efeito da olmesartana na inflamaÇÃo intra articular

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE

FACULDADE DE ENFERMAGEM

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE

MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE

MARILIA STEFANI SOUZA DE MENEZES

EFEITO DA OLMESARTANA NA INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR

INDUZIDA POR ZYMOSAN

MOSSORÓ

2016




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade, da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, como requisito final para obtenção do grau de Mestre em Saúde e Sociedade. Orientadora: Profa. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros

MOSSORÓ

2016

Menezes, Marilia Stefani Souza De Efeito da Olmesartana na inflamação intra-articular induzida por Zymosan. / Marilia Stefani Souza De Menezes – Mossoró, RN, 2016.

68 f.

Orientador(a): Prof. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros

Dissertação (Mestrado) Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. Campus Central. Programa de Pós - Graduação em Saúde e Sociedade, da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte,

1. Inflamação. 2. Injeções Intra-Articulares. 3. Anti-inflamatórios. I. Medeiros,

Caroline Addison Carvalho Xavier de. II. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. III.Título. UERN/ BC CDD 616.15

Catalogação da Publicação na Fonte. Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.

Bibliotecário: Sebastião Lopes Galvão Neto – CRB - 15/486

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE – UERN

FACULDADE DE ENFERMAGEM-FAEN

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE

MESTRADO ACADÊMICO EM SAÚDE E SOCIEDADE

A COMISSÃO ABAIXO ASSINADA APROVA A DISSERTAÇÃO INTITULADA



Elaborada por


COMO REQUISITO FINAL PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM

SAÚDE E SOCIEDADE

BANCA EXAMINADORA:

Prof Drª Caroline Addison Carvalho Xavier de

Medeiros

(Orientadora)

UFRN/RN ________________________________

Prof Drª Patricia Batista Barra Medeiros

Barbosa

(Examinador interno)

UERN/RN ________________________________

Prof Drª Aurigena Antunes de Araújo

(Examinador externo)

UFRN/RN ________________________________

MOSSORÓ

2016

Ao meu Deus, Pai amoroso que sempre

têm me sustentado. “Não tenho palavras

para agradecer Tua bondade (...). Tudo o

que tenho, tudo o que sou, o que vier a

ser, vêm de ti Senhor.”

Aos meus pais por serem a minha base.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por mais essa oportunidade concedida.

À minha família, pai, mãe e irmã, por sempre apoiarem as minhas decisões e

acreditarem em mim.

Ao meu esposo Alexandre, por muitas vezes abdicar das suas obrigações e

priorizar as minhas, sem você tudo teria sido muito mais difícil.

À minha orientadora, Caroline Addison, por ter me iniciado na pesquisa desde

a graduação em Enfermagem e continuar guiando meus passos em mais essa

jornada. Obrigada pela compreensão, por me deixar livre para que eu pudesse

aprender sozinha, por fazer pressão quando as coisas precisaram andar mais

rápidas e, pelas boas referências que sempre foram dadas.

Agradeço às professoras Drª Maria de Lourdes e Drª Isabela Pinheiro, pela

disponibilidade e contribuição na banca de qualificação, suas críticas e sugestões

foram imprescindíveis na conclusão deste estudo.

À banca de defesa, Drª Aurigena Antunes e Drª Patricia Barra, pelo interesse

em aceitar participar deste momento de grande importância na minha caminhada

acadêmica e pelo conhecimento compartilhado que só engrandeceu este trabalho.

Aos professores do Programa Mestrado em Saúde e Sociedade, pelos

conhecimentos repassados que foram tão necessários nessa construção.

Ao meu amado grupo dos “fantoches”: Cintia, Ana Maria, Paulo e Diógenes.

Obrigada pela amizade, união, risadas e confraternizações. Vocês se tornaram

amigos para a vida.

Aos demais colegas de turma, pelas conversas, momentos de descontração e

aprendizado. Desejo sucesso a todos vocês!

A todos que contribuíram direta e indiretamente. Muito obrigada!

RESUMO

A inflamação intra-articular é o principal sintoma clínico encontrado em processos

que envolvem doenças das articulações agudas e crônicas, tais como a Artrite

Reumatoide (AR), osteoartrite (OA) e gota. O objetivo desta pesquisa foi estudar o

efeito do pré-tratamento da olmesartana (OLM) na inflamação intra-articular induzida

por Zymosan (Zy) em ratos Wistar. A inflamação intra-articular (i.a.) foi induzida por 1

mg de Zymosan dissolvido em solução salina no joelho direito dos ratos. Os animais

foram divididos em seis grupos: grupo salina – animais receberam solução salina por

via oral (VO) trinta minutos antes da injeção (i.a.) de solução salina; grupo Zy –

animais receberam solução salina VO e Zy (i.a.); grupos tratados - animais

receberam Olmesartana nas doses de 5, 15 ou 30 mg/kg ou Diclofenaco de Sódio

(DS) 100 mg/kg VO antes da indução com Zymosan (i.a.). 24 horas após a injeção

de Zymosan, houve a coleta de líquido sinovial para contagem total de leucócitos,

coleta de sangue para dosagens bioquímicas (ureia, creatinina, aspartato

aminotransferase – AST e alanino aminotransferase - ALT) e coleta do tecido sinovial

para dosagem de mieloperoxidase (MPO), malondialdeído (MDA), glutationa (GSH)

por determinação de grupos sulfídricos não proteicos (NP-SH), exame

histopatológico e imuno-histoquímica. A OLM 15 ou 30 mg/kg, apresentou efeito

protetor, tal como evidenciado pela redução de alterações inflamatórias no exame

histopatológico da sinóvia dos animais, redução no número de leucócitos totais,

redução nos níveis de MPO e MDA; aumento nos níveis dos grupos NP-SH, em

comparação com o Zymosan. Olmesartana reduziu imunomarcação para

cicloxigenase-2 (COX-2) e aumentou a imunomarcação para superóxido dismutase

(SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px). Os resultados para DS foram semelhantes

aos observados com OLM (p<0,05). Olmesartana não causou alterações a nível

renal (ureia e creatinina) ou hepático (AST e ALT) nos animais e mostrou efeito

protetor sobre a inflamação intra-articular induzida por Zymosan.

DESCRITORES: Inflamação. Injeções Intra-Articulares. Anti-inflamatórios. Pleiotropia

Genética/ efeitos de drogas.

ABSTRACT

Intra-articular inflammation is the main clinical sign found in cases involving acute

and chronic joint diseases, such as Rheumatoid Arthritis (RA), osteoarthritis (OA) and

gout. The objective of this research was to study the effect of olmesartan (OLM) in

inflammation intra-articular zymosan-induced (Zy) in Wistar rats. Inflammation intra-

articular (i.a.) was induced by 1 mg of Zy dissolved in saline at right knee of rats. The

animals were divided into six groups: saline group – animals received saline solution

orally thirty minutes before the injection (i.a.) saline solution; Group Zy – animals

received saline solution orally and intra-articular Zy; and groups treated - animals

received the doses of 5, 15 or 30 mg/kg or diclofenac sodium (DS) 100 mg/kg orally

before induction with Zymosan (i.a.). 24 hours after injection of Zymosan, there was

the synovial fluid collection for total count of leukocytes, blood collection for

biochemical dosages (urea, creatinine, aspartate aminotransferase - AST and alanine

aminotransferase - ALT) and collecting the synovial tissue myeloperoxidase dosage

(MPO), malonaldehyde (MDA), glutathione (GSH) determining non-protein sulfídricos

groups (NP-SH), examination histopathology and immunohistochemistry. The OLM

15 or 30 mg/kg, showed a protective effect, as evidenced by the reduction of

inflammatory changes in synovial histopathological examination of animals, reduction

in the number of total leukocytes, reduction in levels of MPO and MDA; increase in

levels NP-SH groups, compared with zymosan. OLM has reduced immunostaining

for cyclooxygenase-2 (COX-2) and increased the immunostaining to superoxide

dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px). The results for DS were

similar to those seen with OLM (p<0,05). Olmesartan caused no changes in the

kidney (urea, creatinine) and liver (AST and ALT) in animals and showed a protective

effect on intra-articular inflammation induced by Zymosan.

KEYWORDS: Inflammation. Injections, Intra-Articular. Anti-Inflammatory Agents.

Genetic Pleiotropy/ drug effects.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Representação das deformidades em mão ocasionadas pela

AR........................................................................................................

25

Figura 2 Radiografias em perfil dinâmico (A - hiperextensão; e B -

hiperflexão), evidenciando a instabilidade atlanto-

axial.....................................................................................................

26

Figura 3 Representação do Cisto de

Baker...................................................................................................

26

Figura 4 Esquema do protocolo

experimental........................................................................................

39

Figura 5 Influxo celular no lavado sinovial após 24 horas de indução de

sinovite (média ± DP) em

ratos.....................................................................................................

47

Figura 6 Representação histopatológica da sinóvia de grupos não tratados e

tratados que receberam solução salina ou zymosan intra-

articular................................................................................................

49

Figura 7 Escores atribuídos às alterações histopatológicas observadas nos

animais dos diferentes grupos

experimentais.......................................................................................

50

Figura 8 Efeito atenuador da Olmesartana e Diclofenaco Sódico na atividade

de MPO na sinóvia de ratos.................................................................

51

Figura 9 Produção de MDA na sinóvia de ratos submetidos à inflamação

articular por zymosan...........................................................................

51

Figura 10 Concentração de GSH na sinóvia de ratos submetidos à zymosan e

salina (i.a.) pela determinação de NP-SH............................................

52

Figura 11 Representação de imuno-histoquímica de ciclo-oxigenase 2 (COX-

2), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px)

em tecido sinovial de ratos, 24 horas após a administração de

Zy.........................................................................................................

53

Figura 12 Níveis bioquímicos de ureia (A), creatinina (B), aspartato

aminotransferase (AST) (C) E alanina aminotransferase (ALT) (D)....

54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Desenho experimental.....................................................................

38

Tabela 2 Valores de escores para parâmetros utilizados na análise

histopatológica das sinóvias............................................................

42

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACR Colégio Americano de Reumatologia

AIEs Anti-inflamatórios esteroides

AIMR Artrite imuno-mediada em roedores

AINEs Anti-inflamatórios não-esteroides

ALT Alanina aminotransferase

Ang Angiotensina

ANTI-CCP Anti Peptídio Cíclico Citrulinado

AR Artrite Reumatoide

AST Aspartato aminotransferase

AT1-R Antagonistas dos receptores tipo 1

AVE Acidente Vascular Encefálico

Azy Artrite induzida por Zymosan

BRA Bloqueadores dos Receptores da Angiotensina

CDG Carga de doença global

CFA Adjuvante Completo de Freund

COX Ciclo-oxigenase

DCV Doenças cardiovasculares

DM Diabetes mellitus

DMARDs Drogas modificadoras do curso da doença

DNA Ácido desoxirribonucleico

DS Diclofenaco de sódio

DTNB Ácido Ditiobis Nitrobenzóico

ECA Enzima Conversora de Angiotensina

EDTA Ácido etileno-diamino-tetra-acético

EROs Espécies Reativas de Oxigênio

FGF Fator de crescimento de fibroblastos

FLS Fibroblastos

FR Fator Reumatoide

GSH Glutationa

GSH-Px Glutationa peroxidase

HÁ Hipertensão Arterial

HE Hematoxilina-eosina

HLA Antígenos leucocitários humanos

HTAB Tampão brometo de cetil trimetil amônio

i.a. Via intra-articular

IAM Infarto Agudo do Miocárdio

ICAM Molécula de Adesão Intercelular

ICC Insuficiência Cardíaca Congestiva

IECA Inibidores da Enzima Conversora de Angiotensina

IFA Adjuvante incompleto de Freund

IFNγ Interferon gama

Ig Imunoglobulinas

IL Interleucina

INOs Síntese de Óxido Nítrico Induzível

i.p Via intraperitoneal

LES Lúpus Eritematoso Sistêmico

M-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos

MDA Malondialdeído

MLS Macrófagos

MMPs Metaloproteinases da matriz

MPO Mieloperoxidase

MTX Metotrexato

NF-κB Fator nuclear de transcrição kappa B

NP-SH Grupos sulfidrílicos não proteicos

AO Osteoartrite

OLM Olmesartana

PA Pressão Arterial

PCR Proteína C Reativa

PG Proteoglicanos

PGs Prostaglandinas

RANK Receptor ativador do fator nuclear κB

RANKL Ligando do receptor ativador do NF-κB

SOD Superóxido dismutase

SRAA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona

TLR2 Receptores semelhantes a toll like 2

TNF Fator de Necrose Tumoral

VEGF Fator de crescimento vásculo-endotelial

VHS Velocidade de hemossedimentação

ZY Zymosan

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 17

1.1 INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR E ARTRITE REUMATOIDE.................... 17

1.1.1 Artrite Reumatoide e estresse oxidativo............................................... 23

1.1.2 Manifestações Clínicas............................................................................... 24

1.1.3 Diagnóstico.................................................................................................. 27

1.1.4 Tratamento da AR........................................................................................ 29

1.2 MODELO DE INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR INDUZIDA POR

ZYMOSAN..............................................................................................................

