTO EM PLACA

Figura 7. Contagem em placas e diluição seriada

(2) FILTRAÇÃO

• nº de bactérias = pode ser utilizado o método de filtração para a sua contagem.

concentração de bactérias sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos após a passagem de um volume de 100 mL de água.filtro posteriormente transferido para uma placa de Petri contendo meio sólido.

(3) O MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)• utilizado para microrganismos que não crescem bem em meio

sólido.A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)

d) contagem do nº de tubos positivos

e) estimativa do nº de células/mL de bactérias

10 mL DE INÓCULO

1 mL DE INÓCULO

0,1 mL DE INÓCULO

6 tubos positivos (com crescimento bacteriano)

3 tubos positivos

1 tubos positivos

Figura 8. Método do número mais provável (NMP)

6

3

1

Figura 8. Método do número mais provável (NMP)

Tabela de combinações (NMP)

6-3-1

Índice de NMP/100 mL = 110

Inferior = 40

Superior = 300

Confiabilidade de 95%

(4) CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO• um volume conhecido de suspensão bacteriana é

colocado em uma área definida da lâmina de microscópio.a amostra pode ser corada ou analisada a

fresco.

utilizam câmaras de contagem

DESVANTAGENS:• não separa células mortas e vivas• pode haver erros de contagem• difícil contagem para bactérias móveis

Figura 9. Utilização da câmara de contagem Petroff-Hausser.

QUANTIFICAÇÃO INDIRETA:

(1) TURBIDIMETRI

A•

monitoramento do crescimento bacteriano através da turbidez

• espectrofotômetro (540 - 660 nm)

(2) ATIVIDADE METABÓLICA

• quantidade de um certo produto (como ácido ou CO2) é diretamente proporcional ao número de células bacterianas.

A quantidade de luz que atravessa o detector é inversamente proporcional ao nº. de bactérias.

Quanto > o nº. de bactérias < a quantidade de luz que é transmitida

Figura 10. Determinação do nº de bactérias por turbidimetria.

(3) PESO SECO• principalmente para fungos filamentosos

a) fungo é removido do meio por filtração

b) seco em dessecador

c) posterior pesagem

Agora laboratório