estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del dna...

Estructura y organización del genoma humano: genes,

familias génicas y polimorfismos del DNA

Genética Médica – Tema 2

Inma Martín Burriel Genética Médica. Tema 2Curso 2009-10 Estructura y organización del genoma

Bibliografía:Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp376-378Tamarin RH (1996) pp203-220, pp414-419Klug WS y Cummings MR (1999) pp277-298, pp528-539

Tema 2

• Estructura y organización del Genoma• Polimorfismos genéticos:

– Variaciones en el número de repeticiones– Mutaciones puntuales

• Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicina

Estructura en doble hélice del DNA:

10pb /vueltaDestrógiraBases apiladas perpendicularmente

Genoma

Genes de copia única

Unidad de transcripción

Región reguladoraaguas arriba

Promotor

Inicio transcripción

5’UTR

Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4

FintranscripciónIntrón 1 Intrón 2 Intrón 3

Región reguladorainterna

Región reguladoraaguas abajo

Gen eucariota

• Codifican para una única proteína• Se encuentran en una única posición del

genoma (un individuo 2 copias)

Genoma

• Familia génica:– “grupo de genes de un genoma que derivan

de un ancestro común”

Familia de las globinas (beta globina): 5 loci en HSA11 Orden según la expresión en el desarrollo Posición y longitud de intrones similar Evolución concertada

Familias génicas

– Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades:• Organizador Nucleolar (NO):

– Localizado en los brazos cortos de cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque pueden traslocarse

– Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S + 28S)

• Genes del RNAt:– 50 sitios cromosómicos– 10 a 100 copias/sitio

• Genes de las Histonas– Se mantiene la identidad de secuencia

Familias de genes en tándem

Familia de genes dispersos

• Familias de genes dispersos:– Actinas: de 5 a 30 genes– Queratinas: + de 20– Cadena pesada de la Miosina: 5-10– Tubulinas: 3-15– Globinas: hasta 5– Región variable de las inmunoglobulinas: 500– Histonas: 100-1000

• Las secuencias entre genes pueden variar• Genes homólogos pueden tener funciones

diferentes• Algunos pierden la función pseudogenes

Genoma

DNA repetido

Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem

¿DNA basura?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Mecanismo de reparación?- ¿Puntos de recombinación?

Entrecruzamiento desigual Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación

Variación en el número de repeticiones

DNA repetido en tándem

• DNA satélite: – repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y

algunas Mb)– DNA no transcrito– Regiones de heterocromatina, principalmente en

centrómeros (DNA alfoide)

Modelos de organización centromérica


• DNA minisatélite (VNTR)– Repeticiones de tamaño moderado (60pb)– Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros– Normalmente no se transcriben– Tipos:

• DNA minisatélite hipervariable• DNA telomérico

Función DNA telomérico: Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma

• DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente <

150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)

– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)

– Herencia mendeliana codominante


CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Alelo 1

Alelo 2

VNTR Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección

Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites(VNTR)

0,1-20 20-40 pb Elec. agarosa

Microsatélites(STR)

pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación


VNTR Tamaño (Kb)

Unidad repetición

Método detección

Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites(VNTR)

0,1-20 20-40 pb14-100 pb

Elec. agarosa

Microsatélites(STR)

pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación


Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población

Polimorfismos

• Polimorfismo genético:– Cuando un locus presenta al menos 2 alelos

y la frecuencia alélica del más raro es > 5% locus polimórfico.

– El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones ambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad.

DNA minisatélite hipervariable

• Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas

• Secuencia repetida común (core):GGGCAGGAXG

• Son muy polimórficas• Se encuentran principalmente en intrones• Estas secuencias se han empleado como

“huellas dactilares”


Detección del polimorfismo: Digestión del DNA con enzimas de restricción + Southern (hibridación con sonda)

1

10

4

6

8

INDIVIDUO 2

11

7

1

345

2

3 3’

3

5

9

21

32

4

1

32

4

3’3

INDIVIDUO 1

2

4

6

8

1

3

5

7

9

1 1’

1

3

5

7

2

4

6

1

1

3

5

7

2

4

6

8

1’

1

3

5

7

2

4

6

8

1

3

5

2

4

6

2

4

6

1

3

5

7

2’2

1

3

5

7

9

1

3

5

2

4

2 2’

10

2

4

6

8

4

5

7

9 10

11

8

6

INDIVIDUO 1

INDIVIDUO 2

VN

TR

s

• Funciones de los VNTRs:– Regulación de puntos activos de

recombinación– Control de segregación de los cromosomas

(por su localización centromérica)– Estabilización de los cromosomas durante la

replicación (por su localización en telómeros)– Podrían dar estabilidad a los cromosomas

• Aplicaciones:– Identificación individual (medicina forense)


DNA microsatélite

• Localización dispersa en todos los cromosomas

• Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante.

• A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES).

• Secuencia repetida de 1 a 4 pb.

• Son muy polimórficas.• Las secuencias

flanqueantes a la repetición son únicas.

Detección del polimorfismo: PCR

• Visualización de los microsatélites:– http://www.unizar.es/lagenbio/recursos/

DNA microsatélite

ACGT

Secuenciación: Genotipado:

• Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina: – Expansión de microsatélites de trinucleótidos:

• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar

(SCA)– Expansión de tetranucleótidos: DM2– Expansión de pentanucleótidos: SCA10

DNA microsatélite

• Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites:– Enfermedades de herencia recesiva expansión de

tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína)

– Enfermedades con herencia dominante expansión de tripletes produce una proteína alterada

– Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes expansiones en el ARN función celular alterada?

