Apresentao do PowerPoint

Equipamentos utilizados em experimentao animalMemria (Alzheimer)

Farmacologia II | FFUL 2015Alunas:Dbora MartinsFilipa FurtadoHelena OrvalhoIns CorreiaJoana RendasProf. Doutores:Cristina Mello-SampayoRui PintoJoo RochaMargarida EstudanteLabirinto Aqutico de Morris (LAM)Consiste:

Tanque circular de fibra de vidro (134 cm de dimetro e 40 cm de altura)gua a temperatura ambiente de 252CDividido em 4 quadrantes (NW,SW,NE,SE)

Este teste avalia a capacidade do animal para a aquisio de memria espacial, ao medir a latncia para que o animal localize uma plataforma submersa num tanque com gua opaca1 dos quadrantes afixado numa plataforma de PVC circular (11 cm de dimetro x19,5 cm de altura) submersa, com a parte superior localizada imediatamente abaixo da superfcie da gua

Coloca-se amido de milho para a gua ficar turva

Farmacologia II | FFUL 2015Nas paredes internas do tanque, acima da gua, nos quatro quadrantes, esto fixadas figuras sinalizadoras, que podem ser usadas como pontos de referncia pelos animais durante os treinos e/ou o teste finalFigura 1.Labirinto aqutico de Morris O comportamento de cada animal registado por uma cmara posicionada em cima do aparato que permite a monitorizao das imagens numa sala adjacente

Farmacologia II | FFUL 2015Ratinhos Colocados num dos quadrantes aleatoriamente escolhidos 90 segundos para encontrar a plataforma submersa

Se no conseguirem so colocados na plataforma pelo examinador, durante 30 s

Figura 2. Rato colocado sobre a plataforma de LAMFarmacologia II | FFUL 2015Treinos:

5 dias consecutivos 3x por dia30s entre cada umDescanso nas gaiolas durante 4 diasRealizao do teste de memria espacial (1 dia, 3x com intervalos 30s entre cada sesso de teste)O perodo de latncia do ratinho desde sua colocao na gua at encontrar a plataforma escondida em cada teste medido por meio de um cronmetro digital

A cada dia de treino/teste calculada a mdia de latncia do animal para encontrar a plataforma, a velocidade de nado e a distncia percorridaOs animais sero sempre libertados de pontos de partida diferentes de forma pseudo aleatria e a plataforma submersa permanecer na mesma posio (quadrante Sudeste)Farmacologia II | FFUL 2015

Sesso de Teste24h aps os treinos Ratinhos so libertados para nadar a partir da posio NortePlataforma removida O tempo de nado gasto pelos animais no quadrante onde se encontrava a plataforma na sesso de treino (no dia anterior) ndice de Memria Farmacologia II | FFUL 2015Estudo de alteraes sinpticasbiomarcadores para deficincias cognitivas

MemriaAlteraes na induo:Potenciao a longo prazo (LTP)Depresso a longo prazo (LTD) da eficcia sinpticadescrio do fentipo neurolgico de animais com alteraes cognitivascrnios mais espessostecido conjuntivo mais resistente aumento dos danos no hipocampo durante a dissecaoFarmacologia II | FFUL 2015Estudo de alteraes sinpticasProtocoloPreparar Fluido Crebroespinal Oxigenado Artificialmente (ACSF) arrefecido em gelo para conservao do tecido cerebral.Preparar a rea de dissecao e o material necessrio, incluindo uma guilhotina animal.

A, paper towelB, scalpel blade C, Beebee scissors D, bone rongeurs (for rats)E, bone rongeurs (for mice/rats)

F, Plastic spoon G, plastic transfer pipetteH, Hippocampal tool I, spatulaJ, surgical scissorsK, glass petri dishTools and materials used for brain dissection Farmacologia II | FFUL 2015Estudo de alteraes sinpticasProtocolo (cont.)Eutansia do rato, utilizando mtodos aprovados.Decapitar o rato imediatamente antes da primeira vrtebra cervical.Fazer rapidamente uma inciso comeando no osso nasal at ao occipital. Cortar o osso frontal do crnio e separar os ossos do crebro.Extrair o crebro, cortando os nervos cranianos intactos.Submergir no ACSF.Limpar a rea e descartar a carcaa.Extrair o hipocampo.Seccionar o tecido cerebral em fatias usando um micrtomo vibratrio.

