imunodiagnóstico de doenças infecciosas

Imunodiagnóstico de doenças infecciosas

Sandra do Lago MoraesPesquisadora Científica Instituto de Medicina Tropical Universidade de São Paulo

DIAGNÓSTICO DE CERTEZA DE UMA INFECÇÃO

demonstração direta do patógeno ou de seus produtos nos tecidos ou fluidos

biológicos dos hospedeiros e/ou presença de sintomas clínicos definidos

MÉTODOS IMUNOLÓGICOS DIRETOS OU INDIRETOS

Amplamente usados na pesquisa de antígenos, anticorpos ou imunocomplexos

RapidezSimplicidadePossibilidade de automaçãoBaixo custo operacional

ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#1)

Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais

clínicos confundíveis diferenciar a fase da doença diagnosticar doença congênita selecionar doadores de sangue selecionar doadores e receptores de órgãos para

transplantes

ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#2)

avaliar o prognóstico da doença avaliar a eficácia da terapêutica e suspensão

da terapêutica avaliar a imunidade específica naturalmente

adquirida ou artificialmente induzida verificar o agravamento da patologia

ANTICORPOS EM INQUÉRITOS SOROEPIDEMIOLÓGICOS

Estabelecer a prevalência da doençaVerificar a erradicação da doença Verificar a reintrodução de novos casos em

áreas consolidadas

PESQUISA DE ANTÍGENOS

Como critério de curaNa definição da etiologia da doençaNa seleção de doadores de sangueEm inquéritos epidemiólogicos

LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #1

Dependem da capacidade de resposta imune

do hospedeiro Genética Estado de nutrição Integridade dos mecanismos de resposta

imunológica

Ubiqüidade dos determinantes antigênicos Reação cruzada (anticorpos heterófilos,

antígenos semelhantes, experiência

imunológica do hospedeiro com estímulos

antigênicos variados)


Interferentes não específicos Detergentes Solventes orgânicos pH Cromógenos endógenos Inibidores enzimáticos


FATORES DO ANTÍGENO ALVO QUE DEVEM SER CONSIDERADOS NA PESQUISA DE ANTÍGENOS

não persistência na circulação na ausência do parasita

ser abundante não apresentar grande diversidade genética ser estruturalmente diferente de antígenos

encontrados no sangue

MANIFESTAÇÕES DAS REAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO• Reação Primária ligação dos grupos reativos da molécula

antigênica com um de dois sítios de combinação da molécula de anticorpo

• Reação Secundária visibilização direta ou com auxílio de lupas da precipitação ou da aglutinação

• Reação terciária expressão biológica da interação Ag-Ac

TÉCNICAS SOROLÓGICAS

•Testes de complemento teste de hemólise fixação de complemento•Neutralização

Dependentes da reação terciária


•Precipitação•Aglutinação

Dependentes da reação secundária


•Imunofluorescência•Radioimunoensaio•Enzimaimunoensaios

Dependentes da reação primária (técnicas com reagentes marcados)

PRECIPITAÇÃO

•EM MEIO LÍQUIDO•EM MEIO SÓLIDO (ÁGAR)Imunodifusão simples - unidimensional (Oudin) - radial (Mancini)Imunodifusão dupla - unidimensional (Oakley) - radial (Ouchterlony)ImunoletroforeseImunoeletrodifusão - unidimensional simples - unidimensional dupla

AGLUTINAÇÃO

caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e

partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua

superfície

AGLUTINAÇÃO•1o estágio: ligação dos anticorpos aos

antígenos de superfície, por meio de ligações não-covalentes

•2o estágio: resulta das colisões que ocorrem entre as partículas, de modo que os anticorpos ligados a uma partícula se ligam a determinantes antigênicos de outra formam pontes entre partículas

agregados visíveis a olho nu

FATORES QUE INTERFEREM NA FORMAÇÃO DE AGREGADOS:

tipo do anticorpo (IgM é 750x mais eficiente que IgG)

eletrólitospH (ideal entre 6,0 e 8,0)macromoléculas hidrofílicas (em baixas

concentrações impedem a autoaglutinação)enzimas (afastam reações inespecíficas)tempotemperatura