DNA microsatélite

• Aplicaciones:– Identificación individual – Análisis evolutivo de poblaciones– Diagnóstico directo en enfermedades

genéticas causadas por expansión de trinucleótidos

– Diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas:• Ligamiento entre microsatélites polimórficos y

genes causantes de enfermedad.

DNA microsatélite

Identificación individual

Análisis de 15 marcadoresmicrosatélites

Diagnóstico directoEjemplo: Diagnóstico corea de Huntington

Nº repet Clasificación E.H.

<27 Normal No

27-35 Intermedio No

36-39 Penetrancia I +/-

>39 Penetrancia T Si

1 2

3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

45

22201816

12

Diagnóstico indirecto

Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas

Fibrosis quística

HSA7

CFTR

Ms1

Ms2

Ms3

CFTR* CFTR*

127 125

?

222

152

220

154

?

1

123 125

CFTR*

220

150

220

154

2

123 125

CFTR*

220

150

220

154

3

127 129

?

222

152

218

152

?

4

123 129

?

220

150

218

152

?

5

127 129

?

222

152

218

152

?

6

Etiología Detección Frecuencia genómica

Microsatélites errores de DNAp PCR 1/30.000 bp(short tandem slippage repeats)

STRs

Minisatélites entrecruzamiento Southern variable, baja(variable no of no equilibradotandem repeats) unequal crossing over

VNTRs

RFLPs mutaciones Southern-PCR baja(restriction fragment length polymorphisms) SNPs mutaciones PCR 1/1000 bp(Single nucleotide Polymorphisms)

Resumen de polimorfismos genéticos

Mutaciones Puntuales

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales:• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

En regiones codificantes:

Mutaciones con cambio aminoacídicoGCA (Ala) GTA (Val)Mutaciones sin sentidoAAA (Lys) TAA (stop)Mutaciones silentesGCA (Ala) GCC (Ala)

Alelo 1Alelo 2

TACGAGCTATACGGGCTA

Mutaciones:- Cambio de base- Inserción - Deleción

Metodología para determinar mutaciones puntuales

• SNP:– Mutaciones puntuales

detectable por un variado número de técnicas:

• Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte)

• Secuenciación• Minisecuenciación• Sondas específicas• SSCPs• PCR en tiempo real…

– Baja variabilidad (2 alelos)– Localización:

• Exones• DNA de copia única

• RFLPs:– Mutaciones puntuales que se

localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción.

– Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting

– PCR + enzima de restricción– Baja variabilidad (2 alelos).– Localización:

• Exones• Genes de copia única

RFLPs

Determinación mediante Southern

Diagnóstico genético por RFLPs

Polimorfismo debido a mutaciones puntuales En el gen de la globina normal la secuencia correspondiente al 5th-7th aminoácido del péptido beta-globina es CCTGAGGAG que es reconocida por la enzima de restricción MstII. En la variable patológica de la anemia falciforme, eritrocitos en hoz-sickle, se produce una mutación puntual de A a T, lo que invalida el reconocimiento por MstII. En la correspondiente digestión enzimática se genera un único fragmento de 1,3 kb en lugar de los dos fragmentos de 0,2 kb y 1,1 kb propios del gen normal. Los diferentes fragmentos se detectan por técnica de Southern blotting

Aa Aa aaAA

AaAa

aaaa aaAA

RE RE RE RE RE

A a

A a

AA Aa aa

Ms t I I

RFLP(Restriction fragment lenght polymorfism)

Determinación mediante PCR-RFLPs

Mutación:Alelo 1Alelo 2

TGGACGTCTTGGATGTCT

Aat II

PCR Alelo 1 Alelo 2

PCR:

TGGACGTCTTGGAGGTCT

Fragmento PCR

Electroforesis

Genética Médica

• SNP:– Mutaciones puntuales

detectable por un variado número de técnicas:

• Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte)

• Secuenciación• Minisecuenciación• Sondas específicas• SSCPs• PCR en tiempo real…

– Baja variabilidad (2 alelos)– Localización:

• Exones• DNA de copia única

• RFLPs:– Mutaciones puntuales que se

localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción.

– Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting

– PCR + enzima de restricción– Baja variabilidad (2 alelos).– Localización:

• Exones• Genes de copia única

Según metodología de detección

SNPs

• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Presentación muy frecuente (1/300 pb)– 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de

mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)– Fácil estandarización– Aplicaciones en la determinación de

enfermedades y en farmacogenética

Determinación de SNPs

MCL1

Secuenciación:

Minisecuenciación:

PCR en tiempo real con sondas alelo específicas:

• Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina: – Pueden originar diferencias muy sutiles o

provocar la muerte– Mutaciones en líneas germinales:

• Neurofibromatosis (dominante)• Acondroplasia (dominante)• Hemofilia (Factor VII, ligado al X)

– Mutaciones somáticas:• Cáncer: mutaciones de protooncogenes

– Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos

Mutaciones puntuales

• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:– Identificación individual (Medicina

forense)– Construcción de los mapas génicos– Ligamiento con fenotipos

Genética Médica

Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística

Nora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: 648-654

estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del dna...

Documents