Diagnstico molecular de doenas infecciosas

Jorge L M Sampaio

Panorama atual

As possibilidades e oportunidades so inmeras Novas tecnologias com custo elevado Presso dos pagadores para reduo dos custos em

sade Reduo da atuao humana com automao da

extrao, amplificao e interfaceamento com sistema de apoio deciso

Nvel de automao depende do nmero de exames consolidao de laboratrios de anlises clnicas

O grande desafio reduzir custos mantendo ou aumentando a qualidade do resultado

Perguntas

Quais as doenas (excetuando as virais) nas quais os mtodos moleculares so essenciais?

Que tipos de alvos devem ser prioritariamente selecionados e quais as principais estratgias?

Quais as principais metodologias aplicveis ao laboratrio clnico?

Problema

O uso de antimicrobianos que alteram a microbiota entrica est relacionado ocorrncia de diarria causada por Clostridium difficile.

Em vrios casos nos quais h evidncias clnicas e epidemiolgicas sugerindo essa etiologia, a pesquisa das toxinas A e B nas fezes negativa.

Algumas cepas so mais virulentas em funo de maior produo e toxinas

Analisando

Qual o padro ouro? Cultura em meio seletivo seguido de teste de

toxigenicidade

Prazo de 5 a 7 dias

Como possvel detectar

C. difficile

Fonte: Voth, 2005

Fonte: Sloan, 2008

Performance do testeClostridium difficile

Sloan et al., 2009

Outra estratgia

Fonte: Espy, 2006 Animao

Reanalisando

Preparo de reagentes de amplificao (rea 1) Extrao manual (rea 2) Montagem da reao (rea 2) Amplificao e anlise (rea 3) possvel simplificar?

Realmente simplificando: GeneXpert

Realmente simplificando

Pesquisa do DNA de C. difficile PCR em tempo real GeneXpert

Neisseria gonorrhoeae

Paciente de 25 anos, sem parceiro sexual fixo, apresenta cervicite e uretrite.

Foram coletadas amostras endocervical e uretral: Bacterioscpico com raros diplococos Gram-negativos

intracelulares

Cultura em meio seletivo para Neisseria: NEGATIVA

O mdico contesta os resultados O que pode ter ocorrido e o que pode ser feito?

Viabilidade bacteriana em meio de transporte

Fonte: Rishmawi, 2007

Neisseria gonorrhoeae

Hjelmevoll, 2008 360 amostras (185 homens e 57 mulheres)

37 positivas por cultura e Rt-PCR para gene porA 15 positivas apenas por RT-PCR, confirmadas por

sequenciamento de rRNA 16S

Alerta: podem ocorrer resultados falsamente positivos em funo da similaridade dom espcies no patognicas.

Chlamydia trachomatis

Sem parede celular Patgeno de multiplicao intracelular

obrigatria

Uretrite Cervicite Salpingite infertilidade/esterilidade

Mtodos disponveis

Isolamento em cultura de clulas McCoy padro ouro

Imunofluorescncia sensibilidade 88% RT-PCR/Amplicor sensibilidade 97%

SeptiFastDeteco de DNA bacteriano ou fngico

em sangue total

Escherichia coli Klebsiella sp. Enterobacter sp. Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas

maltophilia

Staphylococcus aureus

SCN Streptococcus

pneumoniae

Streptococcus spp. Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

SeptiFastDeteco de DNA bacteriano ou

fngico em sangue total

Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida krusei * Candida glabrata * Aspergillus fumigatus

Tempo de Anlise

Hemocultura Transporte/abertura de ficha

1 hora

Incubao em equipamento com leitura a cada 10 min

Deteco em 6 a 72 horas Bacterioscpico e semeadura

ou inoculao e sistema de automao

8 a 24 horas identificao Total 15 a 96 horas para

possvel interveno

SeptiFast 3 ml de sangue total Transporte/abertura de ficha Extrao do DNA = 2 h Amplificao do DNA, anlise

e identificao da espcie = 3 h

Total 6 horas para possvel interveno

Bases Moleculares

Bactrias de crescimento rpido e fungos tm mltiplos operons de rRNA

Alvo com mltiplas cpias no cromossomo maior sensibilidade

rRNA E. coli - GenBank

Como Funciona

Vrias reaes de PCR Anlise de curva de melting

Estudos Recentes - ICAAC 2008

Tsalik et al. Duke University Adultos febris atendidos no setor de emergncias

(TA > 38,3C) Septifast e 1 par de hemoculturas 142 pacientes recrutados, 20% com hemocultura

positiva Definio de casos:

Confirmado Provvel Possvel

ICAAC 2008

Schaub et al. , Sua

Testes positivos

Comparando os MtodosPadro Ouro a Clnica

Consideraes

H necessidade de estudos para a avaliao do impacto na mortalidade e tempo de internao

Sensibilidade semelhante hemocultura Menor tempo de resposta Redirecionamento do tratamento na sepse

por P. aeruginosa, A. baumannii, S. maltophilia ou Candida krusei/C. glabrata ?