31

1.3 EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DA OLMESARTANA..................................... 32

2 OBJETIVOS........................................................................................................ 35

2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................... 35

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 35

3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 36

3.1 ANIMAIS........................................................................................................... 36

3.2 DROGAS, ANTICORPOS, SOLUÇÕES, LÍQUIDOS E CORANTES

UTILIZADOS..........................................................................................................

36

3.3 APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS.................................... 37

3.4 INFLAMAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN................................ 37

3.4.1 Modelo experimental................................................................................... 37

3.4.2 Grupo salina................................................................................................. 39

3.4.3 Grupo zymosan........................................................................................... 39

3.4.4 Grupos tratados com Olmesartana ou Diclofenaco de Sódio................ 40

3.5 PARÂMETROS AVALIADOS PARA O ESTUDO DA MODULAÇÃO

FARMACOLÓGICA NA ARTRITE INDUZIDA POR ZYMOSAN............................

41

3.5.1 Análise do influxo celular........................................................................... 41

3.5.2 Análise histopatológica das sinóvias........................................................ 41

3.5.3 Dosagem de mieloperoxidase (MPO)........................................................ 42

3.5.4 Determinação dos níveis de glutationa (GSH).......................................... 43

3.5.5 Níveis de malondialdeído (MDA)................................................................ 43

3.5.6 Imuno-histoquímica para cicloxigenase 2 (COX 2), superóxido

dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH - Px).......................................

44

3.5.7 Avaliação de dosagens bioquímicas (ureia, creatinina, AST, ALT)........ 44

3.4.8 Métodos estatísticos................................................................................... 45

4 RESULTADOS.................................................................................................... 46

4.1 ANÁLISE DO INFLUXO CELULAR NO LÍQUIDO SINOVIAL.......................... 46

4.2 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS DAS SINÓVIAS........................................ 47

4.3 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE............................................................. 50

4.4 PRODUÇÃO DE MALONDIALDEÍDO.............................................................. 51

4.5 NÍVEIS DE GLUTATIONA................................................................................ 52

4.6 IMUNO-HISTOQUÍMICA.................................................................................. 52

4.7 AVALIAÇÃO DAS DOSAGENS BIOQUÍMICAS.............................................. 54

5 DISCUSSÃO....................................................................................................... 55

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................ 61

ANEXOS................................................................................................................ 62

REFERÊNCIAS...................................................................................................... 63

16

1 INTRODUÇÃO

1.1 INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR E ARTRITE REUMATOIDE

O processo inflamatório é um mecanismo de reação dos tecidos para que

haja uma eliminação, neutralização e destruição da causa da agressão. Esse

processo se caracteriza pela saída de líquidos e células (exsudação) e induz o

processo de reparo celular. A inflamação pode ser aguda (entre 1 a 2 semanas) ou

crônica (superior a 3 meses), porém, os mecanismos iniciais serão os mesmos para

os dois tipos. Assim sendo, o que diferencia essa divisão é o tempo de exposição ao

agente agressor, o tipo de agente e a resposta imune (KUMAR; ABBAS e FAUSTO,

2008).

Existem cinco sinais no processo inflamatório que são chamados sinais

cardinais: calor, rubor, edema, dor e perda da função. O calor e o rubor são

decorrentes da vasodilatação que leva ao local afetado uma maior quantidade de

sangue (hiperemia), e, portanto, há um aumento da temperatura pelo aumento de

sangue e vermelhidão pela concentração de sangue. O edema se dá pelo aumento

da permeabilidade vascular que permite o extravasamento de líquidos. A dor

aparece tanto por compressão dos nervos pelo edema quanto por mediadores

químicos liberados como prostraglandinas (PGs) E2 e cininas. A perda da função

pode ser total ou parcial e ocorre em decorrência dos outros quatro sinais cardinais.

Durante todo o processo inflamatório há liberação de mediadores químicos, como as

aminas vasoativas (histamina e serotonina), metabólitos do ácido araquidônico (PGs

e leucotrienos), citocinas e espécies reativas de oxigênio (EROs) (BRASILEIRO

FILHO, 2009).

A inflamação intra-articular é o principal sintoma clínico encontrado em

processos que envolvem doenças das articulações agudas e crônicas, tais como a

artrite reumatoide (AR), osteoartrite (OA) e gota. Artrite é um termo genérico para

várias doenças articulares que envolve a inflamação de uma ou mais articulações ou

do sistema musculoesquelético. Existe mais de 150 tipos de doenças reumáticas e

musculoesqueléticas categorizadas como artrite; no entanto, a forma mais comum é

a OA, também denominada de artrose ou osteoartrose (CONTE et al., 2015; CROSS

et al., 2014).

17

Durante as últimas duas décadas, o cenário global da saúde passou por uma

rápida transformação. As pessoas estão vivendo mais do que em qualquer outra

época e a população está envelhecendo. Como resultado, o fardo das doenças é

cada vez mais definido pela invalidez ao invés da mortalidade prematura. A

abordagem do estudo de carga de doença global (GBD) é um esforço sistemático e

científico para quantificar a magnitude comparativa da perda de saúde decorrente de

doenças, lesões e fatores de risco por idade, sexo e geografia para pontos

específicos no tempo. A classificação das doenças se dá pela soma de fatores,

como anos perdidos em decorrência de morte prematura e anos vividos com

invalidez. Neste contexto, algumas formas de artrite foram classificadas como

doenças que levam à maior carga de saúde a nível mundial, como a artrite

psoriática, lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite infecciosa e AR, tendo essa

última maior destaque por ocupar a posição 42 dentre as 291 condições estudadas

globalmente (ROY; KANWAR e KANWAR, 2015).

A AR é uma artropatia inflamatória sistêmica, autoimune, progressiva,

caracterizada por poliartrite crônica que começa insidiosamente com fadiga,

anorexia, astenia e sintomas musculoesqueléticos vagos até o aparecimento da

sinovite se tornar evidente (MOTA et al., 2011).

A poliartrite ocorre por causa de uma sinovite mediada por respostas

imunológicas – celular e humoral –, e o distúrbio afeta, principalmente, as

articulações periféricas de modo simétrico, iniciando pelas articulações dos dedos,

mãos e pés, com destaque para as articulações metacarpofalangeanas e

interfalangeanas proximais e, evoluindo para articulações maiores, como ombros e

joelhos (ABBAS; LICHTMAN e PILLAI, 2008; KOURILOVITCH; GALARZA-

MALDONADO e ORTIZ-PRADO, 2014).

A AR tem uma prevalência mundial em torno de 0,5 a 1,0% da população

adulta, sendo as mulheres duas a três vezes mais acometidas que os homens,

ocorrendo em todas as regiões do mundo e em todas as etnias. A doença se inicia,

geralmente, entre 30 a 50 anos, sendo que 20% a 30% dos pacientes não tratados

tornam-se incapacitados para o trabalho dois a três anos após o diagnóstico. A

prevalência aumenta com a idade em ambos os gêneros, acompanhando o

envelhecimento da população. No Brasil, a prevalência é similar à da população

mundial, predominando na população do gênero feminino, com início após os 40

anos e com maior incidência na faixa dos 50 anos (GIBOFSKY, 2012; BLAY et al.,

18

2012; VOGELPOEL et al., 2015).

A sobrevida dos pacientes com AR é menor do que a da população em geral

e a expectativa de vida pode decrescer de três a dez anos, dependendo da

gravidade e da idade do paciente no início da doença. As causas mais comuns

descritas para as mortes desses pacientes são as doenças cardiovasculares, alguns

tipos de câncer, doenças infecciosas e renais. Pacientes com AR apresentam maior

número de dias com comprometimento da saúde física e mental comparados com

indivíduos sem a doença. Devido ao caráter progressivo, ao desenvolvimento das

deformidades e ao comprometimento da capacidade funcional, a AR representa um

importante impacto econômico e social (AVIÑA-ZUBIETA et al., 2008; GABRIEL e

MICHAUD, 2009; HOOTMAN; HELMICK e BRADY, 2012; ZHANG et al., 2010).

A patogenia da AR ainda é objeto de estudo de pesquisas, e a doença

parece ser de origem multifatorial – fatores hormonais, ambientais e imunológicos,

que atuam em conjunto sobre indivíduos geneticamente suscetíveis –, com

manifestações ocasionadas a partir de diversos mecanismos inflamatórios. Os

fatores genéticos estão fortemente associados à positividade do anticorpo anti

peptídio cíclico citrulinado (anti-CCP). Diversos genes já foram relacionados com o

desenvolvimento da AR, sendo o sistema de histocompatibilidade humano (HLA:

human leukocyte antigens) no locci DRB1 – que codifica as moléculas de

histocompatibilidade presentes na superfície das células apresentadoras de

antígenos – a principal associação genética, estando também associados ao

desenvolvimento de formas mais graves da doença (BALSA et al., 2010; STAHL et

al., 2010).

Sabe-se que a sinovite causa ativação e proliferação das células de

revestimento sinovial, bem como expressão de citocinas pró-inflamatórias,

recrutamento de células inflamatórias mediada por quimiocinas e ativação de células

B, com produção de autoanticorpos. Todos estes fatores agem em conjunto e

amplificam a resposta inflamatória, havendo contínua alteração na expressão de

citocinas e consequente ativação de mecanismos de sinalização celular e inibição de

apoptose, que contribuem para a destruição de cartilagens e a perda óssea,

mecanismos mediados principalmente por osteoclastos (SWEENEY e FIRESTEIN,

2004).

A compreensão da fisiopatologia dos mecanismos envolvidos na lise da

cartilagem articular e do osso subcondral - que consiste de uma fina placa de osso

19

localizada diretamente sob a cartilagem articular, juntamente com o osso esponjoso

que dá sustentação a esta placa óssea – é necessária para se buscar tratamentos

que possam alterar o curso evolutivo da doença.

A cartilagem articular é essencial para o movimento normal das articulações,

apresentando em sua composição condrócitos imersos numa matriz extracelular.

Essa matriz consiste principalmente de colágeno e proteoglicanos sulfatados (PG), o

que confere a esse tecido, resistência e elasticidade (REGO, 2010).

A membrana sinovial normal que reveste as articulações tem uma espessura

de duas a cinco camadas de células, dispondo de uma rica vascularização. Esta

apresenta-se como um tecido composto por duas camadas: uma camada superficial,

de revestimento, denominada camada íntima ou camada de revestimento sinovial, e

uma camada subíntima, localizada abaixo do revestimento e composta,

principalmente, por tecido conjuntivo. A camada íntima apresenta uma espessura de

normalmente uma a três células, sendo uma camada avascular e sem a presença de

lâmina basal. Dois tipos celulares predominam no tecido sinovial: os sinoviócitos do

tipo A e B. As células do tipo A assemelham-se estrutural e funcionalmente a

macrófagos (MLS) e compõem entre 20 e 30% das células da membrana. Os

sinoviócitos do tipo B, que são a maioria – cerca de 70% das células do tecido

sinovial -, são também conhecidos como sinoviócitos semelhantes a fibroblastos

(FLS), e parecem ter um papel-chave não somente no desencadeamento da

sinovite, como também nos mecanismos que levam a perda óssea e destruição de

cartilagens, que são complicações frequentes da AR (SWEENEY e FIRESTEIN,

2004; MOR; ABRAMSON e PILLINGER, 2005).

Uma das hipóteses propostas para explicar o evento inicial na AR atribui o

fato à presença de um agente infeccioso ou outro tipo de exposição ambiental, que

poderia ativar mecanismos locais de imunidade inata no microambiente articular,

ativando células do revestimento sinovial e permitindo uma subsequente resposta

celular adaptativa em indivíduos suscetíveis geneticamente, ocasionando a sinovite.

Projeções de tecido proliferativo penetram na cavidade articular, invadindo a

cartilagem e o tecido ósseo, formando o pannus, característico da AR (VOGELPOEL

et al., 2015).