AGLUTINAÇÃO

FENÔMENO DE PROZONA

falsos resultados negativos em soros com elevado título de anticorpos aglutinantes

esse efeito é eliminado empregando-se diluições seriadas do soro

AGLUTINAÇÃO

AGLUTINAÇÃO DIRETA

ocorre com partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície (Ex: hemácias, bactérias,

protozoários, fungos)

AGLUTINAÇÃO DIRETAhemácias como antígeno:

tipagem de grupos sangüíneos do sistema ABO e Rh (antígenos específicos) reação de Paul-Bunnel-Davidson (antígenos heterófilos)

antígenos íntegros ou fragmentados de bactérias, espiroquetas, protozoários:

teste de Widal (salmoneloses)teste de Wright (brucelose)

teste de Weil-Felix (rickettsiose)teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomíase

INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO DIRETA

baseia-se na capacidade que certos antígenos virais têm de, espontaneamente, aglutinarem certos

tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as partículas virais, resultando

na inibição da aglutinação, indicando um teste positivo para a presença de anticorpos

Exemplos: anticorpos contra os vírus da rubéola, sarampo, influenza e certos enterovírus

AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA

Aglutinação de partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita, sepharose, colódio, charcoal, etc.) ou células antigenicamente

não relacionadas (hemácias, bactérias, leveduras) sensibilizadas com antígenos

solúveis

HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVAHemácias possuem uma superfície complexa, o que

facilita a ligação de muitos antígenosmais usadas: hemácias de carneiro ou humanas do grupo O, fixadas com formaldeído ou glutaraldeído(resolve o problema da fragilidade e permite que sejam estocadas por longos períodos de tempo)

Ags polissacarídicos aderem prontamente a hemáciasantígenos protéicos requerem pré-tratamento com ácido tânico ou cloreto de cromo

INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA

baseia-se na competição, pelos sítios de combinação do anticorpo, entre o antígeno fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o hapteno. O grau de inibição relaciona-se com a quantidade do antígeno presente na amostra e, também, com a afinidade pelos sítios de combinação do anticorpo

AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX

Partículas de látex são esferas de poliestireno que podem ser utilizadas como suportes na adsorção de proteína solúvel e

antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação antígeno-

anticorpo

AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX

fator reumatóide antígenos polissacarídicos bacterianos (Haemaphilus influenzae, Rickettsia sp, estreptococos do grupo B, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, etc., no soro, urina ou líquor)drogas e hormônios (-HCG)anticorpos na rubéolaproteína C reativa

útil na pesquisa de:

AGLUTINAÇÃO DE CRISTAIS DE COLESTEROL

O teste de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) emprega cristais de colesterol

que são sensibilizados com lecitina e cardiolipina, para a pesquisa de anticorpos

antilipídios na sífilis

formação de flóculos ( aglutinação??)

IMUNOFLUORESCÊNCIABaseia-se na capacidade de anticorpos/antígenos se ligarem covalentemente a fluorocromos, sem perder sua reatividade específica com o antígeno

antígeno/anticorpo

Fluorocromos- substâncias que absorvem luz em comprimento de onda menor e quando excitadas com luz UV emitem luz em comprimento maior

mais comuns: isotiocianato de fluoresceína, lisamina-rodamina b

IMUNOFLUORESCÊNCIADIRETA

empregada na pesquisa e localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromoEx.: Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionella sp, Escherichia coli

Luz de excitação

Luz emitida

IMUNOFLUORESCÊNCIAINDIRETA

Empregada na pesquisa de anticorpos/antígenos. O antígeno fixado em lâmina reage com um anticorpo específico e o complexo Ag/Ac é revelado com conjugado

fluorescente (anti-Ig marcado)Exemplos:•pesquisa de antígenos: Plasmodium sp•pesquisa de anticorpos: T. pallidum, T.cruzi, CMV, Plasmodium sp, autoanticorpos