Caso clnico

Paciente de 34 anos, sexo masculino, HIV soropositivo apresenta, h duas semanas, febre, diarria e dor em membro inferior direito em topografia de cicatriz cirrgica.

H cerca de trs meses havia sido submetido a cirurgia ortopdica com colocao de haste de fixao em funo de fratura traumtica de fmur.

A tomografia computadorizada de MI evidenciou abscesso no stio cirrgico e sinais de osteomielite.

Caso clnico

O paciente foi submetido drenagem cirrgica da leso e o material enviado para cultura geral, fungos e micobactrias

Foram iniciados ceftazidima e vancomicina

Aps duas semanas no houve crescimento bacteriano ou fngico

Em funo da persistncia da febre foi solicitada a coleta de trs hemoculturas

Giemsa

Identificao

Identificao

Realizada extrao do DNA do crescimento em Karmali.

Amplificao e sequenciamento parcial do gene que codifica a subunidade 16S do RNA ribossmico (rRNA 16S).

Resultado do alinhamento da seqncia parcial do rRNA 16S com os depsitos do

GenBank

100% de similaridade com Helicobacter fenneliae

Outras aplicaes

Identificao do Complexo M. tuberculosis e diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG.

Isolados Identificados na Rotina - Jan a Dez 2009 - Fleury N %

Complexo M. tuberculosis 55 55,0

Mycobacterium avium/intracellulare 22 22,0

Mycobacterium abscessus 8 8,0

Mycobacterium kansasii 7 7,0

Mycobacterium gordonae 2 2,0

Mycobacterium spp. 6 6,0

Culturas para micobactriasescarro ou lavado bronco-alveolar

Barnes PF, Cave MD. Molecular epidemiology of tuberculosis. N Engl J Med. 2003;349(12):1149-56.

Por que PCR Multiplex?

50% dos casos identificados em uma nica reao

reduo de custo

reduo da carga de trabalho agilidade

Diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG (pirazinamida R)

Sequncias alvo no multiplex

IS6110 complexo MTB hsp65 todas as micobactrias Espaadores 33 e 34 regio DR

diferenciao de M. bovis e M. bovis BCG Yeboah-Manu D, Yates MD, Wilson SM. Application of a simple multiplex

PCR to aid in routine work of the mycobacterium reference laboratory. J Clin Microbiol. 2001;39(11):4166-8.

Regio DR

DR 30 DR 31 DR 32 DR 37 DR 38 DR 39 DR 40 DR 41 DR 42 M.tuberculosis

DR 30 DR 31 DR 25 DR 32 DR 33 DR 34 DR 35 DR 36 DR 37M.bovis

selvagem

99 bp

DR 30 DR 31 DR 25 DR 32 DR 33 DR 33 DR 34 DR 35 DR 36 M.bovis BCG

172 bp

99 bp

PCR Multiplexo

O que fazer para identificar as demais espcies

rRNA 16S (rrs) hsp65 ITS 16S-23S sodA gyrB rpoB

Alvos mais Utilizados rRNA 16S (rrs)

Aproximadamente 1.500 bp Regies hipervariveis A (129-267) e B (430-

500)

Na prtica 9 609 No permite diferenciao:

espcies do complexo MTB M. abscessus e M. chelonae M. zulgai e M. malmoense M. kansasii e M. gastri M. ulcerans e M. marinum M. shimoidei e M. triviale

Alvos mais Utilizados

hsp65 1623 bp Na prtica 146 585 = 441bp Permite diferenciao

M. abscessus e M. chelonae M. zulgai e M. malmoense M. kansasii e M. gastri

No permite diferenciao Espcies do Complexo MTB

Seqenciamento de DNA

Fundamentos

Estrutura dos cidos Nucleicos

Nucleotdeos Estrutura dos cidos Nucleicos

DNA

RNA

Ligao Fosfodister

Ligao Fosfodiester

Dideoxinucleotdio Frederick Sanger Prmio Nobel Qumica - 1980

Sequenciamento de DNA

cycseqpc.exe

O laboratrio clnico hojeExtrao automatizada

Estao para preparo automatizado de reaes

Automao HIV-HCV-HBV

Automao

Automao

Automao