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  • Semina: Cincias Agrrias

    ISSN: 1676-546X

    semina.agrarias@uel.br

    Universidade Estadual de Londrina

    Brasil

    dos Reis, Cndida Camila; Sampaio Henrique, Douglas; Schervinski, Edimara; Zanela,

    Juliano; Vinicius Constantino, Leonel; Dallo, Rafael

    Comparao entre tcnicas para determinao de acares solveis em alimentos

    utilizados na nutrio de ruminantes

    Semina: Cincias Agrrias, vol. 36, nm. 1, enero-febrero, 2015, pp. 401-408

    Universidade Estadual de Londrina

    Londrina, Brasil

    Disponvel em: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=445744146031

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  • 401Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 36, n. 1, p. 401-408, jan./fev. 2015

    Recebido para publicao 21/06/13 Aprovado em 01/10/14

    DOI: 10.5433/1679-0359.2015v36n1p401

    Comparao entre tcnicas para determinao de acares solveis em alimentos utilizados na nutrio de ruminantes

    Comparison of techniques for determination of soluble sugars used in feed for ruminant nutrition

    Cndida Camila dos Reis1*; Douglas Sampaio Henrique2; Edimara Schervinski3; Juliano Zanela4; Leonel Vinicius Constantino5; Rafael Dallo6

    Resumo

    O objetivo do presente trabalho foi avaliar duas tcnicas para determinao de acares solveis (frao CA) em alimentos utilizados na nutrio de ruminantes. Os alimentos analisados foram: cana-de-acar, capim estrela, milho modo e farelo de soja. Foi determinado o contedo de matria seca (MS), matria mineral (MM), extrato etreo (EE) e protena bruta (PB), para calcular a concentrao de carboidratos totais das amostras. O teor de carboidratos solveis foi determinado em 15 repeties de cada amostra, utilizando-se duas tcnicas analticas distintas: uma que se baseia na extrao dos carboidratos solveis e na suaquantificao por espectrofotometria aps a complexao do acar com a antrona; e outra que consiste na utilizao do fenol como agente complexador. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado e os dados foram submetidos anlise de varincia bifatorial ( = 0,05), sendo os fatores, os diferentes alimentos e as duas tcnicas. No houve diferena significativa para o fator tcnica, mas houve efeito do fator alimento e para a interao alimento x tcnica. Por isso, foram realizadas novas anlises de varincia para testar se havia diferena entre as tcnicas em cada um dos alimentos. Apenas o farelo de soja no apresentou diferena significativa quanto ao teor de acar solvel determinado pelas duas tcnicas.Palavras-chave: Anlises bromatolgicas, fracionamento de carboidratos, sistemas de alimentao

    Abstract

    This study aims to evaluate different techniques for determination of soluble sugars (fraction CA) in foods used for ruminant nutrition. Feed analyzed were: sugar-cane, bermuda grass, corn meal and soybean meal. Dry matter (DM), ash, ether extract (EE) and crude protein (CP) were determined to make possible the calculation of total carbohydrates concentration in the samples. The soluble carbohydrate fraction were determined in 15 repetitions of each sample by two different analytical techniques. One technique based on soluble carbohydrates extraction and its quantification by spectrophotometry after chelation of the sugar with anthrone; and another one that uses phenol as the chelating agent. The experiment were conducted in a completely randomized design and the data submitted to the two-factor

    1 Discente do Curso de Mestrado do Programa de Ps Graduao em Zootecnia, Universidade Tecnolgica Federal do Paran, UTFPR, Dois Vizinhos, PR. Bolsista CAPES/DS. E-mail: candidareis@zootecnista.com.br

    2 Prof., Programa de Ps Graduao em Zootecnia, UTFPR, Dois Vizinhos, PR. E-mail: douglas@utfpr.edu.br3 Zootecnista, UTFPR, Dois Vizinhos, PR. E-mail: edimaraschervinski@gmail.com4 Qumico, Tcnico de Laboratrio, UTFPR, Dois Vizinhos, PR. E-mail: julianoz@utfpr.edu.br5 Discente do Curso de Doutorado, Dept de Qumica, Universidade Estadual de Londrina, UEL, Centro de Cincias Exatas,