A invasão da cartilagem pelo pannus leva a degradação do colágeno tipo II

por metaloproteinases da matriz (MMPs), e por outras enzimas produzidas por

células sinoviais e condrócitos quando estimulados por citocinas, como fator de

20

necrose tumoral alfa (TNFα), interleucina (IL) 1β, IL 6, IL 17 e oncostatina. As

melatoproteinases da membrana tipo 1 (MMP-1) são proteinases chave que

medeiam a ação do pannus na cartilagem. Além do colágeno tipo II, o proteoglicano

agrecan é outro importante componente da cartilagem, conferindo a esta

propriedades de resistência à compressão, mantendo as moléculas de água nos

tecidos. Na AR, há diminuição do agrecan na cartilagem, devido a ação de

agrecanases (MILLER et al., 2009).

Sabe-se, além disso, que os fibroblastos sinoviais são células que estão

relacionadas ao controle do volume do líquido sinovial. Em condições saudáveis, um

aumento no volume deste líquido gera estresse na camada íntima e, em mecanismo

de feedback negativo, os fibroblastos sinoviais diminuem a produção de hialuronano

– que tem propriedades lubrificantes e imunomoduladoras –, reduzindo a pressão

oncótica local e reduzindo a retenção de plasma no líquido sinovial. No pannus

reumatoide, ocorre uma falha nestes mecanismos de feedback, de modo que a

produção de hialuronano não é reduzida frente ao estresse mecânico, aumentando a

retenção de líquido na cavidade articular e gerando estresse mecânico na camada

íntima sinovial (MOR; ABRAMSON e PILLINGER, 2005).

Em consequência à exposição inicial (como um agente infeccioso, por

exemplo), há um influxo de macrófagos e o aumento na proliferação de sinoviócitos,

ocasionando uma hiperplasia da membrana sinovial; o tecido é então infiltrado por

células mononucleares, em especial linfócitos T auxiliares e linfócitos B, podendo

haver a formação de estruturas semelhantes a nódulos linfáticos, com a participação

de macrófagos e células dendríticas, em aproximadamente um quinto dos pacientes

(SWEENEY e FIRESTEIN, 2004).

O quadro inflamatório se agrava em função da produção de autoanticorpos,

resultando na formação de imunocomplexos. Os autoanticorpos reconhecem

antígenos articulares, tais como o colágeno tipo II e PG ou ligam-se à porção Fc de

imunoglobulinas da classe IgG – também conhecido como fator reumatoide (FR) –

que possam estar presentes no local. A região Fc realiza ativação de complemento

(quando unida ao antígeno) e auxilia a fagocitose por se ligar a macrófagos. A

ativação do sistema complemento pelos imunocomplexos pode ainda iniciar uma

inflamação vascular com depósitos de FR em arteríolas, originando vasculites, cujo

impacto negativo na qualidade e na expectativa de vida do paciente é significativo

(TURESSON e MATTESON, 2009).

21

Adicionalmente, há uma ativação de mecanismos pró-inflamatórios por meio

da produção de citocinas. As células T que se acumulam na membrana sinovial

produzem IL-17 e interferon gama (IFNγ) em concentrações fisiologicamente

relevantes, enquanto os sinoviócitos A e B produzem citocinas como IL-1, TNFα –

envolvido na regulação de outras citocinas, recrutamento celular, angiogênese e

destruição tecidual – e IL-8, que provavelmente contribuem para a progressão e

perpetuação da inflamação sinovial, uma vez que haverá estímulo à proliferação de

sinoviócitos e produção contínua de outras citocinas e enzimas que levam a efeitos

que vão desde o influxo de outros macrófagos até mesmo a destruição articular,

mantendo um mecanismo de retroalimentação positiva entre sinoviócitos e

macrófagos recrutados que contribui para a progressão da doença (SWEENEY e

FIRESTEIN, 2004).

A IL-18, em particular, resulta em ativação de macrófagos, indução de IFNy e

diferenciação dos linfócitos T presentes no microambiente articular em um padrão de

resposta Th1, o que explica, em parte, a presença de granulomas na sinóvia

inflamada. Já a IL-6 é conhecida por facilitar a diferenciação de células T em células

T efetoras (Th1, Th2 e Th17) ou células T reguladoras (Treg). Citocinas produzidas

por estas células T sinoviais incluem TNF-α, IFN-γ, e a IL-17A. É comprovado

também que os efeitos resultantes da ação sinérgica das várias citocinas presentes

no ambiente articular inflamado incluem uma produção exacerbada de MMPs,

peças-chave para a destruição articular característica da artrite reumatoide

(SWEENEY e FIRESTEIN, 2004; KIKUCHI et al., 2015). Os estudos para elucidar o

perfil da resposta imunológica na artrite reumatoide revelam, portanto, a participação

de diversas citocinas, com os mais diferentes papéis, agindo em sinergia em uma

progressão inflamatória e ocasionando o quadro clínico característico do distúrbio.

A inflamação sinovial é regulada por mecanismos de vias de sinalização

intracelular e regulação da expressão gênica. O destaque nessa regulação é para a

ativação do fator nuclear de transcrição kappa B (NF-κB) – capaz de controlar a

expressão de TNFα, interleucinas, síntese de óxido nítrico induzível (iNOS),

cicloxigenase 2 (COX-2) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) – moléculas

que favorecem a adesão de leucócitos do sangue periférico ao endotélio (KUKAR;

PETRYNA e EFTHIMIOU, 2009).

A COX-2 é uma enzima induzida em processos inflamatórios e está

envolvida na síntese de prostaglandinas e citocinas inflamatórias que promovem a

22

inflamação e dano do tecido local. Autores sugerem que a COX-2 expressa em

fibroblastos sinoviais de pacientes com AR, contribui para o aumento de citocinas

inflamatórias na matriz da cartilagem (HUANG e HUANG, 2014).

A maturação e a proliferação dos precursores dos osteoclastos, assim como

sua formação, ativação e sobrevivência, dependem muito do M-CSF (fator

estimulador de colônias de granulócitos) e RANKL (ligando do receptor ativador do

NF-κB). O RANKL é uma proteína transmembranar produzida pelos osteoblastos

que, ao ligar-se ao RANK (receptor ativador do fator nuclear κB), existente nos

precursores dos osteoclastos, vai estimular a sua diferenciação em osteoclastos

maduros. Os efeitos osteoclastogênicos de RANKL são reforçados pelo TNFα, IL1,

IL6, IL17 e inibidos por IFNγ e IL4. O TNFα é o mais potente estimulador da

diferenciação dos osteoclastos. Em pacientes com AR, o RANKL, além de ser

produzido pelos osteoblastos, é produzido por células T ativadas e por células

sinoviais, estimulando assim a maturação dos osteoclastos e promovendo a

reabsorção óssea, que culmina nas comuns erosões ósseas presentes em

portadores da AR (REGO, 2010).

O influxo de neutrófilos também é um importante achado histopatológico na

AR, atribuído à produção sinovial de IL-8 – citocina quimiotática para leucócitos

polimorfonucleares e produzida em abundância na sinóvia durante a doença. A

inflamação na sinóvia também apresenta como característica uma

neovascularização do tecido, necessária para fornecer nutrientes ao tecido, bem

como para permitir a migração de células inflamatórias para o sítio da inflamação.

Moléculas promotoras da angiogênese, como o fator de crescimento vásculo-

endotelial (VEGF) e o fator de crescimento de fibroblastos (FGF), são produzidos

pelas células presentes no revestimento sinovial, permitindo que haja essa

neovascularização em caso de inflamação, e contribuindo também para proliferação

dos sinoviócitos tipo B, etapa fundamental para o desenvolvimento de fibrose no

tecido sinovial, um outro achado histopatológico da artrite reumatoide (SWEENEY e

FIRESTEIN, 2004).

1.1.1 Artrite Reumatoide e estresse oxidativo

Espécies reativas de oxigênio referem-se aos átomos ou moléculas

altamente reativas, que contêm número ímpar de elétrons em sua última camada

23

eletrônica. É este não emparelhamento de elétrons da última camada que confere

alta reatividade a estes átomos ou moléculas, embora alguns deles não apresentem

elétrons desemparelhados em sua última camada. Em sua maioria são derivados do

metabolismo do O2 e são encontrados em todos os sistemas biológicos (FEITOSA,

2011).

Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, o O2 sofre

redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de

H2O. Durante esse processo são formados intermediários reativos, como os radicais

superóxido (O2-), hidroperoxila (HO2) e hidroxila (OH-), e o peróxido de hidrogênio

(H2O2) (TARIQ et al., 2006).

Normalmente, a redução completa de O2 ocorre na mitocôndria, e a

reatividade das EROs é neutralizada com a entrada dos quatro elétrons. Todos os

componentes celulares são susceptíveis à ação das EROs, porém a membrana é

um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica, que acarreta

alterações na estrutura e na permeabilidade das membranas celulares.

Consequentemente, a perda da seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo

de organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, e formação de produtos

citotóxicos (como o malonaldeído), culminam com a morte celular (TARIQ et al,

2006).

Em condições normais, a concentração destas espécies dentro das células é

extremamente baixa pelo fato de existirem enzimas antioxidantes que as removem,

ou impedem sua formação. Estes radicais tendem a serem eliminados do organismo

do organismo pelo conjunto das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa

peroxidase (GSH-Px), glutationa redutase (GR) e catalase (CAT) (FEITOSA, 2011).

O estresse oxidativo desempenha um papel importante na patogênese da

AR. Os pacientes com AR têm níveis elevados de estresse oxidativo, o

malondialdeído (MDA) é mais elevado do que em pacientes normais. Outros dados

sugerem que o uso de antioxidantes na dieta reduz a incidência da doença (JIA e

HE, 2016; SAHEBARI et al., 2015; CERHAN et al., 2003).

1.1.2 Manifestações Clínicas

O quadro clínico da AR é caracterizado por importantes alterações

articulares e sistêmicas. Tipicamente, o acometimento articular é múltiplo e

24

simétrico, apresentando rigidez matinal com duração maior que uma hora e dor que

piora com a movimentação. As articulações mais frequentemente afetadas são as

das mãos (articulações metacarpofalangeanas e interfalangianas proximais) e pés,

progredindo para os punhos e, depois, demais articulações (MOTA et al., 2011).

Edema, dor e calor local são características das articulações afetadas, que

podem ainda apresentar rubor local. Deformações articulares ocasionadas por

inflamação persistente são comuns, sendo encontradas com mais frequência nas

mãos e punhos. Assim, o desvio ulnar dos dedos decorre de uma frouxidão dos

tecidos moles nas articulações metacarpofalangianas. O dedo em “pescoço de

cisne” (boutonnière) representa uma hiperextensão das interfalangianas proximais

associada à hiperflexão das interfalangianas distais. O dedo em “abotoadura”

corresponde à hiperflexão das interfalangianas proximais com hiperextensão das

distais. O punho em “dorso de camelo” é o resultado da associação das

deformidades das articulações do punho com as das articulações

metacarpofalangianas (Figura 1) (GOELDNER et al., 2011).

FIGURA 1 – Representação das deformidades em mão ocasionadas pela AR (Adaptado de ADAM

images).

25

Outras articulações também são tipicamente acometidas: coluna cervical

(subluxação atlantoaxial) (Figura 2), articulações temporomandibulares (limitação

dolorosa da abertura da boca) e joelho (cistos de Baker, que podem simular um

episódio de tromboflebite) (Figura 3) (KLARESKOG et al., 2006).

FIGURA 2 - Radiografias em perfil dinâmico (A - hiperextensão; e B - hiperflexão), evidenciando a instabilidade atlanto-axial (Adaptado de Moreira Jr.).

FIGURA 3 – Representação do Cisto de Baker (Adaptado de ADAM images).

26

Além dos sintomas articulares, manifestações extra-articulares são

observadas em aproximadamente 50% dos pacientes, sendo a síndrome de Sjögren

– doença autoimune que afeta as glândulas lacrimais e salivares, que leva ao

desenvolvimento de xerostomia e xeroftalmia - a mais comum, além dos típicos

nódulos reumatoides, que resultam da vasculite de pequenos vasos, e a

consequente necrose com proliferação de fibroblastos e histiócitos epiteliais;

manifestações pulmonares (pleurite e fibrose pulmonar) e pericardite

(assintomática). Ao raio-X, a AR pode se manifestar desde um simples edema de

tecidos moles ou aumento do volume articular, até a erosão óssea e destruição

cartilaginosa (GOELDNER et al., 2011; MOTA et al., 2011).

Com a progressão da doença, os pacientes desenvolvem incapacidade para

realização de suas atividades cotidianas, o que leva a um significativo impacto

econômico para o paciente e para a sociedade. Algumas pessoas com AR têm

surtos agudos da doença, seguido por um período de remissão clínica (SMITH e

HAYNES, 2002).

