Nutrição e Crescimento Bacteriano

Prof. Adjunto Ary Fernandes Junior

Departamento de Microbiologia e Imunologia

Instituto de Biociências – UNESP

Tel. 14 3880.0412/0413

ary@ibb.unesp.br

Características básicas das bactérias

Estudos de Biologia Celular

10 horas 1 bilhão de células

95% do

peso

seco da

célula

Crescimento bacteriano

+ Motilidade,

Luminescência, etc

Visão geral do metabolismo celular

Cultura: Propagação do microrganismo

em condições adequadas

(Exigências Nutricionais e Ambientais)

Nutrição: Fornecimento de substâncias

nutritivas para o crescimento

bacteriano

(Energia e Matéria Plástica)

FATORES NUTRITIVOS (in vitro = in vivo)

Ex: Haemophilus influenzae

Hemina (fator X), NAD+ (fator V)

Fastidiosos

N Na H K

Mg

Co Zn Mo Se etc

Ca Fatores de

Crescimento

OBS. Não existe um meio de cultura universal

Classificação dos Meios de Cultura

(Substâncias nutritivas Sintéticos e Complexos)

Líquido

(Turvação do

meio)

Sólido

(1,5 a 2,0%)

(Colônias)

Classificação dos Meios de Cultura

(Estado fisico) Agar

Semi-Sólido

(0,5%)

(Movimento)

(Enriquecidos)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

Agar Sangue

Agar Chocolate

Lowenstein - Jensen

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Seletivos)

(Agar MacConkey)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Seletivos)

(Meio seletivo para Bacillus cereus)

(MAS – Manitol Salt Agar)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

Agentes seletivos cloridrato de lítio e o tellurite de potássio

A gema de ovo Produção de lecitinase e a atividade da lipase .

Colônias preta devido à redução de telurito ;

Ação da lecitinase causam zonas claras em torno das respectivas

colônias.

Zona opaca de precipitação devido à atividade da lipase ( S.aureus ).

Baird Parker Agar

(Seletivos)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Seletivos)

(Eosin Methilen Blue (EMB) Oxoid Chromogenic Listeria Agar (OCLA)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Diferencial)

(Agar Sangue)

(Padrão de Hemólise)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(Diferencial)

(Agar MacConkey)

(Fermentação da Lactose)

Lactose (-)

Lactose (-)

Lac + Lac -

(Meio Cromogênico)

(E. coli/coliformes em alimentos e água)

(Meio de Tetrationato) (Meio de Selenito Cistina)

Classificação dos Meios de Cultura

(Poder Seletivo e Diferencial)

(De Enriquecimento)

Etapas do preparo de um meio sólido

FATORES NUTRICIONAIS

ÁGUA - Solvente; Elevado Calor Específico;

Regula Pressão Osmótica; Participação em

Reações Químicas, Estrutura de

Macromoléculas, etc

FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio

*Fotossintetizantes Fototróficas

Quimiossintetizantes Quimiotróficas

(Quimiolitotróficas e Quimiorganotróficas)

FONTE DE ENERGIA = Doadores de Hidrogênio

RECEPTORES DE HIDROGÊNIOS

Respiração aeróbia O2.

Respiração anaeróbia NO3-, SO4

-, CO2..

Fermentação Fermentação Lática, Alcoólica, etc.

Respiração anaeróbia receptor inorgânico ≠ do O2

(ex: SO42-, NO3

-, CO2, S)

Salmonella, the host and its microbiota. S. Typhimurium uses its virulence factors (flagella, T3SS-1 and T3SS-2) to invade the epithelium and

survive in mononuclear cells. The ensuing inflammatory response results in the epithelial release of an antimicrobial (lipocalin-2) that sequesters

iron chelators (enterobactin) produced by the microbiota, but not an iron chelator (salmochelin) produced by S. Typhimurium. ROS generated by

neutrophils migrating into the intestinal lumen oxidize an endogenous sulfur compound (thiosulfate) to generate a respiratory electron acceptor

(tetrathionate) that enables S. Typhimurium to edge out the fermenting microbiota, thereby enhancing transmission of the pathogen.

Thiennimitr et al, 2011. Salmonella: the host and its microbiota. Current opinion in Microbiology, v.15, n.02, p.108-114, 2012.

4 H2 + SO42- + H+

HS +4 H20 4 H2 + CO2 CH4 + 2 H20

Fermentação Composto orgânico produzido durante o

próprio processo fermentativo.

CARBONO (Composição dos Compostos Orgânicos

-Compostos orgânicos - Quimio-heterotróficos.

-CO2 (Fotossíntetizantes) - Fotoautotróficos.

NITROGÊNIO (Proteínas, Ácidos Nucléicos, Coenzimas)

Orgânica - Aminoácidos, Sais Orgânicos de Amônia.