    Londrina, PR. E-mail: nel_qui_uel@hotmail.com 6 Mdico Veterinrio. UFPR, Palotina, PR. E-mail: rafaelmiola@hotmail.com * Autor para correspondncia

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    Reis, C. C. dos et al.

    factorial analysis of variance ( = 0.05), with the different feeds and the two techniques as factors. There was no statistical difference between techniques, but the effect of the feed and the interaction feed x technique were significant. So, a new analysis of variance was conducted to test the difference between techniques in each feed separately. Only soybean meal did not show statistical difference between the water soluble sugars determined by the two techniques.Key words: Chemical analysis, carbohydrate fractions, feeding systems

    Introduo

    A produo de bovinos no Brasil basicamente realizada sob condies nas quais as pastagens constituem importante fonte de nutrientes. Nesse sistema de produo, podemos associar o baixo desempenho animal ao baixo valor nutritivo das forragens, principalmente quando se trata de animais com elevada demanda de nutrientes (VAN SOEST, 1994). Essa constatao evidencia a importncia da busca de melhor entendimento dos mecanismos que governam a digesto ruminal para o adequado aproveitamento das pastagens pelos animais (ViEiRA et al., 2000).

    Nas forrageiras, os carboidratos perfazem cerca de 60 a 80% da matria seca, sendo a principal fonte de energia para os seres vivos compreendidos nos primeiros nveis trficos (FERNANDES et al., 2003a). Nos ruminantes, a energia proveniente dos carboidratos se torna disponvel indiretamente, na forma de cidos graxos volteis, gerados pela ao microbiana nos compartimentos fermentativos e, diretamente, pela absoro de seus monmeros constituintes, nos intestinos desses animais (VAN SOEST, 1994).

    Os carboidratos so nutricionalmente classificados em fibrosos (CF) e no fibrosos (CNF). Os CF so representados pela celulose e hemicelulose e sua taxa de degradao ruminal lenta e varivel; por isso, ocupam espao no trato gastrintestinal (TGI). Os CNF so representados pelos acares solveis, amido e pectina, sendo a sua degradabilidade no rmenalta e pouco varivel entre os diferentes alimentos (VAN SOEST, 1967; MERTENS, 1996). De acordo com a taxa de

    degradao, os carboidratos podem ser divididos em frao CA, rapidamente degradvel (acares) sendo os principais a glicose e a sacarose; frao CB1, degradao intermediria (amido); frao CB2, degradao lenta (parede celular disponvel) e frao CC, no degradvel (parede celular indisponvel) (SNiFFEN et al., 1992; FERNANDES et al., 2003b).

    Essas quatro fraes de carboidratos so utilizadas pelo sistema de avaliao de dietas, desenvolvido pela Universidade de Cornell: CNCPS (Cornell Net Carbohydrate and Protein System, 2008), para calcular a quantidade de energia disponvel s bactrias que fermentam CNF, que por sua vez utilizam NH3, aminocidos e peptdeos como fonte de compostos nitrogenados (N), assim como s bactrias que fermentam CF, cujo requisito em N atendido apenas pela NH3 (FERNANDES et al., 2003b). Geralmente, as fraes nitrogenadas tm sido determinadas por meio de mtodos de solubilizao, e suas taxas de digesto obtidas por diferentes tcnicas, resultando numa grande variao nos resultados observados (PEREiRA et al., 2000). Da mesma forma, as fraes de carboidratos podem ser determinadas aplicando-se tcnicas diversas, cada qual com seus benefcios e inconvenincias.

    O presente trabalho teve como objetivo avaliar se uma tcnica de anlises de carboidratos menos laboriosa proposta por Dubois et al. (1956), pode ser adaptada para a determinao dos acares solveis em gua. Neste sentido, essa tcnica ser comparada com atcnica padro desenvolvida por Deriaz (1961).

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    Comparao entre tcnicas para determinao de acares solveis em alimentos utilizados na nutrio de ruminantes

    Material e Mtodos

    O projeto foi realizado nas instalaes do Laboratrio de Fitossanidade, do Curso de Zootecnia da Universidade Tecnolgica Federal do Paran-Campus Dois Vizinhos - PR, no perodo de maro a maio de 2011.