Farmacologia II | FFUL 2015Estudo de alteraes sinpticasProtocolo (cont.)Transferir para uma cmara de conservao.

Extrair e registar respostas sinpticas (estao de electrofisiologia para estudo do meio extracelular em fatias cerebrais, registos patch-clamp e imagiologia por fluorescncia).

A, macrochamberB, lidC, H 2 O reservoirD, microchamberE, ACSF delivery tube

F, O2 delivery tube G, port for temperature control H, netted microchamber insert Custom brain slice holding chamberFarmacologia II | FFUL 2015Estudo de alteraes sinpticas

Hippocampal slice illustration and extracellular waveforms A, Cartoon of a transverse hippocampal section used in electrophysiology experiments. B, Electrical stimulation of the Schaffer collaterals. C, Overlapping representative extracellular waveforms recorded in response to nine different stimulus intensity levels in a "healthy" (left panel), "unhealthy", and "hyperexcitable" slice. Healthy slices respond dynamically across this stimulus range. Unhealthy slices show poor plasticity. Hyperexcitable slices are often labile and affected by LTD/LTP stimulation.Farmacologia II | FFUL 2015Estudo de alteraes sinpticas

Representative electrophysiology experiments performed on acute slices from mid-aged mice and aged rats Panels A-B show data collected from mice treated with a control construct or a Reagent A. The slice treated with Reagent A exhibits a marked leftward shift in the curve (A) indicative of greater synaptic strength. The Reagent-A-treated slice also shows robust and stable LTP (B) after the delivery of stimulus, while the control slice exhibits deficient LTP, typical of this animal model. Panels D-F show data collected from two aged rats that received chronic intrahippocampal perfusions of vehicle or a Drug A. Basal synaptic strength was relatively unaffected by drug treatment (D). However, Drug A was very effective at preventing the induction of LTD (E). Panels C and F show representative EPSP waveforms recorded from individual slices before (pre) and after (post) the delivery of LTP/LTD stimulation. Farmacologia II | FFUL 2015Labirinto de Barnesh = 60 cm

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Farmacologia II | FFUL 2015Ensaios (4 experimentaes/dia)Testes(memria a curto e longo prazo)Teste: 5o dia 24h depois do ltimo dia de treino The probe trial is done in order to determine if the animal remembers where the target goal was located.

To assess long-term retention a second probe trial will be applied on day 12, without any training session between day 5 and day 12.Teste da esquiva passivaUtilizado para avaliar a aprendizagem e memria em modelos de distrbios do SNC em roedores;Os indivduos aprendem a evitar um ambiente com estmulos negativos

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A cmara est dividida em dois compartimentos, um iluminado e um escuro, com uma porta entre eles.

Um dos compartimentos d pequenos choques aos ratinhos para que estes aprendam a associar certas propriedades da cmara a maus estmulos.Farmacologia II | FFUL 2015Teste da esquiva passivaProcedimento:Dia 1: os animais podem explorar ambos os compartimentos;Dia 2: um dos compartimentos d choques;Depois: os ratinhos so colocados no compartimento sem estimulo;

Ratinhos com a memria intactaNo entram no compartimento que d choques!Farmacologia II | FFUL 2015Teste da esquiva passivaFarmacologia II | FFUL 2015Teste da esquiva passivaBibliografiaB. Sunyer, S. Patil, H. Hger & G. Lubec - Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice J.M. Walkera, S.W. Fowlera, D.K. Millera, A.Y. Sunb, G.A. Weismanc,d, W.G. Woode, G.Y. Sunb,c, A. Simonyic, T.R. Schachtmana - Spatial learning and memory impairment and increased locomotion in a transgenic amyloid precursor protein mouse model of Alzheimers disease

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