Inorgânica - NH3, NO3-, N2

ENXOFRE (Aminoácidos Sulfurados, Vitaminas)

-Forma orgânica (Radicais sulfidrilas);

-Forma inorgânica ( SO4- , H2S)

-Forma elementar

FÓSFORO (ATP, Ácidos Nucléicos, Fosfolipídeos, Coenzimas)

-Fosfato inorgânico (PO42- )

ATIVADORES DE ENZIMAS

Minerais na forma de sais:

-Mg++e K+ (Ribossomos)

-Fe++ (citocromos e peroxidases)

-Ca++ (Parede celular de Gram positivas e esporulação)

ELEMENTOS TRAÇOS - Cobalto, Zinco (Atividade de

Enzimas), Molibdênio

FATORES DE CRESCIMENTO - Ex: Vitaminas,

Aminoácidos, Bases Nitrogenadas, Ácidos

Graxos, etc.

FATORES AMBIENTAIS

pH

Temperatura

Aeração (O2)

Osmolaridade

FATORES AMBIENTAIS

pH – Estrutura e funções das proteínas

Maioria na faixa ótima de pH entre 6 e 8.

Ex. Thiobacillus - 1 e 2 (Acidófila)

Vibrio comma - 10 (Alcalinófila)

Obs. Normalmente os meios de cultura são

tamponados.

Bactérias patogênicas pH ao redor de 7

Organismo

Mínimo Ótimo Máximo

Thiobacillus thiooxidans 0,5 2,0-2,8 4,0-6,0 Sulfolobus acidocaldarius 1,0 2,0-3,0 5,0

Bacillus acidocaldarius 2,0 4,0 6,0 Zymomonas lindneri 3,5 5,5-6,0 7,5

Lactobacillus acidophilus 4,0-4,6 5,8-6,6 6,8 Staphylococcus aureus 4,2 7,0-7,5 9,3

Escherichia coli 4,4 6,0-7,0 9,0 Clostridium sporogenes 5,0-5,8 6,0-7,6 8,5-9,0

Erwinia caratovora 5,6 7,1 9,3 Pseudomonas aeruginosa 5,6 6,6-7,0 8,0

Thiobacillus novellus 5,7 7,0 9,0 Streptococcus pneumoniae 6,5 7,8 8,3

Nitrobacter sp 6,6 7,6-8,6 10,0

Valores mínimos, ótimos e máximos de pH durante o cultivo para algumas bactérias

Acidofílicas

Neutrofílicas

Alcalinofílicas

Temperatura - Velocidade das reações químicas

Concentração

elevada de ácidos

graxos insaturados

garante fluidez da

membrana

plasmática

Patogênicas

ao homem e

animais)

Organização tridimensional das proteínas

permite a manutenção da estrutura

adequada para sua ação em elevadas

temperaturas

Aeração - Metabolismo energético

Aeróbio estrito

(18-21% )

P. aeruginosa,

Mycobacterium

Anaeróbio estrito

(<0,5%)

C.haemolyticum

Facultativo

(<0.5-21%)

Enterobactérias

Microaerófilo

aeróbio (1-5%)

Campylobacter,

Neisseria

Microaerófilo

anaeróbio

(Aerotolerante)

(2-8%)

Bacteroides,

Clostridium

Bactérias aeróbias e facultativas

O2 Metabolismo

Ação das enzimas superóxido dismutase, catalase e peroxidase. Estas

enzimas eliminam radicais tóxicos do oxigênio que são inevitavelmente gerados

em sistemas vivos na presença de O2.

A distribuição destas enzimas nas células determina a capacidade

destas células existirem na presença de O2 .

Sistema de

desintoxicação

Produtos

não tóxicos

O2 + 2 e- + 2 H+ H2O2

O2 + e- O-2

O2 + H2O2 OH*

O-2 + H2O2 O2 + OH2- + OH*

H2O2 + e- + H+ H2O + OH*

Produtos

tóxicos

Bactérias anaeróbias estritas

Danos ao DNA, destroem

componentes lipídicos,

inativam enzimas

Morte

bacteriana

O2 Metabolismo

O2 + 2 e- + 2 H+ H2O2

O2 + e- O-2

O2 + H2O2 OH*

O-2 + H2O2 O2 + OH2- + OH*

H2O2 + e- + H+ H2O + OH*

Produtos

tóxicos

Ausência do

sistema de

desintoxicação

Reação positiva produzida por Bacillus sp,

Staphylococcus sp;

Reação negativa produzida por Clostridium sp,

Streptococcus sp.