    Os alimentos utilizados na pesquisa foram os volumosos: cana-de-acar (Saccarum spp.) e capim estrela (Cynodon nlemfuensis) e os concentrados: milho modo e farelo de soja. As amostras de cana-de-acar (somente o colmo, sem as extremidades) e capim estrela foram coletadas no ms de fevereiro e pr-secas em estufa de ventilao forada de ar a 5550C durante 72 horas, sendo que as amostras de cana-de-acar foram trituradas em triturador forrageiro antes da pr-secagem. Aps a pr-secagem, o material foi triturado com peneira de malha 1mm, sendo que o milho modo e o farelo de soja foram peneirados (peneira de malha 1mm) para melhor homogeneizao das amostras, e assim determinado o contedo de matria seca (MS), matria mineral (MM), extrato etreo (EE) e protena bruta (PB) de acordo com Silva e Queiroz (2004). O teor de carboidratos totais (CT) foi estimado utilizando a equao (1) proposta por Sniffen et al. (1992).

    (1)

    Para a extrao dos carboidratos solveis foram utilizadas 15 repeties de cada alimento. Destas repeties foram transferidos 200 mg para um frasco erlenmeyer de 250 mL e adicionado 200 mL de gua destilada; os frascos com as amostras em gua foram colocados em incubadora com mesa de agitao orbital (200 rpm), temperatura ambiente, durante uma hora para a solubilizao dos acares.

    A determinao dos acares solveis foi feita por meio de duas tcnicas distintas. A tcnica descrita por Deriaz (1961) determina os carboidratos solveis em gua por meio da espectrofotometria, realizada aps a formao de um complexo azul-esverdeado, gerado pelo aquecimento desses

    compostos em soluo de antrona fortemente cida. A soluo de antrona foi preparada adicionando-se, lentamente, 760 mL de cido sulfrico, para reao com antrona em 330 mL de gua destilada. Em seguida se adicionou 1 g de tiuria e 1 g de antrona, e feita agitao, at dissoluo completa da amostra.

    Aps a solubilizao dos acares em gua, o contedo foi filtrado em papel-filtro quantitativo de filtragem rpida, retendo-se aproximadamente 50 mL do lquido filtrado. Uma alquota de 2 mL do filtrado foi depositada em tubo de ensaio (150 mm 25 mm) com tampa rosquevel, sendo este tubo mantido imerso em banho de gua e gelo durante 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 10 mL da soluo de antrona, lentamente para que ela escorresse pela parede do tubo formando uma camada abaixo do lquido filtrado. O tubo era agitado dentro do banho de gua e gelo, para homogeneizao de seu contedo, e, posteriormente, levado, com a tampa levemente fechada (sem vedar) fervura, durante 20 minutos, tendo o cuidado de manter a gua fervendo durante todo o perodo. Ao trmino desta fase, o tubo foi transferido para o banho de gua e gelo, para que este alcanasse a temperatura ambiente o mais rpido possvel. A leitura era feita no menor tempo possvel, em espectrofotmetro, no comprimento de onda de 620 m.

    A equao-padro, relacionando a absorbncia e a quantidade de carboidrato solvel, foi obtida a partir da diluio de uma soluo de 0,8 mg mL-1 de glicose, preparada para uso imediato, em solues contendo 0;0,04;0,08;0,12;0,16 e 0,20 mg mL-1 de glicose. Em seguida, foram tomados de cada soluo, em duplicata, 2mL, para que se proceda transferncia para os tubos de ensaio e seguidos os mesmos passos para determinao dos carboidratos solveis juntamente com as amostras.

