Painel PEMM 2011 – 10 e 11 de novembro de 2011 – PEMM/COPPE/UFRJ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Cultura dinâmica de células osteoprogenitoras em compósitos hidroxiapatita-colágeno para aplicações biomédicas

Doris Moura Campos1,2*, Karine Anselme2, Glória de Almeida Soares1

*doris@metalmat.ufrj.br, bolsista de doutorado do CNPq 1Laboratório de Bioengenharia óssea, PEMM-COPPE-UFRJ

2IS2M, UHA, France

CP 68505, 21941-972, Rio de Janeiro, RJ

Resumo Compósitos baseados em hidroxiapatita (HA) e colágeno (Col) vêm sendo desenvolvidos atualmente e podem ser considerados biomiméticos por permitirem sua degradação gradual dentro do organismo. Entretanto, arcabouços tridimensionais (3-D) apresentam má oxigenação em seu interior, dificultando a colonização celular e diminuindo sua eficácia em aplicações biomédicas. Arcabouços compósitos 3-D HA-Col foram produzidos e reticulados para serem avaliados como suporte para a colonização e diferenciação celular. Células osteoprogenitoras estromais (STRO+1A) foram cultivadas em condição estática e dinâmica (usando duas velocidades diferentes) durante 21 dias. Apesar da boa adesão e morfologia das células submetidas às diferentes condições, observou-se que os comportamentos de proliferação e diferenciação celular são influenciados pela condição de cultivo. Palavras-chave: compósito hidroxiapatita-colágeno, células STRO+1A, cultura dinâmica. Introdução A engenharia de tecidos pode ser considerada como um importante recurso em aplicações biomédicas atualmente. Para tecido ósseo e dentes, compósitos baseados em fosfatos de cálcio e colágeno vêm sendo classificados como biomiméticos, pois permitem uma substituição gradual do biomaterial pelo tecido naturalmente formado (1,2). Entretanto, arcabouços tri-dimensionais (3-D) vêm apresentando problemas em relação à oxigenação e difusão de nutrientes em cultura de células estática (3,4). Com o objetivo de aperfeiçoar as condições de cultura, células osteoprogenitoras estromais (STRO+1A) foram cultivadas em arcabouços 3-D dentro de bioreatores em cultura dinâmica, o que permite um fluxo constante. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a capacidade de colonização e o comportamento de adesão, proliferação e diferenciação das células STRO+1A em compósitos hidroxiapatita-colágeno (HA-Col), sob diferentes condições de cultura. Materiais e métodos Soluções de Ca(NO3)2, H3PO4 e atelocolágeno

de origem bovina foram utilisados para a produção do arcabouço HA-Col (Ca/P igual a 1,67) (50/50 wt%). Os arcabouços 3-D foram reticulados com solução aquosa de glutaraldeído (0,125%), lavados sucessivamente, liofilizados e esterilizados por radiação gamma (25kGy). Para a cultura de células, os arcabouços foram rehidratados com meio de cultura Iscove's (suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100U/mL de penicilina e 100µg/mL de estreptomicina) durante 24 horas antes da inoculação celular. Células STRO+1A (5x105cels/amostra) foram inoculadas e cultivadas em estufa úmida à 37°C e 5% CO2. Anterior à aplicação do fluxo dentro dos bioreatores, as células foram incubadas sob o compósito por 24 horas em condição estática, para a adesão celular. Após a total adesão, fluxos constantes de 0.03 (baixa velocidade) e de 0.3ml/min (alta velocidade) foram usados para o cultivo das células durante 21 dias. O comportamento celular de proliferação foi mensurado pelo método do MTT e a morfologia das células por microscopia eletrônica de varredura (MEV). A diferenciação celular foi quantificada através da dosagem de: fosfatase alcalina (ALP), osteocalcina (OC) e pró-colágeno tipo I (PIP). A migração celular foi

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avaliada em seções histológicas (15µm) após a marcação dos núcleos celulares por DAPI. Resultados e discussão O arcabouço compósito HA-Col demonstrou ser um bom suporte para a proliferação e diferenciação celular. Na condição de cultivo dinâmico em alta velocidade, o número de células aumenta durante os 21 dias de cultivo, apesar do decréscimo observado após 7 dias na condição dinâmica em baixa velocidade e na estática (Fig.1). A partir das figuras de MEV, as células apresentam-se bem aderidas e espraiadas na superfície do arcabouço 3-D após os 21 dias de cultivo em todas as condições. Adicionalmente, foi observada a produção de matriz extracelular pelas células submetidas à alta velocidade de cultivo dinâmico (Fig.2). Em relação ao processo de diferenciação celular, as células cultivadas em condição dinâmica apresentaram significante acréscimo nos níveis de ALP, OC e PIP, quando comparadas aos resultados do cultivo estático (Fig.3).

Figura1 - Número de células STRO+1A cultivadas sob o arcabouço compósito HA/Col durante 21 dias.

Figura 2 – Micrografias das células STRO+1A após

21 dias de cultivo. (a) Estático, (b) baixa velocidade, (c) alta velocidade. Magnificação: 2000x

Através de seções histológicas, núcleos celulares foram observados na superfície do compósito após as primeiras 24 horas de cultivo em todas as condições. Após 21 dias, núcleos celulares foram visualizados dentro do arcabouço 3-D submetido ao cultivo dinâmico em alta velocidade (0.3ml/min). Entretanto, esse resultado não é homogêneo entre todas as amostras estudadas (dados não demonstrados).

Figura 3 – Níveis de fosfatase alcalina (a), osteocalcina

(b) e pró-colágeno I (c) secretados pelas células STRO+1A durante 21 dias de cultivo.

Conclusões A síntese do compósito HA-Col permitiu a produção de uma estrutura tridimensional satisfatória para o uso em cultura de células. Células STRO+1A demonstraram uma rápida adesão e espraiamento na superfície do arcabouço em condições estática e dinâmica. Entretanto, a diminuição do comportamento proliferativo foi observado em condição estática e em dinâmica de baixa velocidade. O processo de diferenciação celular mostrou-se também ser influenciado pela condição de cultura. As células foram capazes de sobreviver dentro do arcabouço 3-D somente na condição de cultivo dinâmico em alta velocidade (0.3ml/min). Agradecimentos Este trabalho foi financiado pelas agências de fomento: CAPES, CNPq e FAPERJ, Brasil; CNRS, COFECUB (projeto Sv628/09), França. Referências [1] R.Z. Legeros, CRC Press, Boca Raton, 1998, 3-28. [2] S.J. Kalita, et al., Mater Sci and Eng C. 2007, 27, 441-449. [3] B David, et al. Tissue Engineering: Part C. 2011, 17(5), 505-516. [4] R.J. McCoy, F.J. O’Brien, Tissue Engineering: Part B. 2010, 16(6), 587-601.

A B C

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

7d 14d 21d

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