A AR é considerada uma doença sistêmica que afeta, principalmente, as

articulações, mas mediadores inflamatórios envolvidos na patogênese da doença

podem afetar outros órgãos tais como o coração. Os pacientes com AR tem uma

maior taxa de doenças cardiovasculares, incluindo infarto agudo do miocárdio (IAM),

acidente vascular encefálico (AVE), insuficiência cardíaca congestiva (ICC) e

aumento da mortalidade por doenças cardiovasculares (DCV). Citocinas pró-

inflamatórias, complexos imunitários, proteínas de fase aguda e as partículas de

lipídeos modificados aumentam a ativação de células endoteliais e, potencialmente,

a instabilidade da placa aterosclerótica (HOLMQVIST, 2010).

1.1.3 Diagnóstico

O diagnóstico da AR é feito por meio da associação de uma série de

sintomas e sinais clínicos, achados laboratoriais e radiográficos.

A orientação para diagnóstico é baseada nos critérios de classificação do

Colégio Americano de Reumatologia (ACR), que são direcionados para o

diagnóstico precoce da doença em pacientes que se apresentam com

sintomatologia de curta duração. A população-alvo para esses novos critérios é

formada por pacientes com ao menos uma articulação edemaciada, caracterizada

27

clinicamente como sinovite clínica, e pacientes com sinovite que não pode ser

explicada por outra doença, como lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite

psoriática ou gota (GOELDNER et al., 2011).

Os critérios estabelecidos pela ACR são: rigidez matinal durando pelo menos

1 hora; artrite de três ou mais áreas, evidenciado por edema de partes moles ou

derrame articular; nódulos reumatoides; fator reumatoide sérico e alterações

radiográficas (erosões ou descalcificações), sendo necessário estarem presentes

por mais de seis semanas (LAURINDO et al., 2004).

Exames de imagem sofisticados têm contribuído de forma significativa para

o diagnóstico precoce da AR. Atualmente, a ressonância magnética (RM) é a técnica

de imagem que traz mais benefícios ao diagnóstico da doença, pois evidencia

precocemente alterações tanto de tecidos moles quanto de cartilagem e ossos. A

determinação do FR é amplamente utilizada no diagnóstico da AR, porém, estudos

mostraram uma positividade baixa no primeiro ano de doença, variando de 15 a

50%, e pouca especificidade. FRs podem ser encontrados no soro de pacientes com

outras doenças difusas do tecido conjuntivo (20-60%), doenças auto-imunes,

doenças infecciosas, hiperglobulinemias, doenças neoplásicas e indivíduos

saudáveis. Além disso, o FR serve para classificar os pacientes em soropositivos e

soronegativos, o que auxilia na determinação de características evolutivas próprias e

orientação terapêutica. Pacientes soropositivos e com altos títulos têm associação

com doença mais grave e manifestações extra-articulares, principalmente nódulos

reumatóides. A associação da presença do FR com aumento da mortalidade de

origem cardiovascular tem despertado interesse (KOURILOVITCH; GALARZA-

MALDONADO e ORTIZ-PRADO, 2014; SILVEIRA, 2005).

Uma família de auto-anticorpos na AR ganhou importância nos últimos anos:

os anticorpos contra proteínas citrulinadas. Entre eles, o antipeptídeo citrulinado

cíclico (anti-CCP) de segunda geração tem demonstrado melhor sensibilidade e

especificidade em relação aos anteriores. Anti-CCP são anticorpos muito específicos

para AR, e podem aparecer até 10 anos antes do início dos sintomas da doença.

Esses testes são marcadores de doença erosiva com pior evolução clínica. Existe

ainda uma associação do anti-CCP com HLA-DRB1, indicando doença mais grave

(SILVEIRA, 2005).

A fim de monitorar a atividade da doença, após o diagnóstico, é comum a

solicitação de exames como a velocidade de hemossedimentação (VHS) e a

28

dosagem de proteína C reativa (PCR), sendo esta última mais relacionada ao

monitoramento da elevação das citocinas inflamatórias, como IL-6 e TNFα, e à

progressão radiológica da inflamação, constituindo, portanto, um marcador mais

indicado para este monitoramento. Desta maneira, é importante uma atenção

especial para que o diagnóstico não seja confirmado a partir de nenhum teste

isolado, preconizando-se que há importância em detectar alterações laboratoriais, de

imagem e histopatológicas, se possível, para uma maior acurácia no diagnóstico

(MOTA et al., 2011).

1.1.4 Tratamento da AR

Na terapia medicamentosa da AR são empregados os anti-inflamatórios

esteroides (AIEs), as drogas modificadoras do curso da doença (DMARDs) e os anti-

inflamatórios não-esteroides (AINEs).

Os AIEs ou glicocorticoides são fármacos cujo mecanismo envolve a ligação

à proteínas receptoras intracelulares específicas: receptores esteroides, esterol

(vitamina D), hormônio tireoidiano, ácido retinóico, entre outros. O efeito induzido por

esses fármacos pode ser resultado da interação direta sobre sequências de DNA

específicas levando a uma transativação de genes de proteínas anti-inflamatórias

ou, indiretamente, pela inibição dos fatores de transcrição de genes, como o NF-kβ,

que codificam mediadores inflamatórios como citocinas, moléculas de adesão e

enzimas. Como consequência, ocorre supressão da produção de citocinas

inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão, por meio da inibição da função

dos macrófagos e células apresentadoras de antígenos, inibição da desgranulação

dos mastócitos, redução da produção de prostaglandinas (PGEs) e leucotrienos pela

redução da expressão do COX-2, entre vários outros efeitos que contribuem para as

marcantes atividades anti-inflamatórias e imunossupressoras dessa classe. Embora

sejam fármacos anti-inflamatórios eficazes, a sua administração crônica

frequentemente resulta em reações adversas graves como elevação da glicose

sérica e do glicogênio hepático; depressão da função tireoidiana, reprodutiva e da

síntese de hormônios sexuais; interferência na absorção intestinal do cálcio

antagonizando a ação da vitamina D; aumento da reabsorção de sódio e água, com

retenção hídrica e elevação da pressão arterial; entre outras (SCHIMMER e

FUNDER, 2011).

29

Os DMARDs incluem um diversificado grupo de pequenas moléculas,

podendo ser agentes biológicos e não biológicos, sendo os mais comuns o

metotrexato (MTX), a hidroxicloroquina e a sulfassalazina. O objetivo primário das

terapias com esses medicamentos é preservar as funções das articulações,

reduzindo ou prevenindo danos (BLUMBERG e FOX, 2001). Alguns desses

fármacos inibem a produção de citocinas inflamatórias ou impedem a interação com

os receptores. Sendo os fármacos biológicos eficazes imunossupressores, existe o

risco da ocorrência ou agravamento de infecções agudas ou crônicas ou reativação

de infecções latentes, com consequências graves para o paciente (HAROON e

INMAN, 2009; KUKAR et al., 2009).

Os AINEs são anti-inflamatórios não esteroides que apresentam atividades

analgésica, antipirética e antiedema. Entre os mecanismos de ação propostos para

esses fármacos está a inibição das enzimas COX-1 e COX-2, as quais estão

envolvidas na produção de mediadores inflamatórios como PGEs. Entretanto, o seu

uso requer cautela devido à possibilidade de ocorrência de reações adversas como

dor epigástrica, úlceras gastrintestinais, lesões renais e eventos tromboembólicos

(ROUBILLE et al., 2015).

Os AINEs não são considerados DMARDs na AR e devem ser utilizados

somente como sintomáticos. Podem ser utilizados na fase de investigação da

doença e seu uso não costuma mascarar o processo inflamatório intenso observado

na AR. Durante a evolução da doença também pode ser utilizado, mas somente

para melhorar sintomas de rigidez matinal, por exemplo. Não devem ser usados

como a única droga na AR, pois não evitam o aparecimento de erosões ósseas

(TREVISANI; FIDELIX e APPENZELLER, 2011).

Quanto à escolha do melhor AINE, deve ser levado em conta o aspecto

financeiro, comorbidades e o histórico de eventos adversos do paciente. Como os

pacientes geralmente estão em uso de múltiplas medicações, a preferência é para

os inibidores seletivos ou específicos da COX2, evitando assim efeitos colaterais do

trato gastrintestinal (TGI). Os anti-inflamatórios não específicos, como o Diclofenaco,

presente na rede pública, também podem ser utilizados com eficácia similar. Porém

deve ser lembrado que no uso crônico é recomendada a associação de um protetor

gástrico, como o omeprazol (TREVISANI; FIDELIX e APPENZELLER, 2011).

30

1.2 MODELO DE INFLAMAÇÃO INTRA-ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN

No desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a AR, são

comumente utilizados modelos experimentais que fornecem conhecimento sobre os

mecanismos da doença e estudo de novos agentes terapêuticos. Apesar de não se

dispor de uma forma de AR em animais, a maioria dos modelos de artrite

empregados atualmente apresenta similaridades com a doença humana. Entre as

semelhanças, incluem-se o edema de articulação, a infiltração celular e as

alterações histopatológicas (WILSON et al., 2006; ROCHA et al., 2008).

Variações de modelos de artrite imunomediada em roedores (AIMR) têm

sido investigadas nas ultimas décadas a fim de verificar sua adequação para

avaliação de doença articular. As opções de AIMR estão relacionadas a variáveis

como espécie empregada (rato, camundongo ou porco da Índia), tipo de doença

(induzida, espontânea ou por modificação genética) e agente indutor (adjuvantes,

polissacarídeo, proteoglicanas, colágeno e outras proteínas) (BOLON et al., 2011).

A AR pode ser induzida em animais por vários agentes artritogênicos, tais

como o Zymosan (Zy), adjuvante (adjuvante incompleto de Freund - IFA e adjuvante

completo de Freund - CFA), colágeno bovino tipo II, antígeno e imunocomplexos. A

inflamação (i.a.) induzida por Zymosan é um modelo de baixo custo operacional, tem

início definido e permite a reprodução da lesão em 6 horas (fase aguda), podendo

ser usado em rápidos protocolos experimentais (MENEZES, 2013).

O Zymosan é um polissacarídeo preparado a partir da parece celular de

fungos leveduriformes, como o Saccharomyces cerevisiae. Seu principal

componente estrutural é a β-glucana, que apresenta propriedades

imunoestimulatórias. É reconhecido pelo receptor dectina 1, expresso em monócitos,

macrófagos, neutrófilos e células dendríticas (CARDOSO, 2007).

Após a injeção de Zymosan na cavidade articular, ocorre uma intensa

inflamação, com início duas horas após esta administração e atividade máxima na

sexta hora após a indução. Este polissacarídeo é um agonista dos receptores

semelhantes a toll like 2 (TLR-2), sendo capaz de promover resposta a partir da

expressão dos genes responsivos ao NF-κB, favorecendo a expressão de citocinas

pró-inflamatórias, que provocam aumento da permeabilidade vascular, resultando

em edema local e acentuado influxo celular, com predomínio de polimorfonucleares

(PMNs) (ABBAS; LICHTMAN e PILLAI, 2008; CARDOSO, 2007).

31

1.3 EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DA OLMESARTANA

A Olmesartana é um anti-hipertensivo utilizado na clínica médica, da classe

dos fármacos antagonistas dos receptores tipo 1 (AT1-R) da angiotensina II

(Bloqueadores dos Receptores de Angiotensina - BRA) de ação prolongada, que

desempenha um importante papel no sistema renina-angiotensina-aldosterona

(SRAA), diretamente relacionado aos mecanismos intrínsecos de controle da

pressão arterial (PA) (NTOUNTANIOTIS et al., 2014).

Pesquisas sobre as ações do SRAA trazem sólidas informações sobre como

esse sistema é capaz de contribuir, de forma expressiva, na homeostase

hidroeletrolítica, controle da PA, regulação de processos metabólicos, modulação do

crescimento e proliferação celular de vários tecidos. Assim, a capacidade desse

sistema de se adaptar ou contribuir para uma doença está intimamente relacionada

ao seu envolvimento em processos tanto fisiológicos como fisiopatológicos. Cada

vez mais, a hiperatividade do SRAA tem sido relacionada à gênese de várias

doenças, sendo mais comumente relatadas: a hipertensão arterial (HA), o infarto

agudo do miocárdio (IAM), a insuficiência cardíaca congestiva (ICC), as arritmias

cardíacas, o diabetes mellitus (DM), a insuficiência renal crônica e o acidente

vascular encefálico (AVE) (FYHRQUIST e SAIJORUNAA, 2008).