    Para determinao segundo o mtodo de Dubois et al. (1956), seguiu-se o mesmo procedimento descrito anteriormente para secagem, preparao da amostra e extrao dos acares em gua. Posteriormente, foi colocada uma alquota de 0,5

    )%%(%100)(% MMEEPBMSCT =

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    Reis, C. C. dos et al.

    mL da soluo em tubo de ensaio mais 0,5 mL de fenol 5% e 2,5 ml de cido sulfrico, sendo que as amostras de cana foram diludas em gua (0,25 mL da amostra para 0,25 mL de gua) a fim de diminuir as concentraes de acares solveis para evitar problemas na leitura. Aps o resfriamento, foi feita leve agitao e em seguida a leitura em espectrofotmetro a 490 m.

    O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado e os dados foram submetidos anlise de varincia (ANOVA bifatoriala 5%de significncia ( = 0,05).

    As variveis foram analisadas utilizando o seguinte modelo estatstico:

    em que, ijkY representa a k-sima repetio do j-simo alimento analisado pela i-sima tcnica,

    k variando de 1 a 15; a mdia geral; iT se refere tcnica laboratorial, com i = 1 para a tcnica da antrona e i = 2 para a tcnica do fenol;

    jA corresponde aos alimentos analisados, em que j = 1, 2, 3 e 4 representa os alimentos: cana-de-acar, capim estrela, milho modo e farelo de soja, respectivamente; TAij o efeito da interao entre tcnica e alimento e ijk indica o erro aleatrio associado a cada observao, com distribuio supostamente normal e independente NID (0, j2 ).

    Resultados e Discusso

    Os valores encontrados para a concentrao de MS, MM, EE e PB dos alimentos testados (Tabela 1) foram prximos dos obtidos por outros autores (MALAFAiA et al., 1998; PEREiRA et al., 2000; HASHiMOTO et al., 2007; FAVORETO et al., 2008; DiAS et al., 2008).

    ijkijjiijk TAATY ++++=

    Tabela 1. Composio bromatolgica e concentrao dos carboidratos solveis da cana-de-acar, capim estrela, milho modo e farelo de soja.

    Composio* Cana-de-acar Capim estrela Milho modo Farelo de sojaMS 913,2 905,2 877,0 908,3PB 36,16 143,47 90,03 487,96EE 15,5 11,6 45,6 18,5MM 43,4 79,3 22,1 75,9CT 904,9 770,8 842,3 417,6CHOs(antrona) 228,17 11,70 22,91 113,40CHOs(fenol) 216,52 19,38 27,35 116,80

    * Valores expressos em g kg -1MS Matria Seca; PB Protena Bruta; EE Extrato Etreo; MM Matria Mineral; CT Carboidratos Totais; CHOs(antrona) Carboidratos Solveis determinados pela tcnica da antrona; CHOs(fenol) Carboidratos Solveis determinados pela tcnica do fenol. Fonte: Elaborao dos autores.

    Ao analisar os carboidratos solveis da cana foi observado que a concentrao era to alta que ultrapassava a capacidade do espectrofotmetro. Essa constatao baseou-se no valor de absorbncia obtido quando se usou o volume padro de amostra recomendada na tcnica de Dubois et al. (1956), ou seja, 0,5 mL de amostra. Com esse volume de

    amostra os valores de absorbncia ultrapassaram 1,5 e as medies do equipamento variavam muito sem que houvesse a estabilizao da leitura. Segundo, Bracht, Kelmer-Brach e Amado (2003) concentraes muito altas da substncia a ser determinada escapam da faixa de linearidade entre concentrao e absorbncia e geralmente

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    Comparao entre tcnicas para determinao de acares solveis em alimentos utilizados na nutrio de ruminantes

    a linearidade torna-se problemtica a partir de absorbncias entre 1,5 e 2,0. Portanto, avaliou-se vrias diluies da amostra a fim de diminuir a concentrao de acares solveis e reduzir os erros de leitura do espectrofotmetro. O critrio de escolha foi a diluio mnima necessria para encontrar valores de absorbncia menores que 1,5; sendo escolhida a diluio de 0,25 mL de amostra para 0,25 mL de gua.

    Houve considervel variao nas concentraes de acares solveis entre os alimentos analisados, o que confere diferenas importantes entre esses alimentos. A escolha dos alimentos com diferentes concentraes de aucares solveis possibilita melhor avaliao dos limites das tcnicas testadas.