RADIOIMUNOENSAIO

anticorpo antígeno marcado+ não marcado (amostra)

medir radioatividade

Método de competição com antígeno marcado

antígeno fase sólida

anticorpo marcado+antígeno (amostra) medir

radioatividade

Método de competição com anticorpo marcado

RADIOIMUNOENSAIO

anticorpo antígeno (amostra) anti-antígenomarcado

medir radioatividade

Método de captura

RADIOIMUNOENSAIO

TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS

Baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção,

titulação e quantificação de substâncias de interesse biológico

IMUNOPEROXIDASE

Enzima converte o componente cromógeno (substrato + doador de hidrogênio) em produto

insolúvel, que precipita no sítio da reação

precipitado visível ao microscópio óptico comum e eletrônico

(por ser eletrodenso)

ENZIMAIMUNOENSAIO

Método quantitativo em que a reação Ag-Ac é monitorada pela medida da atividade enzimática

Homogêneo: não é necessária a separação entre os complexos Ag-Ac e o Ag e/ou Acs, pois a atividade da enzima não é alterada pela reação Ag-AcHeterogêneo: a atividade da enzima é alterada pela reação Ag-Ac e a separação se faz necessária

Ensaios heterogêneosperoxidase glicose oxidasefosfatase alcalina anidrase carbônica-galactosidase acetilcolinesteraseEnsaios homogêneoslisozima ribonuclease Amalato desidrogenase -galactosidaseglicose-6-desidrogenase

ENZIMAS MAIS UTILIZADAS EM ENZIMAIMUNOENSAIOS:

EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay(ELISA)

Princípio básico:imobilização de um dos reagentes numa fase

sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da atividade

imunológica do Ac

ELISA para pesquisa de anticorpos

antígeno

lava

gem

anticorpo(amostra)

E E

anti-imunoglobulinamarcada

lava

gem

lava

gem E E

substrato cromogênico

Método indireto

Método de Captura de IgM

lava

gem

lava

gem

lava

gem

lava

gem

anti-IgM IgM (amostra) antígeno anti-antígenomarcado

E E

Substratocromogênico

E E

ELISA para pesquisa de anticorpos

ELISA para pesquisa de antígenos

Método de captura

anticorpo antígeno (amostra)

E E

anti-antígeno marcado

E E


lava

gem

lava

gem

lava

gem


Método de competição com anticorpo marcado

antígeno

E

E

E

antígeno (amostra) +anticorpo marcado

E


lava

gem

lava

gem


Método de competição com antígeno marcado

anticorpo

E

E

E

E

E

antígeno marcadoe não marcado (amostra)

E E


lava

gem

lava

gem

Immunodot(ou dot-ELISA, dot-immunobinding assay, dot-blotting assay, dot-blot ELISA)

pequenas quantidades do imuno-reagente são aplicadas como gotas em membrana de nitrocelulose (fase sólida)membranas de nitrocelulose adsorvem proteínas com grande eficiência (praticamente 100%) (volumes de 0,1 a 1 ml, contendo de 100 a 400 pg de imuno-reagente, são suficientes)simplicidaderapidezsensibilidade

Immunodotenzimas mais utilizadas:

º peroxidase º fosfatase alcalinaº glicose oxidase

substratos devem sob ação da enzima, originar um precipitado colorido

para peroxidase: diaminobenzidina/H2O2 e 4-cloro-1-naftol/H2O2)

outros sistemas de detecção: substratos fluorescentes ou luminescentes, radioisótopos

Western blotting (Immunoblotting)1a etapa: proteínas são separadas, de acordo com seu

tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)

2a etapa: as proteínas separadas são transferidas eletroforeticamente, do gel para uma membrana de nitrocelulose, onde ficam imobilizadas, como uma réplica do padrão de bandas do gel

3a etapa: a reação imunoenzimática é então processada na membrana para identificação das proteínas separadas e transferidas

Western blottingpode ser empregado para:

determinar se há antígeno ou anticorpo em uma amostra e qual é a sua especificidade

determinar se o preparado é puro ou nãodeterminar quais proteínas estão sendo reconhecidas

por um anticorpodistinguir diferentes perfis de anticorpos, de acordo

com a fase da doença ou infecção, ou de acordo com a presença ou não da infecção

diferenciar entre cepas patogênicas e não-patogênicas, etc.