A renina, uma protease produzida exclusivamente pelas células

justaglomerulares dos rins, hidrolisa o angiotensinogênio, um substrato de renina

produzido pelo fígado, formando angiotensina (Ang) I, um decapeptídeo, que é

convertido pela enzima conversora de angiotensina (ECA) para o octapeptídeo

angiotensina II (Ang II). Além da ECA, outra protease, a quimase, pode proporcionar

uma via alternativa para conversão da Ang I para Ang II (FYHRQUIST e

SAIJORUNAA, 2008).

A Ang II é o principal peptídeo efetor do SRAA e exerce suas ações via

receptores AT1 e AT2, que parecem mediar ações opostas. Os receptores AT1,

encontrados de forma abundante nos vasos, rins, coração, fígado e cérebro mediam

a vasoconstricção, a sede, a liberação de vasopressina, a fibrose, o crescimento e a

migração celular, a geração de EROs, a inflamação vascular, o remodelamento

cardíaco e vascular e a produção e liberação de aldosterona que contribuem não

somente para a gênese da HA, mas também para acelerar os danos nos chamados

"órgãos-alvo" (coração e rins). Já os receptores AT2, encontrados em tecidos como

32

glândulas adrenais, coração, aorta, rins, ovários, útero e cérebro, induzem

vasodilatação, liberação de óxido nítrico no endotélio e parece inibir o crescimento

celular (SEZAI et al., 2011; LIU et al., 2009).

Estudos demonstram que a Ang II possui efeitos pró-inflamatórios que

podem contribuir para a patogênese de doenças autoimunes, como a estimulação

da proliferação de linfócitos, que pode contribuir para a modulação das respostas

imunes, contudo, essa contribuição ainda não foi completamente elucidada. Além

disso, a angiotensina II pode ainda promover o aumento da permeabilidade vascular

(através da liberação de prostaglandinas e do fator de crescimento de células

endoteliais vasculares/fator de permeabilidade vascular) e participar do recrutamento

de células inflamatórias do infiltrado tecidual através da sua ativação direta ou pela

regulação da expressão de moléculas de adesão e quimiocinas pelas células

residentes; dessa forma, Ang-II participa de diversos eventos-chave da resposta

inflamatória (SAGAWA et al., 2005; OKUNUKI et al., 2009).

A partir da compreensão do SRAA, observou-se que os componentes

envolvidos neste mecanismo poderiam representar um bom alvo terapêutico no

controle da hipertensão, de modo que duas classes de fármacos anti-hipertensivos

agem sobre estes componentes: os inibidores da enzima conversora de

angiotensina (IECA) e os bloqueadores dos receptores da angiotensina (BRA), como

a olmesartana, alvo do presente estudo. Os medicamentos da classe BRA

apresentam efeitos pleiotrópicos anti-inflamatórios que suprimem citocinas como

TNF-α e IL-6, induzidos por ativação do fator nuclear NF-кB em células endoteliais

vasculares. Além de reduzir EROs e inibir o estresse oxidativo (NAKANO et al.,

2009; LI et al., 2013).

É comum que fármacos com propriedades conhecidas sejam estudados,

mesmo após sua introdução no mercado e na prática clínica, a fim de elucidar outras

possíveis propriedades farmacológicas. Embora sejam raros estudos que

correlacionem a terapia com olmesartana e as ações do medicamento na artrite

induzida em animais, nos últimos anos têm sido relatados uma interessante

propriedade anti-inflamatória para este fármaco em outros modelos de inflamação,

inibindo o estresse oxidativo e até mesmo reduzindo os níveis de citocinas

inflamatórias (ARAÚJO et al., 2013; DEROSA et al., 2014; MIYOSHI et al., 2014; LI

et al., 2013; ANDREEVA, 2013; MASON, 2011; KIM et al., 2011; SUKUMARAN et al.,

2011).

33

Desta forma, a realização do presente estudo mostra-se bem fundamentada.

Olmesartana possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, podendo trazer

benefícios ao paciente com AR. Assim, propomos avaliar o efeito da olmesartana na

inflamação intra-articular induzida por Zymosan, vislumbrando melhorar a qualidade

de vida dos pacientes.

34

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estudar o efeito da Olmesartana na inflamação intra-articular induzida por

Zymosan em ratos Wistar.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar a ação da olmesartana sobre a infiltração neutrofílica pela análise de

parâmetros inflamatórios;

Avaliar atuação da Olmesartana sobre o estresse oxidativo;

Investigar o efeito da olmesartana na lesão intra-articular pela análise de

dosagens bioquímicas.

35

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS

Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no

Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN),

número 016/2013.

Para o estudo, foram utilizados 36 ratos da linhagem Wistar (Ratus

norvegicus albinus), machos, com massa corpórea entre 180 e 220 g, procedentes

do Biotério Setorial do Departamento de Biofísica e Farmacologia da UFRN. Os

mesmos foram colocados em gaiolas plásticas apropriadas, laváveis e com tampas

vazadas de metal, permanecendo em média cinco animais em cada uma, sobre

maravalha de madeira de pinho, trocadas a cada dois ou três dias. Todos receberam

ração comercial balanceada e água ad libitum, e foram mantidos sob condições de

temperatura adequada (22 ± 1°C), em ciclos claro-escuros controlados (12h/12h)

durante os experimentos.

3.2 DROGAS, ANTICORPOS, SOLUÇÕES, LÍQUIDOS E CORANTES UTILIZADOS

Água destilada

Álcool etílico 70%

Anticorpos cicloxigenase-2 (COX-2), superóxido dismutase (SOD), glutationa

peroxidase (GSH-Px) – Santa Cruz Biotecnologia, Interprise, Brasil

Avidina-peroxidase - Kit ABC Vectastain

Cromógeno DAB (3,3`diaminobenzidine-peróxido)

Diclofenaco - NOVARTIS

Diidrocloreto de O-dianisidina – Sigma, São Paulo, Brasil

DTNB (ácido 5,5-ditiobis 2-nitrobenzóico) - Sigma, São Paulo, Brasil

EDTA (ácido etileno-diamino-tetra-acético) – Reagen, Paraná, Brasil

Eosina - Merck

Formaldeído 10%

HCl 37% (ácido clorídrico puro)

Hematoxilina - Reagen, Paraná, Brasil

36

Kits aspartato amino transferase (AST), alanina amino transferase (ALT), ureia e

creatinina - Labtest Diagnóstica SA

Olmesartana medoxomila (Benicar 20mg) – Daiichi Sankyo Brasil Farmacêutica

Ltda

Peróxido de hidrogênio 1%

Tetraetoxipropano – Santa Cruz Biotecnologia, Interprise, Brasil

Solução de Turk

Soro fisiológico 0,9% (NaCl 0,1M)

Tampão fosfato salino (PBS)

Tampão HTAB (brometo hexadecil-trimetil-amônio) - Sigma, São Paulo, Brasil

Tampão citrato 0,1 M

Tampão fosfato de potássio

Tampão TRIS (0,4M Ph 8,9)

Tampão Tris HCl

Xilol

Zymosan - Sigma, São Paulo, Brasil

3.3 APARELHOS E INSTRUMENTOS LABORATORIAIS

Balança digital eletrônica – Filizola

Balança analítica (Analytical Standard – Ohaus)

Centrífuga refrigerada (Centrifuge 5804R – Epemdorf)

Espectrofotômetro (Spectrônic 20 – Genesys)

Geladeira e freezer (-70º)

Instrumental cirúrgico (pinças, bisturis, tesouras, etc.)

Micropipetas automáticas

Microscópio óptico binocular

Micrótomo (Olympus)

3.4 INFLAMAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN

3.4.1 Modelo experimental

Inicialmente, os animais foram pré-tratados com Olmesartana ou Diclofenaco

37

de Sódio por via oral, em seguida foram anestesiados com xilazina (10 mg/Kg) e

quetamina (70 mg/Kg) por via intramuscular, realizou-se a injeção intra-articular (i.a.)

de 1 mg de zymosan, diluído em 50 L de solução salina a 0,9%, no joelho direito

dos ratos para indução da inflamação (ROCHA et al., 2008). Após 24h da indução da

artrite, como realizado por Conte et al. (2008), os animais foram eutanasiados com

tiopental (80 mg/Kg) por via intraperitoneal (i.p.) e foi realizada a exsanguinação via

intracardíaca, a fim de evitar hemorragia intra-articular. Após eutanásia foram

realizadas coletas de sangue por meio de punção cardíaca para dosagens

bioquímicas de ureia sérica, creatinina, aspartato aminotransferase (AST) e alanina

aminotransferase (ALT), coleta do líquido sinovial por aspiração intra-articular, para a

contagem do influxo celular, e coleta de sinóvias pela dissecção dos joelhos para a

dosagem de mieloperoxidade (MPO), glutationa (GSH) pela determinação dos

grupos sulfídricos não proteicos (NP-SH), malondialdeído (MDA), avaliação

histopatológica e imuno-histoquímica.

Os animais foram divididos em 6 grupos experimentais – Salina, Zymosan,

Olmesartana 5 mg/Kg, Olmesartana 15 mg/Kg, Olmesartana 30 mg/Kg, Diclofenaco

de Sódio 100 mg/Kg. Cada grupo era composto por 6 (seis) animais.

A tabela 1 resume os grupos em que foram distribuídos os animais, bem

como os fármacos administrados e suas doses. A figura 4 representa o esquema do

protocolo experimental.

Tabela 1 – Desenho experimental

Grupos Administração via oral Administração i.a.

Salina (n = 6) Solução salina a 0,9% Solução salina a 0,9%

Zymosan (Zy) (n = 6) Solução salina a 0,9% 1 mg Zymosan

Olmesartana 5 mg/Kg

(OLM 5) (n = 6)

Olmesartana 5 mg/Kg 1 mg Zymosan

Olmesartana 15 mg/Kg

(OLM 15) (n = 6)


Olmesartana 30 mg/Kg

(OLM 30) (n = 6)


Diclofenaco Sódico

(DS) (n = 6)

Diclofenaco Sódico 100

mg/Kg

1 mg Zymosan

38

FIGURA 4 - Esquema do protocolo experimental. 3.4.2 Grupo salina

Administrou-se 0,5 mL de solução salina, via oral, através de gavagem com

cânula. Após trinta minutos foram administrados 50 L de solução salina estéril

(0,9%) intra-articular. A eutanásia foi realizada na 24ª hora do experimento.

3.4.3 Grupo zymosan

Aplicou-se 1 mg de Zymosan intra-articular (i.a.), dissolvido em 50 L de

solução salina e os animais não receberam qualquer forma de tratamento, apenas

39

0,5 mL de solução salina 0,9%, administradas por via oral (por meio de gavagem com

cânula de metal apropriada), trinta minutos antes da injeção do Zy (i.a.). Os animais

foram eutanasiados na 24ª hora do experimento.

3.4.4 Grupos tratados com Olmesartana ou Diclofenaco de Sódio

Foram submetidos ao pré-tratamento com Olmesartana ou Diclofenaco de

Sódio, 24 animais, divididos em quatro grupos experimentais:

Animais submetidos à artrite experimental tratados com Olmesartana na dose de 5

mg/Kg, administrada por via oral, 30 minutos antes à indução.

Os animais receberam Olmesartana na dose de 5 mg/Kg, via oral por

gavagem, trinta minutos antes da indução com Zymosan (i.a.).

Animais submetidos à artrite experimental tratados com Olmesartana na dose de

15 mg/Kg, administrada por via oral, 30 minutos antes da indução.



Animais submetidos à artrite experimental tratados com Olmesartana na dose de

30 mg/Kg, administradas por via oral, 30 minutos antes da indução.



Animais submetidos à artrite experimental tratados com Diclofenaco de Sódio 100

mg/Kg, administradas por via oral, 30 minutos antes da indução.

Os animais receberam Diclofenaco de Sódio na dose de 100 mg/Kg, via oral

por gavagem, trinta minutos antes da anestesia e indução da artrite por Zymosan

(i.a.).

40

3.5 PARÂMETROS AVALIADOS PARA O ESTUDO DA MODULAÇÃO

FARMACOLÓGICA NA INFLAMAÇÃO ARTICULAR INDUZIDA POR ZYMOSAN

3.5.1 Análise do influxo celular

A coleta do líquido sinovial foi realizada através da lavagem na cavidade

articular, fazendo-se duas injeções com 0,2 mL de tampão fosfato de sódio (0,15 M,

pH 7,4) contendo 37,2 mg de ácido etilenodiamino tetra-acético - EDTA (0,01 M). O

lavado articular foi obtido por aspiração e mantido em banho de gelo. Utilizou-se

amostras desse lavado para contagem global de células na câmara de Neubauer,

diluídas em solução de Turk (composto de ácido acético glacial, azul de metileno e

água destilada), em proporção de 1:20, líquido diluidor que hemolisa as hemácias e

preserva as células nucleadas (ROCHA et al., 2008).