    O capim estrela, quando comparado com os outros alimentos analisados, apresentou baixa concentrao de carboidratos solveis, pelo fato das gramneas, de modo geral, apresentarem de 60 a 80% de seus carboidratos sendo componentes da parede celular vegetal (VAN SOEST, 1994). Favoreto et al. (2008) pesquisando a mesma gramnea tambm encontraram baixas concentraes de carboidratos solveis (13,24 g kg-1), por meio de ensaios in vitro de degradao gravimtrica da fibra, combinada produo cumulativa de gases e de ajustes de modelos matemticos. A exceo dentre as gramneas a cana-de-acar que apresenta elevada concentrao de carboidratos solveis, principalmente sacarose. No presente trabalho encontraram-se valores de carboidratos solveis para cana-de-acar mais de 10 vezes maior do que do capim estrela (tabela 1) evidenciando assim a importncia da cana como fonte de carboidratos de altssima taxa de degradao ruminal. Silva et al. (2008) encontraram teores maiores de carboidratos solveis na cana-de-acar (411,4 gkg-1), analisando caule e folhas. Muitos so os fatores que podem contribuir para essas variaes, tais como o estado fisiolgico da planta no momento da colheita, o gentipo, as condies ambientais durante seu desenvolvimento e a parte da planta que foi colhida (por exemplo,

    a base do colmo possui maior concentrao de acares do que o pice).

    As concentraes de carboidratos solveis do milho foram aproximadamente dez vezes menores do que da cana, o dobro do capim estrela e cinco vezes menores que do farelo de soja (Tabela1). Os teores de acares solveis do milho variam de acordo com a maturidade fisiolgica do gro, sendo que at o 15 dia aps a polinizao as concentraes de sacarose aumentam rapidamente, depois diminuem e ocorre significativo aumento dos polissacardeos totais durante todo amadurecimento (CREECH, 1968), quanto mais maduro o gro menor ser sua concentrao de acar solvel. Alm disso, alteraes nas concentraes de acares solveis no gro de milho podem ser decorrentes da variedade utilizada. Caniato et al. (2007) encontraram valores de acares solveis variando de 43,8 a95,2 g kg -1 em diferentes cultivares de milho, esses valores so muito superiores aos encontrados no presente trabalho, talvez pelo fato do autor ter utilizado gro verde, que como discutido anteriormente possui maior teor de acar.

    O farelo de soja apresentou valores considerveis de carboidratos solveis, ficando abaixo apenas da cana de acar (tabela1). Dentre os fatores que podem alterar a concentrao de carboidratos solveis na soja, podemos citar a forma de extrao do leo, o tipo de solvente utilizado, o tempo e a temperatura de secagem (ViANNA; PiRES; ViANA, 1999). Bertipaglia et al. (2008) encontraram variaes nas concentraes de carboidratos solveis da soja in natura e em diferentes graus de extruso (549 at 715 g kg-1em relao ao CT), quanto maior a temperatura de extruso da soja maior a concentrao de carboidratos solveis. Hashimoto et al. (2007) encontraram concentraes bastante altas de carboidratos solveis no farelo de soja (283,01 g kg-1) quando comparadas ao encontrado no presente trabalho. No entanto esses autores no determinaram os CHO solveis diretamente, mas calcularam essa frao pela diferena entre os CHO

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    Reis, C. C. dos et al.

    totais e as outras fraes de carboidratos, conforme sugerido por Sniffen et al. (1992). Desta forma, todos os erros das outras analises para determinar as fraes de carboidratos recaem sobre a frao solvel, podendo levar a estimativas viesadas da referida frao. Na tabela de alimentos do software CNCPS v. 6.1 os valores de acar solvel do farelo de soja variam de 81 a115 g kg -1, estes valores esto mais prximos dos encontrados no presente trabalho.

    Como esperado houve diferena estatstica na concentrao de carboidratos solveis dos alimentos estudados ( < 0,05). No caso das duas tcnicas usadas para determinao dos CHO solveis no houve diferena significativa (>0,05), porm houve efeito da interao entre tcnica e alimento (Tabela 2). Devido ao efeito positivo da interao foi realizada uma nova anlise de varincia para cada alimento com o intuito de determinar em qual deles haveria diferena significativa entre as duas tcnicas.