anodo

mistura deantígenos protéicos

catodo

migraçãoeletroforética

Western blotting

catodoanodo

papel de filtro

membrana

gel

tampão de transferência

Western blotting

reação antígeno-anticorpo

Y Y

YY

Y

Y

Y

YY

Y

A B

reação com conjugadorevelação com substrato cromogênico

Substratocromogênico

Y Y

YY

Y

Y

Y

YY

YY

E

Y E

YE

Y E

YE

Y E

YE

YE

YE

YE

A Bconjugado

A B

visualização dos complexosantígeno-anticorpo formados

ENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTESQuimioluminescência: fenômeno em que se obtém

energia luminosa a partir de uma reação química gerada como resultado da dissociação de ligações fracas (são produzidos compostos intermediários em um estado eletronicamente excitado que, quando retornam ao

estado de energia inicial, emitem luz

ImunofluorescênciaA fonte de energia que

promove a excitação das moléculas é uma

radiação incidente

BioluminescênciaA energia provém de uma reação biológica, sendo a emissão de luz

facilitada por uma enzima (luciferase) ou uma fotoproteína

VANTAGENS DA QUIMIOLUMINESCÊNCIA

•Elevada sensibilidade de detecção: de atomol até zeptomol (10-18 até 10-21 M)

• Linearidade da curva dose-resposta•Rapidez (sinal é gerado em segundos)•Custo (uso de pequenas quantidades de reagentes)•Reagentes não perigosos e procedimentos simples•Possibilidade de aumento da sensibilidade

(amplificadores)•Possibilidade de aplicação em sistema automatizados

ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE

•Consiste na detecção da reação antígeno-anticorpo utilizando uma enzima e uma molécula sintetizada ou uma mistura de moléculas que atuará como substrato para a enzima e como emissor de luz

•Substratos quimioluminescentes da peroxidase: luminol, isoluminol, polifenóis, ácido gálico, umbiliferone

ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE COM NANOPARTÍCULAS

•Nanopartículas são mais estáveis, mais baratas e de mais fácil purificação

•Ex. de ouro coloidal, que podem ser facilmente preparadas em uma gama de tamanhos, de 2 a 100 nm

WESTERN BLOTTING ENZIMAIMUNOENSAIO QUIMIOLUMINESCENTE

•A emissão de luz é detectada com um filme fotográfico ou de raios X

IMMUNODOT QUIMIOLUMINESCENTE

ENSAIOS IMUNOCROMATOGRÁFICOS

Podem ser encontrados em quatro formatos

B. “dipstick” C.cartão

D.híbrido

A1 A2

C2C1

S ST

A.cassete

TÉCNICAS EMPREGADA NA AUTOMAÇÃO

•Nefelometria•Turbidimetria•Enzimaimunoensaio• Imunoensaio quimioluminescente• Imunoensaio fluorescente (heterogêneo/

homogêneo)• Imunoensaio de polarização de fluorescência• Imunoensaio fluorescente de tempo controlado•Enzimaimunoensaio fluorescente

ENSAIOS MULTIPARAMÉTRICOS

•Possibilitam a realização de múltiplos ensaios em um único tubo, com a mesma amostra e ao mesmo tempo

•Duas plataformas principais•Microarranjos com proteínas ligadas

(chips)•Microarranjos com micropartículas

(suspensão)

SINALExpressão de um teste sorológico que resulta

da integração de um número variável de impulsos elementares, cada um destes

correspondendo à reação de uma molécula de anticorpos com o determinante antigênico para

o qual mostra afinidade

RUÍDOimpulsos resultantes de reatividade

inespecífica e que interferem na capacidade discriminativa do teste

Ideal: SINAL>>>> RUÍDO

LIMIAR DE DETECÇÃO

número de impulsos necessários para

desencadear o sinal. Varia entre as

diferentes técnicas imunológicas

imunodiagnóstico de doenças infecciosas

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