3.5.2 Análise histopatológica das sinóvias

Após a coleta do lavado sinovial, a sinóvia foi coletada e fixada em formol a

10% por um período de 24 horas. A seguir, as peças foram dispostas em álcool

etílico a 70% para desidratação, com posterior inclusão em parafina. Os cortes

teciduais foram colocados em moldes retangulares, formando blocos que foram

subsequentemente seccionados por navalhas de aço do micrótomo de 4 µm visando

a coloração por hematoxilina-eosina (HE) (ROCHA et al., 2008). Foi realizada

análise das lâminas, avaliando-se os seguintes parâmetros histopatológicos:

exsudato inflamatório, comprometimento do exsudado inflamatório (perivascular,

intersticial e epitélio sinovial), depósitos fibrinóides e células gigantes. Foram

atribuídos diferentes escores para os achados histopatológicos, a fim de quantificar

as alterações teciduais, de modo que a ausência de parâmetros inflamatórios foi

representada pelo escore 0; o escore 1 representa parâmetro presente com

intensidade leve, enquanto o escore 2 retrata parâmetro presente com intensidade

moderada e o escore 3 foi atribuído a parâmetro presente com intensidade

acentuada, como representa a tabela 2 (CARDOSO, 2007).

41

Tabela 2 – Valores de escores para parâmetros utilizados na análise histopatológica

das sinóvias

Escore 0 Parâmetro ausente

Escore 1 Parâmetro presente com intensidade

leve


moderada


acentuada

3.5.3 Dosagem de mieloperoxidase (MPO)

A membrana sinovial dos animais dos diferentes grupos experimentais foi

processada para dosagem, por espectrofotometria, com objetivo de verificar a

atividade da mieloperoxidase, enzima presente de forma abundante nos grânulos

azurófilos dos neutrófilos, liberada em resposta a micro-organismos e lesão oxidativa

celular. MPO, ao reagir com peróxido de hidrogênio (H2O2), forma radicais livres e

substâncias oxidantes que causam processo inflamatório e lesão tecidual. Assim,

tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de neutrófilos nos

processos inflamatórios em vários tecidos. Sua presença foi determinada por

método colorimétrico, usando um leitor de placa. As medidas de atividade da MPO

foram realizadas a partir das sinóvias dos ratos, usando uma versão modificada do

método descrito por Bradley et al. (1982).

As membranas sinoviais foram removidas as sinóvias, pesadas e

congeladas em freezer a 70ºC negativos até a realização do ensaio. Durante o

ensaio, as amostras foram incubadas em solução de HTAB 0.5% (brometo de

hexadecil-trimetil-amonio) na proporção de 50 mg de tecido por mL e em seguida,

foram homogeneizadas (politron-13000 rpm). As amostras foram submetidas a um

ciclo de congelamento/descongelamento três vezes. Posteriormente, foi realizada a

centrifugação (5000 rpm, 20 min, 4°C) e as amostras foram congeladas por 24 horas

para recolhimento do sobrenadante. No dia seguinte, após plaqueamento de 7 µL do

sobrenadante, em duplicata (placas de 96 poços), adicionou-se 200 µL da solução

de leitura (água destilada, tampão fosfato de potássio e diidrocloreto de o-diasidina)

42

na placa, sendo adicionado o peróxido de hidrogênio a 1% imediatamente antes da

leitura. A absorbância foi medida a 450 nm através de espectrofotômetro no tempo 0

(basal) e 1 minuto. A mudança na absorbância foi obtida, plotada em curva padrão

de neutrófilos e os valores obtidos foram expressos como neutrófilos/mg de tecido

(atividade de MPO).

3.5.4 Determinação dos níveis de glutationa (GSH)

A glutationa (GSH) é um antioxidante hidrossolúvel reconhecido como o

mais importante componente endógeno do poll dos grupos sulfídricos não proteicos

(NP-SH) do organismo e atua protegendo as células contra toxinas como as EROs.

Os compostos sulfidrila ligam-se aos radicais livres formados durante o processo

inflamatório (FEITOSA, 2012).

A concentração de GSH na sinóvia dos animais foi avaliada pelo ensaio para

determinação de NP-SH (SEDLAK e LINDSAY, 1968). As amostras foram trituradas

em homogeneizador Politron Ultra-Turrax, utilizando-se 1 mL de EDTA 0,02M para

cada 100 mg de tecido, sob refrigeração. Alíquotas de 400 μL do homogenato foram

adicionadas a 320 μL de água destilada e 80 μL de ácido tricloroacético 50% (TCA)

para a precipitação de proteínas. Os tubos foram centrifugados (3000 rpm, 15 min,

4ºC) e alíquotas de 400 μL do sobrenadante foram adicionadas a 800 μL de tampão

Tris 0,4 M, pH 8,9 e 20 μL de ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico) (DTNB) e agitados

por 3 minutos no agitador de tubos. A absorbância foi determinada imediatamente

após o acréscimo do DTNB, em 412 nm. A quantidade de grupos sulfidrílicos não

proteicos nas sinóvias foi expressa como mg/g de tecido.

3.5.5 Níveis de malondialdeído (MDA)

Malonaldeído é um aldeído formado pela decomposição dos hidroperóxidos

lipídico. Sua concentração tem sido utilizada para estimar a intensidade da

peroxidação lipídica que consiste na ação de radicais livres nos fosfolipídios da

membrana celular, causando ruptura da membrana celular, mutações no DNA e

ativação da via do ácido araquidônico (formação de prostaglandinas).

Para quantificar o aumento na produção de radicais livres em amostras de

tecido sinovial, o teor de MDA foi medido através do ensaio descrito a seguir. Para a

43

dosagem, foi adicionado tampão tris HCL 20 mM na proporção de 1:5 à amostra,

sendo o procedimento realizado em capela de exaustão. Após homogeneização, sob

refrigeração, os tubos foram centrifugados (2500 rpm, 10 min, 4ºC). Foram

adicionados 300 µl do sobrenadante e 750 µl do reativo cromogênico (1-metil-2-

fenilindol 10.3 mM em acetonitrila + 225μl HCL 37% - na capela de exaustão) em

novo tubo eppendorf e o material foi incubado durante 40 minutos à 45°C em banho

maria. Foi realizada nova centrifugação (2500 rpm, 5 min, 4ºC) e retirado 300 μL da

amostra para realizar leitura. A absorbância foi determinada a 586 nm e os valores

obtidos foram expressos em nmol/g de tecido. A técnica utilizada foi a descrita por

Gerard-Monnier et al. (1998).

3.5.6 Imuno-histoquímica para cicloxigenase 2 (COX-2), superóxido dismutase

(SOD) e glutationa peroxidase (GSH - Px)

A imuno-histoquímica para a cicloxigenase 2, superóxido dismutase e

glutationa peroxidase foi realizada utilizando a técnica biotina-estreptavidina-

peroxidase (HSU e RAINE, 1981).

Os cortes foram desparafinizados, hidratados em xilol e álcool e imersos em

tampão citrato 0,1 M (pH 6,0), sob aquecimento em forno de micro-ondas, por 15

minutos para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, foram feitas lavagens

com solução salina tamponada fosfato (PBS), bloqueio da peroxidase endógena

com solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 3% (15 minutos) e nova lavagem

com PBS (5 minutos).

As amostras foram incubadas com o anticorpo primário, e depois com

anticorpo secundário biotinilado, para posterior incubação com o complexo estrepto-

avidina peroxidase conjugada (complexo ABC Vectastain) por 30 minutos. Após

lavagem com PBS, seguiu-se coloração com o cromógeno 3,3`diaminobenzidine-

peróxido (DAB), seguida por contra-coloração com hematoxilina de Mayer. Realizou-

se a desidratação das amostras e montagem das lâminas.

3.5.7 Avaliação de dosagens bioquímicas (ureia, creatinina, AST, ALT)

A recolha de sangue de ratos foi realizada por meio de punção cardíaca após

a anestesia com tiopental. Medidas bioquímicas foram efetuadas a partir de

44

amostras de soro dos animais, usando os padrões kits LABTEST e leitura em

espectrofotômetro (MEDEIROS et al., 2011). Para as medições de ureia e creatinina

foi utilizado método colorimétrico. Para ALT e AST foi realizado ensaio de cinética.

3.5.8 Métodos estatísticos

As análises estatísticas foram realizadas a partir da utilização do software

GraphPad Prism versão 5. Os escores histopatológicos foram analisados a partir dos

valores de mediana, analisados pelo teste de Kruskal-Wallis e seguido pelo pós teste

de Dunn’s para diferenciação estatística. As médias dos vários testes experimentais

foram analisadas pelo método estatístico ANOVA, seguido pelo pós-teste de Tukey.

Todos os testes respeitaram o número mínimo de seis animais por grupo

experimental, e os valores de p<0,05 foram considerados como estatisticamente

significantes.

45

4 RESULTADOS

4.1 ANÁLISE DO INFLUXO CELULAR NO LÍQUIDO SINOVIAL

A Figura 5 apresenta a análise do influxo celular no lavado sinovial dos

grupos experimentais. Os animais do grupo salina apresentaram, na contagem

global do influxo celular no lavado sinovial coletado, uma média de 180 células por

mm³, após 24 horas. Os demais grupos, cujos animais foram submetidos à

inflamação experimental, apresentaram valores médios superiores na contagem

global de células, corroborando o fato de que o influxo celular inflamatório é uma

importante etapa na inflamação induzida por Zymosan.

Dessa forma, o grupo que não recebeu tratamento, isto é, ao qual foi

administrado solução fisiológica por gavagem, seguida pela indução da inflamação

por Zymosan, apresentou uma média de 1310 células por mm³ no lavado sinovial,

demonstrando um influxo leucocitário sete vezes maior que o detectado nos animais

do grupo salina.

Os grupos tratados apresentaram valores dentro do intervalo entre os grupos

controle supracitados, conforme esperado. O grupo cujos animais foram tratados

com Olmesartana 5 mg/Kg antes da indução da inflamação apresentou uma média

de 812 células por mm³ no lavado sinovial; não sendo esse valor estatisticamente

significativo (p<0,05) em relação ao grupo zymosan. Quando o tratamento foi

realizado com olmesartana na dose de 15 mg/Kg este valor foi de 310 células por

mm³, e quando a dose de olmesartana utilizada na gavagem foi de 30 mg/Kg, o

influxo celular médio no lavado sinovial foi de 290 células por mm³.

Portanto, os tratamentos com as doses de 15 mg/Kg ou 30 mg/Kg

resultaram em redução estatisticamente significante do influxo leucocitário (p<0,05).

O tratamento com o fármaco-padrão, isto é, o Diclofenaco Sódico 100 mg/Kg, antes

da indução da inflamação, levou a um influxo médio de 280 células por mm³ no

lavado sinovial, 24 horas após a indução.

46

Figura 5: Influxo celular no lavado sinovial após 24 horas de indução de sinovite (média ± DP) em ratos. Os dados representam a média ± DP do número de células/mm

3. Os grupos assinalados

por um asterisco (*) obtiveram redução estatisticamente significativa na infiltração leucocitária em comparação com o grupo Zymosan (p < 0,05). O grupo Zymosan (#) obteve elevação estatisticamente significativa na infiltração leucocitária, em comparação com o grupo salina (p < 0,05).

4.2 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS DAS SINÓVIAS

As análises histopatológicas foram realizadas avaliando as alterações

inflamatórias comumente observadas na sinovite reumatoide. A análise das lâminas

foi semi-quantitativa, avaliando-se para cada grupo experimental os seguintes

parâmetros histopatológicos: exsudato inflamatório, comprometimento do exsudato

inflamatório, depósitos fibrinoides e presença de granulomas, sendo atribuído um

valor de escore para cada parâmetro analisado.

As sinóvias do grupo salina, após 24 horas da injeção intra-articular de

solução salina, não exibiram alterações inflamatórias à microscopia, isto é, o tecido

apresentava-se saudável do ponto de vista histológico, mesmo após o trauma

causado pela injeção (i.a.) de solução salina (cloreto de sódio) (Figura 6, imagens A,

E e I), recebendo escore de alterações histopatológicas equivalente a zero.