Teste da Catalase

Método da

vela acesa

(microaerofilia)

Grampo

de rosca

Tampa com

anel

selador

Catalisador

de paládio

em pastilha

Envelope

contendo

bicarbonado de

sódio e boroidreto

de sódio

Placas de

Petri

Indicador de

anaerobiose

(azul de

metileno)

Jarra de anaerobiose (Sistema GasPak)

Câmara de anaerobiose (“Glove Box”)

Controle da Osmolaridade Transporte ativo de K+ para interior da célula e

eliminação de PUTRESCINA

Osmolaridade - Concentração de solutos no

meio Disponibilidade de água

Aumento no número de células no meio de cultivo

Meio líquido Turvação do meio de cultivo;

Meio Sólido Formação de colônias

Concentração Celular = Núm. Cel. / Vol. meio

Densidade Celular = Massa Cel./ Vol. meio

CRESCIMENTO BACTERIANO

Após inoculação no meio de cultura (= “semeadura”)

em condições ótimas

Contagem bacteriana

(Plaqueamento)

Absorbância = 2 - Log de % de Transmissão

NMP

(Número Mais provável)

Tubos de meio

nutriente (grupo de

cinco tubos

Número de tubos

positivos por

grupo

Volume de

inóculo

para cada

grupo de

cinco tubos

Combinação de

tubos positivos

Índice de

NMP/100mL Inferior Superior

Limites com 95%

de confiabilidade

Fases do crescimento bacteriano

Fisiologicamente

ativas

Tempo de

geração

Progressão

geométrica (Crescimento

Morte)

(Crescimento << Morte)

Formas de involução

Fase Lag (Fase de Demora)

Número de bactéria permanece constante em

função do tempo.

(Fisiologicamente Ativas)

Fase Logarítmica ou Exponencial

Progressão Geométrica (Crescimento >> Morte)

(células viáveis)

Tempo de geração ?????????

Fases do crescimento bacteriano

Fase Estacionária Máxima

(Crescimento Morte)

Morte ??????

(O2, Nutrientes, pH, Produtos Tóxicos, etc )

Fase de Declínio ou Morte

Morte >> Crescimento

(Formas de Involução)

Taxa de Crescimento x Tempo de

Geração

Semeadura = Inocular (transferir o microrganismo a um meio de

cultura)

SEMEADURA POR ESGOTAMENTO

SEMEADURA EM QUADRANTES

Semeadura Correta

Semeadura Errada

Princípios de Alguns Testes

Bioquímicos

2 H2O2 2 H2O + O2

Catalase

Comum em bactérias aeróbias e anaeróbias

facultativas

Staphylococcus, Bacillus (+) e Streptococcus (-)

Oxidase (Citocromo oxidase)

Oxidação do Citocromo C pelo O2

Para fenilenodiamina é oxidado pela enzima

adquirindo cor vermelha

Neisseria (+), Pseudomonas (+), Enterobactérias (-)

Prova de OF

(Oxidação - Fermentação)

(Carboidrato Ácido)

Azul de Bromotimol: pH Alcalino (Azul), pH Ácido

(Amarelo)

Glicose Enterobactérias, Staphylococcus

(Fermentam), Pseudomonas, Micrococcus (Oxidam)

Fermentação de Açúcares

Produção de Ácido ou Ácido mais gás

Açúcar a ser estudado + indicador de Andrade

(vermelho em pH ácido)

Enterobactérias Glicose (Todas), Lactose

(Algumas espécies apenas)

Glicose Lactose

Família Enterobacteriaceae

Lactose

-

Gêneros

Shigella

Salmonella

Proteus

Providência

Morganella

+

Gêneros

Escherichia

Klebsiella

Enterobacter

Serratia

Agar MacConkey

Vermelho de Metila (VM): Fermentação Mista

(Glicose Acidos Orgânicos)

Vermelho de Metila em pH ácido (4,5) fica Vermelho

E.coli (+), Enterobacter (-) 1 2 3

Voges-Proskauer (VP) Fermentação

Butilenoglicólica

Glicose Acetilmetilcarbinol (= Acetoina) 2,3 butilenoglicol

Acetoina + Creatinina composto vermelho

E. coli (-), Klebsiella pneumoniae (+), Enterobacter (+)

Indol

Triptofanase

Triptofano Indol

Para Dimetilaminobenzaldeído = Reativo de Kovacs + indol

Composto vermelho.

E. coli (+), Klebsiella-Enterobacter (-)

Não inoculado + -

Citrato de Simnons

Citrato de Sódio como única fonte de C

Se bactéria usa (Cresce) – Alcaliniza o meio Azul

(Azul de Bromotimol)

Klebsiella - Enterobacter (+), E. coli (-)

Uréia

(Urease)

Amônia

Alcalinização do meio (Vermelho Fenol Vermelho)

E. coli (-), K. pneumoniae (+)

Fenil-Alanina

Desaminação da Fenil-alanina Ácido Fenilpirúvico

Ac. Fenilpirúvico + Cloreto Férrico Hidrazina (Cor

verde-garrafa)

Característica de todas espécies de Proteus

+ -

Movimento

Crescimento em meio semi-sólido (0,5% de Ágar)

Imóvel - Cresce só no local da picada: K. pneumoniae

Móvel - Cresce além da picada: E. coli

EPM, MILI

Tríplice Açúcar com ferro

TSI

Métodos Miniaturizados