    Tabela 2. Anlise de Varincia para os valores mdios das tcnicas analisadas, os alimentos e a interao entre tcnica e alimento.

    FV1 GL2 SQ3 QM4 F0 PTcnica 1 28 28.06024 0.427474 0.51457Alimento 3 834495 278165.1 4237.606 0.00000interao 3 1667 555.6991 8.465599 0.00004Resduo 112 7352 65.64203 - -TOTAL 119 843542 - - -

    1 Fator/varivel analisada 2Grau de Liberdade 3Soma de Quadrados 4 Quadrado MdioFonte: Elaborao dos autores.

    Ao submeter os resultados nova anlise de varincia, todos os alimentos testados, com exceo do farelo de soja, apresentaram valores de carboidratos solveis diferente de acordo com a tcnica utilizada. O milho e o capim tiveram valores menores quando a tcnica utilizada foi a antrona e o oposto foi observado para a cana de acar.

    As altas concentraes de carboidratos solveis da cana causavam instabilidade na leitura do espectrofotmetro a partir da absorbncia 0,9. Provavelmente, a grande massa de carboidrato solvel da amostra de cana ultrapassava a capacidade do equipamento. Segundo a Lei de Lambert-Beer (BRACHT; KELMER-BRACH; AMADO, 2003), deve existir uma relao linear entre a concentrao da amostra e a absorbncia. Contudo, essa linearidade vlida dentro de certos limites, a partir de determinada concentrao deixa de haver proporcionalidade entre concentrao e absorbncia. A faixa de linearidade depende da

    substncia e das interaes entre as substncias, mas depende tambm do aparelho. Geralmente, se observa problemas na linearidade a partir de absorbncias entre 1,5 e 2 (BRACHT; KELMER-BRACH; AMADO, 2003). Porm, quando se utiliza aparelhos com baixa preciso recomenda-se usar concentraes de amostras que produzam valores de absorbncia entre 0,2 e 0,9 para evitar extrapolar os limites do espectrofotmetro (GUTIERREZ, 2011). No presente trabalho o nico alimento que no apresentou diferena estatstica nos carboidratos solveis determinado pelas duas tcnicas testadas foi o farelo de soja. Justamente o alimento que possua teores intermedirios de acar solvel. Todos os outros possuam ou valores muito baixos (capim estrela e gro de milho) ou muito altos (cana de acar) de carboidratos solveis. Essas evidncias nos levam a crer que talvez as diferenas observadas sejam consequncia da sensibilidade e capacidade do equipamento de espectrofotometria

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    Comparao entre tcnicas para determinao de acares solveis em alimentos utilizados na nutrio de ruminantes

    utilizado e no das diferentes tcnicas. Portanto, prope-se mais pesquisas sobre o assunto para tentar adequar os procedimentos analticos de forma a permitir determinaes mais acuradas mesmo com espectrofotmetros de baixa preciso. A proposta mais imediata seria realizar diluies das amostras com maior contedo de acar e aumentar a massa de amostra com baixa concentrao com o objetivo de ajustar a quantidade de acar a ser determinado para que os valores de absorbncia se situem entre 0,2 e 0,9.

    Concluso

    As tcnicas do fenol e da antrona se equivaleram para determinar os acares solveis do farelo de soja. O mesmo no foi observado para o gro de milho, capim estrela e cana de acar, provavelmente, porque esses alimentos tinham concentraes de acares que extrapolavam os limites mximo e mnimo de deteco do equipamento usado. Portanto, recomenda-se mais pesquisa sobre a melhor diluio da amostra para determinao de acar solvel pelos mtodos estudados.

    RefernciasBERTIPAGLIA, L. M. A.; MELO, G. M. P. de; SUGOHARA, A.; MELO, W. J.; BERTIPAGLIA, L. A. Alteraes bromatolgicas em soja e milho processados por extruso. Revista Brasileira de Zootecnia, Viosa, MG, v. 37, n. 11, p. 2003-2010, 2008.

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