Os animais do grupo Zymosan não tratados, após 24 horas do experimento,

apresentaram resposta inflamatória intensa, observada pela presença de

granulomas, com a participação de células gigantes, intenso infiltrado inflamatório e

grande depósito de fibras colágenas, levando a fibrose. Neste grupo, as alterações

histopatológicas foram bastante extensas, estando presentes em toda a extensão da

membrana histopatológica (Figura 6, imagens B, F e J). A mediana dos escores de

47

alterações histopatológicas associada aos animais do grupo zymosan foi de 3,0.

Os animais que receberam zymosan intra-articular e foram tratados com o

Diclofenaco Sódico 100 mg/kg apresentaram uma sinóvia bastante saudável (Figura

6, imagens C, G e K), apresentando somente leves alterações inflamatórias e a

mediana dos escores histopatológicos foi de 1,0.

Os animais que receberam zymosan intra-articular e foram tratados com as

diferentes doses de olmesartana (5, 15 ou 30 mg/Kg), por sua vez, também

apresentaram uma sinóvia mais saudável e mais aproximada da histologia normal

do tecido, de maneira dose-dependente (Figura 6, imagens D, H e L). Assim, quase

não foi possível notar diferenças entre a histologia dos animais que receberam

doses de 30 mg/Kg de Olmesartana e aqueles dos grupos salina ou DS, não

havendo presença marcante de fibrose, infiltrado inflamatório ou granulomas, com

manutenção do tecido característico da membrana sinovial. A mediana dos escores

atribuídos ao grupo tratado com olmesartana 30 mg/Kg foi de 1,0. Fibrose e infiltrado

inflamatório estavam presentes, por sua vez, no tecido sinovial dos animais dos

grupos que receberam doses de 5 mg/Kg ou 15 mg/Kg de olmesartana, tendo o

primeiro maior comprometimento que o segundo.

48

Figura 6: Representação histopatológica da sinóvia de grupos não tratados e tratados que receberam solução salina ou zymosan intra-articular. As imagens em A, E e I representam cortes histopatológicos da sinóvia dos animais do grupo salina, que não foram expostos à artrite experimental, não havendo alterações histopatológicas. As imagens B, F e J são cortes histopatológicos obtidos da sinóvia dos animais do grupo Zymosan, que não foram tratados e que, portanto, apresentam diversas alterações (a = fibrose; b = infiltrado de células inflamatórias; c = presença de granulomas). As imagens C, G e K são cortes da sinóvia dos animais tratados com diclofenaco sódico (100 mg/Kg), demonstrando uma leve resposta inflamatória. As imagens D, H e L são da sinóvia de animais tratados com Olmesartana nas doses de 5 mg/Kg, 15 mg/Kg ou 30 mg/Kg, respectivamente, podendo ser observada a presença de fibrose (a) e infiltrado de células inflamatórias (b) em maior quantidade na imagem D e mais discreta na H e pouca ou nenhuma resposta inflamatória na imagem L.

49

Os dados referentes aos escores atribuídos às diferentes alterações

histopatológicas são demonstrados na Figura 7.

Figura 7: Escores atribuídos às alterações histopatológicas observadas nos animais dos diferentes grupos experimentais (mediana ± DP), demonstrando redução de achados histopatológicos característicos de inflamação aguda a partir da administração via oral de olmesartana, de maneira dose-dependente. Os grupos assinalados com um asterisco (*) obtiveram redução estatisticamente significativa dos escores histopatológicos em relação aos escores do grupo Zymosan (p < 0,05). O grupo Zymosan obteve uma elevação estatisticamente significativa dos escores histopatológicos em relação ao grupo salina (p < 0,05).

4.3 ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE

O grupo salina teve atividade de MPO significativamente inferior (p<0,05)

aos grupos submetidos ao Zymosan (i.a.), corroborando com a baixa contagem de

leucócitos apresentada anteriormente. O grupo Zymosan, como esperado,

apresentou alta taxa de atividade de MPO em relação aos grupos que receberam

tratamento anterior à indução da artrite. A Olmesartana na dose de 5 mg/Kg reduziu

a MPO em relação ao grupo Zy, mas somente os grupos tratados com olmesartana

nas doses de 15 e 30 mg/Kg apresentaram redução significativa (p<0.05) em relação

ao grupo Zy, porém, tendo ação menor quando comparados ao diclofenaco de sódio

(DS) (Figura 8).

50

Figura 8: Efeito atenuador da Olmesartana e Diclofenaco Sódico na atividade de MPO na sinóvia de ratos. A atividade de MPO mostra-se bastante diminuída no grupo que recebeu salina (i.a.) em relação ao grupo zymosan. Todas as doses de olmesartana (5, 15 e 30 mg/Kg) diminuíram a atividade de MPO de maneira dose-dependente, sendo significantes estatisticamente (p<0,05) somente as duas doses mais altas. O grupo tratado com diclofenaco sódico (DS) também reduziu a MPO, semelhante a OLM 15 ou 30 mg/Kg.

4.4 PRODUÇÃO DE MALONALDEÍDO

É possível observar que o grupo Zy submetido à injeção de zymosan (i.a.)

apresentou aumento significativo na produção de MDA em relação ao grupo salina.

O grupo tratado com olmesartana na dose de 5 mg/Kg reduziu os níveis de MDA,

mas não foi significativo estatisticamente em relação aos grupos controle (p>0,05).

Já os grupos tratados com olmesartana em maiores doses (15 ou 30 mg/Kg) e

diclofenaco de sódio (100 mg/Kg) apresentaram redução importante nos níveis de

MDA em relação ao grupo Zy (Figura 9).

51

Figura 9: Produção de MDA na sinóvia de ratos submetidos à inflamação articular por zymosan. O grupo salina apresentou baixa produção de MDA em relação ao grupo submetido à artrite por zymosan (i.a.) não tratado. A olmesartana em maiores doses (15 ou 30 mg/Kg) apresentou níveis próximos ao grupo tratado com diclofenaco sódico (DS) e foi significante estatisticamente (p<0,05) em relação aos grupos Zy e salina.

4.5 NÍVEIS DE GLUTATIONA

Os valores médios de GSH na sinóvia de ratos submetidos à injeção intra-

articular de Zymosan mostrou-se significativamente menor (p<0,05) em relação ao

grupo salina. O grupo tratado com olmesartana na dose de 5 mg/Kg não apresentou

diferenças em relação ao grupo Zy, enquanto os que receberam doses mais altas de

Olmesartana (15 ou 30 mg/Kg) e diclofenaco de sódio (100 mg/Kg) apresentaram

aumento nos níveis de GSH em relação ao grupos controle (Figura 10).

Figura 10: Concentração de GSH na sinóvia de ratos submetidos à zymosan e salina (i.a.) pela determinação de NP-SH. O grupo salina apresentou alta concentração de glutationa em relação aos demais, enquanto o grupo Zy e o grupo tratado com olmesartana 5 mg/Kg apresentaram redução significativa. Os grupos tratados com olmesartana (15 ou 30 mg/Kg) e diclofenaco sódico (DS) apresentaram aumento significativo (p<0,05) em relação aos grupos controle.

4.6 IMUNO-HISTOQUÍMICA

Ratos com inflamação das articulações induzida e não tratados (grupo Zy)

apresentaram imunomarcação intensa na sinóvia para COX 2 (Figura 11 B), em

comparação com grupo salina. OLM 15 ou 30 mg/kg ou DS 100 mg/kg reduziu a

imunomarcação para a COX 2 (Figura 11 C, D, E). A imunomarcação para SOD e

GSH - Px foi mais pronunciada nos grupos tratados com Olmesartana 15 ou 30

mg/kg (Figura 11 H, I e M, N, respectivamente), em comparação com animais Zy.

52

Figura 11: Representação de imuno-histoquímica de ciclo-oxigenase 2 (COX-2), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSH-Px) em tecido sinovial de ratos, 24 horas após a administração de Zy. Os grupos experimentais foram salina, Zy, OLM 15, OLM 30 mg / kg e DS 100 mg / kg. A representação de imuno-histoquímica dos diferentes grupos experimentais para a COX 2 (A, B, C, D, E, respectivamente), SOD (F, G, H, I, J, respectivamente) e de GSH - Px (K, L, M, N, O, respectivamente). Membrana sinovial de ratos não tratados e injetados com Zy mostrou intensa imunocoloração na sinóvia para COX 2. OLM 15 ou 30 mg / kg ou DS 100 mg / kg reduziu a imunocoloração para COX 2 (C, D, E). A imunocoloração para SOD e GSH-Px foi mais pronunciada nos grupos tratados com OLM e DS (H, I, J e M, N, O), em comparação com os animais Zy.

53

4.7 AVALIAÇÃO DAS DOSAGENS BIOQUÍMICAS

O tratamento dos animais com Olmesartana (5, 15 ou 30 mg / kg) não

causou alterações renais ou hepáticas nos animais, como evidenciado pelos níveis

normais de ureia, creatinina, AST e ALT, dosados em soros dos ratos (Figura 12 A,

B , C, D, respectivamente). O diclofenaco de sódio pode favorecer níveis alterados

de ureia no soro de animais submetidos à inflamação das articulações (Figura 8A)

(p<0,05), o que não foi observado para a creatinina, AST e ALT (Figura 12 B, C, D,

respectivamente).

Figura 12: Níveis bioquímicos de ureia (A), creatinina (B), aspartato aminotransferase (AST) (C) e alanina aminotransferase (ALT) (D). Medidas bioquímicas foram efetuadas a partir de amostras de soro de ratos 24 horas após a indução de zymosan. Os ratos receberam apenas solução salina intra-articular (grupo salina); ratos não tratados foram injetados com zymosan intra-articular (grupo Zy) e outros grupos receberam Zy intra-articular e foram tratados com o olmesartana (OLM 5, 15 ou 30 mg / kg) ou com diclofenaco de sódio (DS 100 mg / kg). OLM ou DS foi administrada oralmente 30 min antes da injeção de Zy. Os resultados apresentados são a média ± SEM (n = 5). #p <0,05 comparação com solução salina e * p <0,05 em comparação com animais Zy (ANOVA e pós teste de Tukey).

54

5 DISCUSSÃO

No presente estudo, foi investigada a ação do medicamento da classe dos

anti-hipertensivos BRA, Olmesartana, em um modelo experimental de inflamação

intra-articular induzida por Zymosan, que é quadro comum em pacientes com AR.

O modelo de inflamação intra-articular induzida por Zymosan é fácil de

executar, tem boa reprodutibilidade dos dados e permite a obtenção de resultados

em um curto período de tempo (CARMO, 2015).

A administração intra-articular de Zymosan causou alterações

compatíveis com as características de inflamação aguda, validando o modelo de

estudo utilizado. Após a administração intra-articular de zymosan, os animais

desenvolvem intensa inflamação articular – caracterizada pelo aumento da

permeabilidade vascular, que leva a edema local e acentuado influxo celular

(XAVIER, 2005; BEZERRA et al., 2004).

No presente estudo, o pré-tratamento com Olmesartana nas doses de 15 ou

30 mg/Kg reduziu o influxo de células de modo dose-dependente. Existem vários

relatos na literatura que comprovam esse potencial de atividade anti-inflamatória em

outros modelos de inflamação: fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar

(KURIKAWA et al., 2003), artrite induzida por colágeno (SAGAWA et al., 2005),

miocardite aguda imunomediada (SEKO, 2006), inflamação periondontal

experimental (ARAÚJO et al., 2013). Estudos em modelos experimentais de artrite

demonstraram que os neutrófilos são as primeiras células a migrar para a

articulação. Os neutrófilos ativados promovem fagocitose de complexos imunitários

formados em fases iniciais, que libertam EROs e, assim, levam a um estresse

oxidativo na cartilagem articular, que aumentam a produção de citocinas pró-

inflamatórias. A resposta inflamatória leva a um aumento no fluxo de sangue e

transudação local de histamina e serotonina, aumentando assim a infiltração de

neutrófilos, com a consequente superprodução de EROs. Estudos mostram que o

estresse oxidativo participa da patogênese da AR, promovendo lesão na cartilagem

articular (FERMOR et al., 2007; NONOSE et al., 2014).

Poucos trabalhos relatam a ação anti-inflamatória da Olmesartana em

modelos experimentais de artrite (SAGAWA et al., 2005). Autores demonstraram o

efeito protetor desta em outros modelos experimentais: Araújo Jr. et al. (2014)

mostraram o efeito anti-inflamatório da Olmesartana em um modelo de mucosite

55

intestinal induzida por Metotrexato, que resultou numa redução da infiltração da

mucosa inflamatória, ulcerações, vasodilatação e áreas hemorrágicas, assim como

houve concentrações reduzidas de MPO e citocinas pró-inflamatórias IL -1β e TNF-

a, aumentando ainda a expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Outros estudos

mostraram que Olmesartana reduziu níveis de PCR em pacientes com angina

estável (MIYOSHI et al., 2014), reverteu completamente a hipertrofia ventricular

esquerda em ratos hipertensos (LI et al., 2013) e reduziu a expressão de citocinas

pró-inflamatórias e marcadores do estresse oxidativo em ratos submetidos à

miocardite experimental (SUKUMARAN et al., 2011).

Quanto à presença de células no líquido sinovial, é natural que exista em

baixa quantidade. Mor, Abramson e Pillinger (2005) mostram que a maioria das

células encontradas neste fluido, em condições não inflamatórias, são células

fagocíticas do sistema mononuclear. Este resultado está de acordo com o que se

compreende, atualmente, em relação à composição histológica do revestimento da

membrana sinovial, já que, como visto anteriormente, uma parte das células do

tecido sinovial são sinoviócitos semelhantes a macrófagos. Já nos casos de sinovite,

são encontradas alterações na sinóvia que inclui influxo de macrófagos e linfócitos,

como também proliferação de células dendríticas (SWEENEY e FIRESTEIN, 2004),

dados que corroboram com a nossa pesquisa, em que foi observado um aumento

significativo na contagem global de células no líquido sinovial.

Nossos resultados obtidos no grupo Zy, são compatíveis com quadros de

inflamação aguda. Logo, o resultado obtido, que retratou a presença de uma

quantidade significativamente aumentada de células no líquido sinovial, era

esperado e tem relação com o mecanismo do Zymosan em induzir sinovite

semelhante à presente na Artrite Reumatoide a partir de expressão dos genes

responsivos a NF-κB e a estimulação de nociceptores. A cascata inflamatória

decorrente dos mecanismos supracitados simula a sinovite característica da artrite

reumatoide, já que esta é amplificada em grande parte por meio da sinalização

celular e resposta mediada por ativação de NF-κB (ABBAS; LICHTMAN e PILLAI,

2008). Assim, a administração intra-articular do Zymosan promove aumento da

permeabilidade vascular e permite com isso um acentuado influxo celular, em

conformidade com os resultados aqui obtidos.

Em relação à análise histopatológica da membrana sinovial, Sweeney e

Firestein (2004) relatam a evolução do quadro inflamatório e influência nas

56

mudanças histológicas do tecido, com hiperplasia da membrana sinovial ocasionada

pelo influxo e proliferação dos sinoviócitos tipo A e B, bem como infiltração de

linfócitos T e B, com formação de estruturas semelhantes a nódulos linfáticos e

granulomas. Junto a isso, a produção acentuada de citocinas promove a ativação

dos fibroblastos sinoviais, ocasionando produção excessiva de MMPs e destruição

sinovial, cartilaginosa e óssea, que leva também a um aumento na deposição de

fibras colágenas, gerando fibrose, aspecto histopatológico comum em situações

inflamatórias.

Em concordância com a literatura, os animais do grupo Zymosan, que

receberam apenas solução salina via oral, apresentaram morfologia histopatológica

semelhante à descrita para situações inflamatórias, isto é, apresentaram um tecido

com alterações compatíveis com a inflamação intra-articular.

Neste estudo, os resultados observados na análise histopatológica da

sinóvia dos demais grupos experimentais corroboram os resultados obtidos com a

análise do influxo celular no fluido sinovial e, por conseguinte, com a hipótese de

que a olmesartana confere importante ação anti-inflamatória na inflamação intra-

articular, em consonância com estudos anteriores, em modelos de inflamação em

outros sítios do organismo (KURIKAWA et al., 2003; SAGAWA et al., 2005; SEKO,

2006; ARAÚJO et al., 2013). Neste aspecto, foi notável a análise histopatológica da

sinóvia dos animais que foram tratados com Olmesartana na dose de 30 mg/Kg, que

revelou a ausência de alterações inflamatórias. Isto é, o fármaco apresentou

potencial efeito protetor anti-inflamatório, impedindo a instalação de inflamação intra-

articular, ou impedindo que haja alterações histopatológicas em grande escala.

Foi feita a determinação da atividade de MPO, com intuito de elucidar se as

células que migraram para a articulação seriam neutrófilos. Na presente pesquisa,

observou-se que os grupos tratados com Olmesartana nas doses de 15 ou 30 mg/Kg

por via oral trinta minutos antes da indução da inflamação, apresentaram uma

diminuição da atividade de MPO indicando uma inibição do influxo de neutrófilos, da

mesma forma ocorreu essa inibição no grupo tratado com Diclofenaco de Sódio

quando comparados ao grupo Zy que mostrou uma alta atividade da MPO.

Os neutrófilos estão envolvidos na patogênese de lesões teciduais na artrite,

são predominantes no exsudato sinovial e atuam como fonte de substâncias, tais

como citocinas, espécies reativas de oxigênio e espécies de nitrogênio, enzimas

lisossomais e metaloproteinases, que atuam na degradação da cartilagem e na

57

reabsorção óssea em episódios agudos de artrite (GUERRERO et al., 2006).

Nesta investigação, olmesartana reduziu a imunomarcação de COX-2 no

tecido sinovial de ratos, o que poderia resultar na proteção dos tecidos. Do mesmo

modo, estudos anteriores mostraram que olmesartana reduz a expressão de COX-2,

em outros modelos experimentais de inflamação (ARAÚJO et al., 2013; ARAÚJO

JUNIOR et al., 2014).

O desenvolvimento do processo inflamatório na membrana sinovial ocorre

devido à resposta das células inflamatórias que aumentam a produção de citocinas e

a formação de radicais livres conduzindo ao estresse oxidativo que amplifica a

inflamação e ocasiona a destruição articular, dor e edema (PAIVA et al., 2011).

Observou-se que o Diclofenaco de Sódio (DS), anti-inflamatório não

esteroide, melhorou os parâmetros inflamatórios analisados, de modo semelhante

aos resultados obtidos com a olmesartana. Na avaliação sistêmica, olmesartana não

promoveu mudanças nos marcadores séricos do fígado ou rins. DS não causou

alterações hepáticas, no entanto, foi observado aumento em níveis séricos de ureia.

O fato de o DS inibir a cicloxigenase 1 e 2, em meio não seletivo, explica este efeito

adverso sobre o sistema renal (BESEN et al., 2009), bem como os efeitos

gastrointestinais (MOORE; DERRY e MCQUAY, 2007), descritos anteriormente.

O ataque oxidativo aos componentes essenciais das células por radicais

livres de oxigênio é um mecanismo geralmente reconhecido como relevante na

patogenia de várias enfermidades, tais como as doenças cardiovasculares, a

aterosclerose, o diabetes mellitus e as doenças inflamatórias reumáticas

(MONTUSCHI; BARNES e ROBERTS, 2004).

A peroxidação lipídica pode ocorrer por via enzimática (cicloxigenases e

peroxidades) e por via não enzimática (auto-oxidação). O MDA é um produto

secundário da peroxidação lipídica por via enzimática, derivado da β-ruptura de

ácidos graxos poli-insaturados, tais como ácido linoleico, araquidônico e

docosahexanóico (FILIPPIN e al., 2008). Em nosso estudo, a produção de MDA na

sinóvia do grupo Zymosan foi significativamente mais elevada quando comparada ao

grupo salina. Estes resultados coincidem com os dados publicados por Ramos et al.

(2000), que encontraram concentrações séricas de MDA elevadas em pacientes

com AR, sugerindo que em pacientes com inflamação articular, a lipoperoxidação

está aumentada e existe evidência indireta da importância dos radicais livres na

patogenia desta doença. Os grupos tratados com Olmesartana nas doses de 15 ou

58

30 mg/Kg e DS 100 mg/Kg apresentaram redução considerável na produção de

MDA em relação aos grupos controle, sugerindo que o fármaco estudado pode

interromper a reação em cadeia que se propaga nas membranas lipídicas, reduzindo

o estresse oxidativo.

Em sistemas aeróbicos, é essencial o equilíbrio entre agentes óxido-

redutores e o sistema de defesa antioxidante. Esses agentes são gerados

endogenamente como consequência direta do metabolismo do oxigênio (O2) e por

suas reduções parciais, que dão origem às EROs, como o radical superóxido (O2-),

peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (OH). Quanto ao potencial de

reatividade das EROs no meio biológico, o radical OH é o mais reativo e pode oxidar

qualquer molécula biológica. O H2O2 pode permear membranas e esta propriedade

possibilita a ocorrência de reações em alvos biológicos distantes do seu local de

formação. Já o O2 pode reagir com lipídios de membrana, proteínas, aminoácidos,

ácidos nucleicos, carboidratos e tióis. Dessa forma, para proteger-se, a célula possui

um sistema de defesa que pode atuar como detoxificadora do agente antes que ele

cause lesão, que é o caso da glutationa reduzida (GSH) (BARRY, 2007).

A glutationa desempenha um papel antioxidante intracelular importante na

manutenção de uma relação GSH/Glutationa oxidada elevada, condição essencial

para a proteção contra o dano oxidativo. No nosso estudo, a atividade enzimática da

NP-SH na sinóvia dos grupos tratados se mostrou significativamente aumentada, em

relação ao grupo Zy, resultado que sugere uma resposta adaptativa frente a uma

elevação do estresse oxidativo e poderia ser consequência de um processo de

indução enzimática.

Neste estudo, os animais tratados com olmesartana tiveram imunomarcação

aumentada das enzimas antioxidantes, como a SOD e GSH-Px, um reforço do efeito

protetor sobre o estresse oxidativo. Corroborando os nossos resultados,

olmesartana aumentou os níveis de SOD na nefropatia diabética, em diabetes

induzida por estreptozotocina em ratos (SI et al, 2014) e restaurou a atividade de

GSH-Px na nefrotoxicidade induzida por daunorrubicina em ratos (GOUNDER et al.,

2014).

Distintos estudos correlacionam o bloqueio de receptores AT1 com a

modulação anti-inflamatória, atribuindo propriedades pró-inflamatórias à ativação do

referido receptor a partir de ligação aos seus agonistas (SHAO et al., 2003; LIU et

al., 2009; NAHMOD et al., 2003; NABAH et al., 2004). A administração de

59

Olmesartana apresentou resultados positivos em todos os testes e dosagens deste

trabalho, sugerindo que a interação entre angiotensina II e os receptores AT1 tem

importância na fisiopatologia da artrite reumatoide, uma vez que a menor presença

de células inflamatórias no líquido sinovial denota uma menor infiltração leucocitária

no sítio da inflamação. É provável, portanto, que o bloqueio dos receptores AT1 seja

suficiente para alterar de maneira significativa a presença das citocinas pró-

inflamatórias produzidas na ocasião da sinovite, reduzindo os danos decorrentes da

inflamação.

Baseando-se nos dados obtidos nesse trabalho, é possível observar que

olmesartana apresentou efeito anti-inflamatório, ocasionando a diminuição da

migração de leucócitos para a articulação e reduzindo o estresse oxidativo.

Os nossos resultados são de grande importância, tendo em conta que a AR

está associada com um risco aumentado de DCV, e que a HA é um fator de risco

para essas doenças, com elevada prevalência em pacientes com artrite reumatoide.

Assim, a utilização de olmesartana em doentes com AR pode trazer benefício duplo,

devido ao efeito anti-inflamatório e anti-hipertensivo. Embora o bloqueio de

angiotensina II, provavelmente não vá substituir drogas anti-reumáticas, tais como

MTX, AIEs e agentes biológicos, o BRA pode ser um anti-hipertensivo que traz

benefícios para os pacientes com AR.

60

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os resultados desse estudo demonstram o efeito anti-inflamatório da

Olmesartana no modelo de inflamação intra-articular induzida por Zymosan em ratos

Wistar. Os efeitos desse fármaco estão relacionados com a diminuição da migração

de neutrófilos (MPO), redução da COX-2 e dos biomarcadores do estresse oxidativo

(MDA) e aumento nos níveis do sistema de defesa antioxidante (GSH, SOD, GSH-

Px), diminuindo assim o dano na membrana sinovial. No entanto são necessários

mais estudos para uma melhor elucidação dos mecanismos de sinalização

associados com o efeito da olmesartana na inflamação intra-articular induzida por

Zymosan. Concluímos que a Olmesartana teve um efeito protetor sobre a inflamação

intra-articular e merece um estudo mais aprofundado em seres humanos.

61

ANEXOS

ANEXO A – Aprovação CEUA

62

REFERÊNCIAS

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